KR20050025677A - 펩티드를 생성하는 신규 효소, 이를 생산하는 미생물 및이들을 사용하는 디펩티드의 제조방법 - Google Patents

펩티드를 생성하는 신규 효소, 이를 생산하는 미생물 및이들을 사용하는 디펩티드의 제조방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20050025677A
KR20050025677A KR1020057001376A KR20057001376A KR20050025677A KR 20050025677 A KR20050025677 A KR 20050025677A KR 1020057001376 A KR1020057001376 A KR 1020057001376A KR 20057001376 A KR20057001376 A KR 20057001376A KR 20050025677 A KR20050025677 A KR 20050025677A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
enzyme
peptide
amino acid
component
carboxy
Prior art date
Application number
KR1020057001376A
Other languages
English (en)
Inventor
요코제키겐조
스즈키소노코
하라세이치
가타야마사토시
Original Assignee
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 아지노모토 가부시키가이샤
Publication of KR20050025677A publication Critical patent/KR20050025677A/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06043—Leu-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052—Val-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C07K5/06095—Arg-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06147—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and His-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06165—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Pro-amino acid; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06191—Dipeptides containing heteroatoms different from O, S, or N
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/081—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing O or S as heteroatoms, e.g. Cys, Ser
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩티드를 제조할 수 있는 신규 효소에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드 생성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 저렴한 디펩티드의 제조방법을 제공하는 것이다. 신규하게 밝혀낸 엠페도박터속에 속하는 세균으로부터 펩티드를 효율적으로 생성하는 신규 효소를 밝혀내고, 저렴하면서 또한 간편하게 펩티드를 제조하는 방법을 밝혀냈다.

Description

펩티드를 생성하는 신규 효소, 이를 생산하는 미생물 및 이들을 사용하는 디펩티드의 제조방법 {Novel enzyme forming peptide, microorganism producing the same and process for producing dipeptide using them}
본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩티드를 제조할 수 있는 신규 효소에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드 생성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 디펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
펩티드는 의약품, 식품 등의 다양한 분야에서 이용되고 있다. 예를 들면, L-알라닐-L-글루타민은 L-글루타민과 비교하여 안정적이면서 또한 수용성도 높은 점으로부터 수액(輸液)이나 무혈청 배지의 성분으로서 널리 사용되고 있다.
펩티드의 제조법으로서는 종래부터 화학합성법이 공지되어 있지만, 이의 제조법은 반드시 간편한 것은 아니었다. 예를 들면, N-벤질옥시카보닐알라닌(이하, Z-알라닌이라고 칭한다)과 보호 L-글루타민을 사용하는 방법[참조: Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739(1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966(1962)], Z-알라닌과 보호 L-글루탐산-γ-메틸에스테르를 사용하는 방법[Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200(1964)], Z-알라닌디에스테르와 비보호 글루탐산을 사용하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평) 1-96194호], 2-치환-프로피오닐할라이드를 원료로서 N-(2-치환)-프로피오닐글루타민 유도체를 중간체로서 생성하는 방법[참조: 일본 공개특허공보 제(평)6-234715호] 등이 공지되어 있다.
그러나, 어느 방법에서도 보호기의 도입 및 이탈 또는 광학활성 중간체의 사용이 필요하며, 공업적으로 유리하고 충분하게 만족할 수 있는 제조방법이 아니었다.
한편, 효소를 사용하는 펩티드의 대표적 제조법으로서는 N 보호, C 비보호된 카복시 성분과 N 비보호, C 보호된 아미노 성분을 사용하는 축합반응(반응 1) 및 N 보호, C 보호된 카복시 성분과 N 비보호, C 보호된 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 2)이 널리 공지되어 있다. 반응 1의 예로서는 Z-아스파라긴산과 페닐알라닌메틸에스테르로부터의 Z-아스파르틸페닐알라닌메틸에스테르의 제조방법[참조: 일본 공개특허공보 제(소) 53-92729호]을, 반응 2의 예로서는 아세틸페닐알라닌에틸에스테르와 류신아미드에서의 아세틸페닐알라닐류신아미드의 제조방법[참조: Biochemical J., 163, 531(1977)]을 들 수 있다. N 비보호, C 보호된 카복시 성분을 사용하는 방법의 보고 연구예는 매우 적으며, N 비보호, C 보호된 카복시 성분과 N 비보호, C 보호된 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 3)의 예로서는 특허 WO 90/01555가 있으며, 예를 들면 아르기닌에틸에스테르와 류신아미드에서의 아르기닐류신아미드의 제조방법을 들 수 있다. N 비보호, C 보호된 카복시 성분과 N 비보호, C 비보호된 아민 성분을 사용하는 치환반응(반응 4)의 예로서는 특허 EP 278787A1과 EP 359399B1이 있으며, 예를 들면 티로신에틸에스테르와 알라닌으로부터 티로실알라닌의 제조방법을 들 수 있다.
도 1은 본 발명 효소의 최적 pH를 도시하는 도면이다.
도 2는 본 발명의 효소의 최적온도를 도시하는 도면이다.
도 3은 L-알라닌메틸에스테르와 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민 생성의 시간에 따른 변화를 도시하는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
이하, 본 발명의 실시의 형태에 관해서, (1) 본 발명의 효소를 생산하는 미생물, (2) 미생물의 배양, (3) 효소의 정제, (4) 효소의 성질, (5) 디펩티드의 제조방법의 순서로 상세하게 설명한다.
(1) 본 발명의 효소를 생산하는 미생물
본 발명의 효소는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 것이면 양호하며, 이러한 효소를 생산하는 미생물은 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 명세서에서 카복시 성분이란 펩티드 결합(-CONH-)에서 카보닐 부위(CO)를 공급하는 성분의 것을 말하며, 아민 성분이란 펩티드 결합에서의 아미노부위(NH)를 공급하는 성분의 것을 말한다. 또한, 본 명세서에서 단순히 「펩티드」라고 할 때에는 특별히 단정하지 않는 한, 1개 이상의 펩티드 결합을 갖는 중합체의 것을 말한다. 또한, 본 명세서에서 「디펩티드」란 1개의 펩티드 결합을 갖는 펩티드의 것을 말한다.
본 발명의 효소를 생산하는 미생물로서는, 예를 들면, 엠페도박터속에 속하는 세균 등을 들 수 있으며, 보다 구체적으로는 엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) ATCC 14234주(FERM P-18545주) 또는 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.) FERM BP-8124주를 들 수 있다. 엠페도박터 브레비스 ATCC 14234주(FERM P-18545주, FERM BP-8113주) 또는 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.) FERM BP-8124주는 본 발명자 등이 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 고수율로 생산하는 효소의 생산균을 검색한 결과에서 선출한 미생물이다. 엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) ATCC 14234주(FERM P-18545주) 또는 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.) FERM BP-8124주와 동일한 균학적 성질을 갖는 미생물도 본 발명의 효소를 생산하는 미생물이다.
엠페도박터 브레비스 ATCC 14234주(FERM P-18545주)는 2001년 10월 1일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터(일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 츄오 제6)에 기탁되어, FERM P-18545의 수탁번호가 부여되어 있으며, 또한 헤이세이 14년 7월 8일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에서 부다페스트 조약에 근거하는 기탁으로 이관되어 있으며, FERM BP-8113이 부여된 미생물이다 (미생물의 표시: Empedobacter brevis AJ 13933주).
스핀고박테리움 종 AJ 110003주는 2002년 7월 22일에 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터에 기탁되어 있으며, FERM BP-8124의 수탁번호가 부여되어 있다. 더욱이, AJ 110003주(FERM BP-8124주)는 하기의 분류실험에 의해 상기한 스핀고박테리움 종인 것이 동정되었다. FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소, 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)는 간균(0.7 내지 0.8×1.5 내지 2.0μm), 그램 음성, 포자 형성이 없으며 운동성이 없고 콜로니 형태는 원형, 전체 테두리 매끄러운 모양, 낮은 볼록형, 광택 있으며 담황색, 30℃에서 생육, 카탈라제 양성, 옥시다제 양성, OF 테스트(글루코스) 음성의 성질로부터 스핀고박테리움에 속하는 세균으로 동정되었다. 또한, 질산염 환원 음성, 인돌 생성 음성, 글루코스로부터의 생성 음성, 아르기닌디하이드로라제 음성, 우레아제 양성, 에스쿨린 가수분해 양성, 젤라틴 가수분해 음성, β-갈락토시다제 양성, 글루코스 동화 양성, L-아라비노스 동화 음성, D-만노스 동화 양성, D-만니톨 동화 음성, N-아세틸-D-글루코사민 동화 양성, 말토스 동화 양성, 글루콘산칼륨 동화 음성, n-카프르산 음성, 아디프산 동화 음성, dl-말산 동화 음성, 시트르산나트륨 동화 음성, 아세트산페닐 동화 음성, 시토크롬옥시다제 양성의 성질로부터 스핀고박테리움 멀티보람 또는 스핀고박테리움 스피리티보람의 성상에 유사한 것으로 판명됐다. 또한 16S rRNA 유전자의 염기서열의 상동성 해석의 결과, 스핀고박테리움 멀티보룸과 가장 높은 상동성(98.8%)를 나타내지만, 완전히 일치하는 주는 없는 것으로부터 본 균주를 스핀고박테리움 종(Sphingobacterium sp.)로 동정하였다.
본 발명의 효소는 상기한 바와 같이 엠페도박터 브레비스 또는 스핀고박테리움 종 등의 균체로부터 단리·정제함으로써 수득할 수 있다. 또한, 단리된 효소를 기초로 유전공학적인 수법을 사용하여, 본 발명의 효소 및 당해 효소를 생산하는 미생물을 수득할 수 있다. 즉, 단리·정제한 효소를 기초로 본 발명의 효소를 암호화하는 DNA를 단리하며, 이것을 적당한 숙주에 도입하여, 발현시킴으로써 본 발명의 효소 및 미생물을 작제할 수 있다. 또한, 엠페도박터 브레비스로부터 수득된 본 발명의 효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 등을 기초로 프로브를 작제하며, 다른 미생물로부터 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 효소를 수득하는 것도 양호하다. 각종 유전자 재조합 기법은 문헌[참조: Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press(1989)] 등에 기재되어 있다.
(2)미생물의 배양
본 발명의 효소를 생산하는 미생물의 배양 균체를 수득하기 위해서는 당해 미생물을 적당한 배지에서 배양 증식시키면 양호하다. 이를 위한 배지는 이러한 미생물을 증식할 수 있는 것이면 특별한 제한은 없으며 통상적인 탄소원, 질소원, 인원, 황원, 무기 이온, 또한 필요에 따라 유기 영양원을 포함하는 통상적인 배지가 양호하다.
예를 들면, 탄소원으로서는 상기 미생물을 이용할 수 있으면 모두 사용할 수 있으며, 구체적으로는 글루코스, 프룩토스, 말토스, 아밀로스 등의 당류, 소르비톨, 에탄올, 글리세롤 등의 알콜류, 푸마르산, 시트르산, 아세트산, 프로피온산 등의 유기산류 및 이들의 염류, 파라핀 등의 탄수화물류 또는 이들의 혼합물 등을 사용할 수 있다.
질소원으로서는 황산암모늄, 염화암모늄 등의 무기염의 암모늄염, 푸마르산암모늄, 시트르산암모늄 등의 유기산의 암모늄염, 질산나트륨, 질산칼륨 등의 질산염, 펩톤, 효모 추출물, 고기 추출물, 옥수수 침지액 등의 유기 질소 화합물 또는 이들의 혼합물을 사용할 수 있다.
기타 무기염류, 미량 금속염, 비타민류 등의 통상적인 배지에 사용되는 영양원을 적절하게 혼합하여 사용할 수 있다.
배양조건에도 특별한 제한은 없으며, 예를 들면, 호기적 조건하에 pH 5 내지 8, 온도 15 내지 40℃의 범위에서 pH 및 온도를 적당히 제한하면서 12 내지 48시간 정도 배양을 하면 양호하다.
(3)효소의 정제
본 발명의 효소를 정제하는 예로서, 엠페도박터 브레비스로부터 펩티드 생성 효소를 단리·정제하는 방법을 설명한다. 우선 엠페도박터 브레비스, 예를 들면, FERM BP-8113주(기탁기관: 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일 ; 2002년 7월 8일) 등의 균체로부터 초음파 파쇄 등의 물리적 방법, 또는 세포벽 용해 효소 등을 사용하는 효소법 등에 의해 균체를 파괴하며, 원심분리 등에 의해 불용성 분획을 제거하여 균체 추출액을 조제한다.
상기한 바와 같이 수득되는 균체 추출액을 통상적인 단백질의 정제법, 음이온 교환 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피 등을 조합하여 분획함으로써 펩티드 생성 효소를 정제할 수 있다.
음이온 교환 크로마토그래피용의 담체로서는 Q-Sepharose HP(아마샴사제) 등을 들 수 있다. 본 효소를 포함하는 추출액을 이들의 담체를 채운 칼럼에 통과시키면 당해 효소는 pH 8.5의 조건하에 비흡착 분획으로 회수된다.
양이온 교환 크로마토그래피용 담체로서는 MonoS HR(아마샴사제) 등을 들 수 있다. 본 효소를 포함하는 추출액을 이들의 담체를 채운 칼럼에 통과시키고 본 효소를 칼럼에 흡착시켜, 칼럼을 세정한 후에 고염농도의 완충액을 사용하여 효소를 용출시킨다. 이때, 단계적으로 염농도를 높이는 것도 양호하며, 농도 구배를 거쳐도 양호하다. 예를 들면, MonoS HR을 사용하는 경우에는 칼럼에 흡착된 본 효소는 0.2 내지 0.5M 정도의 NaCl 농도에서 용출된다.
상기와 같이 정제된 효소는 다시 겔 여과 크로마토그래피 등에 의해 균일하게 정제할 수 있다. 겔 여과 크로마토그래피용 담체로서는 Sephadex 200pg(아마샴사제) 등을 들 수 있다.
상기 정제조작에서 본 효소를 포함하는 분획은 후술하는 방법 등에 따라 각 분획의 펩티드 생성활성을 측정함으로써 확인할 수 있다.
(4)본 발명의 효소의 성질
본 발명의 효소는 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 효소이지만 이하, 본 발명의 효소의 바람직한 형태에 관해서, 이의 성질면에서 설명한다.
본 발명의 효소의 바람직한 일 형태로서 디펩티드의 생성속도를 하나의 지표로 하는 하기와 같은 능력을 갖는 효소를 들 수 있다. 즉, 본 발명의 효소의 바람직한 일 형태로서 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 가지며, 하기 (i) 내지 (iv)의 조건하에 디펩티드 생성반응에서 L-알라닐-L-글루타민의 생성속도가 바람직하게는 0.03mM/분 이상, 보다 바람직하게는 0.3mM/분 이상, 특히 바람직하게는 1.0mM/분 이상으로 되는 능력을 갖는 효소를 들 수 있다. 디펩티드 생성반응의 조건은 다음과 같다:
(i) 카복시 성분이 L-알라닌메틸에스테르 염산염(100mM),
(ii) 아민 성분이 L-글루타민(200mM),
(iii) pH가 9.0, 및
(iv) 효소 첨가량이 단백질량으로서 0.61mg/ml 미만.
상기 효소 첨가량이란 반응계에 첨가하는 효소의 종말 첨가량을 나타내며, 단백질량으로서 O.01mg/ml 이상, 바람직하게는 0.02mg/ml 이상의 첨가가 바람직하다. 「단백질량으로서」란 프로테인 분석 CBB 용액(나카라이제)를 사용하여, 소 혈청 알부민을 표준물질로 하는 쿠마시 브릴리언트 블루에 의한 발색법으로 나타내는 수치를 사용한다.
상기와 같은 생성속도는 효소를 사용하는 펩티드 생성의 지금까지의 상식을 훨씬 상회하는 것이며, 본 발명의 효소는 매우 고속으로 펩티드 생성을 촉매하는 능력을 갖는 것이다.
효소활성의 측정에 관해서 보다 구체적인 예를 들어 아미노산에스테르와 아민을 기질로서 포함하는 붕산 완충액 중에 반응시켜 생성된 펩티드를 정량함으로써 측정할 수 있다. 또한 구체적인 예로서는 L-알라닌메틸에스테르 100mM, L-글루타민 200mM을 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0)을 사용하여, 25℃에서 수분 동안 반응시키는 방법을 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 효소의 활성단위에 관해서는 L-알라닌메틸에스테르 100mM, L-글루타민 200mM을 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0)을 사용하여, 25℃에서 반응시킨 조건하에 1분 동안에 1μmole의 펩티드를 생성하는 효소량을 1단위(U) 라고 정의하였다.
또한, 본 발명의 효소로서 바람직한 일 형태로는 카복시 성분으로서 아미노산에스테르 및 아미노산아미드 둘 다를 기질로 할 수 있는 성질을 갖는 효소를 들 수 있다. 「아미노산에스테르 및 아미노산아미드 둘 다를 기질로 할 수 있다」라고 하는 것은 아미노산에스테르의 하나 이상, 아미노산아미드의 하나 이상을 기질로 할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명의 효소로서 바람직한 일 형태로는 아민 성분으로서 아미노산, C 보호 아미노산 및 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있는 성질을 갖는 효소를 들 수 있다. 「아미노산, C 보호 아미노산, 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있다」라는 것은 아미노산의 하나 이상, C 보호 아미노산의 하나 이상 및 아민의 하나 이상을 기질로 할 수 있는 것을 의미한다. 카복시 성분 또는 아미노 성분에 관해서 폭넓은 기질 특이성을 갖는 것은 공업 생산 분야에서 비용, 생산 설비 등에서 적합한 원료의 선택성이 넓어진다는 점에서 바람직하다.
카복시 성분의 구체적인 예를 들면, L-아미노산에스테르, D-아미노산에스테르, L-아미노산아미드, D-아미노산아미드 등을 들 수 있다. 또한, 아미노산에스테르에는 천연형의 아미노산에 대응하는 아미노산에스테르 뿐만 아니라 비천연형의 아미노산 또는 이의 유도체에 대응하는 아미노산에스테르도 있다. 또한, 아미노산에스테르로서는 α-아미노산에스테르 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ- 또는 ω- 등의 아미노산의 에스테르도 있다. 아미노산에스테르의 대표적인 예로서는 아미노산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, n-프로필에스테르, 이소-프로필에스테르, n-부틸에스테르, 이소-부틸에스테르 또는 3급-부틸에스테르 등을 들 수 있다.
아민 성분의 구체적인 예를 들면, L-아미노산, C 보호 L-아미노산, D-아미노산, C 보호 D-아미노산 또는 아민 등이 예시된다. 또한, 아민으로서는 천연형 아민 뿐만 아니라, 비천연형의 아민 또는 이의 유도체 등도 예시된다. 또한, 아미노산으로서는 천연형 아미노산 뿐만 아니라 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체도 예시된다. α-아미노산 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산 등도 예시된다.
또한, 다시 별도의 측면으로서 본 발명의 효소로서 바람직한 일 형태로는 펩티드 생성반응에서 촉매할 수 있는 pH의 범위가 6.5 내지 10.5의 범위인 효소를 들 수 있다. 이와 같이 넓은 pH 범위에서 촉매할 수 있는 것은 다양한 제약이 생길 수 있는 공업적 생산에서 유연한 대응을 할 수 있는 점에서 바람직하다. 단, 실제로 펩티드를 생산하는데 있어서는 효소의 촉매 성능을 최대한으로 끌어내도록 취득된 효소에 대하여 다시 최적 pH로 조정하여 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 다시 별도의 측면으로서 본 발명의 효소로서 바람직한 일 형태로는 펩티드 생성반응에서 촉매할 수 있는 온도조건이 0 내지 60℃의 범위인 효소를 들 수 있다. 이와 같이 넓은 온도범위에서 촉매할 수 있는 것은 다양한 제약이 생길 수 있는 공업적 생산에서 유연한 대응을 할 수 있는 점에서 바람직하다. 단, 실제로 펩티드를 생산하는데 있어서는 효소의 촉매 성능을 최대한으로 끌어내도록 취득된 효소에 대하여 다시 최적온도로 조정하여 사용하는 것이 바람직하다.
(5)디펩티드의 제조방법
본 발명의 디펩티드의 제조방법은 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 효소 또는 당해 효소를 포함하는 함유물을 카복시 성분과 아민 성분에 작용시켜 디펩티드를 합성시키는 것이다.
본 발명에 사용하는 효소 또는 효소 함유물을 카복시 성분과 아민 성분에 작용시키는 방법으로서는 당해 효소 또는 효소 함유물, 카복시 성분 및 아민 성분을 혼합하면 양호하다. 보다 구체적으로는 효소 또는 효소 함유물을 카복시 성분과 아민 성분을 포함하는 용액중에 첨가하여 반응시키는 방법을 사용해도 양호하고, 당해 효소를 생산하는 미생물을 사용하는 경우에는 당해 효소를 생산하는 미생물을 배양하여, 미생물 중 또는 미생물의 배양액 중에 당해 효소를 정제·축적시켜 배양액 중에 카복시 성분과 아민 성분을 첨가하는 방법 등을 사용해도 양호하다. 생성된 디펩티드는 일정한 방법에 따라 회수하며, 필요에 따라 정제할 수 있다.
「효소 함유물」이란 당해 효소를 함유하는 것이면 양호하며, 구체적 형태로서는 당해 효소를 생산하는 미생물의 배양물, 당해 배양물로부터 분리된 미생물 균체, 균체 처리물 등이 포함된다. 미생물의 배양물이란 미생물을 배양하여 수득한 물질의 것이며, 보다 구체적으로는 미생물 균체, 당해 미생물의 배양에 사용하는 배지 및 배양된 미생물에 의해 생성된 물질의 혼합물 등을 말한다. 또한, 미생물 균체는 세정하여, 세정 균체로서 사용해도 양호하다. 또한, 균체 처리물에는 균체를 파쇄, 용균, 동결건조한 것 등이 포함되며, 또한 균체 등을 처리하여 회수되는 조효소, 또한 정제한 정제 효소 등도 포함된다. 정제처리된 효소로서는 각종 정제법에 따라 수득되는 부분 정제 효소 등을 사용해도 양호하고, 이들을 공유결합법, 흡착법, 포괄법 등에 따라 고정화시킨 고정화 효소를 사용해도 양호하다. 또한, 사용하는 미생물에 따라서 배양중에 일부는 용균하는 것도 있으므로, 이 경우에는 배양액 상층액도 효소 함유물로서 이용할 수 있다.
또한, 당해 효소를 포함하는 미생물로서는 야생주를 사용해도 양호하며, 본 효소를 발현하는 유전자 재조합주를 사용해도 양호하다. 당해 미생물로서는 효소 미생물 균체에 한하지 않으며, 아세톤 처리 균체, 동결건조 균체 등의 균체 처리물을 사용해도 양호하며, 이들을 공유결합법, 흡착법, 포괄법 등에 따라 고정화한 고정화 균체, 고정화 균체 처리물을 사용해도 양호하다.
또한, 배양물, 배양 균체 또는 균체 처리물을 사용하는 경우에는 펩티드의 생성에 관여하지 않고 생성 펩티드를 분해하는 효소가 존재하는 경우가 많으며, 이 경우에는 에틸렌디아민 4아세트산(EDTA)과 같은 금속 프로테아제 억제제를 첨가하는 편이 바람직한 경우가 있다. 첨가량은 O.1mM 내지 300mM의 범위이며, 바람직하게는 1mM 내지 100mM이다.
효소 또는 효소 함유물의 사용량은 목적하는 효과를 발휘하는 양(유효량)이면 양호하며 이러한 유효량은 당업자라면 간단한 예비실험에 의해 용이하게 구하지만, 예를 들면, 효소를 사용하는 경우에는 O.01 내지 100유닛(U) 정도, 세정 균체를 사용하는 경우에는 1 내지 500g/L 정도이다.
카복시 성분으로서는 또하나의 기질인 아민 성분과 축합하여 펩티드를 생성할 수 있는 것이면 어떤 것을 사용해도 양호하다. 카복시 성분으로서는, 예를 들면, L-아미노산에스테르, D-아미노산에스테르, L-아미노산아미드, D-아미노산아미드 등을 들 수 있다. 또한, 아미노산에스테르로서는 천연형의 아미노산에 대응하는 아미노산에스테르 뿐만 아니라, 비천연형의 아미노산 또는 이의 유도체에 대응하는 아미노산에스테르 등도 예시된다. 또한, 아미노산에스테르로서는 α-아미노산에스테르 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산의 에스테르 등도 예시된다. 아미노산에스테르의 대표적인 예로서는 아미노산의 메틸에스테르, 에틸에스테르, n-프로필에스테르, 이소-프로필에스테르, n-부틸에스테르, 이소-부틸에스테르, 3급-부틸에스테르 등이 예시된다.
아민 성분으로서는 또 하나의 기질인 카복시 성분과 축합하여 펩티드를 생성할 수 있는 것이면 어떤 것도 사용해도 양호하다. 아민 성분으로서는, 예를 들면, L-아미노산, C 보호 L-아미노산, D-아미노산, C 보호 D-아미노산, 아민 등을 들 수 있다. 또한, 아민으로서는 천연형 아민 뿐만 아니라, 비천연형의 아민 또는 이의 유도체 등이 예시된다. 또한, 아미노산으로서는 천연형 아미노산 뿐만 아니라 비천연형 아미노산 또는 이의 유도체도 예시된다. α-아미노산 이외에 아미노기의 결합 위치가 상이한 β-, γ-, ω- 등의 아미노산 등도 예시된다.
출발원료인 카복시 성분 및 아민 성분의 농도는 각각 1mM 내지 10M, 바람직하게는 0.05M 내지 2M이지만, 카복시 성분에 대하여 아민 성분을 등량 이상 첨가하는 편이 바람직한 경우가 있다. 또한, 기질이 고농도로서 반응을 억제하도록 하는 경우에는 반응중에 이들을 억제하지 않는 농도로 하여 순차적으로 첨가할 수 있다.
반응온도는 0 내지 60℃에서 펩티드를 생성할 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 40℃이다. 또한 반응 pH는 pH 6.5 내지 10.5에서 펩티드를 생성할 수 있으며, 바람직하게는 pH 7.0 내지 10.0이다.
상기한 반응 1 내지 반응 4의 방법 중에서 가장 저렴한 제조방법으로 될 수 있는 것은 당연히 보호기의 수가 가장 적은 반응 4의 범주에 들어 가는 반응이다.
그러나, 반응 4의 선행예(특허 EP 278787Al)에는 하기의 큰 문제점이 있었다. (1) 펩티드 생성속도가 매우 느리다, (2) 펩티드 생성 수율이 낮다, (3) 생산할 수 있는 펩티드가 비교적 소수도가 높은 아미노산을 포함하는 것으로 한정된다, (4) 첨가 효소량이 매우 대량이다, (5) 곰팡이, 효모, 식물에서 유래하는 비교적 비싼 카복시펩티다제 표준품이 필요하다. 반응 4에서, 세균 및 사카로마이세스(Saccharomyces)속 이외의 효모 유래의 효소를 사용하는 방법은 전혀 공지되어 있지 않으며, 또한 친수성이 높은 알라닐글루타민 등의 펩티드의 제조방법에 대해서도 전혀 공지되어 있지 않았다. 이러한 배경하에, 이들 펩티드의 공업적으로 저렴한 제조법의 개발이 요망되고 있다.
본 발명은 복잡한 합성방법을 경유하지 않고 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩티드를 제조할 수 있는 신규 효소를 제공하는 것을 과제로 한다. 보다 상세하게는, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드 생성반응을 촉매하는 신규 효소, 이러한 효소를 생산하는 미생물 및 이러한 효소 또는 미생물을 사용하는 저렴한 펩티드의 제조방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 목적을 감안하여 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자 등은 신규하게 밝혀낸 엠페도박터(Empedobacter)속 등에 속하는 세균으로부터 펩티드를 효율적으로 생성하는 신규 효소를 밝혀내고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 하기와 같다.
[1] 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 엠페도박터속 또는 스핀고박테리움속 유래의 효소.
[2] 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 가지며, 하기 (i) 내지 (iv)의 조건하의 디펩티드 생성반응으로 L-알라닐-L-글루타민의 생성속도가 0.03mM/분 이상으로 되는 능력을 갖는 효소:
(i) 카복시 성분이 L-알라닌메틸에스테르 염산염(100mM),
(ii) 아민 성분이 L-글루타민(200mM),
(iii) pH가 9.0, 및
(iv) 효소 첨가량이 단백질량으로서 0.61mg/ml 미만.
[3] 카복시 성분으로서 아미노산에스테르 및 아미노산아미드 둘 다를 기질로 할 수 있는, [1] 또는 [2]에 기재된 효소.
[4] 아민 성분으로서 아미노산, C 보호 아미노산, 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있는, [1] 내지 [3]의 어느 한 항에 기재된 효소.
[5] pH가 6.5 내지 10.5의 범위에서 펩티드를 생성하는 능력을 갖는, [1] 내지 [4]의 어느 한 항에 기재된 효소.
[6] 온도조건이 0 내지 60℃의 범위에서 펩티드를 생성하는 능력을 갖는, [1] 내지 [5]의 어느 한 항에 기재된 효소.
[7] 세린 효소 억제제인 페닐메틸설포닐플루오리드에 의해서는 억제되지 않으나, p-니트로페닐-p'-구아니디노벤조에이트로 억제되는, [1] 내지 [6]의 어느 한 항에 기재된 효소.
[8] SDS-겔 전기영동에 의한 분자량이 약 75kDa, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 약 150kDa인, [1] 내지 [7]의 어느 한 항에 기재된 효소.
[9] [1] 내지 [8]의 어느 한 항에 기재된 효소를 생산하는 미생물.
[10]엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일 ; 2002년 7월 8일) 또는 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)인, [9]에 기재된 미생물.
[11] [1] 내지 [8]의 어느 한 항에 기재된 효소 또는 당해 효소의 함유물을 사용하여, 카복시 성분과 아민 성분에서 디펩티드를 생성하는 디펩티드의 제조방법.
이하, 실시예를 들어 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들로 한정되는 것이 아니다. 생성물의 측정에는 박층 크로마토그램의 닌하이드린 발색에서의 확인(정성)에 추가하여, 정량적으로는 하기에 기재된 고속 액체 크로마토그래피로써 정량하였다. 칼럼: InertsiL ODS-2(GL 사이언스사제), 용출액: 5.0mM 1-옥탄설폰산나트륨을 포함하는 인산 수용액(pH 2.1):메탄올= 100:15 내지 50, 유량: 1.0mL/min, 검출 210nm.
(실시예 1) 미생물의 배양(엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113)
1L 중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g을 포함하는 배지(pH 6.2) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 나누어 넣고, 115℃에서 15분 동안 살균하였다. 여기 동일 배지에서 30℃, 16시간 동안 배양한 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)을 1백금이(耳)로 접종하여, 30℃, 120왕복/분으로 16시간 동안 진탕 배양을 실시하였다.
(실시예 2) 미생물 균체를 사용하는 펩티드의 생산
실시예 l에서 수득된 배양액을 원심분리(10,000rpm, 15분)하여 균체를 수집하고 10mM EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0)에 100g/L가 되도록 현탁하였다. 현탁액 1mL를 EDTA 10mM과 하기 카복시 성분 200mM과, 하기 아미노산 400mM를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 1mL에 각각 첨가하고, 전량을 2mL로 한 다음, 18℃에서 2시간 동안 반응을 수행하였다. 이 결과, 생성된 펩티드를 표 1에 기재하였다.
(카복시 성분은 모두 염산염을 사용)
(실시예 3) 효소의 정제
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시하였다. 실시예 1과 동일하게 엠페도박터 브레비스 FERM BP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일 ; 2002년 7월 8일)를 배양하여, 원심분리(10,000rpm, 15분)에 의해서 균체를 수집하였다. 균체 16g을 50mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)으로 세정한 다음, 동일 완충액 40ml에 현탁하여, 195W에서 45분 동안 초음파 파쇄처리를 수행하였다. 이러한 초음파 파쇄액을 원심분리(10,000rpm, 30분)하여, 파쇄 균체파편을 제거함으로써 초음파 파쇄액 상층액을 수득하였다. 이러한 초음파 파쇄액 상층액을 50mM 트리스-염산 완충액(pH 8.0)에 대하여 하룻밤 투석하고, 초원심분리(50,000rpm, 30분)에 의해 불용성 분획을 제거함으로써 상층액으로서 가용성 분획을 수득하였다. 수득된 가용성 분획을 트리스-염산 완충액(pH 8.0)으로 미리 평형화한 Q-Sepharose HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 비흡착 분획으로부터 활성 분획을 수집하였다. 이러한 활성 분획을 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)에 대하여 하룻밤 투석하여, 원심분리(10,000rpm, 30분)에 의해 불용성 분획을 제거함으로써 상층액으로서 투석 분획을 수득하였다. 이러한 투석 분획을 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 Mono S 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, O 내지 1M NaCl을 포함하는 동일 완충액의 직선적인 농도 구배에서 효소를 용출시켰다. 활성 분획 내에 협잡 단백질의 가장 적은 1분획을 1M NaCl을 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 Superdex 200pg 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 1M NaCl을 포함하는 동일 완충액(pH 4.5)을 흘림으로써 겔 여과를 실시하고, 활성 분획 용액을 수득하였다. 이들 조작에 따라 본 발명에 사용되는 펩티드 생성 효소는 전기영동의 실험 결과로부터 균일하게 정제되는 것이 확인되었다. 상기한 정제공정에서 효소의 회수율은 12.2%, 정제도는 707배이었다.
(실시예 4) 효소의 분자량 측정
(SDS-겔 전기영동)
실시예 3의 방법에 따라 수득된 정제 효소 분획 0.3μg 상당을 폴리아크릴아미드 전기영동에 제공하였다. 전기영동 완충액에는 0.3%(w/v) 트리스, 1.44%(w/v) 글리신, O.1%(w/v) 라우릴황산나트륨을, 폴리아크릴아미드 겔은 겔 농도 10 내지 20%의 농도 구배 겔(멀티겔 10-20, 다이이치가가쿠야쿠힝제), 분자량 마커는 파마시아제 분자량 마커를 사용하였다. 전기영동 종료후, 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250에 의해 겔을 염색하고, 분자량 약 75kDa 위치에서 균일한 밴드를 검출하였다.
(겔 여과)
실시예 3의 방법에 따라 수득된 정제 효소 분획을 1M NaCl을 포함하는 50mM 아세트산 완충액(pH 4.5)으로 미리 평형화한 Superdex 200pg 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 1M NaCl을 포함하는 동일 완충액(pH 4.5)를 흘림으로써 겔 여과를 실시하고, 분자량을 측정하였다. 검량선을 작성하기 위한 분자량 기지(旣知)의 표준 단백질로서는 파마시아제 분자량 마커를 사용하였다. 이 결과, 수득된 효소의 분자량은 약 150kDa이었다.
SDS-겔 전기영동과 겔 여과의 결과로부터, 본 효소는 분자량 약 75kDa의 호모다이머인 것이 시사되었다.
(실시예 5) 효소의 최적 pH
L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 반응에서 pH의 영향을 검토하였다. 완충액으로서는 아세트산 완충액(pH 3.9 내지 5.4), MES 완충액(pH 5.4 내지 6.4), 인산 완충액(pH 6.0 내지 7.9), 붕산 완충액(pH 7.8 내지 9.3), CAPS 완충액(pH 9.3 내지 10.7) 및 K2HPO4-NaOH 완충액(pH 10.8 내지 11.6)을 사용하였다. 100mM L-알라닌메틸에스테르, 200mM L-글루타민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM의 각각의 완충액 100μl에 실시예 3에서 수득된 Mono S 분획효소(약 180U/ml)를 1μl 가하여, 18℃, 5분 동안 반응시켜 반응에 대한 pH의 영향을 측정하였다. 붕산 완충액(pH 9.3)을 사용하는 경우의 활성을 100%로 한 결과를 도 1에 도시하였다. 이 결과, 본 효소의 최적 pH는 8 내지 9.5이었다.
(실시예 6) 효소의 최적온도
L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민을 생성하는 반응에서 온도의 영향을 검토하였다. 100mM L-알라닌메틸에스테르, 200mM L-글루타민, 10mM EDTA를 포함하는 100mM의 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획을 1μl 가하여, 각 온도에서 5분 동안 반응시켜 반응에 대한 온도의 영향을 측정하였다. 34℃에서의 활성을 100%로 한 결과를 도 2에 도시하였다. 이 결과, 본 효소의 최적온도는 30 내지 40℃이었다.
(실시예 7) 효소의 억제제
L-알라닌메틸에스테르 염산염과 L-글루타민을 기질로서 사용하여, L-알라닐-L-글루타민 생성에 대한 억제제의 영향을 검토하였다. 표 2에 기재된 10mM의 각종 효소 억제제를 포함하는 100mM의 붕산 완충액(pH 9.0) 50μl에 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 가하여, 25℃에서 5분 동안 반응시켰다. 또한, o-페난트롤린, 페닐메틸설포닐플루오리드, p-니트로페닐-p'-구아니디노벤조에이트에 관해서는 50mM이 되도록 메탄올에 용해한 것을 사용하였다. 각 조건에서의 효소활성은 효소 억제제를 가하지 않는 조건에서 L-알라닐-L-글루타민 생성을 100으로 하는 경우의 상대활성으로 나타낸다. 결과를 표 2에 기재하였다. 이 결과, 본 효소는 시험된 세린 효소 억제제 중 페닐메틸설포닐플루오리드로는 억제되지 않지만, p-니트로페닐-p'-구아니디노벤조에이트로 억제되는 성질을 나타내었다.
효소 억제제 L-Ala-L-Gln 생성 상대활성 (%)
없음 100
금속 효소 억제제 EDTA 96
o-페난스롤린 96
SH 효소 억제제 N-에틸 말레이미드 110
모노요오도 아세테이트 101
세린 효소 억제제 페닐메틸설포닐플루오리드 115
4-(2-아미노에틸)벤젠 설포닐플루오리드 75
p-니트로페닐-p'-구아니디노벤조에이트 0.1
(실시예 8) L-알라닌메틸에스테르와 L-글루타민으로부터 L-알라닐-L-글루타민의 생산
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 3μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 염산염, 200mM의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 18℃에서 반응시켰다. 이 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, 효소 첨가구에서는 반응 60분에서 83mM의 L-알라닐-L-글루타민(L-Ala-L-Gln)이 생성되며, 부가적으로 생성되는 L-Ala-L-Ala-L-Gln은 1.3mM이었다. 한편, 효소 무첨가구에서 L-Ala-L-Gln 생성은 거의 확인되지 않으며 반응 120분에서 0.07mM 정도이었다.
(실시예 9) L-알라닐-L-글루타민의 생산에 대한 L-글루타민 농도의 영향
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 1μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 염산염, 표 3에 기재하는 농도의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 18℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 이 결과를 표 3에 기재하였다.
L-알라닌메틸에스테르 염산염 (mM) L-글루타민 (mM) L-Ala-L-Gln (mM)
100 100 68.2
110 72.1
120 73.3
130 75.1
150 75.5
200 82.0
(실시예 10) 효소의 기질 특이성(1)
카복시 성분으로서 L-아미노산에스테르를 사용하는 경우에 에스테르 특이성을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 4에 기재된 100mM의 카복시 성분, 200mM L-글루타민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 25℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 L-A1a-L-Gln 양을 표 4에 기재하였다 (표 4 중에서 HCl은 염산염을 나타낸다).
카복시 성분 L-A1a-L-Gln 생성 (mM)
L-알라닌메틸에스테르·HCl 84.3
L-알라닌에틸에스테르·HCl 91.5
L-알라닌이소프로필에스테르·HCl 78.9
L-알라닌-3급-부틸 에스테르·HCl 7.5
(실시예 11) 효소의 기질 특이성(2)
카복시 성분에 L-알라닌메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 100mM의 L-알라닌메틸에스테르 염산염, 150mM의 표 5에 기재하는 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 5에 기재하였다 (+ 표시는 펩티드의 생성은 확인되지만, 표준형이 없어서 정량할 수 없는 것이며, tr은 미량을 나타낸다).
(실시예 12) 효소의 기질 특이성(3)
카복시 성분에 각종 L-아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 L-글루타민을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 6에 기재된 100mM의 L-아미노산메틸에스테르 염산염(AA-0Me·HCl), 150mM의 L-글루타민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 6에 기재하였다 (+ 표시는 표준형이 없어서 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, L-Trp-OMe, L-Tyr-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 종말농도 O.1%가 되도록 첨가하였다.
(카복시 성분은 모두 염산염을 사용)
(실시예 13) 효소의 기질 특이성(4)
카복시 성분에 각종 L-아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 7에 기재된 100mM의 L-아미노산메틸에스테르 염산염(AA-0Me·HCl), 표 7에 기재된 150mM의 각종 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 7에 기재하였다 (tr는 미량을 나타낸다). 또한, L-Trp-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 종말농도 O.1%가 되도록 첨가하였다 (+ 표시는 표준형이 없어서 정량할 수 없지만, 생성이 확인되는 것을 나타낸다).
(카복시 성분은 모두 염산염을 사용)
(실시예 14) 효소의 기질 특이성(5)
카복시 성분에 각종 L- 또는 D-형의 아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 각종 L- 또는 D-형의 아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 8에 기재된 100mM의 아미노산메틸에스테르 염산염(AA-OMe·HCl), 표 8에 기재된 150mM의 각종 아미노산, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 8에 기재하였다 (tr는 미량을 나타낸다).
(카복시 성분은 모두 염산염을 사용)
(실시예 15) 효소의 기질 특이성(6)
카복시 성분에 각종 L-아미노산아미드, 아민 성분에 각종 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 9에 기재된 100mM의 L-아미노산아미드(AA-NH2·HCl), 표 9에 기재된 150mM의 L-아미노산, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 9에 기재하였다.
(실시예 16) 효소의 기질 특이성(7)
카복시 성분에 각종 L-알라닌메틸에스테르, 아민 성분에 C 보호 L-아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 10에 기재된 100mM의 L-아미노산메틸에스테르(AA-0Me·HCl), 표 10에 기재된 150mM의 L-아미노산아미드, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 10에 기재하였다.
(실시예 17) 효소의 기질 특이성(8)
카복시 성분에 각종 아미노산메틸에스테르, 아민 성분에 메틸 아민을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 11에 기재된 100mM의 아미노산메틸에스테르(AA-0Me·HCl), 표 11에 기재된 150mM의 메틸아민, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 11에 기재하였다.
(실시예 18) 효소의 기질 특이성(9)
카복시 성분으로서 β-아미노산에스테르 또는 아민 성분으로서 β-아미노산을 사용하는 경우에 펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 12에 기재된 100mM의 카복시 성분, 표 12에 기재된 150mM의 아민 성분, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하고, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 12에 기재하였다 (tr는 미량을 나타낸다).
(실시예 19) 효소의 기질 특이성(10)
카복시 성분으로서 L-아미노산에스테르, 아민 성분으로서 펩티드를 사용하는 경우에 올리고펩티드 생산을 검토하였다. 실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획 2μl를 표 13에 기재된 100mM의 카복시 성분, 표 13에 기재된 150mM의 아민 성분, 10mM의 EDTA를 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl에 가하여, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 13에 기재하였다. 이 결과, 본 효소는 디펩티드 생산 뿐만 아니라, 아민 성분으로서 펩티드를 사용함으로써 쇄 길이가 긴 펩티드도 생산할 수 있는 것이 명백해졌다.
이상, 실시예 9 내지 19에 기재된 바와 같이, 엠페도박터 브레비스 FERM PBP-8113주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁이관일; 2002년 7월 8일)로부터 수득된 본 효소가 매우 기질 특이성이 넓은 효소인 것이 판명됐다.
(* L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala-L-Ala의 용해도가 낮으므로, 이러한 시스템에서는 카복시 성분 10mM, 아민 성분 15mM의 농도를 사용하였다. 다른 조건은 실시예의 설명과 동일하다.)
(실시예 20) 기존 효소와의 펩티드 생성 촉매능력의 비교
본 효소의 펩티드 생성능력을 기존 효소와 비교하였다. 기존 효소로서는 EP 278787A1에 기재된 카복시펩티다제Y, EP 359399B1에 기재된 티올엔도펩티다제(피신, 파파인, 브로멜라인, 키모파파인)를 사용하며, 이들에 관해서는 시그마사제의 정제 효소를 사용하였다. 본 효소원으로서는 실시예 3에서 균일하게 정제한 효소를 사용하였다. 이들 효소는 단백질량으로서 표 14에 기재하는 양을 반응계에 첨가하였다. 반응은 100mM L-알라닌메틸에스테르와 200mM L-글루타민을 포함하는 100μl의 붕산 완충액(pH 9.0)에 가하고, 25℃에서 반응시켰다. 또한, 카복시펩티다제는 1mM의 EDTA를 포함하는 10mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 용해한 효소, 티올엔도펩티다제는 2mM EDTA, 0.1M KCl, 5mM 디티오트레이톨을 포함하는 10mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 용해한 효소를 사용하였다. 이들 효소에 의한 L-알라닐-L-글루타민의 생성 속도비를 표 14에 기재하였다.
이 결과, 효소 무첨가에서도 극히 미량의 L-알라닐-L-글루타민 생성이 관찰되며, 카복시펩티다제 또는 티올엔도펩티다제 첨가구에서는 효소 무첨가구에 비하여 약간 생성속도가 빨라지는 것이 관찰되었다. 이에 대해 본 효소의 첨가구에서는 압도적으로 빠른 L-알라닐-L-글루타민 생성속도가 관찰되며, 이의 속도는 카복시펩티다제Y, 티올엔도펩티다제에 대해 약 5,000배 내지 100,000배이었다. 이상과 같이, 본 효소는 지금까지의 예가 없는 매우 빠른 펩티드 생성속도를 갖고 있는 것이 판명됐다. 또한, 본 효소의 분자량은 약 75000의 이량체인 데 대해 카복시펩티다제Y의 분자량은 약 61000, 상기 티올엔도펩티다제의 분자량은 약 23000 내지 36000으로 보고되어 있으므로, 분자량당의 L-알라닐-L-글루타민 생성속도는 실시예에 기재된 단위 중량당보다 본 발명의 효소에 있어서 보다 빠르게 된다.
(실시예 21) 스핀고박테리움 종 균체를 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)의 배양에는 1L 중에 글루코스 5g, 황산암모늄 5g, 인산1칼륨 1g, 인산2칼륨 3g, 황산마그네슘 0.5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g을 포함하는 배지(pH 7.0) 50mL를 500mL 경사구 플라스크에 나누어 넣고, 115℃에서 15분 동안 살균한 것을 사용하였다. 여기에 1L 중에 글루코스 5g, 효모 추출물 10g, 펩톤 10g, NaCl 5g을 포함하는 사면(斜面) 한천배지(한천 20g/L, pH 7.0)에서 30℃, 24시간 동안 배양한 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일)을 1백금이 접종하여, 30℃, 120왕복/분으로 20시간 동안 진탕 배양을 실시하였다. 이러한 배양액 1ml를 상기 배지(50ml/500mL 경사구 플라스크)에 첨가하여, 30℃, 18시간 동안 배양하였다. 배양 종료후, 이들의 배양액으로부터 균체를 원심분리하여, 습균체로서 100g/L이 되도록 10mM의 EDTA를 포함하는 0.1M 붕산 완충액(pH 9.0)으로 현탁하였다. 이러한 균체 현탁액 0.1mL에 EDTA 10mM, L-알라닌메틸에스테르 염산염 200mM 및 L-글루타민 400mM을 포함하는 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 0.1mL를 첨가하고, 전량을 O.2mL로 한 다음, 25℃에서 120분 동안 반응을 실시하였다. 이때의 L-알라닐-L-글루타민의 생성량은 62mM이었다.
(실시예 22) 스핀고박테리움 종으로부터의 효소의 정제
이하, 원심분리 이후의 조작은 빙상 또는 4℃에서 실시하였다. 실시예 21과 동일하게 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일 ; 2002년 7월 22일)를 배양하여, 원심분리(10,000rpm, 15분)에 의해서 균체를 수집하였다. 균체 2g을 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 세정한 다음, 동일 완충액 8ml에 현탁하여, 195W에서 45분 동안 초음파 파쇄처리를 실시하였다. 이러한 초음파 파쇄액을 원심분리(10,000rpm, 30분)하여, 파쇄 균체편을 제거함으로써 초음파 파쇄액 상층액을 수득한다. 이러한 초음파 파쇄액 상층액을 20mM 트리스-염산 완충액(pH 7.6)에 대하여 하룻밤 투석하고, 초원심분리(50,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거하여 상층액으로서 가용성 분획을 수득하였다. 수득된 가용성 분획을 트리스-염산 완충액(pH 7.6)으로 미리 평형화한 Q-Sepharose HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하여, 비흡착 분획으로부터 활성 분획을 수집하였다. 이러한 활성 분획을 20mM 아세트산 완충액(pH 5.0)에 대하여 하룻밤 투석하고, 원심분리(10,000rpm, 30분)로써 불용성 분획을 제거하여 상층액으로서 투석 분획을 수득하였다. 이러한 투석 분획을 20mM 아세트산 완충액(pH 5.0)으로 미리 평형화한 SP-Sepharose HP 칼럼(아마샴사제)에 제공하며, O 내지 1M NaCl을 포함하는 동일 완충액의 직선적인 농도 구배에서 효소를 용출시킨 활성 분획을 수득하였다.
(실시예 23) 효소 분획을 사용하는 L-알라닐-L-글루타민의 생산
실시예 22에서 정제한 SP-Sepharose HP 분획(약 27U/ml) 10μl를 111mM의 L-알라닌메틸에스테르 염산염, 222mM의 L-글루타민, 11mM의 EDTA를 포함하는 111mM 붕산 완충액(pH 9.0) 90μl에 가하여, 25℃에서 120분 동안 반응시켰다. 그 결과, 효소 첨가구에서는 73mM의 L-알라닐-L-글루타민이 생성되었다. 한편, 효소 무첨가구에서의 L-Ala-L-Gln 생성은 거의 확인되지 않으며 반응 120분에서 0.07mM 정도이었다.
(실시예 24) 효소의 기질 특이성(11)
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일) 유래 효소의 기질 특이성을 검토하였다. 표 15-1 내지 표 15-4에 기재된 종말농도 100mM의 각종 카복시 성분과 150mM의 각종 아민 성분, 실시예 22에서 정제한 SP-Sepharose HP 분획효소(반응액 중에 O.33 유닛 첨가)를 포함하는 10mM의 EDTA 함유 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하고, 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 15에 기재하였다 (+ 표시는 표준형이 없어서 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, L-Tyr-OMe를 사용하는 경우에는 반응계에 Tween-80을 종말농도 O.1%가 되도록 첨가하였다. 또한, 카복시 성분은 모두 염산염을 사용하였다.
(실시예 25) 효소의 기질 특이성(12)
스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주(기탁기관; 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터, 기탁기관 주소; 일본국 이바라기켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1반지 1 츄오 제6, 국제기탁일; 2002년 7월 22일) 유래 효소의 올리고펩티드 생산에 대한 기질 특이성을 검토하였다. 표 16에 기재하는 종말농도 100mM의 각종 카복시 성분과 150mM의 각종 아민 성분, 실시예 22에서 정제한 SP-Sepharose HP 분획효소(반응액 중에 0.33 유닛 첨가)를 포함하는 10mM의 EDTA 함유 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하고, 25℃에서 1.5시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 올리고펩티드의 생산량을 표 16에 기재하였다. 또한, 카복시 성분은 모두 염산염을 사용하였다.
(실시예 26) 효소의 기질 특이성(13)
실시예 5에서 사용한 것과 동일한 효소 분획을 사용하여, 다시 이의 기질 특이성을 검토하였다.
표 17에 기재된 종말 농도의 각종 카복시 성분과 각종 아민 성분, 효소(반응액 중에 0.1 유닛 첨가)를 포함하는 10mM의 EDTA 함유 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하여, 25℃에서 표 17에 기재된 반응시간으로 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 펩티드의 생산량을 표 17에 기재하였다 (+ 표시는 표준형이 없어서 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다).
(약어)
H-Ala-OMe: L-알라닌메틸에스테르 염산염
H-p-F-Phe-OMe: p-플루오로-L-페닐알라닌메틸에스테르 염산염
H-Cl-F-Phe-0Me: p-클로로-L-페닐알라닌메틸에스테르 염산염
H-p-NO2-Phe-OMe: p-니트로-L-페닐알라닌메틸에스테르 염산염
H-t-Leu-OMe: 3급-L-류신메틸에스테르 염산염
H-2-Na1-0Me: 3-(2-나프틸)-L 알라닌메틸에스테르 염산염
H-Aib-OMe: α-아미노이소부티르산메틸에스테르 염산염
H-N-Me-Ala-OMe: N-메틸-L-알라닌메틸에스테르 염산염
H-CHA-OMe: β-사이클로헥실-L-알라닌메틸에스테르 염산염
H-Ser(tBu)-OMe: O-3급-부틸-L-세린메틸에스테르 염산염
H-Asp(OtBu)-OMe: L-아스파르트산β-3급-부틸에스테르α-메틸에스테르 염산염
H-Lys(Boc)-OMe: N-ε-3급-부톡시카보닐-L-리신메틸에스테르 염산염
H-p-F-Phe-OH: p-플루오로-L-페닐알라닌
H-Cl-F-Phe-OH: p-클로로-L-페닐알라닌
H-p-NO2-Phe-OH: p-니트로-L-페닐알라닌
H-t-Leu-OH: 3급-L-류신
H-2-Nal-OH: 3-(2-나프틸)-L 알라닌
H-Gln-OH: L-글루타민
H-Phe-OH: L-페닐알라닌
H-Ser(tBu)-OH: O-3급-부틸-L-세린
H-Asp(OtBu)-OH: L-아스파르트산β-3급-부틸에스테르
H-Lys(Boc)-OH: N-ε-tert-부톡시카보닐-L-리신
(실시예 27) 효소의 기질 특이성(14)
실시예 26과 동일한 효소 분획을 사용하여, 올리고펩티드 생산에 대한 기질 특이성을 검토하였다. 표 18에 기재된 종말 농도의 각종 카복시 성분과 각종 아민 성분, 효소(반응액 중에 첨가한 유닛수는 표 18에 기재)를 포함하는 10mM의 EDTA 함유 100mM 붕산 완충액(pH 9.0) 100μl의 반응액을 사용하여, 25℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 본 반응에서 생성된 각종 올리고펩티드의 생산량을 표 18에 기재하였다 (+ 표시는 표준형이 없어서 정량할 수 없지만, 생성은 확인되는 것이며, tr은 미량을 나타낸다). 또한, 카복시 성분은 모두 염산염을 사용하였다.
본 발명에 따라, 보호기의 도입·이탈 등의 복잡한 합성방법을 경감시켜, 간편하면서 또한 고수율로 저렴하게 펩티드를 제조할 수 있는 신규 효소가 제공된다. 본 발명의 효소를 사용함으로써, 효율적인 펩티드의 공업 생산을 할 수 있다.

Claims (11)

  1. 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 갖는, 엠페도박터(Empedobacter)속 또는 스핀고박테리움(Sphingobacterium)속 유래의 효소.
  2. 카복시 성분과 아민 성분으로부터 펩티드를 생성하는 능력을 가지며, 하기 (i) 내지 (iv)의 조건하의 디펩티드 생성반응에서 L-알라닐-L-글루타민의 생성 속도가 O.O3mM/분 이상으로 되는 능력을 갖는 효소:
    (i) 카복시 성분이 L-알라닌메틸에스테르 염산염(100mM),
    (ii) 아민 성분이 L-글루타민(200mM),
    (iii) pH가 9.0, 및
    (iv) 효소 첨가량이 단백질량으로서 0.61mg/ml 미만.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 카복시 성분으로서 아미노산에스테르 및 아미노산아미드 둘 다를 기질로 할 수 있는 효소.
  4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 있어서, 아민 성분으로서, 아미노산, C 보호 아미노산 및 아민의 어느 하나를 기질로 할 수 있는 효소.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, pH가 6.5 내지 10.5의 범위에서 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 효소.
  6. 제1항 내지 제5항 중의 어느 한 항에 있어서, 온도조건이 0 내지 60℃의 범위에서 펩티드를 생성하는 능력을 갖는 효소.
  7. 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 있어서, 세린 효소 억제제인 페닐메틸설포닐플루오리드로는 억제되지 않으나 p-니트로페닐-p'-구아니디노벤조에이트로 억제되는 효소.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, SDS-겔 전기영동에 의한 분자량이 약 75kDa, 겔 여과 크로마토그래피에 의한 분자량이 약 150kDa인 효소.
  9. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 효소를 생산하는 미생물.
  10. 제9항에 있어서, 엠페도박터 브레비스(Empedobacter brevis) FERM BP-8113주 또는 스핀고박테리움 종 FERM BP-8124주인 미생물.
  11. 제1항 내지 제8항 중의 어느 한 항에 따른 효소 또는 당해 효소의 함유물을 사용하여, 카복시 성분과 아민 성분으로부터 디펩티드를 생성함을 포함하는, 디펩티드의 제조방법.
KR1020057001376A 2002-07-26 2003-07-25 펩티드를 생성하는 신규 효소, 이를 생산하는 미생물 및이들을 사용하는 디펩티드의 제조방법 KR20050025677A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2002-00218956 2002-07-26
JP2002218956 2002-07-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20050025677A true KR20050025677A (ko) 2005-03-14

Family

ID=31972369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020057001376A KR20050025677A (ko) 2002-07-26 2003-07-25 펩티드를 생성하는 신규 효소, 이를 생산하는 미생물 및이들을 사용하는 디펩티드의 제조방법

Country Status (11)

Country Link
US (1) US20040253665A1 (ko)
EP (1) EP1553171A4 (ko)
JP (1) JP4501689B2 (ko)
KR (1) KR20050025677A (ko)
CN (1) CN1316016C (ko)
AU (1) AU2003248117A1 (ko)
BR (1) BR0305638A (ko)
CA (1) CA2509765C (ko)
PL (2) PL211730B1 (ko)
RU (1) RU2300565C2 (ko)
WO (1) WO2004022733A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102650468B1 (ko) * 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005168405A (ja) 2003-12-11 2005-06-30 Ajinomoto Co Inc ジペプチドの製造方法
US20060188976A1 (en) * 2004-12-20 2006-08-24 Ajinomoto Co. Inc Mutant protein having the peptide-synthesizing activity
WO2006104186A1 (ja) * 2005-03-29 2006-10-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ジペプチドの結晶およびその製造法
US20090306340A1 (en) * 2006-06-28 2009-12-10 Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. Method for purification of oligopeptides
DE112009001080T5 (de) * 2008-05-12 2011-03-03 Ajinomoto Co., Inc. Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon
DE102009002044A1 (de) * 2009-03-31 2010-10-07 Evonik Degussa Gmbh Dipeptide als Futtermitteladditive
CN104561202B (zh) * 2015-02-06 2018-02-09 江苏诚信药业有限公司 一种酶催化合成丙谷二肽的制备方法及工艺系统
CN106754447B (zh) * 2016-12-30 2020-08-25 大连医诺生物股份有限公司 重组酿酒酵母及其在合成丙谷二肽中的应用
WO2018121458A1 (zh) 2016-12-30 2018-07-05 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
CN106754985B (zh) * 2016-12-30 2019-08-13 大连医诺生物股份有限公司 编码丙谷二肽生物合成酶的基因及其应用
US10793594B2 (en) 2017-04-19 2020-10-06 Indiana University Research And Technology Corporation Antimicrobial compounds and/or modulators of microbial infections and methods of using the same

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2953499A (en) * 1956-04-19 1960-09-20 Ajimomoto Co Inc Process for producing l-glutamic acid from hardly soluble amino-acid
US3847744A (en) * 1971-12-14 1974-11-12 Ajinomoto Kk Method of producing elastases by bacteria
DK72587D0 (da) * 1987-02-13 1987-02-13 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider
CA1337936C (en) * 1987-08-07 1996-01-16 Akiva Tuvia Gross Vibriolysin coupling process
DK163435C (da) * 1988-08-12 1992-07-20 Carlsberg Biotechnology Ltd Fremgangsmaade til enzymatisk fremstilling af dipeptider og derivater deraf
US6825016B1 (en) * 1999-04-12 2004-11-30 Arkray, Inc. α-glycated amino acid releasing enzyme

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102650468B1 (ko) * 2024-01-19 2024-03-25 큐티스바이오 주식회사 생물전환공정을 이용한 디펩타이드의 제조방법

Also Published As

Publication number Publication date
PL211730B1 (pl) 2012-06-29
CN1671840A (zh) 2005-09-21
JPWO2004022733A1 (ja) 2005-12-22
PL374192A1 (en) 2005-10-03
RU2300565C2 (ru) 2007-06-10
BR0305638A (pt) 2004-09-08
CN1316016C (zh) 2007-05-16
CA2509765C (en) 2011-04-26
WO2004022733A1 (ja) 2004-03-18
US20040253665A1 (en) 2004-12-16
RU2005105321A (ru) 2005-08-10
EP1553171A4 (en) 2005-09-21
EP1553171A1 (en) 2005-07-13
PL211754B1 (pl) 2012-06-29
JP4501689B2 (ja) 2010-07-14
AU2003248117A1 (en) 2004-03-29
CA2509765A1 (en) 2004-03-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100762730B1 (ko) 신규 펩타이드 신타제 유전자
KR100635803B1 (ko) 펩타이드 생성 효소 유전자, 펩타이드 생성 효소 및디펩타이드의 제조방법
Yokozeki et al. A novel and efficient enzymatic method for the production of peptides from unprotected starting materials
JP4501689B2 (ja) ペプチドを生成する新規酵素およびこれを生産する微生物およびこれらを用いるジペプチドの製造方法
Stelkes-Ritter et al. Purification and characterization of a newly screened microbial peptide amidase
JP4483579B2 (ja) トリペプチド以上のペプチドの製造方法
US20050032187A1 (en) Novel peptide-forming enzyme, microbe producing the enzyme and method for producing peptide using them
KR100760974B1 (ko) 디펩티드의 제조 방법
JPH04311389A (ja) 新規なチオールプロテアーゼ
CN100999753A (zh) 肽生成酶的基因、肽生成酶以及二肽的生产方法

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
J201 Request for trial against refusal decision
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
J501 Disposition of invalidation of trial
E801 Decision on dismissal of amendment
B601 Maintenance of original decision after re-examination before a trial
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20070319

Effective date: 20071119