JPH0928376A - 新規ジペプチジルペプチダーゼｉｖとその製造方法 - Google Patents
新規ジペプチジルペプチダーゼｉｖとその製造方法Info
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- JPH0928376A JPH0928376A JP7185811A JP18581195A JPH0928376A JP H0928376 A JPH0928376 A JP H0928376A JP 7185811 A JP7185811 A JP 7185811A JP 18581195 A JP18581195 A JP 18581195A JP H0928376 A JPH0928376 A JP H0928376A
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- Japan
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- pro
- dipeptidyl peptidase
- stable
- gly
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 本発明は広く自然界より分離したキサン
トモナス・マルトフィリアを培養して得られる新規ジペ
プチジルペプチダーゼＩＶ及び該酵素の製造方法の提供
である。 【効果】 本発明により得られる新規ジペプチジルペプ
チダーゼＩＶは従来報告されていない、キサントモナス
属細菌から効率よく得られ、細菌由来の既知のジペプチ
ジルペプチダーゼＩＶにはない熱安定性の高さと至適ｐ
Ｈの範囲が広いという性質を兼ね備えている。そのた
め、この酵素はプロリダーゼ等との併用によりタンパク
質の高分解、高度利用等、その用途は極めて広い。
トモナス・マルトフィリアを培養して得られる新規ジペ
プチジルペプチダーゼＩＶ及び該酵素の製造方法の提供
である。 【効果】 本発明により得られる新規ジペプチジルペプ
チダーゼＩＶは従来報告されていない、キサントモナス
属細菌から効率よく得られ、細菌由来の既知のジペプチ
ジルペプチダーゼＩＶにはない熱安定性の高さと至適ｐ
Ｈの範囲が広いという性質を兼ね備えている。そのた
め、この酵素はプロリダーゼ等との併用によりタンパク
質の高分解、高度利用等、その用途は極めて広い。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は微生物の培養物に含
まれる新規ジペプチジルペプチダーゼＩＶ及びその製造
方法に関する。
まれる新規ジペプチジルペプチダーゼＩＶ及びその製造
方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】これまで多くのジペプチジルペプチダー
ゼＩＶが精製され、酵素学的性質が解明されてきた。例
えば、ラット肝（Ｈｏｐｓｕ−Ｈａｖｕ，Ｖ．Ｋ．＆
Ｇｌｅｎｎｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．７，
１９７−２０１（１９６６）），ブタ腎臓（Ｂａｒｔ
ｈ，Ａ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｈ．，＆ Ｎｅｕｂｅｒｔ，
Ｋ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，
１５７−１７４（１９７４）），小腸（Ｓｖｅｎｓｓｏ
ｎ，Ｂ．，Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｓｔａｕｎ，
Ｍ．，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｏ．，＆
Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，Ｈ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９０，４８９−４９８（１９７８）），肝臓（Ｆｕ
ｋａｓａｗａ，Ｋ．Ｍ．，Ｆｕｋａｓａｗａ，Ｋ．，Ｈ
ｉｒａｏｋａ，Ｂ．Ｙ．，＆ Ｈａｒａｄａ，Ｍ．，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６５７，１
７９−１８９（１９８１）），ヒト顎下腺（Ｏｙａ，
Ｈ．，Ｎａｇａｔｓｕ，Ｉ．，＆ Ｎａｇａｔｓｕ，
Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２５
８，５９１−５９９（１９７２）），ヒツジ腎臓（Ｙｏ
ｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．＆ Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ４８５，３９１−
４０１（１９７７），Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｆｉ
ｓｃｈｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｃ．，＆
Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
３，３７０８−３７１６（１９７８））、微生物（Ｆｕ
ｋｕｓａｗａ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｈａｒａｄａ，Ｍ．，Ａｒ
ｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２１０，２３
０−２３７（１９８１），Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．＆
Ｔｓｕｒｕ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１，１８
９９−１９０６（１９８２））等のジペプチジルペプチ
ダーゼＩＶの存在が知られている。
ゼＩＶが精製され、酵素学的性質が解明されてきた。例
えば、ラット肝（Ｈｏｐｓｕ−Ｈａｖｕ，Ｖ．Ｋ．＆
Ｇｌｅｎｎｅｒ，Ｇ．Ｇ．，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．７，
１９７−２０１（１９６６）），ブタ腎臓（Ｂａｒｔ
ｈ，Ａ．，Ｓｃｈｕｌｚ，Ｈ．，＆ Ｎｅｕｂｅｒｔ，
Ｋ．，Ａｃｔａ Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３２，
１５７−１７４（１９７４）），小腸（Ｓｖｅｎｓｓｏ
ｎ，Ｂ．，Ｄａｎｉｅｌｓｅｎ，Ｍ．，Ｓｔａｕｎ，
Ｍ．，Ｊｅｐｐｅｓｅｎ，Ｌ．，Ｎｏｒｅｎ，Ｏ．，＆
Ｓｊｏｓｔｒｏｍ，Ｈ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．９０，４８９−４９８（１９７８）），肝臓（Ｆｕ
ｋａｓａｗａ，Ｋ．Ｍ．，Ｆｕｋａｓａｗａ，Ｋ．，Ｈ
ｉｒａｏｋａ，Ｂ．Ｙ．，＆ Ｈａｒａｄａ，Ｍ．，Ｂ
ｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ６５７，１
７９−１８９（１９８１）），ヒト顎下腺（Ｏｙａ，
Ｈ．，Ｎａｇａｔｓｕ，Ｉ．，＆ Ｎａｇａｔｓｕ，
Ｔ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ２５
８，５９１−５９９（１９７２）），ヒツジ腎臓（Ｙｏ
ｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．＆ Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．，Ｂｉｏ
ｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ４８５，３９１−
４０１（１９７７），Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．，Ｆｉ
ｓｃｈｌ，Ｒ．Ｃ．，Ｏｒｌｏｗｓｋｉ，Ｒ．Ｃ．，＆
Ｗａｌｔｅｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５
３，３７０８−３７１６（１９７８））、微生物（Ｆｕ
ｋｕｓａｗａ，Ｋ．Ｍ．＆ Ｈａｒａｄａ，Ｍ．，Ａｒ
ｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２１０，２３
０−２３７（１９８１），Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔ．＆
Ｔｓｕｒｕ，Ｄ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１，１８
９９−１９０６（１９８２））等のジペプチジルペプチ
ダーゼＩＶの存在が知られている。
【０００３】ジペプチジルペプチダーゼＩＶの分子量に
ついて述べると、ほ乳類では２３０，０００〜２５０，
０００、一方微生物では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｉｔｉｓのそれは１２０，０００、Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍでは
１６０，０００であると報告されている。また、等電点
は、ほ乳類では約４．７、微生物ではＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓのそれは４．０、Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍで
は９．５であると報告されている。
ついて述べると、ほ乳類では２３０，０００〜２５０，
０００、一方微生物では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｉｔｉｓのそれは１２０，０００、Ｆｌａｖｏｂａ
ｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍでは
１６０，０００であると報告されている。また、等電点
は、ほ乳類では約４．７、微生物ではＳｔｒｅｐｔｏｃ
ｏｃｃｕｓ ｍｉｔｉｓのそれは４．０、Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍで
は９．５であると報告されている。
【０００４】熱安定性についてはヒツジ腎臓では７０℃
まで安定、８０℃で完全失活する。さて、酵素の大量調
製が可能な微生物の中では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓｍｉｔｉｓのそれは５０℃まで比較的安定であるが、
５５℃で完全失活してしまうので工業的規模で生産する
場合には微生物汚染の問題がある。一方、Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍで
は５０℃まで比較的安定、５５℃でも５０％の活性を有
しているため、工業的に使用する場合の酵素反応中の微
生物汚染の心配はないという利点を有している。
まで安定、８０℃で完全失活する。さて、酵素の大量調
製が可能な微生物の中では、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ
ｓｍｉｔｉｓのそれは５０℃まで比較的安定であるが、
５５℃で完全失活してしまうので工業的規模で生産する
場合には微生物汚染の問題がある。一方、Ｆｌａｖｏｂ
ａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍで
は５０℃まで比較的安定、５５℃でも５０％の活性を有
しているため、工業的に使用する場合の酵素反応中の微
生物汚染の心配はないという利点を有している。
【０００５】至適ｐＨについては、ほ乳類ではｐＨ８．
７、微生物のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉ
ｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍではｐＨ７．４〜７．８とその
幅はかなり狭い。一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｉｔｉｓのそれはｐＨ６．０〜８．７と広いため汎用
性が高いと考えられる。
７、微生物のＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｅｎｉ
ｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍではｐＨ７．４〜７．８とその
幅はかなり狭い。一方、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ
ｍｉｔｉｓのそれはｐＨ６．０〜８．７と広いため汎用
性が高いと考えられる。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】ロイシンアミノペプチ
ダーゼのように基質特異性が広いアミノペプチダーゼは
アミノ末端からアミノ酸を連続的に加水分解していく
が、プロリンへと続く残基を認識すると、その反応は停
止しＸ−Ｐｒｏ−Ｙ（Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸）の結合
を持ったペプチドが残存してしまう。そこで、プロリダ
ーゼの基質となるＸ−Ｐｒｏを遊離するジペプチジルペ
プチダーゼＩＶが得られれば、タンパク質の高分解、高
度利用が可能となる。従って、酵素の大量調製が比較的
容易な細菌からジペプチジルペプチダーゼＩＶを得るこ
とが強く待ち望まれている。
ダーゼのように基質特異性が広いアミノペプチダーゼは
アミノ末端からアミノ酸を連続的に加水分解していく
が、プロリンへと続く残基を認識すると、その反応は停
止しＸ−Ｐｒｏ−Ｙ（Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸）の結合
を持ったペプチドが残存してしまう。そこで、プロリダ
ーゼの基質となるＸ−Ｐｒｏを遊離するジペプチジルペ
プチダーゼＩＶが得られれば、タンパク質の高分解、高
度利用が可能となる。従って、酵素の大量調製が比較的
容易な細菌からジペプチジルペプチダーゼＩＶを得るこ
とが強く待ち望まれている。
【０００７】しかしながら、上述のように、工業的に使
用する場合、酵素反応中の微生物汚染防止のために比較
的熱安定性が高く、しかも汎用性を高めるため至適ｐＨ
の範囲が広いという性質を兼ね備えている細菌由来のジ
ペプチジルペプチダーゼＩＶは、これまでに存在しなか
った。これ故、本発明の目的は比較的熱安定性が高く、
至適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備た細菌由来の
ジペプチジルペプチダーゼＩＶを大量に提供することで
ある。
用する場合、酵素反応中の微生物汚染防止のために比較
的熱安定性が高く、しかも汎用性を高めるため至適ｐＨ
の範囲が広いという性質を兼ね備えている細菌由来のジ
ペプチジルペプチダーゼＩＶは、これまでに存在しなか
った。これ故、本発明の目的は比較的熱安定性が高く、
至適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備た細菌由来の
ジペプチジルペプチダーゼＩＶを大量に提供することで
ある。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、すでにＧ
ｌｙ−Ｐｒｏを分解することのできるプロリダーゼ活性
細菌として分離したキサントモナス・マルトフィリア
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６）に比較的熱安定性が高
く、至適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備えたジペ
プチジルペプチダーゼＩＶ活性のあることを見出し、そ
の酵素的諸性質を明らかにすると共に、製造方法を確立
して、本発明を完成するに至らしめた。即ち、本発明は
スクリーニングによって得られたキサントモナス・マル
トフィリアに由来し、下記の性質を有するジペプチジル
ペプチダーゼＩＶである。
ｌｙ−Ｐｒｏを分解することのできるプロリダーゼ活性
細菌として分離したキサントモナス・マルトフィリア
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６）に比較的熱安定性が高
く、至適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備えたジペ
プチジルペプチダーゼＩＶ活性のあることを見出し、そ
の酵素的諸性質を明らかにすると共に、製造方法を確立
して、本発明を完成するに至らしめた。即ち、本発明は
スクリーニングによって得られたキサントモナス・マル
トフィリアに由来し、下記の性質を有するジペプチジル
ペプチダーゼＩＶである。
【０００９】
【発明の実施の形態】以下に、本発明を詳細に説明す
る。本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶは以下の特
徴を示す。 １）作用 ｐＨ６．０〜１０．５の間においてアミノ基末端から２
番目にプロリン又はアラニンを持つペプチドに特異的に
働き、ペプチド結合を加水分解してカルボキシル基末端
にプロリンを持つジペプチドを遊離せしめる。 ２）基質特異性 アミノ末端から２番目にプロリン叉はアラニンを有する
ペプチド及びその誘導体に対して加水分解能を示す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適ｐＨは６．０〜１０．０である。 ４）安定ｐＨ範囲 ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適温度は４０〜６０℃である。 ６）安定温度範囲 約３５〜５５℃の範囲で安定である。 ７）阻害剤 Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄ
ａｔｅで活性が阻害される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると１５０，０００〜１７０，００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると７５，０００〜９０，０００である。 ９）金属イオンの影響 ＨｇＣｌ2で活性が阻害される。
る。本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶは以下の特
徴を示す。 １）作用 ｐＨ６．０〜１０．５の間においてアミノ基末端から２
番目にプロリン又はアラニンを持つペプチドに特異的に
働き、ペプチド結合を加水分解してカルボキシル基末端
にプロリンを持つジペプチドを遊離せしめる。 ２）基質特異性 アミノ末端から２番目にプロリン叉はアラニンを有する
ペプチド及びその誘導体に対して加水分解能を示す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適ｐＨは６．０〜１０．０である。 ４）安定ｐＨ範囲 ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適温度は４０〜６０℃である。 ６）安定温度範囲 約３５〜５５℃の範囲で安定である。 ７）阻害剤 Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄ
ａｔｅで活性が阻害される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると１５０，０００〜１７０，００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると７５，０００〜９０，０００である。 ９）金属イオンの影響 ＨｇＣｌ2で活性が阻害される。
【００１０】本発明のもう一つ態様は、キサントモナス
・マルトフィリアを培養して、培地中に目的とするジペ
プチジルペプチダーゼＩＶを生成、蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするキサントモナス・マルトフィ
リア由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造方法で
ある。以下にその製造方法を詳述する。
・マルトフィリアを培養して、培地中に目的とするジペ
プチジルペプチダーゼＩＶを生成、蓄積せしめ、これを
採取することを特徴とするキサントモナス・マルトフィ
リア由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造方法で
ある。以下にその製造方法を詳述する。
【００１１】本発明者らは普通ブイヨン培地（極東製薬
工業（株）製）に終濃度２％になるように寒天を加えて
調製したプレートを用いて、種々の微生物から高プロリ
ダーゼ活性菌株を自然界より取得した。その結果、キサ
ントモナス・マルトフィリア（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８
６）がプロリダーゼを生成、蓄積していることを発見し
た。同時に本菌株のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性
を測定したところ、目的とするジペプチジルペプチダー
ゼＩＶをも発見した。尚、ジペプチジルペプチダーゼＩ
Ｖ活性は芳本らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１．，
１８９９−１９０６（１９８２））により測定した。
工業（株）製）に終濃度２％になるように寒天を加えて
調製したプレートを用いて、種々の微生物から高プロリ
ダーゼ活性菌株を自然界より取得した。その結果、キサ
ントモナス・マルトフィリア（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８
６）がプロリダーゼを生成、蓄積していることを発見し
た。同時に本菌株のジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性
を測定したところ、目的とするジペプチジルペプチダー
ゼＩＶをも発見した。尚、ジペプチジルペプチダーゼＩ
Ｖ活性は芳本らの方法（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９１．，
１８９９−１９０６（１９８２））により測定した。
【００１２】さて、キサントモナス・マルトフィリア
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６）の培養に用いられる栄養
培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、補助因子などから
なる通常の培地であり、炭素源としてはグルコース、マ
ルトース、フラクトース、シュクロース、乳糖、澱粉な
どが単独又は組み合わせて用いられる。窒素源としては
ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、カゼイン、
不溶性コラーゲン、大豆蛋白などが、無機塩類としては
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、リン酸水
素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどが、また補
助因子としては肉エキス、コーンスティープリカーなど
が使用される。これらの成分のうち、肉エキス１％、ポ
リペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．０）の培
地が好適である。
（ＦＥＲＭ Ｐ−１４９８６）の培養に用いられる栄養
培地は、炭素源、窒素源、無機塩類、補助因子などから
なる通常の培地であり、炭素源としてはグルコース、マ
ルトース、フラクトース、シュクロース、乳糖、澱粉な
どが単独又は組み合わせて用いられる。窒素源としては
ペプトン、酵母エキス、硫酸アンモニウム、カゼイン、
不溶性コラーゲン、大豆蛋白などが、無機塩類としては
塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、リン酸水
素二ナトリウム、リン酸二水素カリウムなどが、また補
助因子としては肉エキス、コーンスティープリカーなど
が使用される。これらの成分のうち、肉エキス１％、ポ
リペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％（ｐＨ７．０）の培
地が好適である。
【００１３】本発明のジペプチジルペプチダーゼＩＶを
生産するための微生物の培養条件は、通常の好気的培養
条件でよく、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．
５〜７．５、温度２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜
３５℃、培養時間１０〜３６時間、好ましくは１２〜２
５時間が適当である。また、本発明のジペプチジルペプ
チダーゼＩＶは、培養物をそのままジペプチジルペプチ
ダーゼＩＶ源として用いることができるが、本発明の方
法により分離採取する事により、酵素の比活性は著しく
増大し、安定性も高くなる。尚、本発明のジペプチジル
ペプチダーゼＩＶは、上記した方法により製造されるも
のに限定されず、発現ベクターに接続された該酵素の遺
伝子が導入された大腸菌、枯草菌、酵母などによる組換
えＤＮＡ法によって生産することも可能である。いずれ
の方法で生産された酵素も同程度の効果を期待すること
ができる。また、酵素の精製法も限定されず、通常行わ
れてイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手法
を適宜組み合わせて行えばよい。
生産するための微生物の培養条件は、通常の好気的培養
条件でよく、ｐＨ６．０〜８．０、好ましくはｐＨ６．
５〜７．５、温度２０℃〜４５℃、好ましくは３０℃〜
３５℃、培養時間１０〜３６時間、好ましくは１２〜２
５時間が適当である。また、本発明のジペプチジルペプ
チダーゼＩＶは、培養物をそのままジペプチジルペプチ
ダーゼＩＶ源として用いることができるが、本発明の方
法により分離採取する事により、酵素の比活性は著しく
増大し、安定性も高くなる。尚、本発明のジペプチジル
ペプチダーゼＩＶは、上記した方法により製造されるも
のに限定されず、発現ベクターに接続された該酵素の遺
伝子が導入された大腸菌、枯草菌、酵母などによる組換
えＤＮＡ法によって生産することも可能である。いずれ
の方法で生産された酵素も同程度の効果を期待すること
ができる。また、酵素の精製法も限定されず、通常行わ
れてイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過等の手法
を適宜組み合わせて行えばよい。
【００１４】
【実施例】以下、実施例により本発明のキサントモナス
・マルトフィリア （ＦＥＲＭＰー１４９８６）の分
離、該細菌由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造
方法、及び性質について示す。
・マルトフィリア （ＦＥＲＭＰー１４９８６）の分
離、該細菌由来のジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造
方法、及び性質について示す。
【００１５】（実施例１）：キサントモナス・マルトフ
ィリア （Xanthomonas maltophiliaAJ 13127,ＦＥＲＭ
Ｐー１４９８６）の分離 常法に従い、普通ブイヨン培地（極東製薬工業（株）社
製）に終濃度２％になるように寒天を加えて調製したプ
レート（ｐＨ７．０）上に、土壌を滅菌水にて懸濁した
懸濁液を塗り広げ、３０℃においてコロニーを約５００
個形成させた。これらのコロニーを９６穴プレートに接
種培養し、プロリダーゼ活性の測定を行った。その結
果、プロリダーゼ活性を示す１株、ＫＳ−３株を得た。
さらに、プロリダーゼ活性を有する微生物は、プロリダ
ーゼの基質を提供するジペプチジルペプチダーゼＩＶ活
性を有するという仮説の下、ジペプチジルペプチダーゼ
ＩＶ活性を測定したところ、同菌株にジペプチジルペプ
チダーゼＩＶ活性を確認した。本菌は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。尚、寄託番号はＦ
ＥＲＭ Ｐー１４９８６である。
ィリア （Xanthomonas maltophiliaAJ 13127,ＦＥＲＭ
Ｐー１４９８６）の分離 常法に従い、普通ブイヨン培地（極東製薬工業（株）社
製）に終濃度２％になるように寒天を加えて調製したプ
レート（ｐＨ７．０）上に、土壌を滅菌水にて懸濁した
懸濁液を塗り広げ、３０℃においてコロニーを約５００
個形成させた。これらのコロニーを９６穴プレートに接
種培養し、プロリダーゼ活性の測定を行った。その結
果、プロリダーゼ活性を示す１株、ＫＳ−３株を得た。
さらに、プロリダーゼ活性を有する微生物は、プロリダ
ーゼの基質を提供するジペプチジルペプチダーゼＩＶ活
性を有するという仮説の下、ジペプチジルペプチダーゼ
ＩＶ活性を測定したところ、同菌株にジペプチジルペプ
チダーゼＩＶ活性を確認した。本菌は工業技術院生命工
学工業技術研究所に寄託されている。尚、寄託番号はＦ
ＥＲＭ Ｐー１４９８６である。
【００１６】本菌の菌学的性質を以下に示す。 （ａ）形態的性質 (1)細胞の大きさ及び形：０．４〜０．５×１．０〜
１．５μｍのかん菌（多形性はなし。） (2)グラム染色性：グラム陰性 (3)運動性の有無：３０〜３７℃で運動性有り。 (4)鞭毛の特徴：極鞭毛、複数（１〜３本）。
１．５μｍのかん菌（多形性はなし。） (2)グラム染色性：グラム陰性 (3)運動性の有無：３０〜３７℃で運動性有り。 (4)鞭毛の特徴：極鞭毛、複数（１〜３本）。
【００１７】（ｂ）栄養培地上での生育状態 (1)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ寒天平板培地：生育は中等度。コ
ロニー形態は円形、平滑、光沢あり。菌体を生理食塩水
（０．９％）に懸濁の際には、均一に分散しにくい菌体
性状を示した。 (2)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ液体培地：中等度の生育。試験管
の液面上縁に菌の凝集帯（幅〜１ｍｍ）を形成した。液
は均一に濁り、粘質性の沈澱が生じた（３０℃、２日間
培養）。 (3)ＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板：中等度の生育（３０、
３７℃）。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調
は半透明淡黄色であるが、周縁は橙色を呈す。尚、対照
菌のうちキサントモナス・マルトフィリア ＡＴＣＣ１
３６３７は生育せず。 (4)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天平板：３０℃で中等度
の生育。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調は
淡黄褐色、集落の周縁部は半透明。尚、対照菌のキサン
トモナス・マルトフィリア ＡＪ２０８２，２２２０，
２５５４はすべて、本菌とコロニー外観がきわめてよく
似ていた。培地中に塩化ナトリウムを３％添加ではこれ
らの菌は生育したが、１０％添加では生育は阻害された
（３０℃）。
ロニー形態は円形、平滑、光沢あり。菌体を生理食塩水
（０．９％）に懸濁の際には、均一に分散しにくい菌体
性状を示した。 (2)Ｎｕｔｒｉｅｎｔ液体培地：中等度の生育。試験管
の液面上縁に菌の凝集帯（幅〜１ｍｍ）を形成した。液
は均一に濁り、粘質性の沈澱が生じた（３０℃、２日間
培養）。 (3)ＭｃＣｏｎｋｅｙ寒天平板：中等度の生育（３０、
３７℃）。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調
は半透明淡黄色であるが、周縁は橙色を呈す。尚、対照
菌のうちキサントモナス・マルトフィリア ＡＴＣＣ１
３６３７は生育せず。 (4)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天平板：３０℃で中等度
の生育。コロニー形態は円形、平滑、光沢あり。色調は
淡黄褐色、集落の周縁部は半透明。尚、対照菌のキサン
トモナス・マルトフィリア ＡＪ２０８２，２２２０，
２５５４はすべて、本菌とコロニー外観がきわめてよく
似ていた。培地中に塩化ナトリウムを３％添加ではこれ
らの菌は生育したが、１０％添加では生育は阻害された
（３０℃）。
【００１８】（ｃ）保存性状 (1)Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ寒天斜面培地：８℃にて、
１カ月間保存可能であった。しかし、６カ月以上経過し
た保存スラントでは菌は死滅していた。 (2)真空凍結乾燥法：１５℃にて、１８年間保存可能で
あった。 (3)−８０℃保存法：Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ液体培地
中（８％ＤＭＳＯ添加）に凍結状態にて、１カ月間の保
存が可能であった。
１カ月間保存可能であった。しかし、６カ月以上経過し
た保存スラントでは菌は死滅していた。 (2)真空凍結乾燥法：１５℃にて、１８年間保存可能で
あった。 (3)−８０℃保存法：Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙ液体培地
中（８％ＤＭＳＯ添加）に凍結状態にて、１カ月間の保
存が可能であった。
【００１９】（ｄ）生理学的性質 (1)好気性菌である。従って嫌気的生育無し。 (2)生育温度：３０、３７℃で生育（＋）、４１℃で生
育（−）。 (3)オキシダーゼ：陽性（＋）。 (4)硝酸塩の利用性：陰性（−）。本菌はＫＮＯ3をＮ源
として利用しない。 (5)ウレアーゼ：陰性（−）。 (6)デカルボキシラーゼ：リジンデカルボキシラーゼ
（＋）、アルギニンデカルボキシラーゼ（−）、オルニ
チンデカルボキシラーゼ（−）。 (7)プロテアーゼ：カゼイン加水分解（＋）、ゼラチン
加水分解（＋）。 (8)リパーゼ活性：陽性（＋）。ツゥイーン８０に対す
る加水分解活性が認められた。 (9)糖からの酸生成（３０℃）：糖加アンモニウム培地
で以下の結果を得た。グルコース（−）、セロビオース
（−）、マルトース（＋）、フラクトース（−）、アラ
ビノース（−）、グリセロール（−）、ラクトース
（−）、トレハロース（−）、キシロース（−）。 (10)糖の資化性（３０℃）：糖加アンモニウム培地、及
び最少培地で以下の結果を得た。グルコース（＋）、セ
ロビオース（＋）、マルトース（＋）、ラクトース
（＋）、トレハロース（＋） (11)澱粉の分解性：陰性（−） (12)ＯＮＰＧテスト：陽性（＋）（３０℃の場合）、陰
性（−）（３７℃の場合） (13)クエン酸の利用性：陰性（−）（Ｓｉｍｍｏｎ’ｓ
ｃｉｔｒａｔｅ培地） (14)メチオニン要求性：寒天平板、液体培地のいずれに
ついてもＬ−Ｍｅｔ要求性を認めた。対照としたキサン
トモナス・マルトフィリア （ＡＪ２０８２，２２２
０，２５５４）は、いずれもＬ−Ｍｅｔ要求性を有して
いた（液体培養）。 (15)インドールの生成：陰性（−）（３０、３７℃）
育（−）。 (3)オキシダーゼ：陽性（＋）。 (4)硝酸塩の利用性：陰性（−）。本菌はＫＮＯ3をＮ源
として利用しない。 (5)ウレアーゼ：陰性（−）。 (6)デカルボキシラーゼ：リジンデカルボキシラーゼ
（＋）、アルギニンデカルボキシラーゼ（−）、オルニ
チンデカルボキシラーゼ（−）。 (7)プロテアーゼ：カゼイン加水分解（＋）、ゼラチン
加水分解（＋）。 (8)リパーゼ活性：陽性（＋）。ツゥイーン８０に対す
る加水分解活性が認められた。 (9)糖からの酸生成（３０℃）：糖加アンモニウム培地
で以下の結果を得た。グルコース（−）、セロビオース
（−）、マルトース（＋）、フラクトース（−）、アラ
ビノース（−）、グリセロール（−）、ラクトース
（−）、トレハロース（−）、キシロース（−）。 (10)糖の資化性（３０℃）：糖加アンモニウム培地、及
び最少培地で以下の結果を得た。グルコース（＋）、セ
ロビオース（＋）、マルトース（＋）、ラクトース
（＋）、トレハロース（＋） (11)澱粉の分解性：陰性（−） (12)ＯＮＰＧテスト：陽性（＋）（３０℃の場合）、陰
性（−）（３７℃の場合） (13)クエン酸の利用性：陰性（−）（Ｓｉｍｍｏｎ’ｓ
ｃｉｔｒａｔｅ培地） (14)メチオニン要求性：寒天平板、液体培地のいずれに
ついてもＬ−Ｍｅｔ要求性を認めた。対照としたキサン
トモナス・マルトフィリア （ＡＪ２０８２，２２２
０，２５５４）は、いずれもＬ−Ｍｅｔ要求性を有して
いた（液体培養）。 (15)インドールの生成：陰性（−）（３０、３７℃）
【００２０】（ｅ）黄色色素の産生：菌体中の黄色色素
の存在を確認した。この色素は、キサントモナジンで報
告された波長４２５〜４７５ｎｍの２つの吸収極大がな
かった。 （ｆ）キノンタイプ：ユビキノン（＋）、メナキノン
（−）。 （ｇ）菌体脂肪酸組成の分析：分岐鎖脂肪酸を検出。特
徴的な脂肪酸として、ｉｓｏ−及びａｎｔｅｉｓｏ−型
のＣ15:0脂肪酸を含んでいた。
の存在を確認した。この色素は、キサントモナジンで報
告された波長４２５〜４７５ｎｍの２つの吸収極大がな
かった。 （ｆ）キノンタイプ：ユビキノン（＋）、メナキノン
（−）。 （ｇ）菌体脂肪酸組成の分析：分岐鎖脂肪酸を検出。特
徴的な脂肪酸として、ｉｓｏ−及びａｎｔｅｉｓｏ−型
のＣ15:0脂肪酸を含んでいた。
【００２１】以上の菌学的性質をＢｅｒｇｅｙ’ｓ ｍ
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）及、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７３）、及びＩｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ２９（１９９２）の分
類基準により検索すると、本菌はキサントモナス・マル
トフィリア と同定された。
ａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ（１９８４）及、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏ
ｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ
Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（１９７３）、及びＩｄｅ
ｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ａｐ
ｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍ
ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ２９（１９９２）の分
類基準により検索すると、本菌はキサントモナス・マル
トフィリア と同定された。
【００２２】（実施例２）：キサントモナス・マルトフ
ィリア 由来ジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造法及
び性質 肉エキス１％、ポリペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％を
含む培地（ｐＨ７．０）５ｍｌに上記キサントモナス・
マルトフィリア ＦＥＲＭ Ｐー１４９８６を接種し、
３０℃で２４時間前培養を行ったものを種菌として生産
培地に植菌し（１％）、３０℃で１２時間培養した。そ
の後、得られた培養液１２Ｌを８０００ｒｐｍで３０分
間、遠心分離することによりジペプチジルペプチダーゼ
ＩＶを含む菌体を得た。
ィリア 由来ジペプチジルペプチダーゼＩＶの製造法及
び性質 肉エキス１％、ポリペプトン１％、ＮａＣｌ０．５％を
含む培地（ｐＨ７．０）５ｍｌに上記キサントモナス・
マルトフィリア ＦＥＲＭ Ｐー１４９８６を接種し、
３０℃で２４時間前培養を行ったものを種菌として生産
培地に植菌し（１％）、３０℃で１２時間培養した。そ
の後、得られた培養液１２Ｌを８０００ｒｐｍで３０分
間、遠心分離することによりジペプチジルペプチダーゼ
ＩＶを含む菌体を得た。
【００２３】本菌体を５ｍＭ ＥＤＴＡを含む０．１Ｍ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し
た後、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、Ｄ
ｙｎｏ−Ｍｉｌｌにより菌体を破砕した。菌体破砕物を
８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清に４
０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、さら
に８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。その上清
を４０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ＨＷ６５Ｃカラムにアプラ
イした。４０％から０％の硫酸アンモニウムの減少によ
り溶出されたジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性画分を
集め、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈澱を
５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラムにより脱塩を行い、同緩衝液にて平衡化
したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラムに
アプライした。未吸着の活性画分を集めて限外濾過膜に
より濃縮後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムにアプ
ライした。溶出は、１０ｍＭから５００ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）の濃度勾配により行い精製ジペプチ
ジルペプチダーゼＩＶを得た。次に、得られた精製プロ
リダーゼを用いて本酵素の諸性質について検討を行っ
た。
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し
た後、０．１％ＳＤＳ、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍ
ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）に懸濁し、Ｄ
ｙｎｏ−Ｍｉｌｌにより菌体を破砕した。菌体破砕物を
８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、その上清に４
０％飽和になるように硫酸アンモニウムを添加し、さら
に８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。その上清
を４０％硫酸アンモニウム、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡
化したＴｏｙｏｐｅａｒｌ−ＨＷ６５Ｃカラムにアプラ
イした。４０％から０％の硫酸アンモニウムの減少によ
り溶出されたジペプチジルペプチダーゼＩＶ活性画分を
集め、８０％飽和になるように硫酸アンモニウムを加
え、８，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。沈澱を
５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．０）に溶解した後、Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５カラムにより脱塩を行い、同緩衝液にて平衡化
したＤＥＡＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ ６５０Ｃカラムに
アプライした。未吸着の活性画分を集めて限外濾過膜に
より濃縮後、１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．
０）で平衡化したヒドロキシルアパタイトカラムにアプ
ライした。溶出は、１０ｍＭから５００ｍＭのリン酸緩
衝液（ｐＨ８．０）の濃度勾配により行い精製ジペプチ
ジルペプチダーゼＩＶを得た。次に、得られた精製プロ
リダーゼを用いて本酵素の諸性質について検討を行っ
た。
【００２４】本発明の新規ジペプチジルペプチダーゼＩ
Ｖの性状は次の如くである。 （１）作用 ｐＨ６．０〜１０．５の間においてアミノ基末端から２
番目にプロリン又はアラニンを持つペプチドに特異的に
働き、ペプチド結合を加水分解してカルボキシル基末端
にプロリンを持つジペプチドを遊離せしめる。 （２）基質特異性 低分子合成基質を用いた場合の基質特異性を下記の表１
に示す。用いた基質はすべて０．５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ等である。下記の
表１から分かるように、本酵素はアミノ末端から２番目
にプロリン叉はアラニンを有するペプチド及びその誘導
体に対して加水分解能を示す。
Ｖの性状は次の如くである。 （１）作用 ｐＨ６．０〜１０．５の間においてアミノ基末端から２
番目にプロリン又はアラニンを持つペプチドに特異的に
働き、ペプチド結合を加水分解してカルボキシル基末端
にプロリンを持つジペプチドを遊離せしめる。 （２）基質特異性 低分子合成基質を用いた場合の基質特異性を下記の表１
に示す。用いた基質はすべて０．５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒ
ｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅ等である。下記の
表１から分かるように、本酵素はアミノ末端から２番目
にプロリン叉はアラニンを有するペプチド及びその誘導
体に対して加水分解能を示す。
【００２５】
【表１】
【００２６】３）至適ｐＨ 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適ｐＨは６．０〜１０．０である。 ４）ｐＨ安定性 ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適温度は４０〜６０℃である。 ６）温度安定性 ｐＨ８．０で各温度に６０分間保温した後、Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅを基質に用いて
残存活性を測定したところ、５０％の残存活性を有する
温度範囲は約３５〜５５℃であった。 ７）金属イオンの影響 本酵素の基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈ
ｙｌａｍｉｄｅを用いた場合の金属イオンの影響を下記
の表２に示した。用いた金属はすべて１ｍＭのＨｇＣｌ
2，ＺｎＣｌ2等である。表２から分かるように、本酵素
はＨｇＣｌ2でほぼ完全に活性が阻害された。
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適ｐＨは６．０〜１０．０である。 ４）ｐＨ安定性 ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適温度は４０〜６０℃である。 ６）温度安定性 ｐＨ８．０で各温度に６０分間保温した後、Ｇｌｙ−Ｐ
ｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅを基質に用いて
残存活性を測定したところ、５０％の残存活性を有する
温度範囲は約３５〜５５℃であった。 ７）金属イオンの影響 本酵素の基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈ
ｙｌａｍｉｄｅを用いた場合の金属イオンの影響を下記
の表２に示した。用いた金属はすべて１ｍＭのＨｇＣｌ
2，ＺｎＣｌ2等である。表２から分かるように、本酵素
はＨｇＣｌ2でほぼ完全に活性が阻害された。
【００２７】
【表２】
【００２８】８）阻害剤 本酵素を各プロテアーゼ阻害剤存在下において、Ｇｌｙ
−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅを基質に用
いて相対活性を測定した。その結果を下記の表３に示し
た。表３から分かるように、本酵素はＤｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄａｔｅによりほぼ
完全に活性が阻害された。
−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅを基質に用
いて相対活性を測定した。その結果を下記の表３に示し
た。表３から分かるように、本酵素はＤｉｉｓｏｐｒｏ
ｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄａｔｅによりほぼ
完全に活性が阻害された。
【００２９】
【表３】
【００３０】９）分子量 ゲル濾過法で測定すると１５０，０００〜１７０，００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると７５，０００〜９０，０００である。 １０）力価測定法 前述のＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄ
ｅを基質とし、５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌに０．１ｍ
ｌの５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａ
ｍｉｄｅと０．１ｍｌの酵素液を加え、３７℃で５分間
反応させた後、０．５ｍｌのＦａｓｔＧａｒｎｅｔ Ｇ
ＢＣ（１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して０．１％としたも
の）を添加して反応を停止させ、５５０ｎｍの吸光度を
測定する。
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると７５，０００〜９０，０００である。 １０）力価測定法 前述のＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄ
ｅを基質とし、５ｍＭＥＤＴＡを含む２０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０）０．８ｍｌに０．１ｍ
ｌの５ｍＭ Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａ
ｍｉｄｅと０．１ｍｌの酵素液を加え、３７℃で５分間
反応させた後、０．５ｍｌのＦａｓｔＧａｒｎｅｔ Ｇ
ＢＣ（１０％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含む１Ｍ酢
酸緩衝液（ｐＨ４．０）に溶解して０．１％としたも
の）を添加して反応を停止させ、５５０ｎｍの吸光度を
測定する。
【００３１】
【発明の効果】本発明により得られる新規ジペプチジル
ペプチダーゼＩＶは従来報告されていないキサントモナ
ス属細菌から効率よく得られ、細菌由来の既知のジペプ
チジルペプチダーゼＩＶにはない、熱安定性の高さと至
適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備えている、極め
て工業的に利用し易い酵素である。従って、この酵素は
プロリダーゼ等との併用でタンパク質の高分解、高度利
用等、その用途は極めて広いものと考えられる。
ペプチダーゼＩＶは従来報告されていないキサントモナ
ス属細菌から効率よく得られ、細菌由来の既知のジペプ
チジルペプチダーゼＩＶにはない、熱安定性の高さと至
適ｐＨの範囲が広いという性質を兼ね備えている、極め
て工業的に利用し易い酵素である。従って、この酵素は
プロリダーゼ等との併用でタンパク質の高分解、高度利
用等、その用途は極めて広いものと考えられる。
Claims (2)
- 【請求項１】 キサントモナス・マルトフィリア由来の
下記の性質を有するジペプチジルペプチダーゼＩＶ。 １）作用 ｐＨ６．０〜１０．５の間においてアミノ基末端から２
番目にプロリン又はアラニンを持つペプチドに特異的に
働き、ペプチド結合を加水分解してカルボキシル基末端
にプロリン又はアラニンを持つジペプチドを遊離せしめ
る。 ２）基質特異性 アミノ末端から２番目にプロリン叉はアラニンを有する
ペプチド及びその誘導体に対して加水分解能を示す。 ３）至適ｐＨ 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適ｐＨは６．０〜１０．０である。 ４）安定ｐＨ範囲 ｐＨ７．０〜９．０の範囲で安定である。 ５）作用至適温度 基質としてＧｌｙ−Ｐｒｏ−β−ｎａｐｈｔｈｙｌａｍ
ｉｄｅ及びＧｌｙ−Ｐｒｏ−ｐ−ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉ
ｄｅを用いた時の至適温度は４０〜６０℃である。 ６）安定温度範囲 ３５〜５５℃の範囲で安定である。 ７）阻害剤 Ｄｉｉｓｏｐｒｏｐｙｌｐｈｏｓｐｈｏｆｌｕｏｒｉｄ
ａｔｅで活性が阻害される。 ８）分子量 ゲル濾過法で測定すると１５０，０００〜１７０，００
０である。ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
測定すると７５，０００〜９０，０００である。 ９）金属イオンの影響 ＨｇＣｌ2で活性が阻害される。 - 【請求項２】 キサントモナス・マルトフィリアを培養
して、培地中に目的とするジペプチジルペプチダーゼＩ
Ｖを生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とす
るキサントモナス・マルトフィリア由来のジペプチジル
ペプチダーゼＩＶの製造方法。
Priority Applications (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7185811A JPH0928376A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | 新規ジペプチジルペプチダーゼｉｖとその製造方法 |
| EP96111691A EP0754752B1 (en) | 1995-07-21 | 1996-07-19 | Dipeptidyl peptidase IV and process for producing the same |
| ES96111691T ES2193216T3 (es) | 1995-07-21 | 1996-07-19 | Dipeptidil peptidasa iv y su procedimiento de preparacion. |
| US08/684,480 US5811278A (en) | 1995-07-21 | 1996-07-19 | Dipeptidyl peptidase IV from Xanthomonas maltophilia and process for producing the same |
| DE69626895T DE69626895T2 (de) | 1995-07-21 | 1996-07-19 | Dipeptidyl-Peptidase IV und Herstellungsverfahren dafür |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7185811A JPH0928376A (ja) | 1995-07-21 | 1995-07-21 | 新規ジペプチジルペプチダーゼｉｖとその製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
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