KR100189660B1

KR100189660B1 - 바실러스속 균주 유래의 혈전용해효소

Info

Publication number: KR100189660B1
Application number: KR1019960027835A
Authority: KR
Inventors: 정영기; 박성훈
Original assignee: 공인수; 정영기; 박성훈
Priority date: 1996-07-10
Filing date: 1996-07-10
Publication date: 1999-06-01
Also published as: KR980009454A

Abstract

본 발명은 혈전용해효소 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 따른 혈전용해효소 는 바실러스 속 KA38(KCCM-10083)로부터 유래된 것으로 피브린 분해능이 특이적으로 우수하다.

Description

바실러스(Bacillus)속 균주 유래의 혈전용해효소

본 발명은 새로운 혈전용해효소 및 그의 생산방법에 관한 것이고, 보다 상세하게는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 유래의 혈전용해효소 및 그의 생산방법에 관한 것이다.

혈전은 피브리노겐이 트롬빈에 의해 피브린으로 전환되어 형성되는 중합체로써, 뇌혈관이나 심장 혈관에서 혈전이 형성되는 질환인 혈전증은 치명적이다.

따라서 혈전을 용해시키기 위하여 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(Tissue type plasminogen activator ; tPA), 지렁이 추출물 등이 사용되고 있다. 그러나 유로키나제, 스트렙토키나제, tPA등은 혈중 반감기가 낮고, 출혈등 부작용이 나타나며, 동시에 가격이 비싼 결점이 있다(Sumi, 화학과 생물, 29, 119, 1991). 혈전 이외의 신체부위를 분해하는 부작용도 갖는 이들 종래의 혈전용해효소는 스킴밀크를 분해한다.

이에 따라 이러한 부작용을 갖지 않는 혈전용해물질을 찾고자 하는 연구가 활발하게 진행되고 있다.

본 발명자들은 발효된 대두로부터 혈전용해능을 갖는 미생물을 분리하여 바실러스서브틸리스(Bacillus subtilis)임을 동정하였으며 미생물을 배양하여 새로운 혈전용해효소를 분리 정제하고 N-말단의 아미노산 배열을 결정한 바 있다. (한국특허출원 1996-8674호)

본 발명자들은 계속된 연구의 결과로서, 멸치액젓으로부터 혈전용해능을 갖는 미생물을 새로이 발견하고, 이 균주를 이용하여 새로운 혈전용해효소를 분리, 정제하였으며 이를 기초로하여 본 발명을 완성하게 되었다.

즉, 본 발명의 목적은 기존의 혈전용해효소가 갖고 있는 부작용을 나타내지 않으면서 혈전용해능이 우수한 새로운 혈전용해효소를 제공하는 것이다.

제1도는 본 발명에 따른 혈전용해효소 생산능을 갖는 바실러스 속 균주의 분리과정을 보여주는 흐름도이다.

제2도는 본 발명의 바실러스 속 균주의 배양액으로부터 혈전용해효소를 분리정제하는 과정을 보여주는 흐름도이다.

제3도는 본 발명의 혈전용해효소의 분자량을 결정하기 위한 전기영동사진이다.

상술한 본 발명의 목적은 바실러스(Bacillus)속 KA-38(KCCM-10083) 및 이를 배양하여 혈전용해효소를 회수하는 방법에 의해 달성된다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 적용은 하기 발명의 상세한 설명란으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에 따라 발효된 멸치액젓으로부터 혈전용해능을 갖는 바실러스속 미생물을 분리하는 방법은 멸치액젓을 소금이 5%포함된 세균분리용 LB평판 배지에 도말하여 나타나는 전 미생물을 분리한다.

멸치액젓에서 얻은 미생물을 후술하는 피브린(fibrin)-함유 플레이트에 이식하여 배양한 후, 투명환을 생성하는 집락을 수집하므로써 혈전용해능을 갖는 미생물을 분리한다. 본 발명에 따른 미생물의 분리원으로 사용되는 멸치액젓은 통상의 방법으로 제조된 것을 사용할 수 있으며, 예를 들면 가정에서 제조하거나 또는 공장에서 대량 생산한 것을 사용할 수 있다. 그러나 생산공정 중에 장기 저장을 목적으로 하여 살균처리된 것은 사용할 수 없다. 멸치액젓의 제조에 소요되는 발효기간은 대략 6∼12개월의 범위내에 있을 수 있지만, 이에만 한정되는 것은 아니다. 한편, 멸치액젓 뿐만 아니라 벤댕이 젓갈에서도 N-말단 아미노산 서열이 본 발명의 효소와 동일하고 분자량도 유사한 효소의 활성이 검출되는 것으로 확인되었으므로, 벤댕이 젓갈도 본 발명에 따른 혈전용해효소의 분리원으로 사용할 수 있다.

본 발명에 따르면 상기와 같은 방법에 의해 분리된 혈전용해활성을 갖는 미생물은 바실러스 속으로 밝혀졌으며 이 미생물은 피브린 용해활성이 우수하며 스킴밀크는 약간 분해하지만 제라틴, 혈액-아가(blood-agar) 플레이트에서는 젤라틴, 혈액을 분해하지 않는 혈전용해효소를 생산한다.

상기 미생물을 배양하여 혈전용해효소를 생산하는 것은 통상의 배양법에 의해 행할 수 있으며, 미생물의 배양법 또는 효소의 분리 정제법에 특별한 제한은 없다. 본 발명에 따라 제공되는 신규한 혈전용해효소는 겔 전기영동에 의해 결정한 분자량이 41KDa이다.(제3도)

한편 본 발명에서 채택한 각종 실험법을 아래에 설명한다. 혈전용해는 아스트럽과 뭘러츠의 방법(Astrup Muellertz, Arch. Biochem. Biophys., 40, 346, 1952)을 활용하였다. 즉 0.15M몰이 되도록 소금을 참가한 10mM 인산완충액(pH 7.8)에 피브리노겐을 0.3%되도록 용해시켜 얻은 피브리노겐 용액 5㎖과 동일한 완충액에 아가로스를 1%되도록 용해시킨 아가로스액 5㎖을 혼합하고, 다시 트롬빈(100NIH/㎖) 0.1㎖을 첨가하여 즉시 페트리 접시에 부어 굳혀 피브린 플레이트(plate)를 제조하였다. 접시당 7개의 구멍을 만들고, 시료 0.1㎖을 주입한 뒤 37℃에서 2시간 반응시킨 후 형성된 투명환의 지름을 측정하였다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 개념이 실시예에만 국한되는 것은 아니다. 하기 실시예에서, %는 특별한 언급이 없는 한 중량%를 의미한다.

(실시예 1)

미생물의 분리

젓갈 공장 및 시장에서 구입한 멸치액젓 0.1㎖를 소금이 포함된 영양배지(트립톤 1%, 효모엑기스 0.5%, 포도당 2.5%, 소금 5%)에 도말하여 37℃에서 1∼2일 배양하였다.

배양후 나타난 미생물 집락을 피브린 플레이트(피브린 5%를 구연산 완충액 pH 7.8에 녹이고, 트롬빈 20유니트를 첨가하여 굳힌다)에 옮겨 37℃에서 하루밤 배양한 다음 투명환을 형성하는 집락을 분리하였다.

(실시예 2)

미생물의 동정

실시예 1에서 분리된 미생물에 대해 버기 매뉴얼(Bergy's Manual)에 따라 동정을 위한 생리적 실험을 행하고, 결과를 하기 표1에 나타내었다.

[표 1]

이상에서 분리된 미생물은 바실러스(Bacillus)속으로 동정되었고, KA-38로 명명하고 미생물을 1996년 5월 23일로 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터(KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM-10083을 부여 받았다.

(실시예 3)

효소의 생산 및 정제

실시예 1의 바실러스 속 KA38(KCCM-10083)을 소금 5%가 첨가된 LB액체배지에서 37℃, 18시간 배양하고, 원심분리하여 상등액을 취하고, 암모늄설페이트(Ammoniumsulfate)를 80% 첨가하여 침전을 얻었다. 침전물을 20mM 인산 완충액(pH 7.0)으로 투석한 후, DEAE-셀루로오스(컬럼 5×30㎝)로 크로마토그래피를 행하였다. 같은 완충액을 분당 0.5㎖의 속도로 흘려주었다.

상기 완충액으로 전처리한 Mono Q(컬럼 0.5×5㎝)을 사용하여 고속 액체 크로마토그래피(HPLC)를 행하였다. 같은 완충액을 분당 0.2㎖의 속도로 흘려주었으며 0.5㎖씩 분획하여 혈전용해효소 단백질을 정제하였다. 정제 단계별 단백질 양, 총활성, 특이활성, 정제도, 및 수율을 정리하면 표 2와 같다.

[표 2]

(실시예 4)

분자량 측정

실시예 3에서 정제된 혈전용해효소의 분자량을 결정하기 위하여 12% SDS-PAGE로 전기영동하여 분석하고 그 결과를 제3도에 나타내었다. 분자량 표준물질로는 소혈청알부민(Bovine serum albumin, 66kd), 난 알부민(ovalbumin, 45kd), 글리세르알데히드-3-인산염 탈수소효소(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 36kd), 카본산 안하이드라제(carbonic anhydrase, 29kd)을 사용하였다.

제3도의 결과로부터, 본 발명에 따른 신규 혈전용해효소의 분자량은 41kd이었다.

(실시예 5)

금속 이온의 효과

실시예 3에서 정제한 혈전용해효소액 0.1㎖에 하기 표 3에 나타낸 각각의 금속 이온을 1mM씩 첨가하고, 37℃에서 30분간 반응시킨후 혈전용해능을 비색계로써 280nM에서 흡광도의 차이로써 결정하고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[표 3]

(실시예 6)

억제인자

각종 억제물질들이 본 발명의 효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여 표 4에 나타낸 종류 및 농도의 억제물질을 이용하여 실시예 5와 동일한 조건하에서 실험을 행하고 이들 억제물질에 의한 효소활성의 억제율을 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

[표 4]

(실시예 7)

억제인자인 EDTA의 농도별 영향

금속이온을 결합하는 능력이 있는 EDTA가 본 발명의 효소에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 표 5에 나타낸 각종 농도의 EDTA를 사용하여 실시예 5와 동일한 조건하에서 실험을 행하였다. 결과는 표 5와 같다.

[표 5]

(실시예 8)

N-말단 아미노산 서열

아미노산 분석기(모델 ABI 476A)를 이용하여 본 발명의 효소의 N-말단의 아미노산 서열을 결정하였다. N-말단의 아미노산 서열은 VYPFPGPIPN이었다.

한편, 지금까지 보고된 혈전용해효소들은 N-말단 아미노산 서열과 본 발명효소의 N-말단 아미노산 서열을 비교하고 아래 표 6에 그 결과를 나타내었다.

[표 6]

상기 결과는 본 발명에 따른 효소가 종래의 여러 혈전용해효소와는 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖는 것을 보여주고 있으며, 따라서 본 발명의 효소는 새로운 효소임이 입증된다.

Claims

(정정) 분자량이 41kd이고, N-말단 아미노산 서열이 VYPFPGPIPN이며, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 KA38(KCCM-10083)유래의 혈전용해효소.
제1항에 있어서, 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 KA38(KCCM-10083) 유래 균주는 멸치액젓에서 분리한 것임을 특징으로 하는 혈전용해효소.
(정정) 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 KA38(KCCM-10083)을 배지에서 배양하여 혈전용해효소를 체외로 분비축적시키는 단계; 및 배양액으로부터 혈전용해효소를 분리, 회수하는 단계; 를 포함함을 특징으로 하는 발효법에 의한 제1항의 혈전용해효소의 제조방법.