JPH07289256A - アミノペプチダーゼおよびその生産方法 - Google Patents
アミノペプチダーゼおよびその生産方法Info
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- JPH07289256A JPH07289256A JP8335894A JP8335894A JPH07289256A JP H07289256 A JPH07289256 A JP H07289256A JP 8335894 A JP8335894 A JP 8335894A JP 8335894 A JP8335894 A JP 8335894A JP H07289256 A JPH07289256 A JP H07289256A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 高い基質特異性を有するアラニンアミノペプ
チダーゼおよびその安価で大量な生産方法を提供する。 【構成】 Aeromonas属に属する新菌株から、以下の特
性： 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する； 至適ｐＨ：約６.５； 安定ｐＨ範囲：４℃で５時間処理する場合において、
ｐＨ7.0〜10.0； 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である； 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：L-アラニン残基に対して高い特異性を有
する；および 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する；を、有するアラニン
アミノペプチダーゼを見いだした。本菌の培養により、
本ペプチダーゼが、安価に大量に提供され得る。
チダーゼおよびその安価で大量な生産方法を提供する。 【構成】 Aeromonas属に属する新菌株から、以下の特
性： 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する； 至適ｐＨ：約６.５； 安定ｐＨ範囲：４℃で５時間処理する場合において、
ｐＨ7.0〜10.0； 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である； 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：L-アラニン残基に対して高い特異性を有
する；および 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する；を、有するアラニン
アミノペプチダーゼを見いだした。本菌の培養により、
本ペプチダーゼが、安価に大量に提供され得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、アラニン特異的アミノ
ペプチダーゼおよびこのようなペプチダーゼを細菌培養
物から生産する方法に関する。
ペプチダーゼおよびこのようなペプチダーゼを細菌培養
物から生産する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】食用肉の保存中に生じる遊離アミノ酸が
保存肉質の味、風味を向上することが知られている（Ni
shimuraら、Agric.Biol.Chem.、52、2323(1988)）。こ
のような遊離アミノ酸は、肉質中に存在するアミノペプ
チダーゼのエキソプロテオリシスにより生成される。従
って、このようなアミノペプチダーゼは、食肉加工分野
において、肉質の改善、うま味の向上などの手段として
有用である。
保存肉質の味、風味を向上することが知られている（Ni
shimuraら、Agric.Biol.Chem.、52、2323(1988)）。こ
のような遊離アミノ酸は、肉質中に存在するアミノペプ
チダーゼのエキソプロテオリシスにより生成される。従
って、このようなアミノペプチダーゼは、食肉加工分野
において、肉質の改善、うま味の向上などの手段として
有用である。
【０００３】従来から、この目的に用いる酵素として種
々の動物に由来するアラニンアミノペプチダーゼが知ら
れている。例えば、沖アミ（Kimotoら、Agric.Biol.Che
m.、48(7)、1819(1984)）、ボラ（Chiouら、Agric.Bio
l.Chem.、52(1)、235(1988)）、アラスカタラ（Chiou
ら、J. Biochem.、105、505(1989)）、ウサギの骨格筋
（Nishimuraら、Agric.Biol.Chem.、52(9)、2183(198
8)）、あるいは牛、豚、および鶏の骨格筋（Nishimoto
ら、Agric.Biol.Chem.、54(11)、2769(1990)）に由来す
るアラニンアミノペプチダーゼが知られている。これら
の酵素は特にアラニン残基に対して親和性が高いという
特徴がある。
々の動物に由来するアラニンアミノペプチダーゼが知ら
れている。例えば、沖アミ（Kimotoら、Agric.Biol.Che
m.、48(7)、1819(1984)）、ボラ（Chiouら、Agric.Bio
l.Chem.、52(1)、235(1988)）、アラスカタラ（Chiou
ら、J. Biochem.、105、505(1989)）、ウサギの骨格筋
（Nishimuraら、Agric.Biol.Chem.、52(9)、2183(198
8)）、あるいは牛、豚、および鶏の骨格筋（Nishimoto
ら、Agric.Biol.Chem.、54(11)、2769(1990)）に由来す
るアラニンアミノペプチダーゼが知られている。これら
の酵素は特にアラニン残基に対して親和性が高いという
特徴がある。
【０００４】しかし、これらの酵素は、アラニンのみな
らずメチオニンなどの他のアミノ酸残基にも比較的高い
基質親和性を有することから酵素の基質特異性は低く、
メチオニンなどの含硫アミノ酸を遊離する難点がある。
遊離の含硫アミノ酸は味質を低下するという欠点があ
り、含硫アミノ酸を遊離しない基質特異性の高いアラニ
ンアミノペプチダーゼが望まれていた。
らずメチオニンなどの他のアミノ酸残基にも比較的高い
基質親和性を有することから酵素の基質特異性は低く、
メチオニンなどの含硫アミノ酸を遊離する難点がある。
遊離の含硫アミノ酸は味質を低下するという欠点があ
り、含硫アミノ酸を遊離しない基質特異性の高いアラニ
ンアミノペプチダーゼが望まれていた。
【０００５】また、上記従来のペプチダーゼは、海洋生
物、あるいは高等動物の体組織、代表的にはほ乳類の骨
格筋から単離されることから、安定的に大量に上記ペプ
チダーゼを提供することは困難であり、安価で大量に基
質特異性の高いアラニンアミノペプチダーゼが提供され
ることが望まれていた。
物、あるいは高等動物の体組織、代表的にはほ乳類の骨
格筋から単離されることから、安定的に大量に上記ペプ
チダーゼを提供することは困難であり、安価で大量に基
質特異性の高いアラニンアミノペプチダーゼが提供され
ることが望まれていた。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、上記従来の
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
新規なアラニンアミノペプチダーゼ、ならびに、その生
産方法を提供することである。
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
新規なアラニンアミノペプチダーゼ、ならびに、その生
産方法を提供することである。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、海洋細菌
であるAeromonas属に属する、新たに単離した菌株か
ら、新規なアラニンアミノペプチダーゼを見いだし、本
発明を完成するに至った。
であるAeromonas属に属する、新たに単離した菌株か
ら、新規なアラニンアミノペプチダーゼを見いだし、本
発明を完成するに至った。
【０００８】本発明のアラニンアミノペプチダーゼは、
次の特性を有する。 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する。 至適pH：約６.５である。 安定pH範囲：４℃で５時間処理する場合において、pH
7.0〜10.0である。 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である。 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：アラニン残基に対して高い特異性を有す
る。 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する。このことによって上
記目的が達成される。
次の特性を有する。 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する。 至適pH：約６.５である。 安定pH範囲：４℃で５時間処理する場合において、pH
7.0〜10.0である。 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である。 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：アラニン残基に対して高い特異性を有す
る。 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する。このことによって上
記目的が達成される。
【０００９】本発明の好ましいアラニンアミノペプチダ
ーゼは、チオールプロテアーゼとしての性状を包含す
る。このことによって上記目的が達成される。
ーゼは、チオールプロテアーゼとしての性状を包含す
る。このことによって上記目的が達成される。
【００１０】本発明のアラニンアミノペプチダーゼは、
Aeromonas属の細菌、特に好ましくは平成６年４月１日
に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称す
る）に寄託したAeromonas salmonicida subsp.KUPD-1
（生命研菌寄第14260号；FERMP-14260）により生産され
る。このことによって上記目的が達成される。
Aeromonas属の細菌、特に好ましくは平成６年４月１日
に工業技術院生命工学工業技術研究所（生命研と略称す
る）に寄託したAeromonas salmonicida subsp.KUPD-1
（生命研菌寄第14260号；FERMP-14260）により生産され
る。このことによって上記目的が達成される。
【００１１】上記細菌より生産される本発明のアラニン
アミノペプチダーゼの種々の特性と上記沖アミEuphausi
a superba（Kimotoら、Agric.Biol.Chem.、48(7)、1819
(1984)）、およびボラMugil cephalus（Chiouら、Agri
c.Biol.Chem.、52(1)、235(1988)）に由来する、既知の
アラニンアミノペプチダーゼの同特性との差異を表１に
示す。
アミノペプチダーゼの種々の特性と上記沖アミEuphausi
a superba（Kimotoら、Agric.Biol.Chem.、48(7)、1819
(1984)）、およびボラMugil cephalus（Chiouら、Agri
c.Biol.Chem.、52(1)、235(1988)）に由来する、既知の
アラニンアミノペプチダーゼの同特性との差異を表１に
示す。
【００１２】
【表１】
【００１３】上記特性を有する、微生物由来アラニンア
ミノペプチダーゼは、これまで知られていない。
ミノペプチダーゼは、これまで知られていない。
【００１４】本発明のアラニンアミノペプチダーゼの生
産方法は、上記生産菌を培養し、培養物より該ペプチダ
ーゼを分離精製する工程を包含する。このことによって
上記目的が達成される。
産方法は、上記生産菌を培養し、培養物より該ペプチダ
ーゼを分離精製する工程を包含する。このことによって
上記目的が達成される。
【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。
【００１６】本発明のアラニンアミノペプチダーゼは、
Aeromonas属菌、特にAeromonas salmonicida subsp.KUP
D-1（生命研菌寄第14260号；FERM P-14260）により生産
される。この菌株は、発明者らが長崎沖の海底土壌から
分離した新菌株である。上記菌株の菌学的性質を次に示
す。
Aeromonas属菌、特にAeromonas salmonicida subsp.KUP
D-1（生命研菌寄第14260号；FERM P-14260）により生産
される。この菌株は、発明者らが長崎沖の海底土壌から
分離した新菌株である。上記菌株の菌学的性質を次に示
す。
【００１７】（１）形態および培養 本発明のアラニンアミノペプチダーゼ生産菌（以下、本
菌という）は、Bergy's Manual of Systematic Bacteri
ology第２巻（Williams and Wilkins, Baltimore, 198
6）に従ってAeromonas salmonicidaと同定され、Aeromo
nas salmonicidasubsp.KUPD-1と命名した。本菌は、0.5
〜0.7μm×0.9〜1.2μmの桿菌である。本菌の菌学的性
状を表２に示す。
菌という）は、Bergy's Manual of Systematic Bacteri
ology第２巻（Williams and Wilkins, Baltimore, 198
6）に従ってAeromonas salmonicidaと同定され、Aeromo
nas salmonicidasubsp.KUPD-1と命名した。本菌は、0.5
〜0.7μm×0.9〜1.2μmの桿菌である。本菌の菌学的性
状を表２に示す。
【００１８】
【表２】
【００１９】次に、本菌から本発明のアラニンアミノペ
プチダーゼを生産するための条件について説明する。
プチダーゼを生産するための条件について説明する。
【００２０】本菌を生育させる培地としては、特に限定
されず、通常の液体培地または固体培地が用いられる。
炭素源としては、グルコース、ショ糖、糖蜜等の糖類を
用いる。窒素源としては、プロタミン、ポリペプトン、
各種大豆分解物、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素
の他、アンモニア等の無機窒素も使用し得る。必要に応
じて各種無機塩類、ビタミン類が添加され得る。本菌の
培養には、プロタミンを含ませることが好ましい。培地
のpHを、4.0〜11.0に調製し、滅菌して使用する。本菌
の最適培地を表３に示す。
されず、通常の液体培地または固体培地が用いられる。
炭素源としては、グルコース、ショ糖、糖蜜等の糖類を
用いる。窒素源としては、プロタミン、ポリペプトン、
各種大豆分解物、酵母エキス、肉エキスなどの有機窒素
の他、アンモニア等の無機窒素も使用し得る。必要に応
じて各種無機塩類、ビタミン類が添加され得る。本菌の
培養には、プロタミンを含ませることが好ましい。培地
のpHを、4.0〜11.0に調製し、滅菌して使用する。本菌
の最適培地を表３に示す。
【００２１】
【表３】
【００２２】本菌の培養温度は本菌が生育できる温度で
あれば特に制限はないが、20〜40℃、好ましくは25〜37
℃、より好ましくは30℃である。液体培養の場合は、１
〜３日間、振とうまたは通気撹拌しながら行い得る。培
養過程の菌増殖経時変化は、培養懸濁液の濁度変化（通
常はＯ.Ｄ.660の計測）をモニターして知り得る。
あれば特に制限はないが、20〜40℃、好ましくは25〜37
℃、より好ましくは30℃である。液体培養の場合は、１
〜３日間、振とうまたは通気撹拌しながら行い得る。培
養過程の菌増殖経時変化は、培養懸濁液の濁度変化（通
常はＯ.Ｄ.660の計測）をモニターして知り得る。
【００２３】（２）培養懸濁液からのアラニンアミノペ
プチダーゼの分離精製 上記培養液から本発明のアラニンアミノペプチダーゼを
分離精製するには、既知の精製法が単独もしくは併用し
て利用され得る。
プチダーゼの分離精製 上記培養液から本発明のアラニンアミノペプチダーゼを
分離精製するには、既知の精製法が単独もしくは併用し
て利用され得る。
【００２４】本発明のアラニンアミノペプチダーゼ（以
下、本ペプチダーゼという）は、菌体内部に産生、蓄積
される。従って、培養後、好ましくは対数増殖期後期の
培養液中の菌体を集め、例えば緩衝液中に懸濁して、超
音波処理などで物理的に菌体を破砕することによりある
いは細胞壁を酵素で処理して、菌体を破壊することによ
り、本ペプチダーゼが細胞から溶出され得る。次いで、
この溶出液を濾過または遠心分離にかけて菌体を除去す
る。好ましい上記除去法は超遠心分離処理である。得ら
れた上清（粗酵素液）を、硫安分画（塩析）、透析、各
種クロマトグラフィー、ゲル濾過などの一般的な酵素の
精製工程を行うことにより、本ペプチダーゼが精製され
得る。例えば、上記得られた上清を硫安分画後、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過に順次供試するこ
とにより、精製された高活性の本ペプチダーゼを含有す
る画分が得られる。
下、本ペプチダーゼという）は、菌体内部に産生、蓄積
される。従って、培養後、好ましくは対数増殖期後期の
培養液中の菌体を集め、例えば緩衝液中に懸濁して、超
音波処理などで物理的に菌体を破砕することによりある
いは細胞壁を酵素で処理して、菌体を破壊することによ
り、本ペプチダーゼが細胞から溶出され得る。次いで、
この溶出液を濾過または遠心分離にかけて菌体を除去す
る。好ましい上記除去法は超遠心分離処理である。得ら
れた上清（粗酵素液）を、硫安分画（塩析）、透析、各
種クロマトグラフィー、ゲル濾過などの一般的な酵素の
精製工程を行うことにより、本ペプチダーゼが精製され
得る。例えば、上記得られた上清を硫安分画後、陰イオ
ン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過に順次供試するこ
とにより、精製された高活性の本ペプチダーゼを含有す
る画分が得られる。
【００２５】（３）本ペプチダーゼ活性の測定 本願発明においては、本ペプチダーゼ活性は、Ｌ−アラ
ニン−β−ナフチルアミドを基質として用い、１分間に
１マイクロモルのβ−ナフチルアミンを遊離する量を１
ユニット（Ｕ）として測定する。基本的には本願におい
ては、粗酵素液、または各硫安分画液20μlを、1mMＬ−
アラニン−β−ナフチルアミド（10mMリン酸緩衝液pH6.
5）780μlに添加し、35℃で10分反応させる。次いで0.4
M塩酸/エタノールを100μl加え、室温まで冷却後、0.1
％p-ジメチルアミノケイ皮アルデヒド/エタノールを100
μl添加し、540nmの吸光度（O.D.540）を測定する。上
記粗酵素液、または各硫安分画液中のタンパク質の量も
同時に測定（Bio-rad法）される。上記540nmの吸光度か
ら計算式（O.D.540×0.56×1ml）/（0.02ml×10分×タ
ンパク濃度(mg/ml)）によりタンパク質当りの比活性
（Ｕ/mg）が計算される。
ニン−β−ナフチルアミドを基質として用い、１分間に
１マイクロモルのβ−ナフチルアミンを遊離する量を１
ユニット（Ｕ）として測定する。基本的には本願におい
ては、粗酵素液、または各硫安分画液20μlを、1mMＬ−
アラニン−β−ナフチルアミド（10mMリン酸緩衝液pH6.
5）780μlに添加し、35℃で10分反応させる。次いで0.4
M塩酸/エタノールを100μl加え、室温まで冷却後、0.1
％p-ジメチルアミノケイ皮アルデヒド/エタノールを100
μl添加し、540nmの吸光度（O.D.540）を測定する。上
記粗酵素液、または各硫安分画液中のタンパク質の量も
同時に測定（Bio-rad法）される。上記540nmの吸光度か
ら計算式（O.D.540×0.56×1ml）/（0.02ml×10分×タ
ンパク濃度(mg/ml)）によりタンパク質当りの比活性
（Ｕ/mg）が計算される。
【００２６】以下の実施例にて、本発明をさらに詳細に
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
【００２７】
【実施例】実施例１ （Aeromonas salmonicida subsp.KUPD-1の培養条件）20
mlのＬ培地（1.0％ハ゛クト-トリフ゜トン、0.5％酵母エキス、0.5
％NaCl、0.1％ブドウ糖、pH7.0）を含有する100ml容三
角フラスコにAeromonas salmonicida subsp.KUPD-1を植
菌し、30℃で24時間、150rpmで振とう培養した。次いで
この培養液を100mlのＬ培地を含有する坂口フラスコ２
本に植菌し、30℃で20時間、120rpmの振とう培養した。
この培養液（Ｏ.Ｄ.660＝８）200mlを、表３に示す最適
培地20ｌに移し、30℃、43時間、300rpmの通気条件で培
養した。
mlのＬ培地（1.0％ハ゛クト-トリフ゜トン、0.5％酵母エキス、0.5
％NaCl、0.1％ブドウ糖、pH7.0）を含有する100ml容三
角フラスコにAeromonas salmonicida subsp.KUPD-1を植
菌し、30℃で24時間、150rpmで振とう培養した。次いで
この培養液を100mlのＬ培地を含有する坂口フラスコ２
本に植菌し、30℃で20時間、120rpmの振とう培養した。
この培養液（Ｏ.Ｄ.660＝８）200mlを、表３に示す最適
培地20ｌに移し、30℃、43時間、300rpmの通気条件で培
養した。
【００２８】実施例２ （本ペプチダーゼの分離精製）上記実施例１の培養液を
集めた（80ｌ）後の菌体を遠心分離後、菌体を10mMリン
酸緩衝液(pH7)で洗浄し、同緩衝液400mlに懸濁した。こ
れを超音波破砕し、得られた破砕液を超遠心分離（105,
000×g、４℃、１時間）し、得られた上澄み液を粗酵素
液とした。この粗酵素液を、硫安濃度０〜40％、40〜50
％、50〜60％、60〜70％、および70％以上の各条件で逐
次硫安塩析し、各硫安分画液を調製した。これらの画分
の、本ペプチダーゼ活性を上記の方法で測定した。結果
を表４に示す。本ペプチダーゼは、主として40〜50％硫
安画分に存在した。
集めた（80ｌ）後の菌体を遠心分離後、菌体を10mMリン
酸緩衝液(pH7)で洗浄し、同緩衝液400mlに懸濁した。こ
れを超音波破砕し、得られた破砕液を超遠心分離（105,
000×g、４℃、１時間）し、得られた上澄み液を粗酵素
液とした。この粗酵素液を、硫安濃度０〜40％、40〜50
％、50〜60％、60〜70％、および70％以上の各条件で逐
次硫安塩析し、各硫安分画液を調製した。これらの画分
の、本ペプチダーゼ活性を上記の方法で測定した。結果
を表４に示す。本ペプチダーゼは、主として40〜50％硫
安画分に存在した。
【００２９】
【表４】
【００３０】上記実施例１の培養スケールを80lとし
て、本菌を培養後、上記と同様に粗酵素液を得た。この
粗酵素液を、硫安濃度０〜40％、40〜55％、および55〜
80％の各条件で逐次硫安塩析し、各硫安分画液を調製し
た。これらを上記と同様に本ペプチダーゼ活性測定を行
った。結果を表５に示す。本ペプチダーゼは、主として
40〜55％硫安画分に存在した。
て、本菌を培養後、上記と同様に粗酵素液を得た。この
粗酵素液を、硫安濃度０〜40％、40〜55％、および55〜
80％の各条件で逐次硫安塩析し、各硫安分画液を調製し
た。これらを上記と同様に本ペプチダーゼ活性測定を行
った。結果を表５に示す。本ペプチダーゼは、主として
40〜55％硫安画分に存在した。
【００３１】
【表５】
【００３２】実施例３ （本ペプチダーゼのクロマト精製） （１）陰イオン交換カラムクロマトグラフィー 上記40〜55％硫安画分を10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で
透析後、QA52（ワットマン社製）を担体とする陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーに供試し、さらに分画精製し
た。カラム直径1.6cm、カラム長12cmの陰イオン交換カ
ラムに、タンパク質濃度3.0mg/mlに調整した上記透析後
の溶液を、23ml添加した。10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
を用いて、流速1.3ml/分、NaCl濃度が０から0.5Ｍへの
濃度勾配で溶出し、4.0mlずつ溶出液を分画回収し、得
られた各画分を、280nm紫外吸光度に基づくタンパク質
量の測定、および本ペプチダーゼ活性の測定に供試し
た。結果を図１に示す。図中の横軸は溶出液を分画回収
した、画分番号を表す。左側縦軸は280nm紫外吸光度
（図中の○）、右側縦軸は本ペプチダーゼ活性値（Ｕ/m
l；図中の●）を表し、図中の点線および欄外の右側縦
軸は、NaClの濃度勾配（０〜0.5Ｍ）を表す。
透析後、QA52（ワットマン社製）を担体とする陰イオン交換
カラムクロマトグラフィーに供試し、さらに分画精製し
た。カラム直径1.6cm、カラム長12cmの陰イオン交換カ
ラムに、タンパク質濃度3.0mg/mlに調整した上記透析後
の溶液を、23ml添加した。10mMリン酸緩衝液（pH7.0）
を用いて、流速1.3ml/分、NaCl濃度が０から0.5Ｍへの
濃度勾配で溶出し、4.0mlずつ溶出液を分画回収し、得
られた各画分を、280nm紫外吸光度に基づくタンパク質
量の測定、および本ペプチダーゼ活性の測定に供試し
た。結果を図１に示す。図中の横軸は溶出液を分画回収
した、画分番号を表す。左側縦軸は280nm紫外吸光度
（図中の○）、右側縦軸は本ペプチダーゼ活性値（Ｕ/m
l；図中の●）を表し、図中の点線および欄外の右側縦
軸は、NaClの濃度勾配（０〜0.5Ｍ）を表す。
【００３３】使用した陰イオン交換カラムクロマトグラ
フィーは、本ペプチダーゼの精製に有効であり、本ペプ
チダーゼは0.3M-NaCl濃度付近で溶出した。精製によ
り、比活性が2.19Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得
られた。
フィーは、本ペプチダーゼの精製に有効であり、本ペプ
チダーゼは0.3M-NaCl濃度付近で溶出した。精製によ
り、比活性が2.19Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得
られた。
【００３４】（２）疎水クロマトグラフィー さらに本ペプチダーゼを精製するため、上記クロマトグ
ラフィーで得られた活性画分（図中画分No.45）を疎水
クロマトグラフィー（FPLC；Phenyl-superose充填カラ
ム、ファルマシア社製）に供試した。カラム直径５mm、カラム
長５cmのPhenyl-superose充填カラムに、タンパク質濃
度５mg/mlに調整した上記活性画分を、200μl添加し
た。10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて、流速0.5ml/
分、硫安濃度が20から０％への濃度勾配で溶出し、0.5m
lずつ溶出液を分画回収し、得られた各画分を、280nm紫
外吸光度に基づくタンパク質量の測定、および本ペプチ
ダーゼ活性の測定に供試した。結果を図２に示す。図中
の横軸は溶出液を分画回収した、画分番号を表す。左側
縦軸は280nm紫外吸光度（図中の●）、右側縦軸は本ペ
プチダーゼ活性値（Ｕ/ml；図中の○）を表し、図中の
点線および欄外の右側縦軸は、硫安の濃度勾配（20〜０
％）を表す。
ラフィーで得られた活性画分（図中画分No.45）を疎水
クロマトグラフィー（FPLC；Phenyl-superose充填カラ
ム、ファルマシア社製）に供試した。カラム直径５mm、カラム
長５cmのPhenyl-superose充填カラムに、タンパク質濃
度５mg/mlに調整した上記活性画分を、200μl添加し
た。10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて、流速0.5ml/
分、硫安濃度が20から０％への濃度勾配で溶出し、0.5m
lずつ溶出液を分画回収し、得られた各画分を、280nm紫
外吸光度に基づくタンパク質量の測定、および本ペプチ
ダーゼ活性の測定に供試した。結果を図２に示す。図中
の横軸は溶出液を分画回収した、画分番号を表す。左側
縦軸は280nm紫外吸光度（図中の●）、右側縦軸は本ペ
プチダーゼ活性値（Ｕ/ml；図中の○）を表し、図中の
点線および欄外の右側縦軸は、硫安の濃度勾配（20〜０
％）を表す。
【００３５】使用した疎水クロマトグラフィーは、本ペ
プチダーゼの精製に有効であり、本ペプチダーゼは７％
硫安濃度付近で溶出した。本精製により、比活性が16.5
Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得られた。
プチダーゼの精製に有効であり、本ペプチダーゼは７％
硫安濃度付近で溶出した。本精製により、比活性が16.5
Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得られた。
【００３６】（３）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー さらに本ペプチダーゼを精製するため、上記疎水クロマ
トグラフィーで得られた活性画分（図中画分No.30）を
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（FPLC；Superose1
2、ファルマシア社製）に供試した。カラム直径10mm、カラム
長30cmのSuperose12充填カラムに、タンパク質濃度0.16
mg/mlに調整した上記活性画分を、200μl添加した。0.1
5M-NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて、流
速0.4ml/分で溶出し、0.4mlずつ溶出液を分画回収し、
得られた各画分を、280nm紫外吸光度に基づくタンパク
質量の測定、および本ペプチダーゼ活性の測定に供試し
た。結果を図３に示す。図中の横軸は溶出液を分画回収
した、画分番号を表す。左側縦軸は280nm紫外吸光度
（図中の○）、右側縦軸は本ペプチダーゼ活性値（Ｕ/m
l；図中の●）を表す。
トグラフィーで得られた活性画分（図中画分No.30）を
ゲル濾過カラムクロマトグラフィー（FPLC；Superose1
2、ファルマシア社製）に供試した。カラム直径10mm、カラム
長30cmのSuperose12充填カラムに、タンパク質濃度0.16
mg/mlに調整した上記活性画分を、200μl添加した。0.1
5M-NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）を用いて、流
速0.4ml/分で溶出し、0.4mlずつ溶出液を分画回収し、
得られた各画分を、280nm紫外吸光度に基づくタンパク
質量の測定、および本ペプチダーゼ活性の測定に供試し
た。結果を図３に示す。図中の横軸は溶出液を分画回収
した、画分番号を表す。左側縦軸は280nm紫外吸光度
（図中の○）、右側縦軸は本ペプチダーゼ活性値（Ｕ/m
l；図中の●）を表す。
【００３７】使用したゲル濾過カラムクロマトグラフィ
ーは、本ペプチダーゼの精製に有効であった。本ペプチ
ダーゼは画分No.30付近で溶出した。精製により、比活
性が29.9Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得られた。
ーは、本ペプチダーゼの精製に有効であった。本ペプチ
ダーゼは画分No.30付近で溶出した。精製により、比活
性が29.9Ｕ/mgタンパク質である活性画分が得られた。
【００３８】上記（１）、（２）、および（３）の各精
製工程における本発明の本ペプチダーゼの精製度および
タンパク質当りの比活性を表６に示す。
製工程における本発明の本ペプチダーゼの精製度および
タンパク質当りの比活性を表６に示す。
【００３９】
【表６】
【００４０】実施例４ （本ペプチダーゼの至適pHおよび安定pH範囲） （１）至適pH Carmody広域緩衝液により、pHを4.0から10.0まで0.5間
隔で調整した1mMのＬ−アラニン−β−ナフチルアミド
を用い、上記実施例３（３）で得られた、精製された本
ペプチダーゼの活性を測定した。結果を図４に示す。図
中の横軸は反応pHを表し、縦軸は、最大活性値を100と
した場合の相対活性（％）を表す。本ペプチダーゼの至
適pHは、6.5であることが明らかとなった。
隔で調整した1mMのＬ−アラニン−β−ナフチルアミド
を用い、上記実施例３（３）で得られた、精製された本
ペプチダーゼの活性を測定した。結果を図４に示す。図
中の横軸は反応pHを表し、縦軸は、最大活性値を100と
した場合の相対活性（％）を表す。本ペプチダーゼの至
適pHは、6.5であることが明らかとなった。
【００４１】（２）安定pH範囲 Carmody広域緩衝液により、上記実施例３（３）で得ら
れた精製された本ペプチダーゼ溶液のpHを4.0から12.0
まで0.5間隔で調整し、４℃で５時間インキュベートし
た。次いで、各pH処理液中の活性を測定した。結果を図
５に示す。図中の横軸は処理pHを表し、縦軸は、最大活
性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本ペプ
チダーゼの安定ｐＨ範囲は、約7.0から10.0であること
が明らかとなった。
れた精製された本ペプチダーゼ溶液のpHを4.0から12.0
まで0.5間隔で調整し、４℃で５時間インキュベートし
た。次いで、各pH処理液中の活性を測定した。結果を図
５に示す。図中の横軸は処理pHを表し、縦軸は、最大活
性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本ペプ
チダーゼの安定ｐＨ範囲は、約7.0から10.0であること
が明らかとなった。
【００４２】実施例５ （本ペプチダーゼの作用適温の範囲および熱安定性） （１）作用適温の範囲 上記実施例３（３）で得られた精製された本ペプチダー
ゼ活性を、種々の温度条件（20,30,35,40,45,50,55,60
℃）下で測定した。結果を図６に示す。図中の横軸は反
応温度（℃）を表し、縦軸は最大活性値を100とした場
合の相対活性（％）を表す。本ペプチダーゼの至適温度
は、45℃であることが明らかとなった。
ゼ活性を、種々の温度条件（20,30,35,40,45,50,55,60
℃）下で測定した。結果を図６に示す。図中の横軸は反
応温度（℃）を表し、縦軸は最大活性値を100とした場
合の相対活性（％）を表す。本ペプチダーゼの至適温度
は、45℃であることが明らかとなった。
【００４３】（２）熱安定性 上記実施例３（３）で得られた精製された本ペプチダー
ゼを種々の温度条件（4,30,40,45,50,55,60℃）下で10
分間インキュベートして、活性を測定した。結果を図７
に示す。図中の横軸は処理温度（℃）を表し、縦軸は最
大活性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本
ペプチダーゼは、40℃まで安定であることが明らかとな
った。
ゼを種々の温度条件（4,30,40,45,50,55,60℃）下で10
分間インキュベートして、活性を測定した。結果を図７
に示す。図中の横軸は処理温度（℃）を表し、縦軸は最
大活性値を100とした場合の相対活性（％）を表す。本
ペプチダーゼは、40℃まで安定であることが明らかとな
った。
【００４４】実施例６ （本ペプチダーゼの基質特異性）種々のα−アミノアシ
ル−β−ナフチルアミド類（L-Ala-βNA、L-Arg-βNA、
L-Lys-βNA、L-Trp-βNA、L-Pro-βNA、L-Asp-βNA、Me
t-βNA、L-Phe-βNA、L-Ser-βNA、L-Leu-βNA、L-Tyr-
βNA、L-Ileu-βNA、L-Glu-βNA、およびL-Val-βN
A）、またはα−アミノアシル−ｐ−ニトロアニリド類
（Gly-pNA、L-Leu-pNA、L-Lys-pNA、L-Phe-pNA、DL-Arg
-pNA、L-Cys-pNA、H-Glu-pNA、およびL-Tyr-pNA）を基
質として供試し、上記実施例３（３）で得られた精製さ
れた本ペプチダーゼの活性を測定して、本ペプチダーゼ
の基質特異性を調べた。Ｌ−アラニン−β−ナフチルア
ミド（L-Ala-βNA）を基質とした場合の活性を100とし
た相対活性（％）を表７に示す。
ル−β−ナフチルアミド類（L-Ala-βNA、L-Arg-βNA、
L-Lys-βNA、L-Trp-βNA、L-Pro-βNA、L-Asp-βNA、Me
t-βNA、L-Phe-βNA、L-Ser-βNA、L-Leu-βNA、L-Tyr-
βNA、L-Ileu-βNA、L-Glu-βNA、およびL-Val-βN
A）、またはα−アミノアシル−ｐ−ニトロアニリド類
（Gly-pNA、L-Leu-pNA、L-Lys-pNA、L-Phe-pNA、DL-Arg
-pNA、L-Cys-pNA、H-Glu-pNA、およびL-Tyr-pNA）を基
質として供試し、上記実施例３（３）で得られた精製さ
れた本ペプチダーゼの活性を測定して、本ペプチダーゼ
の基質特異性を調べた。Ｌ−アラニン−β−ナフチルア
ミド（L-Ala-βNA）を基質とした場合の活性を100とし
た相対活性（％）を表７に示す。
【００４５】
【表７】
【００４６】本ペプチダーゼは、アラニン残基に対して
特に高い基質特異性を示すことが明らかとなった。
特に高い基質特異性を示すことが明らかとなった。
【００４７】実施例７ （本ペプチダーゼの分子量測定） （１）SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動による分子
量測定 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）法（L
aemmli,U.K.、Nature、227、680(1970)）で本ペプチダ
ーゼの分子量を測定した。
量測定 SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）法（L
aemmli,U.K.、Nature、227、680(1970)）で本ペプチダ
ーゼの分子量を測定した。
【００４８】スラブ電気泳動装置（ATTO社製）上のSDS
ポリアクリルアミドゲル（分離ゲル(12.5%)および濃縮
ゲル(3%)）に、上記実施例３（３）で得られた精製され
た本ペプチダーゼ20μgを載せ、40mAで110分泳動した。
分子量マーカーとして、ホスホリラーゼｂ（分子量94,0
00）、牛血清アルブミン（分子量67,000）、卵白アルブ
ミン（分子量43,000）、カルボニックアンヒドラーゼ
（分子量30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,1
00）、およびα-ラクトアルブミン（分子量14,400）を
同時に泳動した。泳動終了後、クーマシーブリリアント
ブルーで染色し、本ペプチダーゼと各分子量マーカーと
の相対泳動距離より、本ペプチダーゼの分子量を測定し
た。結果を図８および図９に示す。図８は、泳動後染色
したSDSポリアクリルアミドゲルの模式図を示す。右側
のレーンは、本ペプチダーゼ、左側のレーンは、同時に
泳動した各分子量マーカーである。模式図外側の数値は
分子量サイズを表す。 図９は分子量マーカー検量線お
よび本ペプチダーゼの相対分子量を示す。図の横軸はＲ
f値、縦軸は分子量（104〜105）を表す。図中の○は、
本ペプチダーゼ、そして●1、2、3、4、5、および6は、
それぞれホスホリラーゼｂ（分子量94,000）、牛血清ア
ルブミン（分子量67,000）、卵白アルブミン（分子量4
3,000）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量30,00
0）、大豆トリプシンインヒビター（20,100）、およ
び、α-ラクトアルブミン（分子量14,400）を示す。
本SDS-PAGEにより、本ペプチダーゼは、単一バンドを示
した。本ペプチダーゼのSDS-PAGEにおける分子量は、約
86kDaであることが明らかとなった。
ポリアクリルアミドゲル（分離ゲル(12.5%)および濃縮
ゲル(3%)）に、上記実施例３（３）で得られた精製され
た本ペプチダーゼ20μgを載せ、40mAで110分泳動した。
分子量マーカーとして、ホスホリラーゼｂ（分子量94,0
00）、牛血清アルブミン（分子量67,000）、卵白アルブ
ミン（分子量43,000）、カルボニックアンヒドラーゼ
（分子量30,000）、大豆トリプシンインヒビター（20,1
00）、およびα-ラクトアルブミン（分子量14,400）を
同時に泳動した。泳動終了後、クーマシーブリリアント
ブルーで染色し、本ペプチダーゼと各分子量マーカーと
の相対泳動距離より、本ペプチダーゼの分子量を測定し
た。結果を図８および図９に示す。図８は、泳動後染色
したSDSポリアクリルアミドゲルの模式図を示す。右側
のレーンは、本ペプチダーゼ、左側のレーンは、同時に
泳動した各分子量マーカーである。模式図外側の数値は
分子量サイズを表す。 図９は分子量マーカー検量線お
よび本ペプチダーゼの相対分子量を示す。図の横軸はＲ
f値、縦軸は分子量（104〜105）を表す。図中の○は、
本ペプチダーゼ、そして●1、2、3、4、5、および6は、
それぞれホスホリラーゼｂ（分子量94,000）、牛血清ア
ルブミン（分子量67,000）、卵白アルブミン（分子量4
3,000）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量30,00
0）、大豆トリプシンインヒビター（20,100）、およ
び、α-ラクトアルブミン（分子量14,400）を示す。
本SDS-PAGEにより、本ペプチダーゼは、単一バンドを示
した。本ペプチダーゼのSDS-PAGEにおける分子量は、約
86kDaであることが明らかとなった。
【００４９】（２）ゲル濾過による分子量測定 通常のゲル濾過法を用いて、本ペプチダーゼの分子量を
測定した。
測定した。
【００５０】0.15M-NaClを含む10mMリン酸緩衝液（pH7.
0）で平衡化したFPLC Superose12（ファルマシア社）カラム
に、上記実施例３（３）で得られた精製された本ペプチ
ダーゼ、ならびに分子量マーカーとして、チログロブリ
ン（分子量669,000）、フェリチン（分子量440,000）、
カタラーゼ（分子量232,000）、およびアルドラーゼ
（分子量158,000）を同時に添加し、上記緩衝液でゲル
濾過を行った。結果を図１０に示す。図中の横軸はゲル
濾過開始後の溶出液量（ml）、縦軸は分子量（105〜1
06）を表す。図中の○は、本ペプチダーゼ、そして●
1、2、3、および4は、それぞれチログロブリン（分子量
669,000）、フェリチン（分子量440,000）、カタラーゼ
（分子量232,000）、およびアルドラーゼ（分子量158,0
00）を表す。
0）で平衡化したFPLC Superose12（ファルマシア社）カラム
に、上記実施例３（３）で得られた精製された本ペプチ
ダーゼ、ならびに分子量マーカーとして、チログロブリ
ン（分子量669,000）、フェリチン（分子量440,000）、
カタラーゼ（分子量232,000）、およびアルドラーゼ
（分子量158,000）を同時に添加し、上記緩衝液でゲル
濾過を行った。結果を図１０に示す。図中の横軸はゲル
濾過開始後の溶出液量（ml）、縦軸は分子量（105〜1
06）を表す。図中の○は、本ペプチダーゼ、そして●
1、2、3、および4は、それぞれチログロブリン（分子量
669,000）、フェリチン（分子量440,000）、カタラーゼ
（分子量232,000）、およびアルドラーゼ（分子量158,0
00）を表す。
【００５１】本ゲル濾過の検量線から、本ペプチダーゼ
は、約520kDaであった。従って、本結果および上記SDS-
PAGEの結果より、本ペプチダーゼは、分子量約86kDaの
ペプチドが６量体で存在することが明らかとなった。
は、約520kDaであった。従って、本結果および上記SDS-
PAGEの結果より、本ペプチダーゼは、分子量約86kDaの
ペプチドが６量体で存在することが明らかとなった。
【００５２】実施例８ （プロテアーゼ阻害剤の影響）本ペプチダーゼを種々の
プロテアーゼ阻害剤で処理した。１mMフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（PhMeSO2F）、10mMヨード酢酸、１
mM-EDTA・2Na、0.1mMペプスタチン、0.1mMロイペプチ
ン、および0.1mMピューロマイシンの各阻害剤で、上記
実施例３（３）で得られた精製された本ペプチダーゼを
処理（pH7.0、35℃、５分）し、活性を測定した。結果
を表８に示す。
プロテアーゼ阻害剤で処理した。１mMフェニルメタンス
ルホニルフルオリド（PhMeSO2F）、10mMヨード酢酸、１
mM-EDTA・2Na、0.1mMペプスタチン、0.1mMロイペプチ
ン、および0.1mMピューロマイシンの各阻害剤で、上記
実施例３（３）で得られた精製された本ペプチダーゼを
処理（pH7.0、35℃、５分）し、活性を測定した。結果
を表８に示す。
【００５３】
【表８】
【００５４】本ペプチダーゼは、ヨード酢酸により、著
しく阻害を受け、またロイペプチンによって、わずかに
阻害された。また、拮抗阻害剤であるピューロマイシン
にも若干阻害された。以上の結果より、本ペプチダーゼ
は、チオールプロテアーゼであることが明らかとなっ
た。
しく阻害を受け、またロイペプチンによって、わずかに
阻害された。また、拮抗阻害剤であるピューロマイシン
にも若干阻害された。以上の結果より、本ペプチダーゼ
は、チオールプロテアーゼであることが明らかとなっ
た。
【００５５】実施例９ （添加アミノ酸の影響）種々のアミノ酸を反応液中に混
在させ、本ペプチダーゼの活性に与える影響を調べた。
種々のL-アミノ酸（ロイシン、ク゛ルタミン酸、アルキ゛ニン、フェニルアラニ
ン、リシ゛ン、トリフ゜トファン、メチオニン、チロシン、イソロイシン、アラニン、アスハ゜
ラキ゛ン、セリン、スレオニン、フ゜ロリン）、およびク゛リシンを５mMとなる
ように反応液中に加え、上記実施例３（３）で得られた
精製された本ペプチダーゼの活性を測定した。結果はア
ミノ酸無添加区を100とした相対活性（％）で表し、表
９に示す。
在させ、本ペプチダーゼの活性に与える影響を調べた。
種々のL-アミノ酸（ロイシン、ク゛ルタミン酸、アルキ゛ニン、フェニルアラニ
ン、リシ゛ン、トリフ゜トファン、メチオニン、チロシン、イソロイシン、アラニン、アスハ゜
ラキ゛ン、セリン、スレオニン、フ゜ロリン）、およびク゛リシンを５mMとなる
ように反応液中に加え、上記実施例３（３）で得られた
精製された本ペプチダーゼの活性を測定した。結果はア
ミノ酸無添加区を100とした相対活性（％）で表し、表
９に示す。
【００５６】
【表９】
【００５７】本ペプチダーゼは、共存するL-ロイシン、
L-グルタミン酸、L-アルギニンなどで阻害された。しか
しながら、L-プロリン、グリシン、L-スレオニンなどで
活性化され、基質であるL-アラニンでは阻害されないこ
とが明らかとなった。
L-グルタミン酸、L-アルギニンなどで阻害された。しか
しながら、L-プロリン、グリシン、L-スレオニンなどで
活性化され、基質であるL-アラニンでは阻害されないこ
とが明らかとなった。
【００５８】実施例１０ （本ペプチダーゼのミカエリス定数）Ｌ−アラニン−β
−ナフチルアミドを基質とした場合の本ペプチダーゼの
ミカエリス定数を、上記実施例３（３）で得られた精製
された本ペプチダーゼを用いて、計測した。さらに上記
ピューロマイシンを種々の濃度で反応系に添加し、反応
速度に及ぼす影響を測定した。これらの結果を図１１、
１２、および１３に示す。図１１は、触媒反応曲線を表
し、図中の横軸は、基質初濃度［Ｓ］0(mM)、そして縦
軸は、反応速度Ｖ（ナノモル/分）を示す。図１２は、Hanes
-Woolf線型プロットを表し、図中の横軸は、基質初濃度
［Ｓ］0(mM)、そして縦軸は、［Ｓ］0/Ｖ（分/ml）を示
す。図１３は、Dixonプロットを表し、図中の横軸は、
添加したピューロマイシン量（μM）、そして縦軸は反
応速度の逆数１/Ｖ（分/マイクロモル）を示す。図中の記号
○、●、△、▲は、基質濃度が、それぞれ0.1、0.2、0.
3、0.5mMの場合の結果を示す。
−ナフチルアミドを基質とした場合の本ペプチダーゼの
ミカエリス定数を、上記実施例３（３）で得られた精製
された本ペプチダーゼを用いて、計測した。さらに上記
ピューロマイシンを種々の濃度で反応系に添加し、反応
速度に及ぼす影響を測定した。これらの結果を図１１、
１２、および１３に示す。図１１は、触媒反応曲線を表
し、図中の横軸は、基質初濃度［Ｓ］0(mM)、そして縦
軸は、反応速度Ｖ（ナノモル/分）を示す。図１２は、Hanes
-Woolf線型プロットを表し、図中の横軸は、基質初濃度
［Ｓ］0(mM)、そして縦軸は、［Ｓ］0/Ｖ（分/ml）を示
す。図１３は、Dixonプロットを表し、図中の横軸は、
添加したピューロマイシン量（μM）、そして縦軸は反
応速度の逆数１/Ｖ（分/マイクロモル）を示す。図中の記号
○、●、△、▲は、基質濃度が、それぞれ0.1、0.2、0.
3、0.5mMの場合の結果を示す。
【００５９】これらの測定結果より、本ペプチダーゼ
は、ミカエリス-メンテンの速度論に従い、ミカエリス定数Ｋｍが
0.28mM、および最大反応速度Ｖmaxが49.4マイクロモル/分/mg
であり、そして酵素−阻害剤複合体の解離定数を示すＫ
iが18μMであることが明らかとなった。
は、ミカエリス-メンテンの速度論に従い、ミカエリス定数Ｋｍが
0.28mM、および最大反応速度Ｖmaxが49.4マイクロモル/分/mg
であり、そして酵素−阻害剤複合体の解離定数を示すＫ
iが18μMであることが明らかとなった。
【００６０】
【発明の効果】本発明によれば、高い基質特異性を有す
る新規アラニンアミノペプチダーゼ、およびその生産方
法が提供される。本ペプチダーゼは、アラニンに特異性
が高いため、肉質中に特定の遊離アミノ酸が生成され得
る。このような酵素は貯蔵食用肉の味、風味改善に有用
である。本ペプチダーゼは、細菌の培養によって生産さ
れるため、安価に大量に本ペプチダーゼを提供すること
ができ、試薬または工業用途に広く利用され得る。
る新規アラニンアミノペプチダーゼ、およびその生産方
法が提供される。本ペプチダーゼは、アラニンに特異性
が高いため、肉質中に特定の遊離アミノ酸が生成され得
る。このような酵素は貯蔵食用肉の味、風味改善に有用
である。本ペプチダーゼは、細菌の培養によって生産さ
れるため、安価に大量に本ペプチダーゼを提供すること
ができ、試薬または工業用途に広く利用され得る。
【図１】粗酵素液の40〜55％硫安画分を添加した陰イオ
ン交換カラムクロマトグラフィーによる各溶出画分のタ
ンパク質紫外吸光度（280nm）およびアラニンアミノペ
プチダーゼ活性値（Ｕ/ml）を示す。
ン交換カラムクロマトグラフィーによる各溶出画分のタ
ンパク質紫外吸光度（280nm）およびアラニンアミノペ
プチダーゼ活性値（Ｕ/ml）を示す。
【図２】陰イオン交換カラムクロマトグラフィーによる
アラニンアミノペプチダーゼ活性画分を添加した疎水ク
ロマトグラフィーによる各溶出画分のタンパク質紫外吸
光度（280nm）およびアラニンアミノペプチダーゼ活性
値（Ｕ/ml）を示す。
アラニンアミノペプチダーゼ活性画分を添加した疎水ク
ロマトグラフィーによる各溶出画分のタンパク質紫外吸
光度（280nm）およびアラニンアミノペプチダーゼ活性
値（Ｕ/ml）を示す。
【図３】疎水クロマトグラフィーによるアラニンアミノ
ペプチダーゼ活性画分を添加したゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーによる各溶出画分のタンパク質紫外吸光度
（280nm）およびアラニンアミノペプチダーゼ活性値
（Ｕ/ml）を示す。
ペプチダーゼ活性画分を添加したゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーによる各溶出画分のタンパク質紫外吸光度
（280nm）およびアラニンアミノペプチダーゼ活性値
（Ｕ/ml）を示す。
【図４】pH４〜10の範囲で本ペプチダーゼ活性を測定し
た場合の相対活性を示す。
た場合の相対活性を示す。
【図５】本ペプチダーゼをpH４〜12の条件下、４℃で５
時間インキュベーション後に測定した相対活性を示す。
時間インキュベーション後に測定した相対活性を示す。
【図６】20〜60℃の範囲で本ペプチダーゼ活性を測定し
た場合の相対活性を示す。
た場合の相対活性を示す。
【図７】本ペプチダーゼを４〜60℃の条件下、pH7.0で1
0分インキュベーション後に測定した相対活性を示す。
0分インキュベーション後に測定した相対活性を示す。
【図８】本ペプチダーゼのSDS-PAGEによる泳動パターン
を示す。
を示す。
【図９】SDS-PAGEの検量線から測定した本ペプチダーゼ
の分子量を示す。
の分子量を示す。
【図１０】ゲル濾過の検量線から測定した本ペプチダー
ゼの分子量を示す。
ゼの分子量を示す。
【図１１】本ペプチダーゼ反応における、基質初濃度と
反応速度の関係を表した、触媒反応曲線を示す。
反応速度の関係を表した、触媒反応曲線を示す。
【図１２】本ペプチダーゼ反応における、基質初濃度と
基質初濃度／反応速度の関係を表した、Hanes-Woolf線
型プロットを示す。
基質初濃度／反応速度の関係を表した、Hanes-Woolf線
型プロットを示す。
【図１３】本ペプチダーゼ反応における、添加された阻
害剤（ピューロマイシン）量と対応する反応速度の逆数
を基質濃度別に表した、Dixonプロットを示す。
害剤（ピューロマイシン）量と対応する反応速度の逆数
を基質濃度別に表した、Dixonプロットを示す。
Claims (7)
- 【請求項１】 下記の特性： 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する； 至適ｐＨ：約６.５； 安定ｐＨ範囲：４℃で５時間処理する場合において、
ｐＨ7.0〜10.0； 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である； 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：L-アラニン残基に対して高い特異性を有
する；および 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する；を有するペプチダー
ゼ。 - 【請求項２】 ヨード酢酸で活性阻害を受けるチオール
プロテアーゼである、請求項１記載のペプチダーゼ。 - 【請求項３】 Aeromonas属細菌由来である、請求項１
または２に記載のペプチダーゼ。 - 【請求項４】 前記Aeromonas属細菌が、Aeromonas sal
monicida subsp.KUPD-1（生命研菌寄第14260号）であ
る、請求項３に記載のペプチダーゼ。 - 【請求項５】 下記の特性： 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する； 至適ｐＨ：約６.５； 安定ｐＨ範囲：４℃で５時間処理する場合において、
ｐＨ7.0〜10.0； 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である； 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：L-アラニン残基に対して高い特異性を有
する；および 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する；を有するペプチダー
ゼを生産する方法であって、該ペプチダーゼを生産する
Aeromonas属の細菌を培養し、培養物より該ペプチダー
ゼを分離する工程を包含する、ペプチダーゼの生産方
法。 - 【請求項６】 前記Aeromonas属細菌がAeromonas salmo
nicida subsp.KUPD-1（生命研菌寄第14260号）である、
請求項５に記載の生産方法。 - 【請求項７】 下記の特性： 作用：アミノペプチダーゼ活性を有する； 至適ｐＨ：約６.５； 安定ｐＨ範囲：４℃で５時間処理する場合において、
ｐＨ7.0〜10.0； 作用適温の範囲：至適温度は約４５℃である； 熱安定性：pH7.0で10分間保持した場合に、40℃まで
安定である。 基質特異性：L-アラニン残基に対して高い特異性を有
する；および 分子量；ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法における分子量が、約86キロダ
ルトンであり、６量体で存在する；を有するペプチダー
ゼを生産する、Aeromonas salmonicida subsp.KUPD-1
（生命研菌寄第14260号）。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8335894A JP3685814B2 (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | アミノペプチダーゼおよびその生産方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8335894A JP3685814B2 (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | アミノペプチダーゼおよびその生産方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH07289256A true JPH07289256A (ja) | 1995-11-07 |
| JP3685814B2 JP3685814B2 (ja) | 2005-08-24 |
Family
ID=13800214
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8335894A Expired - Fee Related JP3685814B2 (ja) | 1994-04-21 | 1994-04-21 | アミノペプチダーゼおよびその生産方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3685814B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US6794159B1 (en) * | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| AU2003228145B2 (en) * | 2002-06-07 | 2009-10-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages |
-
1994
- 1994-04-21 JP JP8335894A patent/JP3685814B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6743600B1 (en) | 1999-04-30 | 2004-06-01 | Monsanto Technologies Llc | Method of removing N-terminal alanine residues from polypeptides with Aeromonas aminopeptidase |
| US6794159B1 (en) * | 1999-04-30 | 2004-09-21 | Pharmacia Corporation | Method of removing n-terminal alanine residues from polypeptides with aeromonas aminopeptidase |
| AU2003228145B2 (en) * | 2002-06-07 | 2009-10-08 | Dsm Ip Assets B.V. | Improved method for the prevention or reduction of haze in beverages |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP3685814B2 (ja) | 2005-08-24 |
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