DE112009001080T5

DE112009001080T5 - Verfahren zum Herstellen von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon

Info

Publication number: DE112009001080T5
Application number: DE112009001080T
Authority: DE
Inventors: Rie Takeshita; Yasuaki Takakura; Shunichi Suzuki; Kenzo Yokozeki
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2008-05-12
Filing date: 2009-05-12
Publication date: 2011-03-03
Also published as: US20110081678A1; WO2009139392A1; JPWO2009139392A1

Abstract

Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon, welches das Bilden der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon bilden kann.

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure, wie β-Alanylhistidin (Carnosin) oder eines Derivats davon.
Hintergrund der Erfindung
β-Alanylhistidin (Carnosin), das eine β-Alanylaminosäure ist, ist ein Dipeptid, das aus β-Alanin und Histidin besteht, und ist in Muskeln, dem Gehirn und im Herz von Säugetieren, einschließlich des Menschen, reichlich vorhanden. Obwohl seine Rolle in vivo nicht geklärt ist, sind eine Aktivität zum Einstellen des pH-Wertes, eine entzündungshemmende Wirkung, eine Gewebewiederherstellungswirkung, eine immunregulatorische Wirkung, eine antioxidative Wirkung, eine Antiproteinglycosilierungswirkung und dergleichen berichtet worden.
Es ist ein Verfahren zum Herstellen von Carnosin mit einem Enzym bekannt, welches eine Reaktion (β-Ala + His → β-Ala-His) zur Bildung von β-Alanylhistidin (d. h. Carnosin) aus β-Alanin und Histidin katalysiert (vgl. die Nichtpatentliteratur 1 und 2 und die Patentliteratur 1). Das Enzym benötigt jedoch ATP für die Reaktion.
Es wurde berichtet, dass ein Imidazol enthaltendes Dipeptid, wie Carnosin, durch das vorstehend beschriebene Verfahren synthetisiert wird, indem Imidazoldipeptidsynthase aus Aalmuskel verwendet wird (vgl. Nichtpatentliteratur 3). Dieses Enzym benötigt kein ATP, es hat jedoch eine geringe Effizienz bezüglich der Bildung von Carnosin.

Patentliteratur 1: US-Patentanmeldung Veröffentlichungsnummer 2005/0287627
Nichtpatentliteratur 1: Skaper SD, Das S, Marshall FD. Some properties of a homocarnosine-carnosine synthetase isolated from rat brain. J. Neurochem. 1973 Dec; 21(6): 1429–45
Nichtpatentliteratur 2: Horinishi H, Grillo M, Margolis FL. Purification and characterization of carnosine synthetase from mouse olfactory bulbs. J Neurochem. 1978 Oct; 31(4): 909–19
Nichtpatentliteratur 3: Tsubone S, Yoshikawa N, Okada S, Abe H. Purification and characterization of a novel imidazole dipeptide synthase from the muscle of the Japanese eel Anguilla japonica. Corp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol. 2007 Apr; 146(4): 560–7.

Offenbarung der Erfindung
Durch die Erfindung zu lösende Aufgabe
Vor dem Hintergrund des vorstehend beschriebenen Standes der Technik ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, Mittel zur effizienten Herstellung einer β-Alaninaminosäure, wie Carnosin, oder eines Derivats davon bereit zu stellen.
Mittel zum Lösen der Aufgabe
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um das vorstehend beschriebene Ziel zu erreichen, und sie haben im Verlauf dieser Untersuchungen ihr Augenmerk auf eine Reaktion (β-AlaOMe + His → β-Ala-His) zur Bildung von Carnosin unter Verwendung eines β-Alaninesters und Histidin als Substrate gelegt, und sie haben ein Screening von Mikroorganismen durchgeführt, die ein Enzym enthalten, welches eine solche Reaktion katalysiert. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben ein enzymatisches Protein aus dem so identifizierten Mikroorganismus gereinigt und haben dessen genetische Information identifiziert. Außerdem haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass das erhaltene enzymatische Protein nicht nur eine Reaktion katalysieren kann, bei der Carnosin unter Verwendung eines β-Alaninesters und Histidin als Substrate gebildet wird, sondern auch allgemein eine Reaktion katalysieren kann, bei der eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon gebildet wird, und sie haben die vorliegende Erfindung vervollständigt.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung die folgenden Punkte [1]-[18] bereit.

[1] Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon, welches das Bilden der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon bilden kann.
[2] Verfahren nach [1], welches das Verfahren zum Herstellen der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon ist und das Bilden der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus dem β-Alanylester und der Aminosäure oder dem Derivat davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon aus dem β-Alanylester und der Aminosäure oder dem Derivat davon bilden kann.
[3] Verfahren nach [1], welches das Verfahren zum Herstellen der β-Alanylaminosäure ist und das Bilden der β-Alanylaminosäure aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure bilden kann.
[4] Verfahren nach [1], welches ein Verfahren zum Herstellen von β-Alanylhistidin ist und das Bilden des β-Alanylhistidins aus dem β-Alanylester und Histidin mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, welches das β-Alanylhistidin aus dem β-Alanylester oder dem Histidin bilden kann.
[5] Verfahren nach [1], wobei das Enzym oder das enzymhaltige Produkt ein oder zwei oder mehr Mitglieder der Gruppe ist, die aus einer Kultur eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon, einer von der Kultur abgetrennten mikrobiellen Zelle und einem behandelten mikrobiellen Produkt des Mikroorganismus besteht.
[6] Verfahren nach [5], wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Gattung Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus, Erythrobasidium, Sphingosinicella oder Aspergillus ist.
[7] Verfahren nach [5], wobei der Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus ist, der ein Protein exprimieren kann, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Proteinen (A) bis (H), (K) und (L) besteht: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und das die Fähigkeit hat, die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon zu bilden; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (G) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls; (H) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 in dem Sequenzprotokoll umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (K) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls; und (L) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist.
[8] Verfahren nach [7], wobei die Aktivität eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylhistidin aus dem β-Alanylester und Histidin ist.
[9] Verfahren nach [5], wobei der Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus ist, in den ein Polynukleotid eingeführt worden ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Polynukleotigen (a) bis (h), (k) bis (n) besteht: (a) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (b) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat kodiert; (c) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (d) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid kodiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (e) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91–1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (f) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (g) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls; (h) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (k) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls; (l) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (m) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls; und (n) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert.
[10] Verfahren nach [1], wobei das Enzym mindestens ein Mitglied der Gruppe ist, die aus den folgenden Mitgliedern (A) bis (H), (K) und (L) besteht: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (G) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls; (H) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (K) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls; (L) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist.
[11] Protein, abgeleitet von einem Mikroorganismus einer Gattung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus und Erythrobasidium besteht, und welches eine Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist.
[12] Aus der aus den folgenden Proteinen (A) bis (F) bestehenden Gruppe ausgewähltes Protein: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist.
[13] Protein nach [12], wobei die Aktivität eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin ist.
[14] Polynukleotid, das für das Protein nach [12] kodiert.
[15] Polynukleotid, ausgewählt aus der aus den folgenden Polynukleotiden (a) bis (f), (m) und (n) bestehenden Gruppe: (a) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (b) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (c) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (d) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (e) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (f) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (m) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls; und (n) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert.
[16] Polynukleotid nach [15], wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
[17] Rekombinantes Polynukleotid, welches das Polynukleotid nach einem der Punkte [14] bis [16] aufweist.
[18] Mit dem Polynukleotid nach [17] transformierte Zelle.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Carnosinbildungsaktivität und die Carnosin Abbauaktivität (U/ml) von RhDmpA3 (Rh3) und seiner Homologen: BapA, abgeleitet von dem Stamm Sphingosinicella microcystinivorans Y2 (Y2); DmpA, abgeleitet von dem Stamm Pyrococcus horikoshii OT3 (PH); und DmpA, abgeleitet von dem Stamm Aspergillus oryzae RIB40 (As), welche in E. coli exprimiert worden sind;
2 zeigt die Prozentangaben der Carnosinbildungsaktivität und der Carnosinabbauaktivität von RhDmpA3 (Rh3) und seiner Homologen: BapA, abgeleitet von dem Stamm Sphingosinicella microcystinivorans Y2 (Y2); und DmpA, abgeleitet von dem Stamm Aspergillus oryzae RIB40 (As), die in E. coli exprimiert worden sind.
3 zeigt die Carnosinbildungsaktivität (%) eines gereinigten RhDmpA-Enzyms, wenn verschiedene β-Alaninester und β-Alaninamid als Substrat eingesetzt wurden. Die Abkürzungen haben folgende Bedeutungen: β-AlaOMe: β-Alaninmethylester; β-AlaOEt: β-Alaninethylester; β-AlaOtBu: β-Alanin-tert-butylester; β-AlaOBzl: β-Alaninbenzylester; und β-AlaNH₂: β-Alaninamid.
4 zeigt die Carnosinausbeute (bezogen auf Alanin in %) des gereinigten RhDmpA-Enzyms, wenn verschiedene β-Aladinester und β-Alaninamid als Substrat eingesetzt wurden. Die Abkürzungen sind dieselben wie in 3.
Beste Ausführungsformen der Erfindung
Die vorliegende Erfindung wird im Folgenden in der folgenden Reihenfolge beschrieben:

1. Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon,
2. Mikroorganismen, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden, und
3. Enzyme, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.

1. Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon
In dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon wird die β-Alanylaminosäure (Dipeptid) oder das Derivat davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon in Anwesenheit eines Enzyms mit einer bestimmten Aktivität gebildet. D. h., das erfindungsgemäße Verfahren bildet eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon mit dem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt, welches eine Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid oder einer Aminosäure oder eines Derivats davon aufweist.
Das Enzym oder das enzymhaltige Produkt, das die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist, bezieht sich auf ein Enzym oder ein enzymhaltiges Produkt, das im wesentlichen eine Fähigkeit oder Aktivität zur Katalyse einer Kondensationsreaktion eines β-Alanylesters oder eines β-Alanylamids und einer Aminosäure oder eines Derivats davon aufweist.
Die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon umfasst beispielsweise die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester und einer Aminosäure oder einem Derivat davon, die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon, die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure, die Fähigkeit zur Bildung eines Derivats einer β-Alanylaminosäure aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einem Derivat einer Aminosäure, und die Fähigkeit zur Bildung eine β-Alanylaminosäure aus einem β-Alanylester und einer Aminosäure.
In der vorliegenden Erfindung sind die Strukturen des β-Alanylesters oder des β-Alanylamids und die Strukturen der Aminosäure oder des Derivats davon, die als die Substrate in einer enzymatischen Reaktion eingesetzt werden, nicht besonders eingeschränkt, solange die Reaktion durch das erfindungsgemäße Enzym katalysiert werden kann.
Genauer gesagt ist der als Substrat in der enzymatischen Reaktion eingesetzte β-Alanylester eine Verbindung der Formel I: ₂HNCH₂CH₂CO-OR, wobei R eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe darstellen kann.
Beispiele der ”Kohlenwasserstoffgruppe” in der ”substituierten oder unsubstituierten” Kohlenwasserstoffgruppe” umfassen eine Alkylgruppe (beispielsweise eine C_1-6 Alkylgruppe, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl oder Hexyl) und eine Cycloalkylgruppe (beispielsweise eine C_3-6-Cycloalkylgruppe, wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl oder Cyclohexyl).
Beispiele eines ”Substituenten”, der zu der ”Kohlenwasserstoffgruppe in der ”substituierten Kohlenwasserstoffgruppe” gehört, umfassen ein Halogenatom (wie Fluor, Chlor, Brom oder Iod), eine Nitrogruppe, eine Cyangruppe, Hydroxygruppe, Carboxygruppe, Amingruppe, die vorstehend genannten Alkylgruppen, die vorstehend genannten Cycloalkylgruppen und eine Arylgruppe (wie Phenyl, 1-Naphthyl oder 2-Naphthyl).
Das als Substrat in der enzymatischen Reaktion eingesetzte β-Alanylamid ist eine Verbindung der Formel II: ₂HNCH₂CH₂CO-NR₁R₂, wobei R₁ und R₂ gleich oder verschieden sind und ein Wasserstoffatom oder eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe darstellen können. Die ”Kohlenwasserstoffgruppe” und der ”Substituent” in der ”substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffgruppe” können dieselben sein wie die vorstehend beschriebenen.
Die als Substrat in der enzymatischen Reaktion eingesetzte Aminosäure ist eine Verbindung, die sowohl eine Amingruppe als auch eine Carboxygruppe aufweist und beispielsweise Histidin, Alanin, Valin, Phenylalanin, Lysin, Arginin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Glycin, Asparagin, Glutamin, Threonin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Tyrosin, Tryptophan, Serin, Cystein und Methionin umfasst. Beispiele der Aminosäure umfassen eine α-Aminosäure, eine β-Aminosäure und eine γ-Aminosäure, wobei die α-Aminosäure und die β-Aminosäure bevorzugt sind. Die Aminosäure kann ein L-Isomer oder ein D-Isomer sein, wobei die L-Aminosäure bevorzugt ist.
Das in der enzymatischen Reaktion als Substrat eingesetzte Derivat der Aminosäure kann ein modifiziertes Derivat sein, bei dem die Amingruppe erhalten bleibt. Das Derivat der Aminosäure kann beispielsweise ein Derivat sein, das eine Modifikation einer Seitenkette der vorstehend beschriebenen Aminosäure aufweist, oder ein Derivat, das eine Substitution der Carboxygruppe der vorstehend beschriebenen Aminosäure mit einem Wasserstoffatom oder dem vorstehend beschriebenen ”Substituenten” aufweist (beispielsweise Histamin, das eine Struktur aufweist, bei der die Carboxygruppe des Histidins mit einem Wasserstoffatom substituiert ist). Beispiele des Derivats mit einer Modifikation einer Seitenkette der vorstehend beschriebenen Aminosäure umfassen eine Verbindung, in der die Seitenkette der vorstehend beschriebenen Aminosäure mit dem vorstehend beschriebenen ”Substituenten” substituiert ist, und eine Verbindung, in der ein beliebiges Atom (beispielsweise ein Wasserstoffatom) oder eine beliebige Gruppe in der Seitenkette der vorstehend beschriebenen Aminosäure mit dem vorstehend beschriebenen ”Substituenten” substituiert ist.
In einer Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ein Verfahren zum Herstellen von β-Alanylhistidin sein. Das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen von β-Alanylhistidin (im Folgenden auch als ”erfindungsgemäßes Verfahren zum Herstellen von Carnosin” bezeichnet) bildet β-Alanylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin in Anwesenheit eines Enzyms mit einer bestimmten Carnosin bildenden Aktivität. D. h., das erfindungsgemäße Verfahren zum Herstellen von Carnosin bildet β-Alanylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt, das die Fähigkeit zur Bildung von Alariylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin aufweist. Das Enzym oder das enzymhaltige Produkt, das die Fähigkeit zur Bildung von β-Alanylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin aufweist, bezieht sich auf ein Enzym oder ein enzymhaltiges Produkt, das im wesentlichen eine Fähigkeit oder Aktivität zur Katalyse einer Kondensationsration eines β-Alanylesters und Histidin aufweist, wobei die Reaktion durch die folgende chemische Formel dargestellt ist.
[Chem 1]
In der Reaktionsgleichung 1 stellt R eine substituierte oder unsubstituierte Kohlenwasserstoffgruppe dar. Die ”Kohlenwasserstoffgruppe” und der ”Substituent” in der ”substituierten oder unsubstituierten Kohlenwasserstoffgruppe” können dieselben wie die vorstehend beschriebenen sein.
Das Verfahren, bei dem zugelassen wird, dass das Enzym oder das enzymhaltige Produkt auf einen β-Alanylester oder ein β-Alanylamid und eine Aminosäure oder ein Derivat davon einwirkt, umfasst ein Verfahren, bei dem das Enzym oder das enzymhaltige Produkt mit dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon gemischt wird. Genauer gesagt kann ein Verfahren eingesetzt werden, bei dem das Enzym oder das enzymhaltige Produkt zu einer Lösung, die den β-Alanylester oder das β-Alanylamid und die Aminosäure oder das Derivat davon enthält, gegeben wird und das Gemisch dann umgesetzt wird. Wenn ein das Enzym produzierender Mikroorganismus als enzymhaltiges Produkt eingesetzt wird, kann ein Verfahren, bei dem der das Enzym produzierende Mikroorganismus kultiviert wird, um das Enzym in dem Mikroorganismus oder dem Kulturmedium des Mikroorganismus zu produzieren und anzuhäufen, und der β-Alanylester oder das β-Alanylamid und die Aminosäure oder das Derivat davon zu dem Kulturmedium gegeben werden, zusätzlich zu einem Verfahren eingesetzt werden, bei dem der das Enzym produzierende Mikroorganismus zu der vorstehend beschriebenen Lösung gegeben wird und das Gemisch dann umgesetzt wird. Die gebildete β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon kann durch Standardverfahren gewonnen und bei Bedarf gereinigt werden.
Das ”enzymhaltige Produkt” ist ein das Enzym enthaltendes Gemisch. Das enzymhaltige Produkt kann außerdem eine oder mehrere andere Substanzen enthalten. Genauer gesagt kann ein Gemisch, welches das in einer Stufe zur Herstellung des Enzyms, beispielsweise Kultivierung des Mikroorganismus, hergestellte Enzym enthält, oder eines, das erhalten wird, indem das Gemisch bei Bedarf einer Nachbehandlung unterzogen wird, als enzymhaltiges Produkt eingesetzt werden. Die anderen Substanzen können Zellen des Mikroorganismus und Zelltrümmer des Mikroorganismus zusätzlich zu den Substanzen, welche das Kulturmedium darstellen, enthalten. Die Nachbehandlung umfasst das Gewinnen des Mediums oder das Gewinnen der mikrobiellen Zellen aus dem Kulturmedium nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung; das Aufbrechen, die Bakteriolyse und die Lyophilisierung der mikrobiellen Zellen; das teilweise Entfernen der anderen Substanzen durch grobe Reinigung und dergleichen; die Immobilisierung des Enzyms oder einer Einheit (beispielsweise einer Zelle), welche das Enzym enthält, durch ein Verfahren zur kovalenten Bindung, ein Adsorptionsverfahren oder ein Einschlussverfahren; und Kombinationen davon. Unabhängig von dem eingesetzten Mikroorganismus werden einige mikrobielle Zellen in dem Kulturmedium während der Kultivierung lysiert. Somit kann in diesem Fall ein Kulturüberstand auch als enzymhaltiges Produkt eingesetzt werden.
Als Mikroorganismus, der das Enzym enthält, kann ein Wildtypstamm oder ein modifizierter Stamm eingesetzt werden, in dem das erfindungsgemäße Enzym exprimiert wird. Der Mikroorganismus ist nicht auf eine mikrobielle Zelle eines enzymatischen Mikroorganismus beschränkt, und eine behandelte mikrobielle Zelle, beispielsweise eine mikrobielle Zelle, die mit Aceton behandelt wurde, und eine lyophilisierte mikrobielle Zelle können eingesetzt werden, oder es können eine immobilisierte mikrobielle Zelle und eine immobilisierte behandelte mikrobielle Zelle, erhalten durch ein Verfahren zur kovalenten Bindung, ein Adsorptionsverfahren oder ein Einschlussverfahren, eingesetzt werden.
Wenn ein Wildtypstamm, der ein Enzym herstellen kann, das eine Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aufweist, eingesetzt wird, ist dieser Stamm dahingehend geeignet, dass er auf einfachere Weise die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon herstellt, ohne dass ein genetisch modifizierter Stamm präpariert wird. Wenn andererseits ein mutierter Stamm eingesetzt wird, der so modifiziert ist, dass das Enzym, welches die Aktivität zur Bildung von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aufweist, in großen Mengen produziert (beispielsweise ein genetisch modifizierter Stamm, der ein für dieses Enzym kodierendes Gen in hohem Maße exprimiert), kann die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon in hohem Maß und schnell gebildet werden. D. h., in der vorliegenden Erfindung. können auch ein Mikroorganismus, der transformiert worden ist, so dass er das Enzym, das die Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aufweist (beispielsweise ein später beschriebenes erfindungsgemäßes Protein) exprimieren kann, und ein Mikroorganismus eingesetzt werden, der transformiert worden ist, so dass er ein Gen des Enzyms exprimieren kann (beispielsweise ein später beschriebenes erfindungsgemäßes Polynukleotid). Der Wildtypstamm oder der mutierte Stamm kann in dem Medium kultiviert werden, um das Enzym in dem Medium und/oder dem Mikroorganismus anzuhäufen, und das Enzym kann mit einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon unter Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon gemischt werden.
Wenn die Kultur, die kultivierte mikrobielle Zelle, die gewaschene mikrobielle Zelle oder ein behandeltes mikrobielles Produkt, erhalten durch Aufbrechen oder Lyse der mikrobiellen Zellen, eingesetzt wird, ist oft ein Enzym vorhanden, welches β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon abbaut, wobei dieses Enzym nicht an der Bindung von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon beteiligt ist. Deshalb ist es möglich, einen Metallproteaseinhibitor, wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zuzugeben. Die zuzugebende Menge kann in geeigneter Weise in dem Bereich von beispielsweise 0,1 mM bis 300 mM und bevorzugt 1 mM bis 100 mM bestimmt werden.
Die Menge des einzusetzenden Enzyms oder enzymhaltigen Produkts kann die Menge sein, die eine objektive Wirkung erzielt (wirksame Menge). Ein Fachmann kann diese wirksame Menge durch einfache Vorexperimente mühelos bestimmen. Beispielsweise ist die wirksame Menge etwa 0,01 bis 100 Einheiten (U), wenn das Enzym eingesetzt wird, und etwa 0,1 bis 500 g/L, wenn gewaschene mikrobielle Zellen eingesetzt werden. Ein Einheit ist die Menge des Enzyms, die 1 μmol β-Alanylaminosäure (beispielsweise β-Alanylhistidin) oder ein Derivat davon pro Minute bildet, wenn die Reaktion unter Einsatz von 100 mM Boratpuffer, der 50 mM β-Alanylester oder β-Alanylamid und eine Aminosäure (beispielsweise Histidin) oder ein Derivat davon enthält, unter einer Temperaturbedingung von 25°C durchgeführt wird.
Die für die Reaktion eingesetzte Aminosäure oder das Derivat davon kann ein L-Isomer oder ein D-Isomer sein, wobei jedoch die L-Aminosäure oder ein Derivat davon bevorzugt ist.
Eine Konzentration des β-Alanylesters oder des β-Alanylamids und der Aminosäure oder des Derivats davon, welche Ausgangsmaterialien sind, ist 1 mM bis 2 M und vorzugsweise 20 bis 600 mM. Wenn die Reaktion inhibiert wird, wenn die Konzentration des Substrats zu hoch ist, können diese Substrate nacheinander zugegeben werden, wobei die Konzentration so gehalten wird, dass die Reaktion nicht inhibiert wird.
Die Reaktionstemperatur ist 5 bis 60°C, bei der β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon gebildet werden kann, und vorzugsweise 10 bis 40°C. Der pH-Wert der Reaktion ist 5 bis 12, bei dem β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon gebildet werden kann, und vorzugsweise pH 6 bis 11. Die gebildete V-Alanylaminosäure oder das Derivat davon kann kristallisiert werden, indem die enzymatische mikrobielle Zelle entfernt wird und mit einem Harz oder dergleichen entsalzt wird, und danach Alkohol (Methanol, Ethanol usw.) zugegeben wird. Beispielsweise kann ein hochreiner Carnosinkristall abgeschieden werden, indem eine wässerige Lösung von grobem L-Carnosin, welches Verunreinigungen enthält, mit Alkohol, wie Methanol, gemischt wird, ein L-Carnosinkristallkeim zu der erhaltenen Mischlösung gegeben wird und bei 30 bis 80°C während 1 bis 10 Stunden gezüchtet wird, und danach Alkohol zu der Mischlösung gegeben wird ( JP 2007-31328 A ).
2. In der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroorganismen
Als in der vorliegenden Erfindung eingesetzter Mikroorganismus kann ein Mikroorganismus eingesetzt werden, der die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist, und das eine spezielle Einschränkung besteht. Der Mikroorganismus, der die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist, kann Mikroorganismen der Gattung Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus, Erythrobasidium, Sphingosinicella, Pyrococcus und Aspergillus umfassen. Spezifische Beispiele davon umfassen Rhodotorula sp, Rhodotorula minuta, Tremella encephala, Candida mogii, Cryptococcus flavus, Rhodotorula marina, Rhodotorula aurantiaca, Erythrobasidium hasegawianum, Sphingosinicella microcystinivorans, Pyrococcus horikoshii, Aspergillus oryzae und dergleichen. Unter diesen können die bevorzugten Mikroorganismen die folgenden mikrobiellen Stämme umfassen. Diese mikrobiellen Stämme wurden durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung ausgewählt, indem ein Mikroorganismus, der das Enzym produziert, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon in hoher Ausbeute aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon herstellt, untersucht wurde. Unter den folgenden Mikroorganismen haben (1), (2), (5) (11) und (15) eine besonders hohe Aktivität.

(1) Rhodotorula minuta IFO0932 (Y129, AJ5019)
(2) Rhodotorula minuta IF00879 (Y127, AJ5014)
(3) Tremella encephAla IFO09293 (Y152, AJ14156, IFO0412)
(4) Rhodotorula minuta IFOO387 (Y-33-4, Y234, AJ4862)
(5) Candida mogii IFO0436 (I. G. C. 3442, Y246, AJ5104)
(6) Cryptococcus flavus Y-33-8 IFO0710 (Nr.41, AJ4864)
(7) Rhodotorula minuta K-38 (Nr.50, AJ4873)
(8) Rhodotorula minuta KN-35 (Nr.51, AJ4874, CBS5706, IFO1434)
(9) Rhodotorula minuta KN-36 CBS5695 (Nr. 52, AJ4875, IFO1435)
(10) Rhodotorula minuta AY-24 AJ4957 (Nr. 59)
(11) Rhodotorula sp AY-30 AJ4958 (Nr.60) (FERN BP-11120)
(12) Rhodotorula marina NP-2-10 (Nr.62, AJ4965)
(13) Rhodotorula aurantiaca IFO0754 (Nr.65, AJ5011)
(14) Rhodotorula aurantiaca 68–254 AJ5119 (Nr.74)
(15) Erythrobasidium hasegawianum IFO1058 (No.92, AJ5228)
(16) Sphingosinicella microcystinivorans Y2 (JCM13185)
(17) Pyrococcus horikoshii OT3 (JCM9974, RDB5990) und
(18) Aspergillus oryzae RIB40 (NBRC G07-138-010).

Rhodotorula sp AY-30 AJ4958 (Nr. 60) wurde am 6. November 2007 unter der Nummer FERN P-21429 bei der International Patent Organism Depositary (IPOD), National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) (Chuo No. 6, Higashi 1-1-1, Tsukuba City, Ibaraki Pref., Japan), hinterlegt, und die Überführung in eine internationale Hinterlegung wurde am 24. April 2009 beantragt. Dem Stamm wurde die Hinterlegungsnummer FERN BP-11120 zugeteilt, und der Stamm kann von IPOD erhalten werden.
Unter den vorstehend beschriebenen Stämmen wurden die Stämme mit IFO Nummer ursprünglich bei dem Institute for Fermentation Osaka (17–85 Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka, Japan) hinterlegt und danach in das Biological Resource Center (NBRC) im Department of Biotechnology, National Institute of Technology and Evaluation (Kazusakamatari 2-5-8, Kisarazu-City, Chiba Pref., Japan) im Jahr 2003 überführt. Somit können diese von NBRC erhalten werden.
Unter den vorstehend beschriebenen Stämmen können die Stämme mit CBS-Nummer vom Centraalbureau vor Schimmelcultures (UppsAlalaan 8 3584 CT Utrecht, Niederlande) bezogen werden.
Unter den vorstehend beschriebenen Stämme können die Stämme mit JCM-Nummer von Incorporated Administrative Agency RIKEN, Bioresource Center (Hirosawa 2-1, Wako-City, Saitama Pref., Japan) bezogen werden.
Als diese Mikroorganismen kann ein Wildtypstamm oder ein mutierter Stamm eingesetzt werden, und es kann auch ein modifizierter Stamm verwendet werden, der durch genetische Verfahren, beispielsweise durch Zellfusion oder Gentechnologie, erhalten wurde.
Um eine mikrobielle Zelle, beispielsweise einen Mikroorganismus, zu erhalten, kann der Mikroorganismus in einem geeigneten Medium kultiviert und gezüchtet werden. Das hierfür verwendete Medium ist nicht besonders eingeschränkt, solange der Mikroorganismus darin wachsen kann, und es kann ein übliches Medium sein, das eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, Phosphorquelle, Schwefelquelle, anorganische Ionen und bei Bedarf organische Nährstoffe enthält.
Beispielsweise kann eine beliebige Kohlenstoffquelle, die für den vorstehend beschriebenen Mikroorganismus zugänglich ist, eingesetzt werden. Genauer gesagt, ist es möglich, Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose und Amylose, Alkohole, wie Sorbitol, Ethanol und Glycerin, organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure, Essigsäure und Propionsäure und Salze davon, Kohlenwasserstoffe, wie Paraffin, und Gemische davon einzusetzen.
Bezüglich der Stickstoffquelle ist es möglich, Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Ammoniumsalze von organischen Säuren, wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, Phosphatsalze, wie Monokaliumphosphat und Dikaliumphosphat, Sulfatsalze, wie Magnesiumsulfat, Nitratsalze, wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat, organische Stickstoffverbindungen, wie Pepton, Hefeextrakte, Fleischextrakte und Maisquellwasser, und Gemische davon einzusetzen.
Zusätzlich können Nährstoffquellen, wie anorganische Salze, Spurenmetallsalze und Vitamine, die typischerweise für das Medium eingesetzt werden, in geeigneter Weise zugemischt und eingesetzt werden.
Die Kultivierungsbedingungen sind nicht besonders eingeschränkt, und die Kultivierung kann unter einer aeroben Bedingung während etwa 12 bis 48 Stunden unter zweckmäßigem Kontrollieren des pH-Wertes und der Temperatur im Bereich von pH 5 bis 8 und der Temperatur bei 15 bis 40°C durchgeführt werden.
3. In der vorliegenden Erfindung eingesetztes Enzym
In der vorliegenden Erfindung wird das Enzym, das die Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist, eingesetzt. In der vorliegenden Erfindung ist dessen Ursprung und Verfahren zur Bereitstellung des Enzyms nicht eingeschränkt, solange das Enzym eine solche Aktivität hat. Im Folgenden werden das enzymatische Protein gemäß der vorliegenden Erfindung, seine Reinigung, der Einsatz von gentechnischen Verfahren und dergleichen beschrieben.
(3-1) Protein der vorliegenden Erfindung
Das erfindungsgemäße Protein kann aus einem Mikroorganismus erhalten werden, der die Fähigkeit zur Bildung von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist. Beispielsweise können die Mikroorganismen, die vorstehend als Beispiele der in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Mikroorganismen genannt sind, d. h. Mikroorganismen der Gattung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus, Erythrobasidium, Sphingosinicella, Pyrococcus und Aspergillus besteht, eingesetzt werden. Genauer gesagt können die vorstehend beschriebenen mikrobiellen Stämme (1) bis (18) eingesetzt werden.
Die Verfahren zur Isolierung und Reinigung des erfindungsgemäßen Proteins aus dem vorstehend beschriebenen Mikroorganismus werden im Folgenden beschrieben.
Zuerst werden die mikrobiellen Zellen durch ein physikalisches Verfahren, wie Ultraschallzertrümmerung, oder ein enzymatisches Verfahren unter Einsatz eines Enzyms zum Auflösen der Zellwand aufgebrochen, und die darin enthaltene unlösliche Fraktion wird durch Zentrifugation und dergleichen entfernt, wobei eine Lösung eines mikrobiellen Zellextrakts hergestellt wird. Das erfindungsgemäße Protein kann gereinigt werden, indem die so erhaltene Lösung des mikrobiellen Zellextrakts durch eine Kombination üblicher Verfahren für die Proteinreinigung, wie Ammoniumsulfatfraktionierung, Dialyse, Anionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie, Kationenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie und dergleichen, fraktioniert wird.
Ein Träger für die Anionenaustauschchromatographie kann Q-Sepharose FF 26/10, 16/10, HP und Mono-Q HR5/5 (alle erhältlich von Pharmacia (GE health Care Bioscience)) umfassen. Wenn die das erfindungsgemäße Enzym enthaltende Extraktlösung durch eine mit diesem Träger gepackte Säule geleitet wird, wird das erfindungsgemäße Enzym in einer nicht adsorbierten Fraktion unter der Bedingung von pH 7,6 gewonnen.
Ein Träger für die hydrophobe Chromatographie umfasst Phenylsepharose HP 16/10 (erhältlich von Pharmacia (GE health Care Bioscience)). Die das erfindungsgemäße Enzym enthaltende Extraktlösung wird durch eine mit diesem Träger gepackte Säule geleitet, um das erfindungsgemäße Enzym an die Säule zu adsorbieren, die dann gewaschen wird, und danach wird das Enzym unter Verwendung eines Puffers mit hoher Salzkonzentration eluiert. Hierbei kann die Salzkonzentration stufenweise erhöht werden, oder es kann ein Konzentrationsgradient eingesetzt werden.
Ein Träger für die Kationenaustauschchromatographie umfasst Monos HR (erhältlich von Pharmacia (GE health Care Bioscience)). Die das erfindungsgemäße Enzym enthaltende Extraktlösung wird durch eine mit diesem Träger gepackte Säule geleitet, um das erfindungsgemäße Enzym an die Säule zu adsorbieren, die dann gewaschen wird, und danach wird das Enzym unter Einsatz eines Puffers mit hoher Salzkonzentration eluiert. Hierbei kann die Salzkonzentration stufenweise erhöht werden, oder es kann ein Konzentrationsgradient verwendet werden.
Ein Träger für die Gelfiltrationschromatographie umfasst Superdex 200 pg und Sephadex 200 pg 16/10 (beide erhältlich von Pharmacia (GE health Care Bioscience)).
Die das erfindungsgemäße Enzym enthaltende Fraktion kann identifiziert werden, indem die Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon in jeder Fraktion der vorstehend beschriebenen Reinigungsvorgänge mit Hilfe von Methoden gemessen wird, die in den nachstehend beschriebenen Beispielen gezeigt sind. Eine inerte Aminosäuresequenz des erfindungsgemäßen Enzyms, das wie vorstehend beschrieben gereinigt wurde, ist in den SEQ ID Nummern: 9 und 10 des Sequenzprotokolls offenbart.
Das erfindungsgemäße Protein kann ein Protein, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:8 als N-terminale Aminosäuresequenz und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:9 als innere Aminosäuresequenz aufweist, und Homologe davon umfassen. Genauer gesagt umfasst es die Proteine, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus folgenden Punkten (A) bis (L) besteht:

(A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls;
(B) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und das die Fähigkeit hat, die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon zu bilden;
(C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls;
(D) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist;
(E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls;
(F) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist;
(G) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls;
(H) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 in dem Sequenzprotokoll umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist;
(I) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 23 des Sequenzprotokolls;
(J) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 23 in dem Sequenzprotokoll umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist;
(K) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls; und
(L) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist.

Die Proteine mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 3, 5 und 7 wurden aus Rhodotorula minuta IFO0932 (Y129, AJ5019) neu isoliert, und ihre Aminosäuresequenzen wurden durch die Erfinder der vorliegenden Erfindung identifiziert. Die Proteine mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID NOS: 3, 5 und 7 sind dahingehend gleich, dass sie die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:7 in Teilen ihrer Sequenzen aufweisen.
Das erfindungsgemäße Protein umfasst im wesentlichen dasselbe Protein wie das Protein mit der Aminosäuresequenz, die in einer beliebigen der SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23 und SEQ ID NO:25 beschrieben ist. Genauer gesagt können die vorstehend in (B), (D), (F), (H), (J) und (L) beschriebenen Proteine umfasst sein.
Der hier verwendete Ausdruck ”mehrere” variiert in Abhängigkeit von der Position und der Art eines Aminosäurerestes in der dreidimensionalen Struktur des Proteins und ist in dem Bereich, in dem die dreidimensionale Struktur und die Aktivität des Proteins mit den Aminosäureresten nicht wesentlich beeinträchtigt werden, und ist speziell 20 bis 50, vorzugsweise 2 bis 30 und stärker bevorzugt 2 bis 10. Die Sequenz mit einer oder mehreren Aminosäure Mutationen kann 70% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr, stärker bevorzugt 90% oder mehr, noch stärker bevorzugt 95% oder mehr und noch stärker bevorzugt 97% oder mehr Homologie oder Identität zu einer Sequenz aufweisen, die keine Mutation hat. In dieser Hinsicht ist es jedoch wünschenswert, dass das Protein mit der Aminosäuresequenz, die eine Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz des Proteins in (B), (D), (F), (H), (J) und (L) aufweist, die enzymatische Aktivität zu etwa der Hälfte oder mehr, stärker bevorzugt 80% oder mehr, noch stärker bevorzugt 90% oder mehr des Proteins ohne Mutation unter der Bedingung bei 50°C bei pH 8 beibehält. Beispielsweise ist es im Fall des Proteins (B) mit einer Aminosäuresequenz, die eine Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 des Sequenzprotokolls aufweist und eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylhistidin aus β-Alanylester und Histidin hat, wünschenswert, dass dieses Protein die enzymatische Aktivität zu etwa der Hälfte oder mehr, stärker bevorzugt 80% oder mehr und noch stärker bevorzugt 90% oder mehr des Proteins mit einer Aminosäuresequenz der Aminosäurereste Nummern 14 bis 340 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 unter der Bedingung bei 50°C bei pH 8 aufweist.
Die hier genannte Homologie oder Identität wird dadurch ermittelt, dass die Anzahl der Aminosäurereste in der Sequenz der vollständigen Länge als Zähler eingesetzt wird und die Anzahl der identischen Aminosäurereste in jeweils zwei zu vergleichenden Sequenzen als Nenner eingesetzt wird und der berechnete Wert mit 100 multipliziert wird. Die Homologie oder die Identität kann auch unter Verwendung von ”Genetyx” (GENETIX Ltd.) ohne Vorgabeparameter berechnet werden.
Die Mutation der vorstehend in (B) gezeigten Aminosäure wird beispielsweise ermittelt, dass im Vorfeld die Aminosäuresequenz entworfen wird, die durch ortsgerichtete Mutagenese modifiziert ist, so dass die Aminosäure an einer bestimmten Position in der Aminosäuresequenz, die in (A) gezeigt ist, und dergleichen substituiert, deletiert und/oder insertiert ist, und eine Nukleotidsequenz, die dieser Aminosäuresequenz entspricht, exprimiert wird.
Die Substitution, Deletion, Insertion und/oder dergleichen des Nukleotids, wie vorstehend beschrieben, umfasst natürlich vorkommende Mutationen, beispielsweise Unterschiede in der Art oder dem Stamm des Mikroorganismus. Im wesentlichen dasselbe Protein wie das Protein mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NOS:3, 5, 7, 21, 23 und 25 des Sequenzprotokolls wird erhalten, indem ein Polynukleotid, das für die Aminosäuresequenz mit der vorstehend beschriebenen Mutation kodiert, in einer geeigneten Zelle exprimiert wird und die Aktivität des Enzmys in dem exprimierten Produkt untersucht wird.
Die Substitution der Aminosäure kann eine konservative Substitution sein. Der Ausdruck ”konservative Substitution” der Aminosäure bedeutet, dass ein bestimmter Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit analoger Seitenkette substituiert ist. Familien der Aminosäurereste mit analoger Seitenkette sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Beispiele solcher Familien umfassen eine Aminosäure mit einer basischen Seitenkette (beispielsweise Lysin, Arginin oder Histidin), eine Aminosäure mit einer sauren Seitenkette (wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure), eine Aminosäure mit einer ungeladenen polaren Seitenkette (wie Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin oder Cystein), eine Aminosäure mit einer unpolaren Seitenkette (wie Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin oder Tryptophan), eine Aminosäure mit einer in β-Position verzweigten Seitenkette (wie Threonin, Valin oder Isoleucin), eine Aminosäure mit einer aromatischen Seitenkette (wie Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan oder Histidin), eine Aminosäure mit einer Hydroxygruppe (wie einer alkoholischen oder phenolischen) in der Seitenkette (wie Serin, Threonin oder Tyrosin), und eine Aminosäure mit einer Schwefel enthaltenden Seitenkette (wie Cystein oder Methionin). Vorzugsweise kann die konservative Substitution der Aminosäuren die Substitution zwischen Asparaginsäure und Glutaminsäure, die Substitution unter Arginin, Lysin und Histidin, die Substitution zwischen Tryptophan und Phenylalanin, die Substitution zwischen Phenylalanin und Valin, die Substitution unter Leucin, Isoleucin und Alanin, und die Substitution zwischen Glycin und Alanin sein.
(3-2) Herstellung und Reinigung des Polynukleotids, des rekombinanten Polynukleotids und der erfindungsgemäßen Transformante, und Reinigung des Enzyms.
(3-2-1) Polynukleotid, das für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Polynukleotid bereit, das für das vorstehend beschriebene Protein kodiert. Das erfindungsgemäße Polynukleotid ist ein Polynukleotid, das die Aminosäuresequenz kodiert, welche das vorstehend beschriebene Protein darstellt, und es können eine Vielzahl von Nukleotidsequenzen, die eine einzige Aminosäuresequenz definieren, aufgrund der Degeneriertheit der Kodons vorhanden sein. Im speziellen ist ein Polynukleotid mit einer Nukleotidsequenz umfasst, die für ein Protein kodiert, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den vorstehend genannten Proteinen (A) bis (L) besteht.
Bevorzugte spezifische Beispiele des erfindungsgemäßen Polynukleotids können ein Polynukleotid umfassen, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Polynukleotiden (a) bis (n) besteht.

(a) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls;
(b) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat kodiert;
(c) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls;
(d) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid kodiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert;
(e) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91-1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls;
(f) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert;
(g) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls;
(h) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert;
(i) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 22 des Sequenzprotokolls;
(h) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 22 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert;
(k) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls;
(l) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert;
(m) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls; und
(n) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert.

Die Polynukleotide, die aus den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NO:1 und SEQ ID NO:32 des Sequenzprotokolls bestehen, wurden aus Rhodotorula minuta IFO0932 (Y129, AJ5019) isoliert. Die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 enthält drei offene Leserahmen (ORF), die durch die SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 und SEQ ID NO:6 dargestellt sind; d. h. die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 ist ähnlich der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:4 bzw. SEQ ID NO:6, die drei verschiedene ORFs darstellen. Drei ORFs sind ein Polynukleotid, das aus der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der SEQ ID NO:1 (vgl. SEQ ID NO:2) besteht, ein Polynukleotid, aus der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der SEQ ID NO:1 (vgl. SEQ ID NO:4) besteht, und ein Polynukleotid, das aus der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der SEQ ID NO:1 (SEQ ID NO:6) besteht. Ein durch ORF kodiertes zeigt die hohe Aktivität zur Bildung von Carnosin. Die Nukleotidsequenz in SEQ ID NO:1 ist den Nukleotidsequenzen der SEQ ID NOS:2, 4 und 6 jeweils gemein. Andererseits ist ein Polynukleotid, das aus der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:32 besteht, eine genomische DNA, welche das Polynukleotid, das aus der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 besteht, als Exonregion enthält, und das ebenfalls eine Intronregion aufweist. Eine solche genomische DNA kann die Proteine exprimieren, die durch die vorstehen beschriebenen drei ORFs kodiert werden, indem sie in eine bestimmte Wirtszelle (wie Hefe) eingeführt wird, welche die Fähigkeit zum splicen hat, und sie kann eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon zeigen.
Es können verschiedene Genrekombinationstechniken, die nachstehend genannt sind, gemäß den Beschreibungen in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor press (1989), und dergleichen durchgeführt werden.
Das erfindungsgemäße Polynukleotid kann aus cDNA oder genomischer DNA oder einer cDNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek von Rhodotorula minuta und dergleichen durch PCR (Polymerasekettenreaktion, vgl. White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185(1989)) oder Hybridisierung erhalten werden. Für die PCR eingesetzte Primer können auf der Grundlage der inneren Aminosäuresequenz, die ausgehend von dem vorstehend in (3) gereinigten Enzym bestimmt wird, entworfen werden. Da die Nukleotidsequenz des Gens des Enzyms (SEQ ID NO:1) durch die vorliegende Erfindung offenbart wird, können die Primer und Sonden für die Hybridisierung auf der Grundlage dieser Nukleotidsequenz entworfen werden, und das Polynukleotid kann auch unter Einsatz der Sonde isoliert werden. Wenn Primer mit der Sequenz, die der 5'-nicht translatierten Region und der 3-nicht translatierten Region entsprechen, als Primer für die PCR eingesetzt werden, kann eine kodierende Region des erfindungsgemäßen Enzyms in vollständiger Länge amplifiziert werden. Genauer gesagt umfasst ein Primer der 5'-Seite einen Primer mit einer Nukleotidsequenz in einer Region stromaufwärts der Nukleotidnummer 40 der SEQ ID NO:1, einen Primer mit einer Nukleotidsequenz in einer Region stromaufwärts der Nukleotidnummer 55 der SEQ ID NO:1 und einen Primer mit der Nukleotidsequenz in der Region stromaufwärts der Nukleotidnummer 91. Ein Primer auf der S'-Seite umfasst einen Primer mit einer Sequenz, die zu einer Nukleotidsequenz einer Region stromaufwärts der Nukleotidnummer 1239 komplementär ist.
Der Primer kann unter Einsatz eines DNS-Synthetisiergeräts Modell 380B, erhältlich von Applied Biosystems, und unter Einsatz einer Phosphoamiditmethode (vgl. Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) gemäß Standardverfahren synthetisiert werden. Die PCR kann unter Einsatz von Gene Amp PCR System 9600 (erhältlich von PERKIN ELMER) und TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß den Herstellerangaben durchgeführt werden.
Das Polynukleotid, das für das Enzym kodiert, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann, umfasst im wesentlichen dasselbe Polynukleotid wie einen der ORFs des Polynukleotids der SEQ ID NO:1 oder des Polynukleotids der SEQ ID NO:32, die Polynukleotide in einer der SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 und SEQ ID NO:24 des Sequenzprotokolls. D. h., von einem Polynukleotid, das für das die Mutation enthaltende Enzym kodiert, oder von einer dieses Polynukleotid enthaltenden Zelle wird im wesentlichen das identische Polynukleotid zu dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung erhalten, indem ein Polynukleotid isoliert wird, das unter einer stringenten Bedingung mit dem Polynukleotid, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die komplementär ist zu einem der ORFs von SEQ ID NO:1 oder dem Polynukleotid von SEQ ID NO:32 oder dem Polynukleotid einer von SEQ ID NO:20, SEQ ID NO:22 oder SEQ ID NO:24, oder mit der Sonde hybridisiert, die aus derselben Nukleotidsequenz hergestellt wird, und für ein Protein mit Carnosin-Aktivität kodiert.
Die Sonde kann auf der Grundlage der in SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:21, SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25 und SEQ ID NO:32 beschriebenen Nukleotidsequenz durch Standardverfahren hergestellt werden. Unter Einsatz der Sonde kann ein damit hybridisierendes Polynukleotid identifiziert werden, um das gewünschte Polynukleotid mit Hilfe von Standardverfahren zu isolieren. Beispielsweise kann die DNA-Sonde hergestellt werden, indem die Nukleotidsequenz, die in einem Plasmid oder einem Phagenvektor kloniert ist, amplifiziert wird, eine zu verwendende Nukleotidsequenz als Sonde mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten wird und dann extrahiert wird. Stellen, die herausgeschnitten werden sollen, können in Abhängigkeit von dem gewünschten Polynukleotid kontrolliert werden.
Der hier verwendete Ausdruck ”stringente Bedingung” bezieht sich auf eine Bedingung, bei der ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird, während ein nicht spezifisches Hybrid nicht gebildet wird. Obwohl es schwierig ist, diese Bedingung genau zu quantifizieren, können Beispiele davon eine Bedingung umfassen, bei der ein Paar von Polynukleotiden mit hoher Homologie, beispielsweise die Polynukleotide mit einer Homologie von 50% oder mehr, stärker bevorzugt 80% oder mehr, noch stärker bevorzugt 90% oder mehr, noch stärker bevorzugt 95% oder mehr und noch weiter bevorzugt 97% oder mehr hybridisiert, während Polynukleotide mit einer geringeren Homologie nicht hybridisieren, oder eine Waschbedingung einer üblichen Southern Hybridisierung, d. h. eine Hybridisierung bei Salzkonzentrationen, die 1 × SSC (Natriumchlorid/Natriumcitrat) und 0.1% SDS bei 60°C entspricht, vorzugsweise 0,1 × SSC und 0,1% SDS bei 60°C. Ein weiteres Beispiel einer stringenten Bedingung ist eine Hybridisierung in 6 × SSC bei etwa 45°C und nachfolgenden ein oder zwei Waschgängen in 0,2 × SSC und 0,1% SDS bei 50 bis 65°C. Diese Gene, die unter einer solchen Bedingung hybridisieren, umfassen solche, in denen ein Stoppkodon in einer inneren Region einer Sequenz vorhanden sind, und solche, die aufgrund einer Mutation im aktiven Zentrum ihre Aktivität verloren haben. Diese können jedoch mühelos entfernt werden, indem sie an käuflich erwerbbare Expressionsvektoren ligiert werden, in einem geeigneten Wirt exprimiert werden und die enzymatische Aktivität des exprimierten Produkts durch nachstehend beschriebene Verfahren gemessen wird.
Diesbezüglich ist es jedoch wünschenswert, dass ein Polynukleotid, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die unter der vorstehend beschriebenen stringenten Bedingung hybridisiert, eine enzymatische Aktivität von etwa der Hälfte oder mehr, stärker bevorzugt 80% oder mehr und noch stärker bevorzugt 90% oder mehr eines Proteins mit der Aminosäuresequenz, die durch die ursprüngliche Nukleotidsequenz kodiert wird, unter der Bedingung bei 50°C bei pH 8 behält. In einem Beispiel des Falles (b), bei dem die Nukleotidsequenz, die unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 komplementär ist, hybridisiert, ist es wünschenswert, dass ein Protein, das durch diese Nukleotidsequenz kodiert wird, eine enzymatische Aktivität von etwa der Hälfte oder mehr, stärker bevorzugt 80% oder mehr und noch stärker bevorzugt 90% oder mehr eines Proteins mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 unter der Bedingung bei 50°C bei pH 8 behält.
Das so modifizierte Polynukleotid kann durch herkömmlich bekannte Mutageneseverfahren erhalten werden. Die Mutageneseverfahren umfassen ein Verfahren, bei dem ein Polynukleotid, das für das Enzym kodiert, beispielsweise ein beliebiges der Polynukleotide (a), (c), (e), (g), (i), (k) und (m), mit Hydroxylamin oder dergleichen in vitro behandelt wird, und ein Verfahren, bei dem Escherichia-Zellen, die ein für das Enzym kodierendes Polynukleotid enthalten, mit einem für künstliche Mutationen typischerweise eingesetztem Mutagen behandelt werden, beispielsweise UV-Strahlen, N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) oder salpetrige Säure.
In SEQ ID NO:1 des Sequenzprotokolls sind drei ORFs enthalten, wie nachstehend beschrieben (vgl. SEQ ID NO:2, 4 und 6), und die durch jeden ORF kodierte Aminosäuresequenz wird durch SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:5 oder SEQ ID NO:7 des Sequenzprotokolls dargestellt.
(3-2-2) Herstellen von rekombinanten Polynukleotiden (Expressionsvektor) und Transformanten sowie Bildung des Enzyms.
Das Enzym (als ”Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon” oder ”Carnosin bildendes Enzym” bei Bedarf bezeichnet wird), das in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden kann, kann auch durch Einführen des vorstehend in (3-2-1) beschriebenen Polynukleotids in einen geeigneten Wirt unter Herstellung eines rekombinanten Polynukleotids und Exprimieren des Proteins, das durch das Polynukleotid kodiert wird, in den erhaltenen transformierten Zellen (Transformanten) gebildet werden.
Als Wirt zum Exprimieren des durch das Polynukleotid kodierten Proteins können verschiedene prokaryotische Zellen, einschließlich Bakterien der Gattung Escherichia, wie Escherichia coli und Zellen von Bacillus subtilis, und verschiedene eukaryotische Zellen, einschließlich Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis und Aspergillus oryzae, eingesetzt werden.
Das zum Einführen des Polynukleotids in den Wirt eingesetzte rekombinante Polynukleotid kann hergestellt werden, indem das in den Vektor einzuführende Polynukleotid in Abhängigkeit von der Art des Wirtes eingefügt wird, um es in einer Form zu exprimieren, in der das durch das Polynukleotid kodierte Protein exprimiert werden kann. Wenn ein dem Gen des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, inhärenter Promotor in der Wirtszelle funktioniert, kann der Promotor als der Promotor zum Exprimieren des erfindungsgemäßen Polynukleotids eingesetzt werden. Der andere Promotor, der in der Wirtszelle funktioniert, kann an das erfindungsgemäße Polynukleotid ligiert werden, um es bei Bedarf unter der Kontrolle des Promotors zu exprimieren.
Das Verfahren der Transformation zum Einführen des rekombinanten Polynukleotids in die Wirtszelle kann das D. M. Morrison-Verfahren (Methods in Enzymology 68, 326 (1979)) oder ein Verfahren umfassen, bei dem die Permeabilität eines Polynukleotids durch Behandeln der bakteriellen Empfängerzelle mit Calciumchlorid erhöht wird (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)).
Im Fall der Herstellung eines Proteins im großen Maßstab unter Einsatz einer Rekombinationstechnologie kann eine bevorzugte Durchführungsform die Bildung von Einschlusskörpern des Proteins, verursacht durch eine Assoziation des Proteins in einer das Protein produzierenden transformierten Zelle, umfassen. Die Vorteile dieses Expressionsproduktionsverfahrens können den Schutz des Zielproteins vor Abbau durch in den mikrobiellen Zellen vorhandenen Proteasen und die einfache Reinigung des Zielproteins sein, das durch Aufbrechen der mikrobiellen Zelle und nachfolgende Zentrifugation durchgeführt werden kann.
Der auf diese Weise erhaltene Proteineinschlusskörper wird durch ein Proteindenaturieruingsmittel aufgelöst, und dann einem Verfahren zur Wiederherstellung der Aktivität unterzogen, das hauptsächlich aus der Eliminierung des Denaturierungsmittels besteht, so dass das Protein in das korrekt rückgefaltete und physiologisch aktive Protein umgewandelt wird. Es gibt viele Beispiele solcher Verfahren, wie die Wiederherstellung der Aktivität von menschlichem Interleukin 2 ( JP 61-257931 A ).
Um aus dem Proteineinschlusskörper ein aktives Protein zu erhalten, ist eine Reihe von Vorgängen erforderlich, beispielsweise die Auflösung und die Wiedergewinnung der Aktivität, so dass diese Vorgehensweisen komplizierter sind als solche, die bei der direkten Herstellung eines aktiven Proteins erforderlich sind. Wenn jedoch ein Protein, welches das mikrobielle Zellwachstum beeinträchtigt, im großen Maßstab in der mikrobiellen Zelle hergestellt wird, können diese Auswirkungen durch Anhäufen des Proteins als Einschlusskörper des inaktiven Proteins in der mikrobiellen Zelle unterbunden werden.
Das Verfahren zur Herstellung des gewünschten Proteins im großen Maßstab als Einschlusskörper umfasst Verfahren, bei denen ein Protein allein unter der Kontrolle eines starken Promotors exprimiert wird sowie Verfahren, bei denen das gewünschte Protein als Fusionsprotein mit einem Protein exprimiert wird, das bekanntlich in großen Mengen exprimiert wird.
Im Folgenden wird beispielhaft das Verfahren zum Herstellen von transformiertem Escherichia coli (E. coli) und zur Produktion des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, genauer beschrieben.
Als Promotor zur Expression des Polynukleotids, das für das Enzym kodiert, welches β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, kann der typischerweise für die Produktion eines fremden Proteins in E. coli eingesetzte Promotor verwendet werden, wobei Beispiele davon starke Promotoren, wie T7-Promotor, lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor und PR-Promotor und PL-Promotor des Phagen lambda umfassen. Als Vektor können pUC19, pUCl8, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, PHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, pMW218 und dergleichen eingesetzt werden. Zudem kann auch ein Phagen Polynukleotid als Vektor verwendet werden. Außerdem kann auch ein Expressionsvektor, der den Promotor enthält, und die eingeführte Polynukleotidsequenz exprimieren kann, verwendet werden.
Um das Enzym, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, als Einschlusskörper des Fusionsproteins zu produzieren, wird ein Gen, das für ein anderes Protein kodiert, vorzugsweise ein hydrophiles Peptid, stromaufwärts oder stromabwärts des Gens des Enzyms, welches β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, ligiert, um ein Fusionsproteinen herzustellen. Ein solches Gen, das für ein anderes Protein kodiert, kann eines sein, welches die angehäufte Menge des Fusionsproteins erhöht und die Löslichkeit des Fusionsproteins nach den Stufen der Denaturierung und der Wiederherstellung erhöht, wobei Beispiele davon das T7-Gen 10, das β-Galactosidasegen, das Dehydrofolatreduktasegen, das Interferon γ-Gen, das Interleukin-2-Gen, das Prochymosingen und dergleichen als Kandidaten umfassen.
Die Ligierung dieser Gene an das Gen, das für das Enzym kodiert, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, wird so durchgeführt, dass die Leserahmen der Kodons übereinstimmen. Eine solche Ligierung kann durchgeführt werden, indem bei einer geeigneten Restriktionsenzymstelle ligiert wird, oder durch Verwendung eines synthetischen Polynukleotids mit einer geeigneten Sequenz.
Um die produzierte Menge zu erhöhen, ist es manchmal bevorzugt, einen Terminator, d. h. eine Transkriptionsterminationssequenz, stromabwärts des Gens des Fusionsproteins zu ligieren. Dieser Terminator kann einen rrn8-Terminator, T7-Terminator, fd Phage-Terminator, T4-Terminator, Terminator des Tetracyclinresistenzgens und den Terminator des trpA-Gens aus E. coli umfassen.
Als Vektor zum Einführen des Gens, welches für das Enzym kodiert, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet oder für das Fusionsprotein des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, und eines weiteren Proteins kodiert, in E. coli sind sogenannte Mehrkopientypen bevorzugt, welche Plasmide umfassen, die einen von ColE1 abgeleiteten Replikationsursprung aufweisen, wie Plasmide vom pUC-Typ, Plasmide vom pBR322-Typ oder Derivate davon. Der hier verwendete Ausdruck ”Derivat” bedeutet, dass das Plasmid durch Substitution, Deletion und/oder Insertion von Nukleotiden modifiziert worden ist. Die hier genannte Modifikation umfasst auch die Modifikation durch Mutagenesebehandlungen durch Mutagenisierungsmittel und UV Bestrahlung oder natürliche Mutation.
Es ist bevorzugt, dass der Vektor einen Marker aufweist, beispielsweise ein Ampicillin-Resistenzgen, für die Selektion der Transformante. Als ein solches Plasmid sind Expressionsvektoren, die starke Promotoren enthalten, käuflich erwerbbar (pUC-Typen) (erhältlich von Takara Shuzo Co., Ltd.), pPROK-Typen (erhältlich von Clontech), pKK233-2 (erhältlich von Clontech) und dergleichen).
Das rekombinante Polynukleotid wird durch Ligieren des Promotors, des Gens, das für das Enzym, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder das Fusionsprotein des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, und eines anderen Proteins kodiert, und in einigen Fällen des Terminators in dieser Reihenfolge, um ein Polynukleotidfragment zu erhalten, und außerdem wird das erhaltene Polynukleotidfragment an ein Vektorpolynukleotid ligiert.
Unter Verwendung des erhaltenen rekombinanten Polynukleotids wird E. coli transformiert. Die Kultivierung dieses Bakteriums von E. coli führt zu einer Expression und Produktion des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder des Fusionsproteins des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, und eines weiteren Proteins. Der zu transformierende Wirt kann ein Stamm sein, der üblicherweise für die Expression von fremden Genen eingesetzt wird, wobei der Stamm E. coli JM109 bevorzugt ist. Verfahren zum Durchführen der Transformation und Verfahren zur Selektion der Transformanten sind in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989) und dergleichen beschrieben.
Im Fall der Expression des Enzyms als Fusionsprotein kann das Fusionsprotein so zusammengesetzt sein, dass es in der Lage ist, das Enzym, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, unter Verwendung einer Restriktionsprotease, welche eine Sequenz des Blutgerinnungsfaktors Xa, Kallikrein oder dergleichen erkennt und welche in dem Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, nicht vorhanden ist, davon abzuspalten.
Die einzusetzenden Produktionsmedien können die üblichen Medien umfassen, die für die Kultivierung von E. coli eingesetzt werden, wie M9-CasAminosäure-Medium und LB-Medium. Die Kultivierungsbedingungen und Produktionsinduktionsbedingungen werden in Abhängigkeit von den Typen des Vektormarkers, des Promotors, des Wirtsbakteriums und dergleichen in geeigneter Weise ausgewählt.
Das Enzym, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder das Fusionsprotein des Enzyms, welches eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, und eines anderen Proteins kann durch das folgende Verfahren gewonnen werden: Wenn das Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet oder dessen Fusionsprotein in den mikrobiellen Zellen ausgelöst wird, können die mikrobiellen Zellen gewonnen werden und dann aufgeschlossen oder lysiert werden, wobei eine Rohenzymlösung erhalten wird. Bei Bedarf kann das Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder dessen Fusionsprotein außerdem einer Reinigung gemäß üblichen Verfahren unterworfen werden, wie Ausfällung, Filtration und Säulenchromatographie. In diesem Fall kann die Reinigung auch gemäß Verfahren durchgeführt werden, die einen Antikörper gegen das Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder dessen Fusionsprotein einsetzt.
Im Fall der Bildung eines Einschlusskörpers des Proteins kann dieser mit einem Denaturierungsmittel aufgelöst werden. Der Einschlusskörper kann zusammen mit den mikrobiellen Zellen aufgelöst werden. Unter Berücksichtigung des folgenden Reinigungsverfahrens ist es jedoch bevorzugt, den Einschlusskörper vor der Auflösung zu entfernen. Die Gewinnung des Einschlusskörpers aus den mikrobiellen Zellen kann gemäß herkömmlichen und allgemein bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise werden die mikrobiellen Zellen aufgebrochen, und der Einschlusskörper wird durch Zentrifugation und dergleichen gewonnen. Das Denaturierungsmittel, welches den Proteineinschlusskörper auflöst, kann Guanidiniumhydrochlorid (beispielsweise 6 M, pH 5 bis 8) und Harnstoff (beispielsweise 8 M) umfassen.
Als ein Ergebnis der Entfernung des Denaturierungsmittels durch Dialyse und dergleichen kann das Protein als Protein mit Aktivität wieder hergestellt werden. Die für die Dialyse eingesetzten Dialyselösungen können tris-Chlorwasserstoffsäurepuffer und Phosphatpuffer umfassen. Dessen Konzentration ist 20 mM bis 0.5 M, und der pH-Wert ist 5 bis 8.
Es ist bevorzugt, dass die Proteinkonzentration in der Wiederherstellungsstufe bei etwa 500 μg/ml oder weniger gehalten wird. Um das Vernetzen des wiederhergestellten Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, mit sich selbst zu unterdrücken, ist es bevorzugt, dass die Dialysetemperatur bei 5°C oder niedriger gehalten wird. Andere Verfahren zum Entfernen des Denaturierungsmittels als das Dialyseverfahren können ein Verdünnungsverfahren und ein Ultrafiltrationsverfahren umfassen. Von der Wiederherstellung der Aktivität kann bei Einsatz eines beliebigen dieser Verfahren ausgegangen werden.
Vorstehend wurde beispielhaft das Verfahren zum Herstellen des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, unter Einsatz von transformiertem E. coli beschrieben.
Es ist auch bevorzugt, das Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, unter Einsatz von transformierter Hefe herzustellen. Die Hefe wird mühelos kultiviert und ist sicher, weil Hefe traditionell für die Herstellung von Nahrungsmittelprodukten eingesetzt wird. Wenn transformierte Hefe eingesetzt wird, kann ein allgemein bekannter Promotor verwendet werden. Beispiele eines solchen Promotors umfassen CYC1, HIS3, GAL1, GAL10, ADH1, PGK, PHO5, TRP1, URA3, LEU2, Mal, ENO, TPI und 1. Es kann auch ein geeigneter Terminator, wie der TPI-Terminator, eingesetzt werden.
Genauer gesagt kann beliebig ein Mehrkopientyp (YEp-Typ), ein Einkopientyp (YCp-Typ) und ein Chromosomenintegrationstyp (YIp-Typ) als Vektor zum Einführen in Hefe eingesetzt werden. Die Expressionsvektoren, wie YEp24, YCp50 und YIp5 sind allgemein als Vektoren vom YEp-Typ, Vektoren vom YCp-Typ bzw. Vektoren vom YIp-Typ bekannt, und können auch für die Transformation von Hefe in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden.
Beispielsweise wird das rekombinante Polynukleotid erhalten, indem der Promotor, das Gen, das für das Enzym kodiert, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder für ein Fusionsprotein des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon kodiert, und eines anderen Proteins kodiert, und in einigen Fällen der Terminator in dieser Reihenfolge ligiert werden, um ein Polynukleotidfragment zu erhalten, und außerdem das erhaltenen Polynukleotidfragment und das Vektorpolynukleotid ligiert wird.
Hefe wird unter Verwendung des erhaltenen rekombinanten Polynukleotids transformiert. Die Kultivierung dieser Hefe führt zu einer Expression und Produktion des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder des Fusionsproteins des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon kodiert, und eines weiteren Proteins. Der zu transformierende Wirt kann ein Stamm sein, der üblicherweise für die Expression von Fremdgenen eingesetzt wird, wobei beispielsweise eine Hefe der Gattung Saccharomyces oder Pichia eingesetzt werden kann. Die Hefe kann in einem allgemein bekannten Medium kultiviert werden, beispielsweise in SD-Medium, YPD-Medium, YPAD-Medium oder SC-Medium. Verfahren zur Durchführung der Transformation, Verfahren zum Selektieren der Transformante und Verfahren zum Kultivieren der erhaltenen Transformante sind in Molecular Cloning, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press (1989) und dergleichen beschrieben. Das Enzym, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, oder das Fusionsprotein des Enzyms, das eine β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon bildet, und eines anderen Proteins kann auf dieselbe Weise wie vorstehend für E. coli beschrieben, gewonnen werden.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele eingehender beschrieben, wobei die Erfindung jedoch nicht darauf beschränkt ist. Carnosin wurde in den Beispielen unter Einsatz von Hochleistungs-Flüssigchromatographie quantifiziert.
1. Säule:

Inertsil ODS-3 (4,6 × 250 mm), Säulentemperatur: 40°C, Elutionsmittel: 0,1 M KH₂PO₄-H₃PO₄(pH 2,1)/CH₃CN = 10/2, Fließgeschwindigkeit: 0,7 ml/min., Nachweis: UV 210 nm.

Eine andere Verbindung β-Ala-X als Carnosin wurde unter Einsatz der Hochleistungsflüssigchromatographie quantifiziert.
2. Säule:

Inertsil ODS-3 (4,6 × 250 mm), Säulentemperatur: 40°C, Elutionsmittel: 0,1 M NaH₂PO₄-H₃PO₄(pH 2,1)/CH₃OH = 2/1, Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min., Nachweis: UV 210 nm.

Beispiel 1: Bildung von Carnosin aus β-AlaOMe und L-His durch mikrobielle Zellreaktion eines Carnosin bildenden Mikroorganismus
Rhodotorula minuta IFO0879, Rhodotorula minuta IFO0932, Tremella encephAla IFO9293, Rhodotorula minuta IFO0387, Candida mogii IFO0436, Cryptococcus flavus Y-33-8 IFO0710, Rhodotorula minuta K-38 AJ4873, Rhodotorula minuta KN-35 CBS5706, Rhodotorula minuta KN-36 CBS5695, Rhodotorula minuta AY-24 AJ4957, Rhodotorula sp. AY-30 AJ4958 (FERN P-21429), Rhodotorula marina NP-2-10 AJ4965, Rhodotorula aurantiaca IFO0754, Rhodotorula aurantiaca 68–254 AJ5119 und Erythrobasidium hasegawianum IFO1058 wurden auf Flachmedien, die 10 g/l Glucose, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt, 5 g/l Pepton und 15 g/Agar enthielten, aufgetragen und 2 Tage bei 25°C kultiviert.
Eine Impföse der erhaltenen mikrobiellen Zellen wurde in 50 ml des flüssigen Mediums, das 10 g/l Glucose, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt und 5 g/l Pepton enthielt, in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben eingeimpft, und dann wurde eine Kultivierung unter Schütteln 24 Stunden bei 25°C durchgeführt. Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation gewonnen, mit 25 ml Natriumchloridlösung gewaschen und in Natriumchloridlösung suspendiert, um eine mikrobielle Zellsuspension herzustellen.

Diese mikrobielle Zellsuspension (100 μL) und 100 μL einer Substratlösung, die 200 mM β-AlaOMe, 200 mM L-His, 20 mM EDTA und 200 mM Boratpuffer (pH 9,0) enthielt, wurden gemischt und 15 Stunden bei 25°C umgesetzt. Nach dem vollständigen Ablauf der Reaktion wurde die Menge des gebildeten Carnosins gemessen. Tabelle 1. Menge des aus 100 mM β-AlaOMe und 100 mM L-His gebildeten Carnosins

Mikrobielle Zelle	Carnosin
Rhodotorula minuta IFO0879	17,6
Rhodotorula minuta IFO0932	19,3
Tremella encephala IFO9293	4,46
Rhodotorula minuta Y-33-4 IFO0387	5,29
Candida mogii I.G.C. 3442 IFO0436	14,7
Cryptocioccus flavus Y-33-8 IFO0710	10,5
Rhodotorula minuta K-38 AJ4873	13,3
Rhodötorula minuta KN-35 CBS5706	9,12
Rhodotorula minuta KN-36 CBS5695	5,72
Rhodotorula minuta AY-24 AJ4957	11,7
Rhodotorula minuta AY-30 AJ4958	18,2
Rhodotorula marina NP-2-10 AJ4965	11,7
Rhodotorula aurantiaca IFO0754	2,45
Rhodotorula aurantiaca 68–254 AJ5119	6,18
Erythrobasidium hasegawianum IFO1058	13,5

Es ergab sich eine Anhäufung von 2,45 bis 19,3 mM Carnosin in jedem mikrobiellen Stamm. Unter diesen zeigten 5 Stämme, nämlich Rhodotorula minuta IFO0879, Rhodotorula minuta IFO0932, Candida mogii IFO0436, Rhodotorula minuta AY-30 AJ4958 und Erythrobasidium hasegawianum IFO1058 eine hohe Aktivität zur Bildung von 13,5 mM oder mehr Carnosin.
Beispiel 12: Reinigung eines von dem Stamm Rhodotorula minuta IFO0879 abgeleiteten Carnosin bildenden Enzyms
Das Carnosin bildende Enzym wurde aus einer löslichen Fraktion des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 wie folgt gereinigt. Eine enzymatische Aktivität wurde durch Messen der Carnosin bildenden Aktivität unter Einsatz von β-AlaOMe und L-His als Substrate unter den folgenden Bedingungen bestimmt.
Reaktionsbedingung:
50 mM β-AlaOMe, 100 mM L-His und 10 μl/100 μ Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) wurden bei 25°C umgesetzt, und es wurde die nach 15 Minuten gebildete Menge Carnosin gemessen.
(1) Herstellung einer löslichen Fraktion
Der Stamm Rhodotorula minuta IFO0879 wurde auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1 kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden aus dem erhaltenen Kulturmedium durch Zentrifugation gewonnen, mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) gewaschen und dann erneut durch Zentrifugation gewonnen. Die erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung bei 4°C während 60 Minuten aufgebrochen. Die mikrobiellen Zelltrümmer wurden durch Zentifugation (× 8000 rpm, 30 Minuten) der aufgebrochenen Suspension entfernt, und der erhaltene Überstand als lösliche Fraktion eingesetzt.
(2) Ammoniumsulfatfraktionierung
Ammoniumsulfat wurde zu der vorstehend beschriebenen löslichen Fraktion bis zu einer 30%igen Sättigung gegeben. Danach wurde zentrifugiert (× 8000 rpm, 30 Minuten), und der Überstand wurde gewonnen. Danach wurde Ammoniumsulfat zu dem erhaltenen Überstand bis zu einer 70%igen Sättigung gegeben. danach wurde zentrifugiert (× 8000 rpm, 30 Minuten), und ein Niederschlag wurde gewonnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert und gegen 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) bei 4°C über Nacht dialysiert.
(3) Anionenaustauscherchromatographie Q-Sepharose FF
Die vorstehend nach der Dialyse erhaltene Lösung wurde auf eine Anionenaustauscherchromatographiesäule Q-Sepharose FF 26/10 (erworben von Pharmacia (GE Health Care Bioscience, CV = 53 ml) äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), aufgetragen, um Proteine auf einen Träger zu adsorbieren. Die Proteine, die nicht an dem Träger adsorbiert worden waren (nicht absorbierte Proteine), wurden mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) ausgewaschen. Danach wurde das adsorbierte Protein bei einer Fließgeschwindigkeit von 8 ml/min. mit sich linear ändernder NaCl-Konzentration von 0 M bis 0,5 M eluiert. Die Carnosin bildende Aktivität wurde in jeder eluierten Fraktion überprüft, und es wurde ein Peak der Carnosinaktivität in der Fraktion nachgewiesen, die etwa 0,3 M NaCl entspricht.
(4) Hydrophobe Chromatographie: Phenylsepharose HP 16/10
Die Lösung, in der die Carnosin bildende Aktivität nachgewiesen worden war, wurde gegen 1;0 M Ammoniumsulfat, 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) bei 4°C über Nacht dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde auf eine hydrophobe Chromatographiesäule Phenylsepharose HP 16/10 (erworben von Pharmacia (GE Health Care Bioscience, CV = 20 ml), äquilibriert mit 1,0 M Ammoniumsulfat und 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6). Das Carnosin bildende Enzym wurde durch diesen Vorgang auf den Träger adsorbiert.
Die nicht adsorbierten Proteine, die nicht an den Träger adsorbiert worden waren, wurden mit 1,0 M Ammoniumsulfat und 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) ausgewaschen. Danach wurde das Carnosin bildende Enzym bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/min. mit einer sich linear verändernden Ammoniumsulfatkonzentration von 1,0 M bis 0 M eluiert. Die Carnosin bildende Aktivität wurde in jeder eluierten Fraktion gemessen, wobei die Carnosin bildende Aktivität in Elutionsfraktionen beobachtet wurde, die etwa 0,6 bis 0,7 M Ammoniumsulfatkonzentration entsprachen
(5) Gelfiltrationschromatographie: Sephadex 200 pg 16/60
Die Fraktionen, die das Carnosin bildende Enzym enthielten, wurden vereint, und dann wurde gegen 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 7,6) dialysiert. Die erhaltene Lösung wurde unter Einsatz einer Ultrafiltrationsmembran Centriprep 10 konzentriert. Die erhaltene konzentrierte Lösung wurde auf Gelfiltration Sephadex 200 pg 16/60 (erworben von Pharmacia (GE Health Care Bioscience, CV = 120 ml), äquilibriert mit 0,1 M NaCl und 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6)) aufgetragen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0.5 ml/min. eluiert. Die Carnosin bildende Aktivität wurde bei einer Position festgestellt, die abgeschätzt etwa 230 kDa Molekulargewicht entsprach.
(6) Anionenaustauscherchromatographie: Mono Q HR 5/5
Die erhaltene Fraktion wurde auf eine Anionenaustauscherchromatographiesäule Mono Q HR 5/5 (erworben von Pharmacia (GE Health Care Bioscience, CV = 1 ml), äquilibriert mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6)) aufgetragen. Das Carnosin bildende Enzym wurde durch diesen Vorgang auf den Träger adsorbiert. Die nicht adsorbierten Proteine wurden mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) ausgewaschen. Danach wurde das Carnosin bildende Enzym bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 ml/min. mit einer sich linear verändernden NaCl-Konzentration von 0 M bis 0,5 M. Die Carnosin bildende Aktivität wurde in jeder eluierten Fraktion gemessen und bei einer Elutionsposition bestimmt, die einer NaCl-Konzentration von etwa 0,3 M entsprach.
Die erhaltene Fraktion wurde einer SDS-PAGE unterzogen, wobei in der aktiven Fraktion hauptsächlich zwei Banden beobachtet wurden, die 30 kDa und 12 kDa entsprachen. In beiden Banden stimmten das Aktivitätsprofil und das Profil der SDS-PAGE-Bandenintensität überein. Diese zwei Banden wurden aus dem Gel der SDS-PAGE als Kandidaten für das Carnosin bildende Enzym herausgeschnitten und einer Analyse der Aminosäuresequenzen unterworfen.

Die Aktivitäten, Ausbeute und Reinigungsgrade in jeder Reinigungsstufe sind in Tabelle 2 zusammengefasst. [Tabelle 2] Tabelle 2. Zusammenfassung der partiellen Reinigung des von Rhodotorula minuta IFOO879 abgeleiteten Carnosin bildenden Enzyms

	Gesamtprotein (mg)	Gesamtaktivität (U)	spezifische Aktivität (U/mg)	Ausbeute (%)	Reinigung (Faktor)
Rohextrakt	1450	32,8	0,0226	100	1,00
Ammoniumsulfat	352	31,3	0,0889	95,4	3,93
Q-Sepharose	13,5	13,5	1,01	41,2	- 44,5
Phenylsepharose	0,733	12,1	16,5	37,0	732
Superdex	0,305	8,50	27,7	25,8	1230
Mono Q	0,0967	3,12	32,3	9,51	1430

1U = Die Aktivität zur Herstellung von 1 μmol Carnosin pro Minute

Beispiel 3: Bestimmung der N-terminalen und inneren Aminosäuresequenz des Carnosin bildenden Enzyms
Nachdem die gereinigte Fraktion des Carnosin bildenden Enzyms einer SDS-PAGE unterworfen worden war, wurde die 12 kDa entsprechende Bande herausgeschnitten und die N-terminale Aminosäuresequenz, die 27 Aminosäureresten entsprach, wurde wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt, bestimmt (SEQ ID NO:8). Die 30 kDa entsprechende Bande wurde ebenfalls herausgeschnitten, die Probe im Gel der SDS-PAGE wurde mit Trypsin behandelt (pH 8,0, 35°C, 20 Stunden) und dann wurde die Probe einer Umkehrphasen HPLC zur Auftrennung der fragmentierten Peptide unterworfen. Die Aminosäuresequenz, die 12 Resten entsprach, in der abgetrennten Fraktion wurde wie in der folgenden Tabelle 3 gezeigt bestimmt (SEQ ID NO:9). Die Anwesenheit des Proteins, das eine signifikante Homologie zeigte, wurde in der inneren Aminosäuresequenz von 30 kDa nicht nachgewiesen. Die N-terminale Aminosäuresequenz von 12 kDa zeigte jedoch 70% Homologie zu der N-terminalen Sequenz der von Ochrobactrum anthropi abgeleiteten DmpA β-Untereinheit und 67% Homologie zu der von Pseudomonas sp. MCI3434 abgeleiteten BapA β-Untereinheit. [Tabelle 3] Tabelle 3. Festgestellte Aminosäuresequenzen Zusammenfassung der partiellen Reinigung des von Rhodotorula minuta IFO0879 abgeleiteten Carnosin bildenden Enzyms
Beispiel 4: Klonierung des von Rhodotorula minuta IFO0879 abgeleiteten Gens des Carnosin bildenden Enzyms
(1) Präparation von cDNA
Der Stamm Rhodotorula minuta IFO0879 wurde auf das Flachmedium, das 10 g/l Glucose, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/l Malzextrakt, 5 g/Pepton und 15 g/Agar enthielt, aufgetragen und 2 Tage bei 25°C kultiviert. Eine Impföse der erhaltenen mikrobiellen Zellen wurde in das flüssige Medium, das 10 g/l Glucose, 3 g/l Hefeextrakt, 3 g/Malzextrakt und 5 g/l Pepton enthielt, in einem 500 ml Sakaguchi-Kolben eingeimpft, und dann wurde unter Schütteln 24 Stunden bei 25°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation aus der Kultur gewonnen. Die Gesamt RNA wurde aus dieser mikrobiellen Zellpräparation unter Verwendung von RNeasy Midi kit (Qiagen) präpariert. Danach wurde aus der erhaltenen Gesamt RNA unter Verwendung von SMART RACE cDNA Amplifikation Kit (Clontech) cDNA präpariert.
(2) Bestimmung der Sequenz der β-Untereinheit des Carnosin bildenden Enzyms durch das 3'-RACE-Verfahren.
Die in Tabelle 4 beschriebenen Mischprimer wurden auf der Grundlage der festgestellten N-terminalen Aminosäuresequenz des 12 kDa-Fragments des Carnosin bildenden Enzyms snythetisiert. [Tabelle 4]: Tabelle 4. Auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz entworfener und synthetisierter Mischprimer
Die Amplifikation durch PCR wurde mit cDNA des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 als Matrize unter Einsatz des hergestellten Mischprimers RhDmpAl2-f (SEQ ID NO:10) und SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde die Amplifikation durch verschachtelte (nested) PCR unter Einsatz des Mischprimers RhDmpA12-f2 (SEQ ID NO:11) mit dem erhaltenen DNA-Fragment als Matrize durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in pTA2 (Takara) kloniert, und dessen Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die von dem erhaltenen DNA-Fragment abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte 44% Homologie zu der Aminosäuresequenz der von Ochrobactrum anthropi abgeleiteten DmpA β-Untereinheit und 41% Homologie zu der Aminosäuresequenz der von Pseudomonas sp. MCI3434 abgeleiteten BapA β-Untereinheit. Es wurde daher davon ausgegangen, dass die Sequenz der β-Untereinheit des gewünschten Carnosin bildenden Enzyms erhalten worden war.
(3) Bestimmung der α-Untereinheitensequenz des Carnosin bildenden Enzyms durch das 5'-RACE-Verfahren.
Die in Tabelle 5 beschriebenen Primer für 5'-RACE wurden auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der β-Untereinheit des Carnosin bildenden Enzyms gebildet, welches durch das 3'-RACE-Verfahren bestimmt worden war. Tabelle 5]: Tabelle 5. Auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der β-Untereinheit entworfene und synthetisierte Primer
Die Amplifikation durch PCR wurde mit cDNA des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 als Matrize unter Einsatz des hergestellten Mischprimers RhDmpA12-r (SEQ ID NO:12) und des SMART RACE cDNA Amplifikation Kit (Clontech) durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde die Amplifikation durch verschachtelte (nested) PCR unter Einsatz des Mischprimers RhDmpA12-r2 (SEQ ID NO:13) mit dem erhaltenen DNA-Fragment als Matrize durchgeführt. das erhaltene DNA-Fragment wurde in pTA2 (Takara) kloniert, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die von dem erhaltenen DNA-Fragment abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte Homologie zu der α-Untereinheit von DmpA, abgeleitet von Ochrobactrum anthropi und BapA, abgeleitet von Pseudomonas sp. MCI3434. Die Sequenz, die man als Translationsinitiationsstelle vermutete, wurde jedoch nicht bestätigt. Somit wurden die in Tabelle 6 beschriebenen Primer für 5'-RACE auf der Grundlage der erhaltenen Nukleotidsequenz synthetisiert. [Tabelle 6]: Tabelle 6. Auf der Grundlage der Nukleotidsequenz der α-Untereinheit entworfene und synthetisierte Primer
Die Amplifikation durch PCR wurde mit der cDNA des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 als Matrize unter Verwendung des hergestellten Mischprimers RhDmpA30-r (SEQ ID NO:14) und SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech) durchgeführt. Auf ähnliche Weise wurde die Amplifizierung durch verschachtelte (nested) PCR unter Verwendung des Mischprimers RhDmpA30-r2 (SEQ ID NO:15) mit dem erhaltenen DNA-Fragment durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in pTA2 (Takara) kloniert, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Die von dem erhaltenen DNA-Fragment abgeleitete Aminosäuresequenz zeigte 41% Homologie zu der Aminosäuresequenz der von Ochrobactrum anthropi abgeleiteten DmpA α-Untereinheit und 36% Homologie zu der Aminosäuresequenz der von Pseudomonas sp. MCI3434 abgeleiteten BapA α-Untereinheit. Die Sequenz, die man als Translationsinitiationsstelle vermutete, wurde ebenfalls bestätigt. Diese Sequenz enthielt die Sequenz, die zu der inneren Aminosäuresequenz des 30kDa-Fragments identisch ist. Es wurde somit davon ausgegangen, dass die Sequenz der α-Untereinheit des gewünschten Carnosin bildenden Enzyms erhalten worden war.
(4) Bereitstellung des vollständigen Gens des Carnosin bildenden Enzyms durch PCR.
Die in Tabelle 7 beschriebenen Primer zur Amplifikation des vollständigen Gens des Carnosin bildenden Enzyms wurden von den durch 5'-RACE und 3'-RACE erhaltenen Sequenzen synthetisiert. [Tabelle 7] Tabelle 7. Zum Bereitstellen des vollständigen Gens entworfene und synthetisierte Primer
Die Amplifikation durch PCR wurde mit der cDNA des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 als Matrize unter Verwendung der hergestellten Primer RhDmpA-Ndef1 (SEQ ID NO:16) und RhDmpA-Hindr (SEQ ID NO:17) durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde in pTA2 (Takara) kloniert, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Es zeigte sich, dass dieses DNA-Fragment die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 aufwies. Es wurde ein ORF von 1200 bp, einschließlich die Nukleotidsequenzen, welche den ermittelten n-terminalen und inneren Aminosäuresequenzen entsprachen, bestätigt, und das Gen des gewünschten Carnosin bildenden Enzyms (RhDmpA) wurde in vollständiger Länge erhalten. Man ging davon aus, dass das Carnosin bildende Enzym (RhDmpA) als ein Polypeptid translatiert wird und danach in die α-Untereinheit und die β-Untereinheit auf dieselbe Weise wie in DmpA, abgeleitete von Ochrobactrum anthropi, und BapA, abgeleitet von Pseudomonas sp. MCI3434 gespalten wird. Man geht davon aus, dass die α-Untereinheit aus der Aminosäuresequenz von dem ersten Methionin Zu Glycin 274 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 besteht, und dass die β-Untereinheit aus der Aminosäuresequenz von Serin 275 bis Tyrosin 400 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 besteht. Es wurde berichtet, dass sowohl Polypeptide des vom Ochrobactrum anthropiabgeleiteten DmpA als auch des von Pseudomonas sp. MCI3434 abgeleiteten BapA zwischen Glycin und Serin in eine α-Untereinheit und β-Untereinheit gespalten werden. Das vorliegende Enzym stimmt in diesem Punkt damit überein.
Es wurde auch eine genomische DNA isoliert, welche das Polynukleotid umfasst, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 als Exonregion besteht, und welches seine Intronregion umfasst. Die Nukleotidsequenz der isolierten genomischen DNA wurde analysiert, und es zeigte sich, dass sie eine Nukleotidsequenz aufweist.
Beispiel 5: Expression des Carnosin bildenden Enzyms in E. coli
(1) Konstruktion eines Plasmids, welches das Carnosin bildende Enzym exprimiert, unter Einsatz des Vektors pSFN
Ein Plasmid, in das das Gen des Carnosin bildenden Enzyms an pTA2 (Takara) ligiert worden war, wurde mit NdeI und HindIII verdaut, um ein DNA-Fragment zu erhalten, welches das Gen des Carnosin bildenden Enzyms enthält. Dieses wurde an den Vektor pSFN, beschrieben in WO2006/075486 (vgl. pSFN Sm_Aet in den Beispielen, insbesondere in den Beispielen 1, 6 und 12 in WO2006/075486 ), der mit NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser Ligationslösung transformiert, ein Stamm, der das gewünschte Plasmid enthält, wurde in Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und dieses Plasmid wurde pSFN-RhDmpA genannt. Dieses Plasmid exprimiert das Carnosin bildende Enzym, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 besteht, erhalten durch Translation der Nukleotide von dem mit A 40 beginnenden ATG als Translationsinitiationskodon bis zu Nukleotid 1239 in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1. Man ging davon aus, dass die α-Untereinheit des Carnosin bildenden Enzyms aus der Aminosäuresequenz von dem ersten Rest bis zu dem Rest 274 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 besteht, und dass die β-Untereinheit aus der Aminosäuresequenz von Resten 275 bis 400 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:3 besteht.
(2) Expression des Carnosin bildenden Enzyms in E. coli unter Einsatz von pSFN-RhDmpA
Das konstruierte Expressionsplasmid pSFN-RhDmpA wurde in E. coli JM109 eingeführt, um eine Transformante zu erhalten. Eine Impflösung der Transformante wurde in 50 ml TB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft, und dann wurde 16 Stunden unter Schütteln bei 33°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen von 1 ml des erhaltenen Kulturmediums gewonnen, gewaschen und in 1 ml 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert. Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Verwendung dieser mikrobiellen Zellsuspension gemessen. Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Einsatz von β-AlaOMe und L-His als Substrate unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung: 50 mM β-AlaOMe, 100 mM L-His und 20 μl mikrobielle Zellsuspension/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) wurden 15 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten Carnosins wurde mittels HPLC gemessen.
Die Messung ergab, dass 2,15 U/ml Carnosinbildungsaktivität in dem Stamm, in den pSFN-RhDmpA eingeführt worden war, nachgewiesen wurde, wohingegen keine Carnosinbildungsaktivität in e. coli, worin pUC18 eingeführt worden war (Kontrolle), nachgewiesen wurde. In Verbindung mit der Konstruktion des Plasmids mit hoher Expression von RhDmpA konnte dies bestätigen, dass das Gen des gewünschten Carnosin bildenden Enzyms mit Sicherheit kloniert worden war.
(3) Expression des Carnosin bildenden Enzyms von einer anderen Translationsinitiationsstelle aus
Die in Tabelle 8 gezeigten Primer wurden synthetisiert für die Amplifikation von ORF, der das Polynukleotid ausgehend von ATG 55 als Translationsinitiationskodon zu dem Nukleotid 1239 (vgl. SEQ ID NO:4) in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 kodiert, und für die Amplifikation von ORF, der das Polynukleotid ausgehend von ATG 91 als Translationsinitiationskodon zu dem Nukleotid 1239 (vgl. SEQ ID NO:6) in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1 kodiert. [Tabelle 8]: Tabelle 8. Primer, die für die Amplifikation der ORFs, die von einem anderen Translationsinitiationspunkt ausgehen, entworfen und synthetisiert wurden.
Die Amplifikation durch PCR wurde mit der cDNA des Stammes Rhodotorula minuta IFO0879 als Matrize unter Verwendung des hergestellten Primers RhDmpA-Ndef2 (SEQ ID NO:18) und RhDmpA-Hindr durchgeführt. Das erhaltene DNA-Fragment wurde im pTA2 (Takara) kloniert und seine Nukleotidsequenz wurde ermittelt, und es wurde bestätigt, dass es die gewünschte Nukleotidsequenz ist. Das erhaltene Plasmid wurde mit NdeI und HindIII verdaut und dann an den pSFN-Vektor, der mit NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser Ligationslösung transformiert, ein Stamm mit dem gewünschten Plasmid wurde in Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und dieses Plasmid wurde pSFN-RhDmpA2 genannt. Dieses Plasmid exprimiert das Carnosin bildende Enzym, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 besteht, erhalten durch Translation des Polynukleotids ausgehend von ATG 55 als Translationsinitiationskodon bis zum Nukleotid 1239 in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1. Man geht davon aus, dass die α-Untereinheit des Carnosin bildenden Enzyms aus der Aminosäuresequenz ausgehend von dem ersten Rest bis zu dem Rest 269 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 besteht, und dass die β-Untereinheit aus der Aminosäuresequenz von dem Rest 270 bis zu dem Rest 295 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:5 besteht. Das konstruierte Expressionsplasmid pSFN-RhDmpA2 wurde in E. coli J109 eingeführt, um eine Transformante zu erhalten. Eine Impföse der Transformante wurde in 50 ml TB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft, und dann wurde 16 Stunden unter Schütteln bei 33°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen aus 1 ml des erhaltenen Kulturmediums gewonnen, gewaschen und in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert. Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Verwendung dieser mikrobiellen Zellsuspension gemessen, wobei eine Carnosinbildungsaktivität von 2,09 U/ml ermittelt wurde.
Auf ähnliche Weise wurde die Amplifikation durch PCR unter Verwendung von RhDmpA-Ndef3 (SEQ ID NO:19) und RhDmpA-Hindr durchgeführt, um pSFN-RhDmpA3 zu konstruieren. Dieses Plasmid exprimiert das Carnosin bildende Enzym, das aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:7 besteht, erhalten durch Translation des Polynukleotids ausgehend von ATG 91 als Translationsinitiationskodon bis zu Nukleotid 1239 in der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO:1. Man geht davon aus, dass die α-Untereinheit des Carnosin bildenden Enzyms aus der Aminosäuresequenz, ausgehend von dem ersten Rest bis zu dem Rest 257 in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO:7 besteht. Das konstruierte Expressionsplasmid pSFN-RhDmpA3 wurde in E. coli JM109 eingeführt, um eine Transformante zu erhalten. Eine Impföse der Transformante wurde in 50 ml TB-Medium, das 100 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft, und dann wurde 16 Stunden bei 33°C unter Schütteln kultiviert. Nach der Kultivierung wurden. mikrobielle Zellen aus 1 ml des erhaltenen Kulturmediums gewonnen, gewaschen und in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert. Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Verwendung dieser mikrobiellen Zellsuspension gemessen, wobei eine Carnosinbildungsaktivität von 2,58 U/ml ermittelt wurde.
Beispiel 6: Expression eines RhDmpA-Homologen in E. coli
(1) Konstruktion eines Plasmids, das ein RhDmpA-Homologes exprimiert, unter Verwendung des Vektors pSFN
Es wurde für RhDmpA3 die Aminosäurehomologie untersucht (im Folgenden, falls erforderlich, als Rh3 abgekürzt). Die Expression der folgenden drei Homologen (A) bis (c), die eine relativ hohe Homologie aufweisen, wurde durchgeführt:

(a) BapA, abgeleitet von dem Stamm Sphingosinicella microcystinivorans Y2 (40% Homologie zu der Aminosäuresequenz von RhDmpA; im Folgenden, falls erforderlich, als Y2 abgekürzt);
(b) DmpA, abgeleitet von dem Stamm Pyrococcus horikoshii OT3 (35% Homologie zu der Aminosäuresequenz von RhDmpA; im Folgenden, falls erforderlich, als PH abgekürzt); und
(c) DmpA, abgeleitet von dem Stamm Aspergillus oryzae RIB40 (49% Homologie zu der Aminosäuresequenz von RhDmpA; im Folgenden, falls erforderlich, als As abgekürzt).

Was Y2 betrifft, wurde der Stamm Sphingosinicella microcystinivorans Y2 (JCM 13185) vom RIKEN Bioresource Center erhalten, und seine genomische DNA wurde nach Kultivierung extrahiert und als Matrize verwendet. Ein DNA-Fragment, welches das abgeleitete β-Peptidylamindipeptidasegen (Locus tag number: EF043283, GenBank Accession number: EF043283) enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung des Primers Y2-NdeI-f (SEQ ID NO:26) und Y2-HindIII-r (SEQ ID NO:27), wie in Tabelle 9 beschrieben, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit NdeI und HindIII verdaut, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, das ein Gen des RhDmpA-Homologen enthält. Dieses DNA-Fragment wurde an den Vektor pSFN, beschrieben in WO2006/075486 , der mit NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser Ligationslösung transformiert, ein Stamm, der das gewünschte Plasmid enthält, wurde in Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und dieses Plasmid wurde pSFN-Y2-BapA genannt.
Was PH betrifft, wurde von dem Stamm Pyrococcus horikoshii OT3 (JCM 9974, RDB5990) abgeleitete genomische DNA vom RIKEN Bioresource Center erhalten und als Matrize eingesetzt. Eine DNA-Sequenz, die ein D-Aminopeptidasegen (Locus tag number: PH0078, GenBank Accession number: NP 142096 und BA000001) enthielt, wurde durch PCR unter Verwendung des Primers PH-NdeI-f (SEQ ID NO: 28) und des Primers PH-HindIII-r (SEQ ID NO:29), beschrieben in der folgenden Tabelle 9, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit NdeI und HindIII verdaut, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches ein zu RhDmpA homologes Enzymgen enthielt. Dieses DNA-Fragment wurde an dem Vektor pSFN, beschrieben in WO2006/075486 , der mit NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser Ligationslösung transformiert, ein Stamm, der das gewünschte Plasmid enthielt, wurde in Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und dieses Polyamid wurde pSFN-PH-DmpA genannt.
Was As betrifft, wurde der von Aspergillus oryzae RIB40 abgeleitete BAC-Klon B043G02 der genomischen DNA von NBRC erhalten, und als Matrize eingesetzt. Eine DNA-Sequenz, die das L-Aminopeptidase/D-Esterase-Gen (Locus tag number: AO090138000075; GenBank Accession number: XM 001825534) enthielt, wurde durch PCR unter Einsatz der Primer As-NdeI-f (SEQ ID NO:30) und As-HindIII (SEQ ID NO:31), beschrieben in der folgenden Tabelle 9, amplifiziert. Das erhaltene DNA-Fragment wurde mit NdeI und HindIII verdaut, wobei ein DNA-Fragment erhalten wurde, welches das Gen des zu RhDmpA homologen Enzyms enthält. Dieses DNA-Fragment wurde an den Vektor pSFN, beschrieben in WO2006/075486 , der mit NdeI und HindIII verdaut worden war, ligiert. E. coli JM109 wurde mit dieser Ligationslösung transformiert, ein Stamm, der das gewünschte Plasmid enthielt, wurde in Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und dieses Plasmid wurde pSFN-As-DmpA. [Tabelle 9] Tabelle 9. Für die Amplifikation von Genen der RhDmpA-Homologen entworfene und synthetisierte Primer
(2) Enzymatische Expression von RhDmpA-Homologen in E. coli
Das konstruierte Expressionsplasmid wurde in E. coli JM109 eingeführt, um eine Transformante zu erhalten. Eine Impföse der Transformante wurde in 50 ml TB-Medium, das μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft, und dann wurde 16 Stunden unter Schütteln bei 37°C kultiviert. Nach der Kultivierung wurden die mikrobiellen Zellen aus 1 ml des erhaltenen Kulturmediums gewonnen, gewaschen und in 1 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6) suspendiert. Die Carnosinbildungsaktivität und die Carnosinabbauaktivität wurden unter Einsatz dieser mikrobiellen Zellsuspension gemessen.
Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Verwendung von β-AlaOMe und L-His als Substrate unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung: 50 mM β-AlaOMe, 100 mM L-His und 20 μl mikrobielle Zellsuspension/microbial cell suspension/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 8,5) wurden 15 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten Carnosins wurde mit HPLC gemessen.
Die Carnosinabbauaktivität wurde unter Einsatz von Carnosin als Substrat unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung: 20 mM Carnosin und 20 μl mikrobielle Zellsuspension/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 8,5) wurden 15 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des hergestellten Histidins wurde durch HPLC gemessen.
Als Ergebnis der Messung wurde eine Carnosinbildungsaktivität von 1,4 U/ml in dem mit pSFN-RhDmpA transformierten Stamm nachgewiesen (1). Eine Aktivität von etwa 0,4 U/ml wurde auch in dem mit pSFN-Y2-BapA oder pSFN-As-DmpA transformierten Stamm nachgewiesen. Die Carnosinabbauaktivität war stark in dem mit pSFN-Y2-BapA transformierten Stamm (etwa 0,4 U/ml), während sie in dem mit pSFN-RhDmpA oder pSFN-As-DmpA transformierten Stamm schwach war (0,1 U/ml oder weniger). Beide Aktivitäten waren am oder unter der Nachweisgrenze in dem mit pSFN-PH-DmpA transformierten Stamm.
(3) Messung der Carnosinausbeuten und Carnosinbildung und Abbau der RhDmpA-Homologen.
Die Carnosinausbeute wurde für die drei Stämme gemessen, d. h. für die mit pSFN-Y2-BapA und pSFN-As-DmpA transformierten Stämme, welche die Homologen von pSFN-RhDmpA sind, deren Expression in (2) identifiziert wurde, und für den mit pSFN-RhDmpA3 transformierten Stamm. Es wurden Ausbeuten von 24%, 31% und 67% Carnosin in den mit pSFN-Y2-BapA, pSFN-As-DmpA bzw. pSFN-RhDmpA3 transformierten Stämmen erzielt. Somit wurde gezeigt, dass Carnosin effizient gebildet werden konnte (Tabelle 10). Aus den Ergebnissen der Messung der Carnosinbildung und des Carnosinabbaus schließt man, dass nicht nur eine spezifische Aktivität der Carnosinbildung, sondern auch das Verhältnis der Bildungsaktivität zu der Abbauaktivität wichtig sind (2). [Tabelle 10] Tabelle 10. Ausbeute von Carnosin mit dem jeweiligen Plasmid

Plasmid Ausbeute

pSFN-RhDmpA3 67%

pSFN-Y2-BapA 24%

pSFN-AS-DmpA 31%
Beispiel 7: Carnosinbildungsreaktion unter Verwendung eines anderen Substrats als Methylester
Das RhDmpA-Enzym wurde aus dem mit pSFN-RhDmpA3 transformierten Stamm gereinigt. Unter Verwendung dieses Enzyms wurde Carnosin unter Einsatz von β-Ala-Ester oder β-Ala-Amid als Substrat gebildet. Die Carnosinbildungsaktivität wurde unter Einsatz von β-Ala-Ester oder β-Ala-Amid und L-His als Substrate unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung der Aktivitätsmessung: 50 mM β-Ala-Ester oder β-Ala-Amid, 100 mM L-His und 0,1 U/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 8,5) wurden 15 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten Carnosins wurde durch HPLC gemessen.
Reaktionsbedingung der Ausbeutemessung: 50 mM β-Ala-Ester oder β-Ala-Amid, 100 mM L-His und 2 U/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 8,5) wurden 120 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten Carnosins wurde durch HPLC gemessen.
Als Ergebnis wurde gefunden, dass die anderen Ester als β-Ala-methylester und β-Ala-Amid eingesetzt werden konnten (3). Die Ausbeute war bei Verwendung von β-Ala-methylester oder β-Ala-ethylester hoch (4).
Beispiel 8: β-Ala-X-Bildungsreaktion unter Einsatz einer anderen Aminosäure als Histidin als Substrat.
Die β-Ala-X-Bildungsreaktion wurde unter Verwendung des RhDmpA-Enzyms, das in Beispiel 7 gereinigt worden war, durchgeführt, und es wurden verschiedene Aminosäuren als Substrat eingesetzt. Die β-Ala-X-Bildungsaktivität wurde unter Verwendung von β-Ala-methylester und der Aminosäure X als Substrate unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung der Aktivitätsmessung: 50 mM β-Ala-methylester, 100 mM L-Aminosäure X, 10 mM EDTA und 30 mU/200 μl, Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) wurden 10 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten β-Ala-X wurde durch HPLC gemessen.

Als Ergebnis wurde gefunden, dass die andere Aminosäure als Histidin auch als Substrat erkannt werden konnte. [Tabelle 11] Tabelle 11: Spezifische Aktivitäten der Bildung von Dipeptiden aus verschiedenen Aminosäuren

Aminosäure X	hergestelltes Dipeptid	spezifische Aktivität (U/mg)
Histidin	Carnosin	28,8
β-Alanin	βAla-βAla	64,8*
Alanin	βAla-Ala	12,5*
Valin	βAla-Val	87,1
Phenylalanin	βAla-Phe	37,5

1U = Die Aktivität, bei der 1 μmol Carnosin pro Minute gebildet wird
Nur * wurden mit β-Ala-methylester bei einer Konzentration von 100 mM durchgeführt

Beispiel 9: β-Ala-X-Bildungsreaktion unter Verwendung eines Aminosäurederivats als Substrat
Die β-Ala-X-Bildungsreaktion wurde unter Einsatz verschiedener Aminosäurederivate als Substrat auf dieselbe Weise wie in Beispiel 8 durchgeführt. Die β-Ala-X-Bildungsaktivität wurde unter Verwendung von β-Ala-methylester und einem Aminosäurederivat X als Substrat unter der folgenden Bedingung gemessen.
Reaktionsbedingung der Aktivitätsmessung: 50 mM β-Ala-methylester, 100 mM L-Aminosäure X, 10 mM EDTA und 30 U/200 μl Reaktionslösung in 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) wurden 10 Minuten bei 25°C umgesetzt, und die Menge des gebildeten β-Ala-X wurde durch HPLC gemessen.
Als Ergebnis wurde gefunden, dass das Aminosäurederivat auch als Substrat erkannt werden konnte. [Tabelle 12] Tabelle 12: Spezifische Aktivitäten der Bildung von Dipeptiden aus verschiedenen Aminosäurederivaten

Derivat X Hergestelltes Dipeptid spezifische Aktivität (U/mg)

Histamin Carcinin 42,8*

3-Methylhistidin Anserin 55,4

1-Methylhistidin Vanillin 12,3

1U = Die Aktivität, bei der 1 μM Carnosin pro Minute gebildet wird
Nur * wurden mit β-Alamethylester bei einer Konzentration von 100 mM durchgeführt

Aufgrund der Ergebnisse in den Beispielen 8 und 9 geht man davon aus, dass das RhDmpA-Enzym ein Enzym ist, das β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon eher bildet als ein Carnosin bildendes Enzym.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur effizienten Herstellung einer β-Alanylaminosäure (beispielsweise Carnosin) oder eines Derivats davon bereit. Genauer gesagt stellt sie ein Verfahren zur Herstellung einer β-Alanylaminosäure (beispielsweise Alanylhistidin) oder eines Derivats davon bereit, welches das Bilden der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder eines Derivats davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, welches eine Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure (beispielsweise β-Alanylhistidin) oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure (beispielsweise Histidin) oder dem Derivat davon aufweist; ein Protein, das eine Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist; und ein für das Protein kodierende Polynukleotid. SEQUENZPROTOKOLL
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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JP 61-257931 A [0079]
WO 2006/075486 [0129, 0129, 0137, 0138, 0139]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Claims

Verfahren zum Herstellen einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon, welches das Bilden der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure oder ein Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon bilden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, welches das Verfahren zum Herstellen der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon ist und das Bilden der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus dem β-Alanylester und der Aminosäure oder dem Derivat davon mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon aus dem β-Alanylester und der Aminosäure oder dem Derivat davon bilden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, welches das Verfahren zum Herstellen der β-Alanylaminosäure ist und das Bilden der β-Alanylaminosäure aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, das die β-Alanylaminosäure aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure bilden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, welches ein Verfahren zum Herstellen von β-Alanylhistidin ist und das Bilden des β-Alanylhistidins aus dem β-Alanylester und Histidin mit einem Enzym oder einem enzymhaltigen Produkt umfasst, welches das β-Alanylhistidin aus dem β-Alanylester oder dem Histidin bilden kann.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym oder das enzymhaltige Produkt ein oder zwei oder mehr Mitglieder der Gruppe ist, die aus einer Kultur eines Mikroorganismus mit der Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon, einer von der Kultur abgetrennten mikrobiellen Zelle und einem behandelten mikrobiellen Produkt des Mikroorganismus besteht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ein Mikroorganismus der Gattung Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus, Erythrobasidium, Sphingosinicella oder Aspergillus ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus ist, der ein Protein exprimieren kann, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Proteinen (A) bis (H), (K) und (L) besteht: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und das die Fähigkeit hat, die β-Alanylaminosäure oder das Derivat davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon zu bilden; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (G) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls; (H) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 in dem Sequenzprotokoll umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (K) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls; und (L) ein Protein, das eine Aminosäuresequenz aufweist, welche Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls umfasst, und das eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Aktivität eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylhistidin aus dem β-Alanylester und Histidin ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Mikroorganismus ein transformierter Mikroorganismus ist, in den ein Polynukleotid eingeführt worden ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den folgenden Polynukleotigen (a) bis (h), (k) bis (n) besteht: (a) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (b) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat kodiert; (c) ein Polynukleotid der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (d) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid kodiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (e) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91-1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (f) ein Polynukleotid, das unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Fähigkeit zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (g) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls; (h) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 20 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (k) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls; (l) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 24 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert; (m) ein Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls; und (n) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon kodiert.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Enzym mindestens ein Mitglied der Gruppe ist, die aus den folgenden Mitgliedern (A) bis (H), (K) und (L) besteht: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (G) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls; (H) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 21 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist; (K) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls; (L) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 25 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder des Derivats davon aus dem β-Alanylester oder dem β-Alanylamid und der Aminosäure oder dem Derivat davon aufweist.
Protein, abgeleitet von einem Mikroorganismus einer Gattung, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus den Gattungen Rhodotorula, Tremella, Candida, Cryptococcus und Erythrobasidium besteht, und welches eine Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist.
Aus der aus den folgenden Proteinen (A) bis (F) bestehenden Gruppe ausgewähltes Protein: (A) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls; (B) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 3 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist; (C) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls; (D) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 5 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist; (E) ein Protein mit der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls; (F) ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die Substitution, Deletion und/oder Insertion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der Sequenz ID No. 7 des Sequenzprotokolls umfasst, und welches eine Aktivität zur Bildung der β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon aufweist.
Protein nach Anspruch 12, wobei die Aktivität eine Aktivität zur Bildung von β-Alanylhistidin aus einem β-Alanylester und Histidin ist.
Polynukleotid, das für das Protein nach Anspruch 12 kodiert.
Polynukleotid, ausgewählt aus der aus den folgenden Polynukleotiden (a) bis (f), (m) und (n) bestehenden Gruppe: (a) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (b) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 40 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (c) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (d) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 55 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (e) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls; (f) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Nukleotidnummern 91 bis 1239 der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 1 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Aktivität zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert; (m) Polynukleotid mit der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls; und (n) ein Polynukleotid, welches unter einer stringenten Bedingung mit einem Polynukleotid hybridisiert, das aus einer Nukleotidsequenz besteht, die zu der Nukleotidsequenz der Sequenz ID No. 32 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und welches für ein Protein mit einer Fähigkeit zur Bildung einer β-Alanylaminosäure oder eines Derivats davon aus einem β-Alanylester oder einem β-Alanylamid und einer Aminosäure oder einem Derivat davon kodiert.
Polynukleotid nach Anspruch 15, wobei die stringente Bedingung eine Bedingung ist, bei der das Waschen bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, bei 60°C durchgeführt wird.
Rekombinantes Polynukleotid, welches das Polynukleotid nach einem der Ansprüche 14 bis 16 aufweist.
Mit dem Polynukleotid nach Anspruch 17 transformierte Zelle.