DE60226243T2

DE60226243T2 - Peptid-bildendes Enzymgen, Pepid-bildendes Enzym und Dipeptidherstellungsverfahren

Info

Publication number: DE60226243T2
Application number: DE60226243T
Authority: DE
Inventors: Naoto Kawasaki-shi Tonouchi; Sonoko Kawasaki-shi SUZUKI; Kenzo Kawasaki-shi YOKOZEKI; Hiroyuki Kawasaki-shi NOZAKI; Masakazu Kawasaki-shi SUGIYAMA
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2001-07-26
Filing date: 2002-07-26
Publication date: 2009-05-14
Anticipated expiration: 2022-07-27
Also published as: JPWO2003010189A1; EP1911839B1; EP1411116A1; CN100422207C; CN1529712A; CN1268742C; US7618796B2; JPWO2003010187A1; DK1411116T3; DK1911839T3; JP4289151B2; DE60226243D1; WO2003010307A1; WO2003010189A1; EP1411060A1; US20070048838A1; US20070042459A1; US20050054067A1; EP1911839A1; WO2003010187A1

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur bequemen und wirtschaftlichen Herstellung von Dipeptiden ohne komplizierte Syntheseverfahren und insbesondere ein Peptid-bildendes Enzymgen, ein Peptid-bildendes Enzym und ein Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden unter Verwendung des Enzyms.
STAND DER TECHNIK
Dipeptide werden auf dem Gebiet der pharmazeutischen Materialien und der funktionellen Lebensmittel und auf verschiedenen weiteren Gebieten eingesetzt. Beispielsweise wird L-Alanin-L-glutamin als eine Komponente von serumfreien Medien eingesetzt und wird für Infusionskomponenten verwendet, da es eine höhere Stabilität und Löslichkeit als L-Glutamin hat.
Chemische Syntheseverfahren, die herkömmlich als Verfahren zum Herstellen von Dipeptiden bekannt sind, sind nicht notwendigerweise einfach. Bekannte Beispiele solcher Verfahren umfassen ein Verfahren, welches N-Benzyloxycarbonylalanin (im Folgenden als "Z-Alanin" bezeichnet) und geschütztes L-Glutamin verwendet (vergleiche Bull. Chem. Soc. Jpn., 34, 739 (1961), Bull. Chem. Soc. Jpn., 35, 1966 (1962)), ein Verfahren, welches Z-Alanin und einen geschützten L-Glutamat-γ-methylester verwendet (Bull. Chem. Soc. Jpn., 37, 200 (1964)), ein Verfahren, welches einen Z-Alaninester und ungeschützte Glutaminsäure verwendet ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H1-96194 ), und ein Verfahren, welches ein 2-substituiertes Propionylhalogenid als Ausgangsmaterial verwendet und ein N-(2-substituiertes)-Propionylglutaminderivat als Intermediat synthetisiert ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H6-234715 ).
In all diesen Verfahren ist jedoch das Einführen und das Eliminieren einer Schutzgruppe oder die Synthese eines Intermediats erforderlich, sodass diese Produktionsverfahren im Hinblick auf ihre industriellen Vorteile nicht zufriedenstellend sind. Bekannte Beispiele von typischen Dipeptidproduktionsverfahren unter Einsatz von Enzymen umfassen eine Kondensationsreaktion unter Verwendung einer N-geschützten, C-ungeschützten Carboxykomponente und einer N-ungeschützten, C-geschützten Aminkomponente (Reaktion 1) sowie eine Substitutionsreaktion unter Verwendung einer N-geschützten, C-geschützten Carboxykomponente und einer N-ungeschützten, C-geschützten Aminkomponente (Reaktion 2). Ein Beispiel von Reaktion 1 ist ein Verfahren zur Herstellung von Z-Aspartylphenylalaninmethylester aus Z-Asparaginsäure und Phenylalaninmethylester ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. S53-92729 ), während ein Beispiel von Reaktion 2 ein Verfahren zur Herstellung von Acetylphenylalanylleucinamid aus Acetylphenylalaninethylester und Leucinamid ist (Biochemical J., 163, 531 (1977)). Es gibt extrem wenige Beispiele von Forschungsberichten, welche Verfahren unter Verwendung von N-ungeschützten, C-geschützten Carboxykomponenten beschreiben. Ein Beispiel einer Substitutionsreaktion unter Verwendung einer N-ungeschützten, C-geschützten Carboxykomponente und einer N-ungeschützten, C-geschützten Aminkomponente (Reaktion 3) wird in WO 90/01555 beschrieben, und ein Beispiel einer solchen Reaktion ist ein Verfahren zur Herstellung von Arginylleucinamid aus Argininethylester und Leucinamid. Ein Beispiel einer Substitutionsreaktion unter Verwendung einer N-ungeschützten, C-geschützten Carboxykomponente und einer N-ungeschützten, C-ungeschützten Aminkomponente (Reaktion 4) wird in EP 278787 A beschrieben, und ein Beispiel einer solchen Reaktion ist ein Verfahren zur Herstellung von Tyrosylalanin aus Tyrosinethylester und Alanin. Unter den Verfahren sind die kostengünstigen Verfahren natürlicherweise diejenigen, die unter Reaktion 4 fallen, welche die geringste Anzahl von Schutzgruppen erfordert.
Das in dem Beispiel des Standes der Technik der Reaktion 4 ( EP 278787 A ) eingesetzte Enzym ist jedoch eine relativ teure Carboxypeptidasezubereitung, die von Schimmelpilzen und Pflanzen abgeleitet ist, und die hergestellten Dipeptide enthielten Aminosäuren, die vergleichsweise hoch hydrophob sind. Bezüglich Reaktion 4 gibt es kein bekanntes Verfahren, welches ein Enzym bakteriellen Ursprungs oder Hefeursprungs verwendet, und es ist kein Verfahren zur Herstellung von hochhydrophilem Alanylglutamin oder Alanylasparagin bekannt. Unter solchen Umständen besteht Bedarf an der Entwicklung eines kostengünstigen industriellen Verfahrens zur Herstellung solcher Peptide.
Andererseits ist Proliniminopeptidase ein Enzym, welches eine Reaktion katalysiert, die ein N-terminales Prolin von einem Peptid mit einem Prolin an seinem N-Terminus spaltet, und dieses Enzym existiert bekanntlich in zahlreichen Arten von Organismen. Beispielsweise ist bekannt, dass es in höheren Tieren, wie Meerschweinchen (Hirn) (J. Biol. Chem., 258, 6147–6154 (1983)), Ratten (Hirn und Nieren) (Eur. J. Biochem., 190, 509–515 (1990)), höheren Pflanzen, wie Aprikosensamen (J. Biochem., 92, 413–421 (1982)), Spirochäten der Mundhohlräume, wie Trichoderma denticola (Infect. Immun., 64, 702–708 (1996), filamentösen Pilzen, wie Penicillium species ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H1-215288 ), Basidiomyceten, wie Shiitakepilzen ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. S58-36387 ), Actinomyceten, wie Streptomyces blicatus (Biochem. Biophys. Res. Commun., 184, 1250–1255 (1992), und in Bakterien, wie Corynebacterium variabilis (J. Appl. Microbiol., 90, 449–456 (2001)), vorkommen.
Was das Proliniminopeptidasegen betrifft, sind zudem das Klonieren und die Rasensequenzen der Gene von Arthrobacter nicotiana (FEMS Microbiol. Lett., 78, 191–197 (1999)), Escherichia coli ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H2-113887 ), Flavobacterium meningosepticum (Arch. Biochem. Biophys., 336, 35–41 (1996)), Hafnia alvei (J. Biochem., 119, 468–474 (1996)), Lactobacillus debrueckii (Microbiology, 140, 527–535 (1994)), Bacillus coagulans Quelle (J. Bacteriol., 174, 7919–1925 (1994)), Aeromonas sobria Quelle (J. Biochem., 116, 818–825 (1994)), Xanthomonas campestris ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H9-121860 ), Neisseria gonorrhoeae (Mol. Microbiol., 9, 1203–1211 (1993), Propionibacterium freundenreichii (Appl. Environ. Micorbiol., 64, 4736–4742 (1998)), Serratia marcescens (J. Biochem., 122, 601–605 (1997)) und Thermoplasma acidophilum (FERS Lett., 398, 101–105 (1996)) berichtet worden.
Zudem sind Basensequenzen, von denen vorhergesagt wird, dass sie Proliniminopeptidase kodieren, kürzlich in zahlreichen Arten von Organismen als das Ergebnis von Analysen der Gesamtgenome von Mikroben berichten worden. Beispielsweise wurde die Gesamtgenombasensequenz von Pseudomonas aeruginosa berichtet (Nature, 406, 959 (2000)), und es wurde darin eine Basensequenz gefunden, von der vorhergesagt wird, dass sie Proliniminopeptidase kodiert.
Andererseits wurde gefunden, dass ein Prolin-enthaltendes Dipeptid gebildet wird, wenn ein Ester von L-Prolin oder DL-Prolin und eine α-Aminosäure unter Verwendung von Proliniminopeptidase umgesetzt werden ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. H3-13391 ). Obwohl Proliniminopeptidase ein Enzym ist, welches eine Reaktion katalysiert, die das N-terminale Prolin von einem Peptid mit Prolin an seinem N-Terminus spaltet, und eine Prolylaminosäure auf natürliche Weise von Prolinester und einer Aminosäure gebildet werden sollte, war jedoch die Synthese eines Peptids aus einer Aminosäure und einem anderen Aminosäureester als Prolin unter Einsatz von Proliniminopeptidase vollkommen unbekannt. Die Synthese von L-Alanyl-L-glutamin aus L-Alaninethylesterhydrochlorid und L-Glutamin war natürlich vorher bekannt. Obwohl die Teilbasensequenz von Proliniminopeptidase von Pseudomonas putida Stamm ATCC 12633 offenbart war (AF032970), gab es außerdem überhaupt keine Untersuchung bezüglich ihrer Aktivität, einschließlich ihres Nachweises.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids auf industriell vorteilhafte und einfache Weise unter Einsatz eines Ausgangsmaterials bereitzustellen, das kostengünstig bezogen werden kann, und einer Enzymquelle, die kostengünstig bereitgestellt werden kann (beispielsweise eine Mikrobenkultur, Mikrobenzellen oder ein behandeltes Mikrobenzellprodukt einer Mikrobe).
Als Ergebnis umfangreicher Forschungen zum Erreichen des vorstehend genannten Zieles haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Proliniminopeptidase die Fähigkeit hat, ein Peptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen. Zudem haben die Erfinder der vorlie genden Erfindung das Gen des Enzyms auch kloniert und exprimiert, und sie haben auch die Breite Substratspezifität des Enzyms bei der Peptidherstellung unter Einsatz von gereinigten rekombinanten Enzymen klar gezeigt, wodurch die vorliegende Erfindung vervollständigt wurde.
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend beschrieben.

[1] Ein Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz.
[2] Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz.
[3] DNA, die aus der Basensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in der in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenz besteht.
[4] DNA, die aus der Basensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenz besteht.
[5] Vektor-DNA, welche darin einverleibt die DNA nach Punkt [3] oder [4] enthält.
[6] Transformierte Zelle, die mit der Vektor-DNA nach Punkt [5] transformiert ist.
[7] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptid-bildenden Enzyms, welches umfasst: Kultivieren der transformierten Zellen gemäß Punkt [6] in einem Medium und Anhäufen eines Proteins mit der Aktivität, das Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure in dem Medium und/oder in der transformierten Zelle herzustellen.
[8] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: Herstellen eines Dipeptids aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure unter Verwendung eines Proteins mit der Aktivität, das Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure, die in Zellen produziert wird, die mit der Vektor-DNA transformiert worden sind, zu bilden, wobei die Vektor-DNA darin einverleibt eine DNA enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (c) bis (f) besteht: (c) eine DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in einer in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, (d) eine DNA mit einer Homologie von 90% oder mehr mit der DNA, die aus der Basensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in der in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, und welche für ein Protein mit der Aktivität kodiert, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure zu bilden, (e) eine DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, (f) eine DNA mit einer Homologie von 90% oder mehr zu der DNA, die aus der Basensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Basensequenz besteht, und die für ein Protein mit der Aktivität kodiert, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure zu bilden.
[9] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Punkt [8], wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, einem Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Leucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
[10] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Punkt [8] oder [9], wobei die L-Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.
[11] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: das Zulassen, dass ein Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität auf einen L-Aminosäureester und eine L-Aminosäure wirkt, um ein Dipeptid zu bilden, wobei das Protein aus (C) bis (F) ausgewählt ist: (C) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (D) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen, (E) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (F) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen.
[12] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Punkt [11], wobei das Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität von einer Mikrobe der Gattung Corynebacterium, Pseudomonas oder Bacillus abgeleitet ist.
[13] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Punkt [11], wobei das Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität von einer beliebigen Art, die unter Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida und Bacillus coagulans ausgewählt ist, abgeleitet ist.
[14] Verfahren zum Herstellen eins Dipeptids nach einem der Punkte [11] bis [13], wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Isoleucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
[15] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach einem der Punkte [11] bis [14], wobei die L-Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L- Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.
[16] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: das Herstellen des Dipeptids aus einem Aminosäureester und einer Aminosäure unter Verwendung einer Kultur einer Mikrobe der Gattung Corynebacterium, Pseudomonas oder Bacillus, das Herstellen eines Proteins mit der Fähigkeit, das Dipeptid aus dem Aminosäureester und der Aminosäure herzustellen, unter Verwendung mikrobieller Zellen, die aus der Kultur isoliert worden sind, oder eines behandelten mikrobiellen Produkts der Mikrobe, wobei das Protein unter (C) bis (F) ausgewählt ist: (C) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (D) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen, (E) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (F) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen.
[17] Das Verfahren zum Herstellen eins Dipeptids nach Punkt [16], wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Leucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
[18] Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Punkt [16], wobei die Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 ist ein Graph, der die Dipeptid-bildende Aktivität veranschaulicht, wenn ein Inhibitor zugegeben wird.
BESTE AUSFÜHRUNGSFORM DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Protein mit der Fähigkeit zur Herstellung eines Dipeptids aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure, eine für dieses Protein kodierende DNA und ein Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids unter Einsatz des Proteins bereit. Die Reaktion in dem erfindungsgemäßen Dipeptidherstellungsverfahren wird durch das nachstehende Reaktionsschema veranschaulicht. Wie in den folgenden chemischen Formeln beispielhaft gezeigt wird, bedeutet der hier verwendete Ausdruck "Dipeptid" ein Peptidpolymer mit einer Dipeptidbindung. (Chemische Formel 1)
(In der Formel stellt R eine substituierte oder nichtsubstituierte Kohlenwasserstoffkette dar, R₁ stellt eine Aminosäureesterseitenkette dar und R₂ stellt eine Aminosäureseitenkette dar.)
Aminosäureester sind Verbindungen, die kostengünstig bezogen werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren, bei dem Ausgangsmaterialien in der Form eines Aminosäureesters und eine ungeschützte Aminosäure in einer wässrigen Lösung unter Einsatz von Bakterien, Hefe und dergleichen als Enzymquelle umgesetzt werden, ist ein neues Dipeptidherstellungsverfahren, welches herkömmlich nicht bekannt war, und mit diesem Verfahren können nützliche Dipeptide für die Verwendung in Arzneimittelmaterialien und funktionellen Lebensmitteln kostengünstig bereitgestellt werden.
Die vorliegende Erfindung wird in der folgenden Reihenfolge eingehend beschrieben:

[I] Mikroben mit der Fähigkeit zur Produktion von Dipeptiden aus L-Aminosäureestern und L-Aminosäuren
[II] Isolierung von DNA, die für ein Protein mit Peptidherstellungsaktivität kodiert
[III] Eigenschaften des Peptid-bildenden Enzyms
[IV] Dipeptidherstellungsverfahren

[I] Mikroben mit der Fähigkeit zur Produktion von Dipeptiden aus L-Aminosäureestern und L-Aminosäuren
Mikroben mit der Fähigkeit zur Produktion von Dipeptiden aus L-Aminosäureestern und L-Aminosäuren können ohne besondere Einschränkungen als in der vorliegenden Erfindung eingesetzte Mikroben verwendet werden. Beispiele von Mikroben mit der Fähigkeit zur Produktion von Dipeptiden aus L-Aminosäureestern und L-Aminosäuren umfassen Bacillus species, Corynebacterium species und Pseudomonas species, wobei spezifische Beispiele nachstehend aufgelistet werden.
Bacillus subtilis ATCC 6633 Bacillus coagulans EK01 (J. Bacteriol. 174, 7919–7925 (1992)) Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 Pseudomonas putida AJ-2402 FERM BP-8101 Pseudomonas putida ATCC 12633 Pseudomonas putida AJ-2048 FERM BP-8123 Diejenigen Stämme der vorstehenden Liste, die mit ATCC-Nummern angegeben sind, sind bei der American Type Culture Collection (P. O. Box 1549, Manassas, VA 20110) hinterlegt, und Subkulturen können unter Bezugnahme auf die jeweilige Nummer bezogen werden.
Diejenigen Stämme der vorstehend genannten Liste von Mikroorganismen, die mit FERM-Nummern angegeben sind, sind bei der unabhängigen Verwaltungseinheit International Patent Organism Depositary of the National Institute for Advanced Industrial Science und Technology (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) hinterlegt und tragen eine Hinterlegungsnummer. Pseudomonas putida-Stamm AJ-2402 wurde bei der unabhängigen Verwaltungseinheit International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science und Technology am 1. Oktober 2001 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM P-18544, wobei eine Kontrolle dieses Stamms später in eine internationale Hinterlegung am 1. Juli 2002 überführt wurde und die Hinterlegungsnummer FERM BP-8101 erhielt. Es ist anzumerken, dass FERM BP-8101 (AJ-2402) als der vorstehend genannte Stamm Pseudomonas putida auf der Grundlage des nachstehenden Klassifizierungsexperiments identifiziert wurde. Zudem wurde der Stamm Pseudomonas putida AJ-2048 bei der unabhängigen Verwaltungseinheit International Patent Organism Depositary of the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology am 22. Juli 2002 hinterlegt und erhielt die Hinterlegungsnummer FERM BP-8123.
Der Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8101 ist ein beweglicher akonidaler Stab, der als Bacterium der Gattung Pseudomonas auf der Grundlage der Eigenschaften identifiziert wurde, dass er ein Gram-negativer Stab ist (0,7 bis 0,8 × 1,5 bis 2,0 Mikrometer (μm)), der keine Sporen bildet, beweglich ist, runde, glänzende cremefarbene Kolonien mit vollständig glatten oder undolierenden Rändern bildet, bei 30°C wächst und Catalase positiv, Oxidase positiv und OF-Test (Glucose) negativ ist. Überdies wurde er auf der Grundlage der physiologischen Eigenschaften als Pseudomonas putida identifiziert, nämlich durch die Eigenschaften, dass er bei Nitratreduktion negative, Indolproduktion negativ, Produktion von Glucose negativ, Arginindihydrolase positiv, Urease negativ, Esculinhydrolyse negativ, Gelatinehydrolyse negativ, β-Galactosidase negativ, Glucoseassimilation positiv, L-Arabinoseassimilation negativ, D-Mannoseassimilation positiv, D-Mannitolassimilation positiv, N-Acetyl-D-glucosaminassimilierung negativ, Maltoseassimilierung negativ, Kaliumgluconatassimilierung positiv, n-Caprinsäure positiv, Adipinsäureassimilation negativ, dl-Malinsäureassimilation positiv, Natriumcitratassimilation positiv, Phenylacetatassimilation positiv, Oxi dase positiv, Fluorchromproduktion auf King's B Agarmedium positiv, Levanproduktion aus Saccharose positiv ist und schwache Assimilation von Sorbitol zeigt.
Wildtypstämme oder Variantenstämme können für diese Mikroben eingesetzt werden, und rekombinante Stämme und dergleichen, die durch Zellfusion, genetische Manipulation oder andere genetische Verfahren abgeleitet sind, können ebenfalls verwendet werden.
Um mikrobielle Zellen dieser Mikroben zu erhalten, reicht es aus, dass die Mikroben in einem geeigneten Medium kultiviert und gezüchtet werden. Hinsichtlich des zu diesem Zweck eingesetzten Mediums gibt es keine besondere Einschränkung, solange es das Wachstum der Mikroben zulässt. Dieses Medium kann ein übliches Medium sein, das übliche Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Phosphorquellen, Schwefelquellen, anorganische Ionen und organische Nährstoffquellen bei Bedarf enthält.
Beispielsweise kann eine beliebige Kohlenstoffquelle eingesetzt werden, solange sie durch die vorstehend beschriebenen Mikroben verwertet werden kann, und spezifische Beispiele davon umfassen Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose und Amylose, Alkohole, wie Sorbitol, Ethanol und Glycerin, organische Säuren, wie Fumarsäure, Citronensäure, Essigsäure und Propionsäure und deren Salze, Kohlenhydrate, wie Paraffin, sowie Gemische davon.
Beispiele von Stickstoffquellen, die eingesetzt werden können, umfassen Ammoniumsalze von anorganischen Salzen, wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, Ammoniumsalze von organischen Säuren, wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, Nitrate, wie Natriumnitrat und Kaliumnitrat, organische Stick stoffverbindungen, wie Peptone, Hefeextrakt, Fleischextrakt und Maisquellwasser, sowie Gemische davon.
Zudem können auch Nährstoffquellen, die in üblichen Medien eingesetzt werden, wie anorganische Salze, Spurenmetalle und Vitamine, ebenfalls in geeigneter Weise zugemischt und verwendet werden.
Hinsichtlich der Kultivierungsbedingungen gibt es keine besondere Einschränkung, und die Kultivierung kann beispielsweise während etwa 12 bis 48 Stunden unter geeignetem Kontrollieren des pH-Wertes und der Temperatur auf einen pH-Bereich von 5 bis 8 und einer Temperatur von 15 bis 40°C unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden.
[II] Isolierung von DNA, die für ein Protein mit Peptid-bildender Enzymaktivität kodiert
[II-1] DNA-Isolierung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben die erfindungsgemäße DNA isoliert und deren Sequenz bestimmt, welche für ein Protein mit der Aktivität kodiert, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure zu synthetisieren. Eine DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 57 bis 1295 der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls besteht, wurde aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 isoliert. Zudem wurde aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 eine DNA isoliert, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 der SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls besteht. Daneben wurde aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 eine DNA isoliert, die aus der Basensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 der SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls besteht. Es ist anzumerken, dass in der vorliegenden Beschrei bung der Ausdruck "Rasensequenz der SEQ ID NO: 4", "Rasensequenz der SEQ ID NO: 14" und "Rasensequenz der SEQ ID NO: 16" die kodierenden Bereiche bezeichnen, wenn nichts anderes angegeben wird.
Ein Beispiel der Isolierung von DNA wird nachstehend angegeben. Zuerst wird die Aminosäuresequenz eines gereinigten Peptid-bildenden Enzyms bestimmt. Die Aminosäuresequenz kann unter Einsatz der Edman-Methode bestimmt werden (vergleiche Edman, P., Acta Chem. Scand., 4, 227 (1950)). Zusätzlich kann die Aminosäuresequenz unter Einsatz eines von Applied Biosystems hergestellten Sequenziergeräts bestimmt werden. Die Aminosäuresequenz wird für den N-Terminus oder etwa 10 bis 30 Reste des Peptids, erhalten durch Behandlung mit Lysylendopeptidase und dergleichen, für das gereinigte Peptid-bildende Enzym bestimmt, und die Rasensequenz der DNA, die dafür kodiert, kann auf der Grundlage der ermittelten Aminosäuresequenz abgeleitet werden. Es werden für das Ableiten der Basensequenz der DNA universelle Kodons eingesetzt.
Dann wird ein DNA-Molekül von etwa 30 Basenpaaren auf der Grundlage der abgeleiteten Basensequenz synthetisiert. Ein Verfahren zum Synthetisieren dieses DNA-Moleküls ist in Tetrahedron Letters, 22, 1859 (1981) offenbart. Zusätzlich kann das DNA-Molekül unter Einsatz eines von Applied Biosystems hergestellten Sequenziergeräts synthetisiert werden. Eine DNA, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, kann dann von einer chromosomalen DNA mittels PCR unter Verwendung des DNA-Moleküls als Primer amplifiziert werden. Da jedoch die DNA, die mittels PCR amplifiziert worden ist, vollständige DNA, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, nicht enthält, wird die DNA vollständiger Länge, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, aus einer chromosomalen Genbibliothek verschiedener mikrobiellen Zellen, wie Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida oder Bacillus subtilis, unter Verwendung der mittels PCR amplifizierten DNA als Sonde isoliert.
Alternativ dazu kann, wenn ein Teil der Basensequenz des Gens bekannt ist, die vollständige DNA, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, aus einer chromosomalen Genbibliothek unter Verwendung der DNA bekannter Sequenz als Sonde isoliert werden.
Wenn die Basensequenz des Gens mit einer bekannten Sequenz eine Homologie aufweist kann überdies die vollständige DNA, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, aus einer chromosomalen Genbibliothek unter Einsatz einer DNA bekannter Sequenz als Sonde isoliert werden.
Das Verfahren der PCR ist beispielsweise in White, T. J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989) beschrieben. Ein Verfahren zur Präparation einer chromosomalen DNA sowie ein Verfahren zum Isolieren eines Ziel-DNA-Moleküls aus einer Genbibliothek unter Einsatz eines DNA-Moleküls als Sonde werden in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989) beschrieben.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Basensequenz der isolierten DNA, die für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert, wird in Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley & Sons, Inc. (1985), beschrieben. Zudem kann die Basensequenz auch unter Einsatz eines DNA-Sequenziergeräts (Applied Biosystems) bestimmt werden. DNAs, die für Peptid-bildende Enzyme kodieren, die aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286, dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 und dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 auf diese Weise isoliert wurden, sind in den SEQ ID NO: 4, 14 bzw. 16 gezeigt.
DNAs, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind nicht nur die DNAs der SEQ ID NO: 4, 14 und 16. Beispielsweise ist gemäß der Beschreibung der DNA der SEQ ID NO: 4, die aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 isoliert wurde, selbst eine DNA, die künstlich zu einer DNA mutiert worden ist, die für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert, das aus der chromosomalen DNA des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 isoliert worden ist, ebenfalls eine erfindungsgemäße DNA, solange sie für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert. Ein häufig eingesetztes Verfahren zum künstlichen Mutieren einer DNA ist die ortsgerichtete Mutagenese, die in Methods in Enzymol., 154 (1987) beschrieben wird.
Zudem kann auch eine DNA mit einer Hasensequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid einer Basensequenz, die zu der Rasensequenz der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls komplementär ist, und für ein Protein mit Peptid-bildender Enzymaktivität kodiert, als erfindungsgemäße DNA eingesetzt werden.
Überdies kann eine DNA, die im Wesentlichen identisch zu der erfindungsgemäßen DNA ist, ebenfalls erhalten werden, indem eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde hybridisiert, die auf der Grundlage einer DNA präpariert wurde, die aus der kodierenden Sequenz der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls besteht, und für ein Protein mit Peptid-bildender Enzymaktivität kodiert, isoliert wird. Eine Sonde kann gemäß etablierter Verfahren auf der Grundlage von beispielsweise der Rasensequenz der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls präpariert werden. Zudem kann auch ein Verfahren, bei dem eine Ziel-DNA unter Einsatz einer Sonde und Aufnehmen einer DNA, die damit hybridisiert, isoliert wird, gemäß etablierter Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine DNA-Sonde durch Amplifizieren einer Rasensequenz, die in ein Plasmid oder in einem Phagenvektor kloniert worden ist, und durch Extrahieren der gewünschten Rasensequenz, die als Sonde eingesetzt werden soll, durch Schneiden mit einem Restriktionsenzym präpariert werden. Die Position, an der die Sequenz geschnitten wird, kann in Abhängigkeit von der Ziel-DNA eingestellt werden.
Die hier erwähnten "stringenten Bedingungen" beziehen sich auf Bedingungen, unter denen ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird, während nicht-spezifische Hybride nicht gebildet werden. Obwohl es schwierig ist, diese Bedingungen klar zu quantifizieren, umfassen Beispiele solche Bedingungen, unter denen eine DNA mit einem hohen Grad an Homologie, beispielsweise eine DNA mit einer Homologie von 50% oder mehr, vorzugsweise 80% oder mehr und stärker bevorzugt 90% oder mehr, hybridisiert, während eine DNA mit einem niedrigen Grad an Homologie nicht hybridisiert, oder Bedingungen, unter denen eine DNA bei 60°C und bei einer Salzkonzentration, die 1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, welche die Bedingungen beim Waschen bei der üblichen Southern-Hybridisierung ist, vorzugsweise bei 60°C und einer Salzkonzentration, die 0,1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, und stärker bevorzugt bei 65°C und einer Salzkonzentration, die 0,1 × SSC und 0,1% SDS entspricht, hybridisiert. Die Aktivität eines Peptid-bildenden Enzyms ist wie vorstehend erklärt. Wenn jedoch eine Hasensequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer Rasensequenz hybridisiert, die zu der Rasensequenz der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls komplementär ist, verbleiben vorzugsweise 10% oder mehr und stärker bevorzugt 50% oder mehr der Enzymaktivität eines Proteins mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls unter Bedingungen von 50°C und pH 8.
Überdies kann in der vorliegenden Erfindung auch ein Protein, das im Wesentlichen identisch ist zu dem Peptid-bildenden Enzym, das durch eine DNA der SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls kodiert wird, eingesetzt werden. Somit kann auch eine DNA, die für "ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 des Sequenzprotokolls und mit einer Peptid-bildenden Enzymaktivität zum Katalysieren einer Reaktion, die ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herstellt", kodiert, in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden. Der Ausdruck "mehrere" bezieht sich auf einen Bereich, der die dreidimensionale Struktur des Proteins aus den Aminosäureresten oder die Aktivität eines Peptid-bildenden Enzyms nicht beeinträchtigt, und der Ausdruck bezieht sich speziell auf einen Wert von 2 bis 50, vorzugsweise 2 bis 30 und stärker bevorzugt 2 bis 10. Zudem ist die Aktivität eines Peptid-bildenden Enzyms wie vorstehend erklärt.
Wenn jedoch eine Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 des Sequenzprotokolls eingesetzt wird, verbleiben vorzugsweise 10% oder mehr und stärker bevorzugt 50% oder mehr der Enzymaktivität eines Proteins der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5 des Sequenzprotokolls unter Bedingungen von 50°C und pH 8.
Wie vorstehend beschrieben wurde, werden neben einer DNA, die aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 isoliert wurde, einer DNA die aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 isoliert wurde, und einer DNA, die aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 isoliert wurde, DNAs, die im Wesentlichen identisch zu diesen DNAs sind, ebenfalls als erfindungsgemäße DNAs bereitgestellt. Das heißt, Beispiele von durch die vorliegende Erfindung bereitgestellter DNAs sind folgende:

(i) Eine DNA, die aus der in SEQ ID NO: 4, 14 oder 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen kodierenden Region besteht;
(ii) Eine DNA, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das aus einer Rasensequenz besteht, die zu der in SEQ ID NO: 4, 14 oder 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen kodierenden Region komplementär ist, und für ein Protein mit einer Peptid-bildenden Enzymaktivität kodiert, wobei eine Reaktion katalysiert wird, die aus einem Aminosäureester und einer L-Aminosäure ein Dipeptid herstellt;
(iv) Eine DNA, die für ein Protein der in SEQ ID NO: 5, 15 oder 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz kodiert; und
(v) Eine DNA, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 5, 15 oder 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz, kodiert und eine Peptid-bildende Enzymaktivität hat, wobei eine Reaktion katalysiert wird, die ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure produziert.

[II-2] Herstellung einer Transformante
Als Nächstes wird die Herstellung einer Transformante beschrieben, die ein Protein mit Peptid-bildender Enzymaktivität exprimiert. Es sind zahlreiche Beispiele der Herstellung von Enzymen, physiologisch aktiven Substanzen und anderen nützlichen Proteinen unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie bekannt, und der Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie erlaubt die Produktion von nützlichen Proteinen, die in der Natur nur in Spurenmengen vorkommen, im großen Maßstab.
Bevorzugte Beispiele von Transformanten, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können, umfassen die Transformanten, wie ein Protein der nachfolgenden Punkte (AA), (BB) oder (CC) oder dergleichen exprimieren können:

(AA) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, 15 oder 17 des Sequenzprotokolls;
(BB) ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, einschließlich Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 5, 15 oder 17 des Sequenzprotokolls, und einer Peptid-bildenden Enzymaktivität, wobei eine Reaktion katalysiert wird, die ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure produziert; oder
(CC) ein Protein, das für eine DNA kodiert, die unter stringenten Bedingungen mit einem Polynucleotid hybridisiert, das aus einer Rasensequenz besteht, die zu der Rasensequenz der SEQ ID NO: 4, 16 oder 18 des Sequenzprotokolls komplementär ist, oder mit einer Sonde hybridisiert, die auf der Grundlage der Rasensequenz der SEQ ID NO: 4, 16 oder 18 präpariert wurde und für ein Protein mit Peptid-bildender Enzymaktivität kodiert, wobei eine Reaktion katalysiert wird, die aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure ein Dipeptid herstellt.

Um Transformanten herzustellen, die ein Protein mit Peptid-produzierender Aktivität der vorstehend genannten Punkte (AA) bis (CC) exprimieren, kann eine DNA der vorstehend in Abschnitt [II-1] beschriebenen Punkte (i), (ii), (iii), (iv) oder (v) in Wirtszellen eingeführt werden. Das heißt, eine DNA der Punkte (i), (ii), (iii), (iv) oder (v) wird in eine rekombinante DNA einverleibt, genauer gesagt in einen Expressionsvektor, der in den Wirtszellen exprimiert werden kann, und danach wird dieser Expressionsvektor in Wirtszellen eingeführt.
Zudem werden Varianten, wie diejenigen des vorstehend genanntes Punktes (BB), dadurch erhalten, dass die Rasensequenz so modifiziert wird, dass eine Aminosäure an einer spezifischen Position des Enzymgens substituiert, deletiert, insertiert oder addiert wird, indem beispielsweise ein Verfahren der ortsgerichteten Mutagenese eingesetzt wird. Zudem kann die vorstehend erwähnte modifizierte DNA auch durch eine herkömmliche Mutagenesebehandlung erhalten werden. Beispiele der Mutagenesebehandlung umfassen eine Methode, bei der eine DNA, die für das vorliegende Enzym kodiert, in vitro mit Hydroxylamin und dergleichen behandelt wird, und eine Methode, bei der Escherichia coli, das eine DNA aufweist, die für das vorliegende Enzym kodiert, mit UV-Strahlen oder mit N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG), salpetriger Säure oder einem anderen Mutagen behandelt wird, das üblicherweise bei der künstlichen Mutagenese eingesetzt wird.
Im Fall der Massenproduktion eines Proteins unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie ist die Konjugation des Prote ins in eine Transformante, die das Protein produziert, wobei Einschlusskörper (inclusion bodies) des Proteins gebildet werden, eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung. Vorteile dieses Expressions- und Produktionsverfahrens umfassen den Schutz des Zielproteins vor Verdauung durch in den mikrobiellen Zellen enthaltenden Proteasen und die einfache Reinigung des Zielproteins durch Zerstören der mikrobiellen Zellen und anschließende Zentrifugation.
Die Einschlusskörper des Proteins, die auf diese Weise erhalten werden, werden mit einem Proteindenaturierungsmittel aufgelöst und dann zu einem ordnungsgemäß gefalteten, physiologisch aktiven Protein umgewandelt, indem sie einem Aktivitätsregenerationsverfahren unterworfen werden, das hauptsächlich aus dem Entfernen des Denaturierungsmittels besteht. Es gibt zahlreiche Beispiele dafür, einschließlich die Regeneration der Aktivität von menschlichem Interleukin-2 ( offengelegte Japanische Patentanmeldung Nr. S61-257931 ) und dergleichen.
Um aus den Einschlusskörpern des Proteins das aktive Protein zu erhalten, sind eine Reihe von Vorgängen erforderlich, einschließlich Auflösung und Aktivitätsregeneration, und das Verfahren ist komplexer als im Fall der direkten Herstellung eines aktiven Proteins. Wenn jedoch in mikrobiellen Zellen eine große Menge eines Proteins hergestellt wird, das eine nachteilige Wirkung auf das Wachstum der Mikroorganismen hat, kann diese Wirkung unterdrückt werden, indem das Protein in der Form von Proteineinschlusskörpern, die in den mikrobiellen Zellen inaktiv sind, angehäuft wird.
Beispiele der Verfahren zur Herstellung von großen Mengen eines Zielproteins in der Form von Einschlusskörpern umfassen ein Verfahren, bei dem ein Zielprotein unter der Kontrolle eines leistungsfähigen Promotors allein exprimiert wird, und ein Verfahren, bei dem ein Zielprotein in der Form eines Fusionsproteins mit einem Protein exprimiert wird, das bekanntlich in großen Mengen exprimiert wird.
Überdies ist es auch wirksam, die Erkennungssequenz einer Restriktionsprotease an einer geeigneten Position einzuführen, um das Zielprotein nach der Expression in der Form eines Fusionskörpers zu spalten.
Im Fall der Massenproduktion eines Proteins unter Einsatz der rekombinanten DNA-Technologie umfassen Beispiele von einsetzbaren Wirtszellen Bakterienzellen, Actinomyceszellen, Hefezellen, Schimmelpilzzellen, Pflanzenzellen und tierische Zellen, Darmbakterien, wie Escherichia coli werden allgemein eingesetzt, wobei Escherichia coli bevorzugt eingesetzt wird. Das liegt daran, dass es bezüglich der Massenproduktion von Proteinen unter Verwendung von Escherichia coli umfangreiche Erkenntnisse gibt. Im Folgenden wird ein Verfahren zur Herstellung eines Peptid-bildenden Enzyms unter Einsatz transformierter Escherichia coli beschrieben.
Promotoren, die üblicherweise bei der Produktion von heterogenen Proteinen in Escherichia coli eingesetzt werden, können als Promotoren zur Expression von DNA, die für das Peptid-bildende Enzym kodiert, eingesetzt werden, wobei Beispiele davon leistungsstarke Promotoren umfassen, wie den T7-Promotor, lac-Promotor, trp-Promotor, trc-Promotor, tac-Promotor, den PR-Promotor und den PL-Promotor des Phagen Lamdba.
Um ein Peptid-bildendes Enzym in der Form eines Einschlusskörpers aus Fusionsprotein zu produzieren, wird ein Gen, das ein anderes Protein kodiert, und vorzugsweise ein hydrophiles Peptid, stromaufwärts oder stromabwärts des Gens für das Peptid-bildende Enzym angekoppelt, wobei ein Fusionsproteingen erhalten wird. Das Gen, das auf diese Weise für ein anderes Protein kodiert, kann ein beliebiges Gen sein, das die Menge des angehäuften Fusionsproteins erhöht und die Löslichkeit des Fusionsproteins nach den Denaturierungs- und Regenerationsstufen erhöht. Kandidaten dafür umfassen beispielsweise das T7-Gen-10, β-Galactosidasegen, Dehydrofolatreduktasegen, Interferon-γ-Gen, Interleukin-2-Gen und Prochymosingen.
Wenn diese Gene an ein Gen, das für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert, gekoppelt werden, werden die Kodonleserahmen miteinander in Einklang gebracht. Sie können an einer geeigneten Restriktionsenzymstelle gekoppelt werden, oder es kann eine synthetische DNA einer geeigneten Sequenz verwendet werden.
Um die Produktionsmenge zu erhöhen, ist es in einigen Fällen zudem bevorzugt, eine Transkriptionsterminationssequenz in der Form eines Terminators stromabwärts des Fusionsproteingens anzukoppeln. Beispiele dieses Terminators umfassen einen T7-Terminator, einen fd-Phagen-Terminator, einen T4-Terminator, einen Tetracyclinresistenzgenterminator und einen Terminator des Gens trpA aus Escherichia coli.
Sogenannte Mehrkopienvektoren sind als Vektor für das Einführen eines Gens, das für ein Peptid-bildendes Enzym oder ein Fusionsprotein, das aus einem Peptid-bildenden Enzym und einem anderen Protein besteht, kodiert, in Escherichia coli bevorzugt, wobei Beispiele Plasmide mit einem Replikator, der von ColE1 abgeleitet ist, beispielsweise das Plasmid pUC, das Plasmid pBR322 oder Derivate davon umfassen. Der hier verwendete Ausdruck "Derivat" betrifft solche Plasmide, die durch Modifikation des Plasmids durch Basen-Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion erhalten werden. Es ist anzumerken, dass die hier genannte Modifikation die Modifikation umfasst, die sich aus der Mutagenesebehandlung durch ein Mutagen oder durch UV-Bestrahlung oder durch spontane Mutation ergibt. Genauer gesagt umfassen Beispiele von einsetzbaren Vektoren pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219 und pMW218. Daneben können auch Vektoren aus Phagen-DNA oder Transposon-DNA eingesetzt werden.
Zudem hat der Vektor vorzugsweise einen Marker, beispielsweise ein Ampicillinresistenzgen, um die Transformante zu screenen. Expressionsvektoren mit leistungsstarken Promotoren sind käuflich erwerbbar für die Verwendung als solche Plasmide (wie der Vektor pUC, hergestellt von Takara Shuzo), der Vektor pPROK (hergestellt von Clontech) und pKK233-2 (hergestellt von Clontech) und andere).
Eine rekombinante DNA wird durch Kopplung eines DNA-Fragments, worin ein Promotor, ein für ein Peptid-bildendes Enzym oder ein Fusionsprotein, das aus einem Peptid-bildenden Enzym und einem anderen Protein besteht, kodierendes Gen und in Abhängigkeit vom Einzelfall ein Terminator in dieser Reihenfolge aneinander gekoppelt sind, mit einer Vektor-DNA erhalten.
Wenn Escherichia coli unter Verwendung der rekombinanten DNA transformiert wird und das erhaltene E. coli kultiviert wird, wird ein Peptid-bildendes Enzym oder ein Fusionsprotein, das aus dem Peptid-bildenden Enzym und einem anderen Protein besteht, exprimiert und produziert. Obwohl ein Stamm des transformierten Wirts eingesetzt werden kann, der normalerweise bei der Expression eines heterogenen Gens eingesetzt wird, ist der Stamm Escherichia coli JM109 bevorzugt. Verfahren zum Ausführen der Transformation und Verfahren zum Screenen der Transformanten sind in Molecular Cloning, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Press (1989) und in anderen Veröffentlichungen beschrieben.
Im Fall der Expression des Proteins in der Form eines Fusionsproteins kann das Fusionsprotein so präpariert werden, dass das Peptid-bildende Enzym unter Einsatz einer Restriktionsprotease, die eine in dem Peptid-bildenden Enzym nicht vorkommende Sequenz nutzt, ausgeschnitten werden, beispielsweise durch Einsatz des Blutkoagulationsfaktors Xa oder Kallikrein.
Ein normalerweise zum Kultivieren von Escherichia coli eingesetztes Medium, wie ein M9-Casaminosäuremedium oder ein LB-Medium, kann als Produktionsmedium eingesetzt werden. Zudem werden Kultivierungsbedingungen und Produktionsinduktionsbedingungen in Abhängigkeit von dem Marker des eingesetzten Vektors, dem Promotor, der Art des Wirtsmikroorganismus und dergleichen in geeigneter Weise ausgewählt.
Das folgende Verfahren kann eingesetzt werden, um ein Peptid-bildendes Enzym oder ein Fusionsprotein, das aus dem Peptid-bildenden Enzym und einem anderen Protein besteht, zu gewinnen. Wenn das Peptid-bildende Enzym oder sein Fusionsprotein in der mikrobiellen Zelle nach dem Gewinnen der mikrobiellen Zelle aufgelöst worden ist, werden die mikrobiellen Zellen zerstört oder lysiert, sodass sie als Rohenzymflüssigkeit eingesetzt werden können. Überdies kann das Peptid-bildende Enzym oder sein Fusionsprotein vor der Verwendung durch übliche Verfahren bei Bedarf gereinigt werden, beispielsweise durch Ausfällung, Filtration oder Säulenchromatografie. In diesem Fall kann auch ein Reinigungsverfahren eingesetzt werden, das Antikörper gegen das Peptid-bildende Enzym oder dessen Fusionsprotein verwendet.
Wenn Einschlusskörper des Proteins gebildet werden, werden die Einschlusskörper mit einem Denaturierungsmittel aufgelöst. Obwohl sie mit dem mikrobiellen Zellprotein aufgelöst werden können, werden unter Berücksichtigung des folgenden Reinigungsverfahrens die Einschlusskörper vorzugsweise entnommen und dann aufgelöst. Es können herkömmliche Verfahren eingesetzt werden, um die Einschlusskörper aus den mikrobiellen Zellen zu gewinnen. Beispielsweise können Einschlusskörper durch Zerstören der mikrobiellen Zellen und durch anschließende Zentrifugation gewonnen werden. Beispiele von Denaturierungsmitteln, die Einschlusskörper auflösen können, umfassen Guanidinhydrochlorid (beispielsweise 6 M, pH 5 bis 8) und Harnstoff (beispielsweise 8 M).
Aktivität-aufweisendes Protein wird durch Entfernen dieser Denaturierungsmittel durch Dialyse gewonnen. Als Dialyselösung sollten eine Tris-HCl-Pufferlösung oder eine Phosphatpufferlösung und dergleichen eingesetzt werden, und die Konzentration kann beispielsweise 20 mM bis 0,5 mol sein, während der pH-Wert beispielsweise 5 bis 8 sein kann.
Die Proteinkonzentration während der Regenerierungsstufe wird vorzugsweise bei etwa 500 μg/ml oder niedriger gehalten. Die Dialysetemperatur ist vorzugsweise 5°C oder niedriger, um das Auftreten einer internen Quervernetzung durch das regenerierte Peptid-bildende Enzym zu verhindern. Zudem kann Verdünnung oder Ultrafiltration zusätzlich zu der Dialyse zum Entfernen der Denaturierungsmittel eingesetzt werden, und es kann davon ausgegangen werden, dass die Enzymaktivität unabhängig von dem eingesetzten Denaturierungsmittel regeneriert werden kann.
Wenn die in SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls angegebene DNA als die DNA eingesetzt wird, die für das Peptid-bildende En zym kodiert, wird das Peptid-bildende Enzym produziert, das die in SEQ ID NO: 5 angegebene Aminosäuresequenz hat. Zudem wird, wenn eine DNA nach SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls als die DNA eingesetzt wird, die für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert, ein Peptid-bildendes Enzym hergestellt, das die in SEQ ID NO: 15 beschriebene Aminosäuresequenz hat. Zudem wird, wenn eine DNA nach SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls als die DNA eingesetzt wird, die für ein Peptid-bildendes Enzym kodiert, ein Peptid-bildendes Enzym produziert, das die Aminosäuresequenz nach SEQ ID NO: 17 hat.
Es ist anzumerken, dass gentechnische Verfahren in Übereinstimmung mit den in der Literatur beschriebenen Verfahren, beispielsweise in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989), durchgeführt werden können.
[III] Eigenschaften des Peptid-bildenden Enzyms
Als Nächstes werden die Eigenschaften eines Peptid-bildenden Enzyms beschrieben, welches aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 als Beispiel der vorstehend beschriebenen Mikroben gereinigt wurde.
Wenn beispielsweise ein L-Alaninester und L-Glutamin als Ausgangsmaterialien (Substrate) eingesetzt werden, hat dieses Peptid-bildende Enzym die Fähigkeit, L-Alanyl-L-glutamin unter Verwendung eines L-Alaninesters und von L-Glutamin als Substrate herzustellen. Wenn beispielsweise ein L-Alaninamid und L-Glutamin als Ausgangsmaterialien eingesetzt werden, hat dieses Peptid-bildende Enzym die Aktivität, L-Alanyl-L-asparagin unter Einsatz eines L-Alaninesters und von L-Asparagin als Substrate herzustellen.
Im Hinblick auf die Enzymwirkung produziert, wenn beispielsweise ein L-Alaninester und L-Asparagin oder L-Glutamin als Ausgangsmaterialien eingesetzt werden, dieses Peptid-bildende Enzym ein Molekül L-Alanyl-L-glutamin und ein Molekül Alkohol aus einem Molekül L-Alaninester und einem Molekül L-Glutamin, und produziert ein Molekül L-Alanyl-L-asparagin und ein Molekül Alkohol aus einem Molekül L-Alaninester und einem Molekül Asparagin.
Der optimale pH-Wert ist in der Nähe von 6,0 bis 10,0, und die optimale Temperatur ist in der Nähe von 30 bis 50°C. Das Molekulargewicht der Untereinheit wird mit 42000 bis 46000 berechnet, bestimmt durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese.
[IV] Dipeptidherstellungsverfahren
Das erfindungsgemäße Dipeptidherstellungsverfahren produziert ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure unter Verwendung eines Enzyms oder einer Enzym-enthaltenden Substanz mit der Fähigkeit zum Synthetisieren eines Dipeptids, und produziert genauer gesagt ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure unter Einsatz eines Peptid-bildenden Enzyms, das von einer Mikrobenkultur, von mikrobiellen Zellen, die aus der Kultur isoliert wurden, oder von einem behandelten mikrobiellen Zellprodukt der Mikrobe mit der Fähigkeit zur Produktion eines Dipeptids aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure abgeleitet ist. Es ist anzumerken, dass ein Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität, das von den vorstehend beschriebenen Mikroben oder den in der folgenden Tabelle 1 aufgelisteten Mikroben abgeleitet ist, auch eingesetzt werden kann, solange es die Aktivität hat, aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure ein Dipeptid herzustellen.
Das durch die vorstehend beschriebenen Mikroben produzierte Peptid-bildende Enzym hat die Aktivität, unter Verwendung eines L-Aminosäureesters und einer L-Aminosäure als Substrate ein Dipeptid zu produzieren.
Als das Verfahren, durch das zugelassen wird, dass das durch die vorstehenden Mikroben produzierte Peptid-bildende Enzym auf den L-Aminosäureester und die L-Aminosäure einwirkt, können die Substrate direkt zu der Kulturflüssigkeit während der Kultivierung der vorstehend beschriebenen Mikroben gegeben werden, oder mikrobielle Zellen können von der mikrobiellen Kultur durch Zentrifugation und dergleichen abgetrennt werden, und danach kann entweder in Puffer direkt oder nach dem Waschen resuspendiert werden, und dann können ein L-Aminosäureester und eine L-Aminosäure zugegeben und umgesetzt werden. Alternativ dazu können mikrobielle Zellen eingesetzt werden, die durch ein bekanntes Verfahren unter Einsatz eines Polyacrylamidgels, von Carrageenan oder eines Algininsäuregels immobilisiert wurden.
Zudem können zerstörte mikrobielle Zellen, Aceton-behandelte mikrobielle Zellen oder gefriergetrocknete mikrobielle Zellen als das behandelte mikrobielle Zellprodukt eingesetzt werden. Verfahren, wie das Zerstören mit Ultraschall, das Zerstören mit einer French Press oder das Zerstören mit Glasperlen können zum Zerstören von mikrobiellen Zellen eingesetzt werden, während Verfahren unter Einsatz von Eiweißlysozym, Peptidasebehandlung oder einer geeigneten Kombination davon im Fall der Lyse von mikrobiellen Zellen eingesetzt werden.
Überdies kann ein Peptid-bildendes Enzym aus dem behandelten mikrobiellen Zellprodukt gewonnen und als Rohenzymflüssigkeit eingesetzt werden, oder das Enzym kann bei Bedarf vor dem Einsatz gereinigt werden. Übliche Enzymreinigungsverfahren können eingesetzt werden, um das aus einer Kultur erhaltene Enzym zu reinigen. Genauer gesagt werden mikrobielle Zellen durch Zentrifugation und dergleichen gewonnen, und die Zellen werden dann durch mechanische Verfahren, wie Ultraschallbehandlung, Glasperlen oder eine Dynomill zerstört, und feste Materialien, wie Zellfragmente, werden durch Zentrifugation entfernt, wobei ein Rohenzym erhalten wird, und danach wird das vorstehend beschriebene Peptid-bildende Enzym gereinigt, indem eine Ultrazentrifugationsfraktionierung, ein Aussalzen, eine Ausfällung mit einem organischen Lösungsmittel, Ionenaustauschchromatografie, Adsorptionschromatografie, Gelfiltrationschromatografie, hydrophobe Chromatografie und dergleichen durchgeführt werden.
Es ist anzumerken, dass das "Peptid-bildende Enzym, das von einer Mikrobe abgeleitet ist", nicht nur ein Enzym umfasst, das von dem behandelten mikrobiellen Zellprodukt erhalten wird, indem die vorstehend beschriebene Reinigungsstufe durchgeführt wird, sondern auch ein Enzym, das durch sogenannte gentechnische Verfahren hergestellt wird, bei denen das Gen des Enzyms in einem heterogenen oder einem homogenen Wirt exprimiert wird.
Im Fall einer Fraktion mit einer Aktivität zur Produktion eines Dipeptids aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure kann das gesamte Enzym und eine Enzym-enthaltende Substanz verwendet werden. Hier bezieht sich der Ausdruck "Enzym-enthaltende Substanz" auf eine Substanz, die das Enzym enthält, und umfasst spezifische Formen, wie eine Mikrobenkultur, die das Enzym produziert, mikrobielle Zellen, die von der Kultur abgetrennt werden, und behandelte mikrobielle Zellprodukte der Mikroben. Eine Mikrobenkultur bezieht sich auf das, was durch die Kultivierung von Mikroben erhalten wird, genauer gesagt auf ein Gemisch von mikrobiellen Zellen, dem zur Kultivierung der Mikroben eingesetzten Medium und den durch die kultivierten Mikroben hergestellten Substanzen. Zudem können die mikrobiellen Zellen gewaschen werden und als gewaschene mikrobielle Zellen eingesetzt werden. Das behandelte mikrobielle Zellprodukt umfasst Zellen, die zerstört, lysiert oder gefriergetrocknet worden sind, und umfasst außerdem ein Rohenzym, das durch Behandlung der Zellen und dergleichen erhalten wurde, sowie gereinigtes Enzym, das durch die Reinigung erhalten wird. Teilweise gereinigte Enzyme und dergleichen, die durch verschiedene Reinigungsverfahren erhalten werden, können ebenfalls als gereinigte Enzyme eingesetzt werden, oder es können immobilisierte Enzyme eingesetzt werden, die durch kovalente Bindung, durch Adsorption oder durch Einschlussverfahren immobilisiert worden sind. Da außerdem einige Mikroben während der Kultivierung in Abhängigkeit von den eingesetzten Mikroben teilweise lysiert werden, kann der Kulturüberstand auch als Enzym-enthaltende Substanz in solchen Fällen eingesetzt werden.
Es ist anzumerken, dass im Fall der Verwendung einer Kultur, von kultivierten mikrobiellen Zellen, gewaschenen mikrobiellen Zellen oder verarbeiteten mikrobiellen Zellen, wobei die Zellen zerstört oder lysiert worden sind, es viele Fälle gibt, bei denen ein Enzym vorhanden ist, welches das produzierte Peptid zersetzt, ohne dass es an der Peptidproduktion beteiligt ist, und in solchen Fällen kommt es vor, dass es bevorzugt ist, einen Metallenzyminhibitor, beispielsweise einen Metallproteaseinhibitor wie Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), zuzugeben. Die zugegebene Menge ist im Bereich von 0,1 mM bis 100 mM und vorzugsweise 1 mM bis 50 mM.
Die Menge des Enzyms oder der eingesetzten Enzym-enthaltenden Substanz kann ausreichend sein, wenn sie eine Menge ist, bei der die gewünschte Wirkung erzielt wird (effektive Menge). Diese effektive Menge kann durch einfaches und vorbereitendes Experimentieren durch einen Fachmann leicht bestimmt werden. Beispielsweise ist im Fall des Einsatzes gewaschener Zellen die eingesetzte Menge 1 bis 500 g/l der Reaktionsflüssigkeit.
Es kann ein beliebiger L-Aminosäureester als der L-Aminosäureester eingesetzt werden, solange er ein L-Aminosäureester ist, der Dipeptid mit einer L-Aminosäure mit der Substratspezifität des Peptid-bildenden Enzyms produzieren kann, und Beispiele davon umfassen Methylester, Ethylester, n-Propylester, Isopropylester, n-Butylester, Isobutylester und tert-Butylester der L-Aminosäuren. Zudem können auch nicht nur L-Aminosäureester, die natürlich vorkommenden Aminosäuren entsprechen, sondern auch L-Aminosäureester, die nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren entsprechen, oder deren Derivate verwendet werden. Beispiele von L-Aminosäureestern, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt eingesetzt werden können, umfassen L-Alaninester, Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Leucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester.
Hinsichtlich der L-Aminosäure gibt es keine besondere Einschränkung, sodass eine beliebige L-Aminosäure eingesetzt werden kann, solange sie ein Dipeptid mit einem L-Aminosäureester mit der Substratspezifität des Peptid-bildenden Enzyms produziert. Beispiele von L-Aminosäuren, die in der vorliegenden Erfindung bevorzugt eingesetzt werden können, umfassen L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat, wobei L-Glutamin und L-Asparagin besonders bevorzugt sind.
Die jeweilige Konzentration des eingesetzten L-Aminosäureesters und der eingesetzten L-Aminosäure als Ausgangsmaterialien ist 1 mM bis 10 M und vorzugsweise 0,05 M bis 2 M.
Es gibt jedoch Fälle, in denen es bevorzugt ist, eine äquimolare Menge oder mehr der L-Aminosäure in Bezug auf die Menge des L-Aminosäureesters zuzugeben. Wenn eine hohe Konzentration des Substrats die Reaktion inhibiert, kann sie zudem auf eine Konzentration eingestellt werden, die keine Inhibition verursacht, und das Substrat kann dann während der Reaktion sukzessive zugegeben werden.
Die Reaktionstemperatur ist 3 bis 70°C und vorzugsweise 5 bis 50°C, während der pH der Reaktion 2 bis 12 und vorzugsweise 3 bis 11 ist. Durch die Durchführung der Reaktion auf diese Weise während etwa 2 bis 48 Stunden wird ein Dipeptid in dem Reaktionsgemisch hergestellt und angehäuft. Das erhaltene Dipeptid kann dann durch etablierte Verfahren gewonnen und bei Bedarf gereinigt werden.
Beispiele
Im Folgenden wird die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele eingehend beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt. Es ist anzumerken, dass in den Beispielen die quantitative Bestimmung von L-Alanin, L-Alanyl-L-glutamin oder L-Alanyl-L-asparagin durch ein Verfahren unter Einsatz von Hochleistungsflüssigchromatografie durchgeführt wurde (Säule: Inertsil ODS-2 (GL Science), Eluat: wässrige Phosphatlösung (pH 2,2, 5,0 mM Natrium-1-octansulfonat/Methanol = 100/15), Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/min, Nachweis: 210 nm).
(Beispiel 1) Wirkung der Zugabe von EDTA auf die Herstellung von L-Alanyl-L-glutamin
50 ml eines Mediums (pH 7,0), das 5 g Glucose, 5 g Ammoniumsulfat, 1 g Monokaliumphosphat, 3 g Dikaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 10 g Hefeextrakt und 10 g Pepton in 1 1 enthielt, wurde in einen 500 ml-Sakaguchikolben überführt und 15 Minuten bei 115°C sterilisiert. Eine Impföse des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8101, der 24 Stunden bei 30°C auf einem Schrägröhrchenagarmedium, das dieselbe Zusammensetzung enthielt (Agar: 20 g/l, pH 7,0), kultiviert worden war, wurde in das vorstehend genannte Medium eingeimpft und durch Schüttelkultivieren 17 Stunden bei 30°C und 120 Schlägen/Minute kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und mit 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) bis zu einer Nasszelldichte von 100 g/l suspendiert. 1 ml jeder Zellsuspension wurde jeweils zu 1 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), enthaltend 200 mM L-Alaninethylesterhydrochlorid und 400 mM L-Glutamin, entweder in Abwesenheit von EDTA oder bei einem zusätzlichen Gehalt von 20 mM EDTA (Substratlösung) gegeben, wobei ein Endvolumen von 2 ml erreicht wurde, und danach wurde 1 Stunde bei 30°C eine Reaktion zugelassen. Als Ergebnis wurde L-Alanyl-L-glutamin in einer Konzentration von 4,9 mM in dem Bereich produziert, zu dem kein EDTA zugegeben worden war, und in einer Konzentration von 10,1 mM in dem Bereich mit zugegebenem EDTA.
Es ist anzumerken, dass in diesem Reaktionssystem unter Bedingungen, bei denen 1 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,0) anstelle einer Zellsuspension zu 1 ml Substratlösung (zellfreier Ansatz) gegeben wurde, und unter Bedingungen, bei denen 1 ml 100 mM Boratpuffer entweder ohne EDTA oder mit einem Gehalt von 20 mM EDTA, jedoch ohne L-Alaninethylesterhydrochlorid und Glutamin, zu der Zellsuspension gegeben wurde (substratfreier Ansatz), eine Produktion von L-Alanyl-L-glutamin in keinem Fall beobachtet wurde.
(Beispiel 2) Verwendung von Aminosäureester als Substrat
1 ml Zellsuspension von Nasszellen (100 g/l) des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8101, hergestellt auf dieselbe Weise wie in Beispiel 1, wurde jeweils zu 1 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), enthaltend 20 mM EDTA und die folgenden L-Alaninesterhydrochloride in einer Konzentration von 200 mM und L-Glutamin in einer Konzentration von 400 mM, gegeben, wobei ein Endvolumen von 2 ml erhalten wurde, und danach wurde 1 Stunde bei 30°C eine Reaktion zugelassen. Als Ergebnis wurden 14,9 mM L-Alanyl-L-glutamin in dem Fall hergestellt, dass L-Alaninmethylesterhydrochlorid und L-Glutamin als Substrate eingesetzt wurden, 11,4 mM L-Alanyl-L-glutamin wurden in dem Fall hergestellt, dass L-Alaninethylesterhydrochlorid und L-Glutamin als Substrate eingesetzt wurden, und 0,5 mM L-Alanyl-L-glutamin wurde hergestellt, wenn L-Alanin-tert-butylesterhydrochlorid und L-Glutamin als Substrate eingesetzt wurden.
(Beispiel 3) Verwendung von L-Aminosäure als Substrat
1 ml einer Zellsuspension von Nasszellen (100 g/l) des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8101, hergestellt auf dieselbe Weise wie Beispiel 1, wurde jeweils zu 1 ml 100 mM Boratpuf fer (pH 9,0), enthaltend 20 mM EDTA und die folgenden L-Alaninesterhydrochloride in einer Konzentration von 200 mM und L-Glutamin oder L-Asparagin in einer Konzentration von 400 mM, zu einem Endvolumen von 2 ml zugegeben, und danach wurde 1 Stunde bei 30°C eine Reaktion zugelassen. Als Ergebnis wurden 12,7 mM L-Alanyl-L-glutamin hergestellt, wenn L-Alaninmethylesterhydrochlorid und L-Glutamin als Substrate eingesetzt wurden, und 4,8 mM L-Alanyl-L-asparagin wurden hergestellt, wenn L-Alaninmethylesterhydrochlorid und L-Asparagin als Substrate eingesetzt wurden.
(Beispiel 4) Mikroben, die L-Alanyl-L-glutamin produzieren
50 ml eines Mediums (pH 7,0), enthaltend 5 g Glucose, 5 g Ammoniumsulfat, 1 g Monokaliumphosphat, 3 g Dikaliumphosphat, 0,5 g Magnesiumsulfat, 10 g Hefeextrakt und 10 g Pepton in 1 1, wurden in einen 500 ml-Sakaguchikolben überführt und 15 Minuten bei 115°C sterilisiert. Eine Impföse jedes der in Tabelle 1 gezeigten Bakterien, die 24 Stunden bei 30°C auf einem Schrägröhrchenagarmedium (Agar: 2 g/l, pH 7,0), enthaltend 5 g Glucose, 10 g Hefeextrakt, 10 g Pepton und 5 g NaCl, kultiviert worden war, wurde in das vorstehend beschriebene Medium eingeimpft und mittels Schüttelkultivierung 17 Stunden bei 30°C und 120 Schlägen/Minute kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden die mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation abgetrennt und mit 0,1 M Boratpuffer (pH 9,0), enthaltend 10 mM EDTA, suspendiert, wobei 100 g/l Nassmikrobenzellen erhalten wurden. 0,1 ml 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), enthaltend 10 mM EDTA, 200 mM L-Alaninmethylesterhydrochlorid und 400 mM L-Glutamin, wurden jeweils zu 0,1 ml dieser mikrobiellen Zellsuspensionen bis zu einem Endvolumen von 0,2 ml gegeben, und dann wurde während 2 Stunden bei 25°C eine Reaktion zugelas sen. Die Mengen (mM) des zu diesem Zeitpunkt hergestellten L-Alanyl-L-glutamins (Ala-Gln) sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Mikrobe Ala-Gln (mM)

Bacillus subtilis ATCC 6633 1,1

Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 7,2

Psudomonas putida FERM BP-8101 14,8
(Beispiel 5) Wirkung der Temperatur auf die Produktion von L-Alanyl-L-glutamin
1 ml der Suspension des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8101 (100 g/l), hergestellt gemäß dem Kultivierungsverfahren nach Beispiel 4, wurden jeweils zu 1 ml eines 100 mM Boratpuffers (pH 9,0), enthaltend 10 mM EDTA, 200 mM L-Alaninmethylesterhydrochlorid und 400 mM L-Glutamin gegeben, wobei ein Endvolumen von 2 ml erhalten wurde, und danach wurde eine Reaktion 1 Stunde bei Temperaturen von 20°C, 30°C bzw. 40°C durchgeführt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. Die Produktion von L-Alanyl-L-glutamin (Ala-Gin) zeigte den höchsten Wert bei einer Temperatur von 40°C im Fall des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8101. Tabelle 2

Mikrobe Ala-Glnhergestellt (mM)

20°C 30°C 40°C

Psudomonas putida FERM BP-8101 8,2 16,9 20,8
(Beispiel 6) Reinigung des Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 und Produktion von L-Alanyl-L-glutamin durch das gereinigte Enzym
500 ml eines Mediums, enthaltend 5 g Glycerin, 5 g Hefeextrakt, 5 g Pepton, 5 g Natriumchlorid und 5 g L-Alaninamidhydrochlorid in 1 l, wurden in einen 5 l-Sakaguchikolben überführt und 20 Minuten bei 120°C sterilisiert. Die Kulturflüssigkeit des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13286, der 20 Stunden in einem Medium der wie vorstehend beschriebenen Zusammensetzung kultiviert worden war, wurde in das Medium in einer Endkonzentration von 5% (Vol./Vol.) eingeimpft und 20 Stunden bei 30°C und 120 Schlägen pro Minute kultiviert. Die mikrobiellen Zellen wurden aus 8 l dieser Kulturflüssigkeit durch Zentrifugation gewonnen. Das nachfolgende Verfahren wurde entweder auf Eis oder bei 4°C durchgeführt. Nach dem Waschen der mikrobiellen Zellen mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) wurden die Zellen etwa 10 Minuten unter Einsatz von Glasperlen mit einem Durchmesser von 0,1 mm zerstört. Die Glasperlen und die Flüssigkeit der zerstörten Zellen wurden dann voneinander getrennt, und die zerstörten Zellfragmente wurden durch Zentrifugation während 30 Minuten bei 20000 × g zentrifugiert, wobei ein zellfreier Extrakt erhalten wurde. Überdies wurde die unlösliche Fraktion durch Ultrazentrifugation während 60 Minuten bei 200000 × g entfernt, wobei eine lösliche Fraktion in der Form des Überstandes erhalten wurde. Ammoniumsulfat wurde dann zu der erhaltenen löslichen Fraktion bis zu 60% Sättigung gegeben, und danach wurde der Niederschlag durch Zentrifugation während 30 Minuten bei 20000 × g gewonnen. Der erhaltene Niederschlag wurde in einer kleinen Menge 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) aufgelöst und dann gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert. Die Enzymflüssigkeit wurde dann auf eine Q- Sepharose-HP-Säule gegeben, die mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und das Enzym wurde über einen linearen Konzentrationsgradienten von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0 bis 1,0 M Natriumchlorid, eluiert. Die aktive Fraktion wurde gewonnen und auf eine Superdex-200-pg-Säule aufgetragen, die mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, und das Enzym wurde dann mit demselben Puffer eluiert. Die aktive Fraktion wurde gewonnen und gegen 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, dialysiert und dann auf eine Phenyl-Sepharose-HP-Säule, die mit 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war, aufgetragen. Das Enzym wurde dann über einen linearen Konzentrationsgradienten von 20 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0,5 bis 0 M Ammoniumsulfat, eluiert. Die aktive Fraktion wurde gewonnen und gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) dialysiert und dann auf eine MonoQ-Säule, die mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibriert worden war, aufgetragen, und danach wurde das Enzym über einen linearen Konzentrationsgradienten von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), enthaltend 0 bis 1,0 M Natriumchlorid, eluiert. Das gereinigte Peptid-bildende Enzym wurde auf der Grundlage von Elektrophorese auf diese Weise gleichförmig gereinigt.
Die spezifische Aktivität des gereinigten Enzyms war 9,841 U/mg, und die spezifische Aktivität des gereinigten Peptid-bildenden Enzyms wurde als Ergebnis dieser Reinigungsstufen um das etwa 246-fache erhöht. Zudem wurde anhand eines gereinigten Enzymstandards in der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese eine gleichförmige Bande bei der Position gefunden, die einem Molekulargewicht von 42000 bis 46000 entspricht. Die Messung des Enzymtiters wurde wie nachstehend beschrieben durchgeführt. 200 μM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), 50 μM L-Alaninamid und eine geeignete Menge der Enzymflüssigkeit wurden zugegeben und auf ein Endvolumen von 1 ml gemischt, und nach der Reaktion während 60 Minuten bei 30°C wurden 4 ml wässrige Phosphorsäure (pH 2,1) zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Das produzierte Alanin wurde durch Hochleistungsflüssigchromatografie quantifiziert, und die Menge des Enzyms, die 1 μM L-Alanin in 1 Minute produziert, wurde als eine Einheit definiert.
Dieses gereinigte Enzym wurde dann zu Boratpuffer (pH 9,0), enthaltend EDTA, L-Alaninmethylesterhydrochlorid und L-Glutamin (oder L-Asparagin), gegeben und auf ein Gesamtvolumen von 1 ml gemischt (für die Endkonzentrationen war die zugegebene Enzymmenge 2 Einheiten als Alaninamidzersetzungsaktivität, EDTA war 10 mM, L-Alaninmethylesterhydrochlorid war bei 100 mM und L-Glutamin (oder L-Asparagin) war bei 200 mM, Boratpuffer war bei 100 mM), und danach wurde 4 Stunden bei 30°C eine Reaktion durchgeführt. (Es ist anzumerken, dass die Anzahl der Enzymeinheiten nicht die Produktionsaktivität bezüglich der Produktion von L-Alanyl-L-glutamin aus L-Alanin-methylester und L-Glutamin angibt, sondern einfach die L-Alaninamidzersetzungsaktivität bezeichnet.) Die Menge des zu diesem Zeitpunkt hergestellten L-Alanyl-L-glutamins war 50,2 mM, während die Menge des produzierten L-Alanyl-L-asparagins 49,8 mM war.
(Beispiel 7) Isolierung des Gens, des Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 und Expression in Escherichia coli Im Folgenden wird die Isolierung eines Gens des Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 und dessen Expression in Escherichia coli (Esche richia coli) beschrieben. Escherichia coli JM109 wurde als Wirt eingesetzt, und pUC18 wurde als Vektor sowohl für die Isolierung als auch die Expression des Gens verwendet.
1. Produktion eines PCR-Primers auf der Grundlage der ermittelten Aminosäuresequenz
Gemischte Primer, die in SEQ ID NO: 2 bzw. SEQ ID NO: 3 angegeben sind, wurden auf der Grundlage der N-terminalen Aminosäuresequenz des Peptid-bildenden Enzyms aus Corynebacterium glutamicum Stamm ATCC 13286 (SEQ ID NO: 1), erhalten in Beispiel 1, produziert.
2. Gewinnung der Mikroben
Die Mikroben wurden durch Kultivieren des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 während 24 Stunden bei 30°C auf einem CM2Gly-Agarmedium (0,5 g/dl Glycerin, 1,0 g/dl Hefeextrakt, 1,0 g/dl Pepton, 0,5 g/dl NaCl, 2 g/dl Agar, pH 7,0) aufgefrischt. Eine Impföse mit der Kultur wurde dann in einen 500 ml-Sakaguchikolben, enthaltend 50 ml CM2Gly-Flüssigmedium, eingeimpft und danach einer Schüttelkultur während 16 Stunden bei 30°C unter aeroben Bedingungen unterworfen.
3. Gewinnung der chromosomalen DNA aus mikrobiellen Zellen
50 ml Kulturflüssigkeit wurden zentrifugiert (12000 Umdrehungen pro Minute, 4°C, 15 Minuten), wobei die mikrobiellen Zellen gewonnen wurden. Diese mikrobiellen Zellen wurden dann in 10 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 20 mM EDTA, suspendiert, und danach wurden die mikrobiellen Zellen durch Zentrifugation gewonnen. Die mikrobiellen Zellen wurden in 10 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 20 mM EDTA, erneut suspendiert. Überdies wurde nach der Zugabe von 0,5 ml einer 20 mg/ml Lysozymlosung und 1 ml 10% SDS (Natriumdode cylsulfat) zu dieser Suspension die Lösung 20 Minuten bei 55°C inkubiert. Die inkubierte Lösung wurde dann durch Zugabe einer äquimolaren Menge Phenol, das mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM EDTA, gesättigt war, von Proteinen befreit. Eine äquimolare Menge 2-Propanol wurde zu der abgetrennten wässrigen Schicht zur Ausfällung der DNA gegeben, und danach wurde die ausgefällte DNA gewonnen. Nach dem Auflösen der ausgefällten DNA in 0,5 ml 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 20 mM EDTA, wurden 5 μl 10 mg/ml RNase und 5 μl 10 mg/ml Proteinase K zugegeben und 2 Stunden bei 55°C umgesetzt. Nach der Reaktion wurde diese Lösung durch Zugabe eines gleichen Volumens von Phenol, das mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM EDTA, gesättigt war, von Proteinen befreit. Überdies wurde ein gleiches Volumen von 24:1 Chloroform/Isoamylalkohol zu der abgetrennten wässrigen Schicht gegeben, und danach wurde die wässrige Schicht gerührt und gewonnen. Nach dem zweimaligen Durchführen dieses Verfahrens wurde eine 3 M Natriumacetatlösung (pH 5,2) zu der erhaltenen wässrigen Schicht gegeben, wobei eine Endkonzentration von 0,4 M erhalten wurde, und danach wurden 2 Volumina Ethanol zugegeben. Die DNA, die als Niederschlag gebildet wurde, wurde gewonnen, und nach dem Waschen mit 70% Ethanol wurde sie getrocknet und in 1 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), enthaltend 1 mM EDTA, aufgelöst.
4. Gewinnung eines DNA-Fragments, welches ein Teilgen für das Peptid-bildende Enzym enthält, durch Kassetten-PCR
Der TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit (hergestellt von Takara Shuzo) wurde für die Isolierung und Amplfizierung von DNA-Molekülen, enthaltend ein Gen (aah), das für das Peptid-bildende Enzym kodiert, unter Einsatz des Kassetten-PCR-Verfahrens eingesetzt. Wenn nichts anderes angegeben wird, wurde das Experiment auf der Grundlage des in der Gebrauchsanweisung beschriebenen Verfahrens durchgeführt. Bei dem Kassetten-PCR-Verfahren wurde in dem Fall der Verwendung des Primers 1 (1. PCR, SEQ ID NO: 2) und des Primers 2 (2. PCR, SEQ ID NO: 3) als Primer eine etwa 0,5 Kilobasen (kb) große Bande (Fragment 1) mit der Eco-RI-Kassette amplifiziert. Als Ergebnis der Ermittlung der Rasensequenz dieses Fragments wurde bestätigt, dass Fragment 1 ein Teil von aah ist.
5. Klonierung des Gens für das Peptid-bildende Enzym aus einer Genbibliothek
Um das vollständige Gen aah zu gewinnen, wurde danach eine Southern-Hybridisierung zuerst unter Einsatz des Fragments 1 als Sonde durchgeführt.
Das DNA-Fragment, das als Sonde diente, wurde in einer Konzentration von etwa 50 ng/μl hergestellt, und die Sonde wurde durch Inkubieren von 16 μl dieser DNA-Lösung während 24 Stunden bei 37°C gemäß dem Protokoll unter Verwendung von DIG High Prime (Boehringer Mannheim) markiert.
1 μg chromosomale DNA wurde unter Einsatz der Kombinationen verschiedener Restriktionsenzyme vollständig verdaut und dann mit 0,8% Agarosegel elektrophoretisiert. Dann wurde dieses Gel auf positiv geladene Nylonmembranen (Boehringer Mannheim, Nylonmembranen positiv geladen) geplottet. Die Southern-Hybridisierung wurde dann gemäß dem folgenden etablierten Verfahren durchgeführt. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von DIG Easy Hyb (Boehringer Mannheim) durchgeführt, und nach der Hybridisierung während 30 Minuten bei 50°C wurde die Sonde zugegeben, und danach wurde 18 Stunden bei 50°C hybridisiert. Der Nachweis wurde unter Verwendung des DIG Nucleotide Detection Kit (Boehringer Mannheim) durchgeführt.
Als Ergebnis wurde eine Bande bei etwa 7 kb in dem mit BglII geschnittenen Produkt nachgewiesen. Dieses 7 kb-Fragment wurde gewonnen und an pUC18 gekoppelt, wobei eine Bibliothek (120 Stämme) mit Escherichia coli JM109 hergestellt wurde. Es wurde dann eine Koloniehybridisierung gemäß dem folgenden etablierten Verfahren durchgeführt. Die Kolonien wurden auf Nylonmembranen überführt, um eine Kolonie- und Plaquehybridisierung (Boehringer Mannheim) durchzuführen, und danach wurde eine Behandlung durch alkalische Denaturierung, Neutralisierung und Immobilisierung durchgeführt. Die Hybridisierung wurde unter Verwendung von DIG Easy Hyb durchgeführt. Der Filter wurde in Puffer eingetaucht und 30 Minuten bei 42°C vorhybridisiert. Danach wurde die vorstehend genannte markierte Sonde zugegeben, und es wurde eine Hybridisierung während 18 Stunden bei 42°C durchgeführt. Nach dem Waschen mit SSC-Puffer wurde ein positiver Klon unter Einsatz des DIG Nucleotide Detection Kit selektiert.
6. Hasensequenz des Gens für das Peptid-bildende Enzym aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286
Plasmide, die in der selektierten Transformante enthalten waren, wurden gemäß dem in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989), beschriebenen Verfahren präpariert, und die Hasensequenz in der Nähe, die mit der Sonde hybridisierte, wurde bestimmt. Ein offener Leserahmen (ORF) war vorhanden, der ein Protein kodierte, das 30 Reste der N-terminalen Aminosäuresequenz eines Peptid-bildenden Enzyms enthielt, und es wurde bestätigt, dass es das Gen aah war, das für das Peptid-bildende Enzym kodiert. Die Hasensequenz des vollständigen Gens für das Peptid-bildende Enzym ist in SEQ ID NO: 4 des Sequenzprotokolls gezeigt. Der erhaltene ORF zeigte eine Basensequenzhomologie von 57,6% mit bekannter Proliniminopeptidase aus Bakterien der Spezies Propionbacterium. Es ist anzumerken, dass der numerische Wert der Homologie der Wert ist, der durch Genetyx erhalten wurde (im Folgenden gilt dies auch für dieses Beispiel).
7. Expression des Gens für ein Peptid-bildendes Enzym in Escherichia coli
Das Plasmid pUCAAH, das stromabwärts des lac-Promotors von pUC18 an aah gekoppelt war, wurde konstruiert, um aah in Escherichia coli zu exprimieren. Fragmente, die durch PCR unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 als Matrize und der Oligonucleotide in Tabelle 3 als Primer amplifiziert wurden, wurden mit SacI und SmaI behandelt, und nach dem Ligieren mit den mit SacI und SmaI geschnittenen Produkten von pUC18 wurden die ligierten Produkte eingesetzt, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Stämme mit dem Zielplasmid wurden aus Ampicillin-resistenten Stämmen ausgewählt, und das konstruierte Expressionsplasmid wurde pUCAAH genannt.
Die Transformante, die das Peptid-bildende Enzym in Escherichia coli mit pUCAAH exprimierte, wurde 16 Stunden bei 37°C in einem LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, vor kultiviert. 1 ml dieser Vorkulturbrühe wurde in einen 500 ml-Sakaguchikolben, der 50 ml LB-Medium enthielt, eingeimpft, und danach erfolgte eine Kultivierung bei 37°C. 2 Stunden nach dem Start der Kultivierung wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und danach erfolgte eine zusätzliche Kultivierung während 3 Stunden.
Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurden die Mikroben gewonnen und gewaschen, in 10 ml 20 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und dann 30 Minuten bei 180 W durch Ultraschall zerstört. Die Lösung wurde gewonnen und 10 Minuten bei 12000 g zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde als zellfreier Extrakt eingesetzt.
(Beispiel 8) Messung der Aktivität des Peptid-bildenden Enzyms
1. Aktivität des Enzyms aus dem Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286
Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung auf die vorstehend beschriebene Weise wurde ein zellfreier Extrakt präpariert, und die Aktivität des Peptid-bildenden Enzyms wurde unter Einsatz dieses Extrakts als Enzymquelle gemessen. Die Messung der Peptid-bildenden Enzymaktivität wurde durch Inkubieren einer Reaktionsflüssigkeit, die 100 mM L-Alaninmethylesterhydrochlorid, 150 mM L-Glutamin, 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), 10 mM EDTA und die Enzymlösung enthielt, während 60 Minuten bei 30°C durchgeführt, und danach wurde die Reaktion durch Zugeben des 4-fachen Volumens Phosphorsäure (pH 1,5) gestoppt. Die Menge des L-Alanyl-L-glutamins wurde durch HPLC bestimmt. Für die Einheit der Enzymaktivität wurde die Enzym aktivität, die 1 μmol L-Alanyl-L-glutamin in 1 Minute unter diesen Bedingungen produzierte, als 1 Einheit (U) definiert.
Die für die Analyse eingesetzten Bedingungen der HPLC waren folgende:
Säule: Inertsil ODS-2
Mobile Phase: (wässrige Phosphorsäurelösung (pH 2,1)), 2,5 mM Natrium-1-octansulfonat/Methanol = 10/1
Säulentemperatur: 40°C
Fließgeschwindigkeit: 1,0 ml/Minute
Nachweis: UV 210 Nanometer
Als Ergebnis wurden 0,54 U/mg Aktivität, die L-Alanyl-L-glutamin aus L-Alaninmethylesterhydrochlorid synthetisierte, nachgewiesen, wenn pUC18 AAH eingeführt wurde, wodurch bestätigt wurde, dass das klonierte AAH-Gen in Escherichia coli exprimiert wurde. Es ist anzumerken, dass keine Aktivität nachgewiesen wurde, wenn pUC18 allein als Kontrolle eingeführt wurde.
2. Expression des Gens für das Peptid-bildende Enzym mit His-Tag in Escherichia coli
Das Plasmid pQEAAH, das ein Peptid-bildendes Enzym als ein His-Tag-Protein stromabwärts des lac-Promotors von pUC18 exprimierte, wurde konstruiert, um aah in Escherichia coli zu exprimieren. Fragmente, die durch PCR unter Einsatz der chromosomalen DNA des Stammes Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 als Matrize und der in Tabelle 4 gezeigten Oligonucleotide als Primer amplifiziert wurden, wurden mit SacI und SmaI behandelt, und nach dem Ligieren mit Produkten von pQE-30 (Qiagen), die mit SacI und SmaI geschnitten worden waren, wurden die erhaltenen Produkte eingesetzt, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Stämme mit der Zielsequenz wurden aus Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und das konstruierte Expressionsplasmid wurde als pQEAAH bezeichnet.
Wenn die Aktivität der Transformante, die das Peptid-bildende Enzym in Escherichia coli mit pQEAAH exprimierte, unter Verwendung desselben Verfahrens wie in Beispiel 8 gemessen wurde, wurde gefunden, dass eine Peptid-bildende Enzymaktivität von 5,28 U/mg vorhanden war.
3. Herstellung des gereinigten His-Tag-Enzyms
Mikrobielle Zellen aus 150 ml Kulturbrühe von Escherichia coli JM109, welches pQEAAH enthielt, wurden gemäß dem vorstehend beschriebenen Verfahren zerstört, und die L-Alaninamidhydrolase mit His-Tag wurde unter Einsatz des His Trap Kit (hergestellt von Amersham Pharmacia Biotech) gemäß der dem Kit beiliegenden Anleitung gereinigt. 24 mg Protein wurden gewonnen, wobei das Protein eine einzige Bande auf der SDS-PAGE zeigte, und die spezifische Aktivität der Synthese des L-Alanyl-L-glutamins aus L-Alaninmethylesterhydrochlorid war 148,3 U/mg und 50,7%, bezogen auf L-Alaninmethylesterhydrochlorid.
4. Untersuchung der Substratspezifität unter Verwendung des gereinigten His-Tag-Enzyms
Die Synthese von anderen Peptiden als L-Alanyl-L-glutamin durch das gewonnene Peptid-bildende Enzym wurde unter Verwendung des gereinigten His-Tag-Enzyms untersucht.
(1) Peptidsynthese aus L-Alaninmethylester und anderen L-Aminosäuren
Die Synthesereaktion wurde durch Inkubieren einer Reaktionsflüssigkeit, die 100 mM L-Alaninmethylesterhydrochlorid, 150 mM Testaminosäure, 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), 10 mM EDTA und Enzymlösung (0,05 U/ml) enthielt, 3 Stunden bei 25°C durchgeführt, und danach wurde die Menge der hergestellten Peptide durch HPLC bestimmt. Es zeigte sich, dass 22,34 mM L-Alanyl-L-asparagin hergestellt wurden, wenn L-Asparagin als die andere Aminosäure eingesetzt wurde, 5,66 mM L-Alanyl-glycin wurden hergestellt, wenn Glycin eingesetzt wurde, 10,63 mM L-Alanyl-L-alanin wurden hergestellt, wenn L-Alanin eingesetzt wurde, 13,73 mM L-Alanyl-L-leucin wurden hergestellt, wenn L-Leucin hergestellt wurde, 48,80 mM L-Alanyl-L-methionin wurden hergestellt, wenn L-Methionin eingesetzt wurde, 1,02 mM L-Alanyl-L-prolin wurden hergestellt, wenn L-Prolin eingesetzt wurde, 16,13 mM L-Alanyl-L-phenylalanin wurden hergestellt, wenn L-Phenylalanin eingesetzt wurde, 15,31 mM L-Alanyl-L-tryptophan wurden hergestellt, wenn L-Tryptophan eingesetzt wurde, 26,14 mM L-Alanyl-L-serin wurden hergestellt, wenn L-Serin eingesetzt wurde, 24,23 mM L-Alanyl-L-threonin wurden hergestellt, wenn L-Threonin eingesetzt wurde, 0,96 mM L-Alanyl-L-tyrosin wurden hergestellt, wenn L-Tyrosin eingesetzt wurde, 7,91 mM L-Alanyl-L-lysin wurden hergestellt, wenn L-Lysin eingesetzt wurde, 24,87 mM L-Alanyl-L-arginin wurden hergestellt, wenn L-Arginin eingesetzt wurde, 23,16 mM L-Alanyl-L-histidin wurden hergestellt, wenn L-Histidin eingesetzt wurde, 1,11 mM L-Alanyl-L-glutamat wurden hergestellt, wenn L-Glutamat eingesetzt wurde.
(2) Peptidsynthese aus anderen L-Aminosäuremethylestern und L-Glutamin
Die Reaktionen wurden unter Einsatz von anderen Aminosäuremethylestern als L-Alaninmethylester durchgeführt.
Die Synthesereaktion wurde durch Inkubieren einer Reaktionsflüssigkeit, die 100 mM Testaminosäuremethylester, 150 mM L-Glutamin, 100 mM Boratpuffer (pH 9,0), 10 mM EDTA und Enzym (0,05 U/ml) enthielt, 3 Stunden bei 25°C durchgeführt, und danach wurde die Menge der hergestellten Peptide durch HPLC bestimmt. Es zeigte sich, dass 52,19 mM Glycyl-L-glutamin hergestellt wurden, wenn Glycinmethylester als L-Aminosäuremethylester eingesetzt wurde, 5,94 mM L-Valyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Valinmethylester eingesetzt wurde, 0,59 mM L-Isoleucyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Isoleucyl-L-glutamin eingesetzt wurde, 4,31 mM L-Methionyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Methioninmethylester eingesetzt wurde, 3,67 mM L-Phenylalanyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Phenylalaninmethylester eingesetzt wurde, 40,44 mM L-Seryl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Serinmethylester eingesetzt wurde, 3,85 mM L-Threonyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Threoninmethylester eingesetzt wurde, 0,23 mM L-Glutaminyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Glutaminmethylester eingesetzt wurde, 1,24 mM L-Tyrosyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Tyrosinmethylester eingesetzt wurde, 6,52 mM L-Arginyl-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Argininmethylester eingesetzt wurde, und 8,22 mM L-Aspartyl-α-L-glutamin wurden hergestellt, wenn L-Asparaginsäure-α-methylester eingesetzt wurde. Zusätzlich wurde auch bestätigt, dass Peptide, die aus den korrespondierenden Aminosäuren und L-Glutaminen zusammengesetzt waren, produziert wurden, wenn L-Leucinmethylester, L-Asparaginmethylester, L-Lysinmethylester, L-Asparaginsäure-β-methylester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester oder L-Glutaminsäure-γ-methylester als die Aminosäuremethylester eingesetzt wurden (die Bestimmung der Menge dieser Ester wurde nicht durchgeführt, da keine Standardpräparation zur Verfügung stand).
(3) Messung der Proliniminopeptidase (pep1)-Aktivität
Die Reaktion wurde bei 30°C unter Einsatz einer Reaktionsflüssigkeit durchgeführt (Zusammensetzung: 50 mM Boratpuffer (pH 9,0), 5 mM EDTA, 1 mM Prolin-2-naphthylamid (Prolin-pNA). Die Freisetzungsrate von Naphthylamid wurde als Erhöhung der optischen Absorption bei 405 Nanometer (nm) gemessen (ε = 9,83). Die Aktivität, die aus der Freisetzung von 1 μM Naphthylamid in 1 Minute resultierte, wurde als eine Einheit definiert.
Die Proliniminopeptidaseaktivität des gereinigten Enzyms war 5,83 × 10³ U/mg.
(Beispiel 9) Isolierung des Proliniminopeptidase (pepI)-Gens aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 und Expression in Escherichia coli
1. Gewinnung eines Teilfragments des Proliniminopeptidase (pepI)-Gens
Eine DNA wurde aus kultivierten Zellen des Stammes Pseudomonas putida ATCC 12633 unter Einsatz desselben Verfahrens wie in Abschnitt 3 des Beispiels 7 isoliert.
Andererseits wurden synthetische DNA-Oligonucleotide (SEQ ID NO: 10: GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A und SEQ ID NO: 11: GGC GGA TC AGG TCG CCG CGT TCT TC) auf der Grundlage der Teilbasensequenz (AF032970) von Proliniminopeptidase des Stammes Pseudomonas putida ATCC 12633, veröffentlicht in Genbank, hergestellt, und ein Teilgenfragment wurde durch PCR mit TaKaRa LA (hergestellt von Takara Shuzo) unter Einsatz dieser Oligomere als Primer amplifiziert.
2. Klonierung des vollständigen Proliniminopeptidasegens aus einer Genbibliothek
Um das vollständige Proliniminopeptidase (pep1)-Gen aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 zu gewinnen, wurde zuerst eine Southern-Hybridisierung auf dieselbe Weise wie in Abschnitt 5 des Beispiels 7 unter Verwendung des Teilfragments als Sonde durchgeführt. Es wurde eine Bande bei etwa 2,8 kb in dem mit XhoI geschnittenen Produkt nachgewiesen. Dann wurde dieses 2,8 kb-Fragment gewonnen und an die SalI-Stelle von pUC18 gekoppelt, wobei eine Bibliothek (100 Stämme) mit Escherichia coli JM109 erhalten wurde. Es wurde eine Koloniehybridisierung auf dieselbe Weise wie im Beispiel durchgeführt, und es wurde ein positiver Klon selektiert.
3. Hasensequenz des Proliniminopeptidasegens von Pseudomonas putida ATCC 12633
Plasmide, die in der selektierten Transformante vorhanden waren, wurden gemäß den in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989), beschriebenen Verfahren präpariert, und die Hasensequenz eines Abschnitts, bei dem die Hybridisierung mit der Sonde auftrat, und der benachbarten Bereiche wurde bestimmt. Ein offener Leserahmen (ORF) war vorhanden, der für ein Protein kodierte, das aus 337 Aminosäuren bestand, und es wurde bestätigt, dass das vollständige Gen gewonnen wurde. Die Rasensequenz des vollständigen Proliniminopeptidasegens ist in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls gezeigt.
Es ist anzumerken, dass der erhaltene ORF eine Basensequenzhomologie von 46,3% mit einer bekannten Proliniminopeptidase aus Bakterien der Spezies Corynebacterium und eine Homologie von 82,4% mit Proliniminopeptidase von Pseudomonas putida PA01 aufwies.
4. Expression des Proliniminopeptidasegens in Escherichia coli
Das Plasmid pUCPPPEPI, das an Proliniminopeptidase (pepI) stromabwärts des lac-Promotors von pUC18 gekoppelt war, wurde konstruiert, um pep1 in Escherichia coli zu exprimieren. Fragmente, die unter Einsatz einer chromosomalen DNA als Matrize und der in SEQ ID NO: 9 und 11 (SEQ ID NO: 9: GGC GGA TCC GGT GCT CAA AGC GCA A; SEQ ID NO: 11: CAC GCG CTG CAG CAA ACC CCT CAT) gezeigten Oligonucleotide als Primer durch PCR amplifiziert wurden, wurden behandelt, und nach der Ligation mit den geschnittenen Produkten von pUC18 eingesetzt um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Stämme mit dem Zielplasmid wurden unter Ampicillin-resistenten Stämmen ausgewählt, und das konstruierte Expressionsplasmid wurde pUCPP-PEPI genannt.
Die Escherichia-coli-Transformante mit pUCPPPEPI wurde 16 Stunden bei 37°C in einem LB-Medium, das 0,1 mg/ml Ampicillin enthielt, vorkultiviert. 1 ml dieser Vorkulturbrühe wurde in einem 500 ml Sakaguchikolben, der 50 ml LB-Medium enthielt, eingeimpft, und danach wurde die Hauptkultivierung bei 37°C durchgeführt. 2 Stunden nach Beginn der Kultivierung wurde Isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranosid (IPTG) in einer Endkonzentration von 1 mM zugegeben, und danach wurde weitere 3 Stunden kultiviert.
Nach dem vollständigen Ablauf der Kultivierung wurden die Mikroben gewonnen und gewaschen, in 10 ml 20 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) suspendiert und dann 30 Minuten bei 180 W durch Ultraschall zerstört. Die Lösung wurde gewonnen und 10 Minuten bei 12000 g zentrifugiert, und der erhaltene Überstand wurde als zellfreier Extrakt verwendet. Als Ergebnis wurde eine Proliniminopeptidaseaktivität (1,21 × 10³ U/mg) nur in dem Fall nachgewiesen, wenn pUCPPPEPI eingeführt wurde, sodass bestätigt wurde, dass das klonierte pep1-Gen in Escherichia coli exprimiert worden war.
(Beispiel 10) Synthese von L-Alanyl-L-glutamin durch Proliniminopeptidase des Stammes Pseudomonas putida ATCC 12633
1. Nachweis der L-Alanyl-L-glutamin-bildenden Aktivität in dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633
Der Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 wurde über Nacht bei 30°C in einem L-Medium flüssig kultiviert, wobei mikrobielle Zellen erhalten wurden. Die erhaltenen mikrobiellen Zellen wurden in 0,1 M Boratpuffer (pH 9,0), 10 mM EDTA suspendiert, und die erhaltene Suspension wurde als Enzymflüssigkeit eingesetzt. Es ist anzumerken, dass die Bestimmung der L-Alanyl-L-glutamin-bildenden Aktivität gemäß dem nachstehend beschriebenen Verfahren zur Messung der Enzymaktivität durchgeführt wurde. Eine Enzymreaktion wurde bei 30°C in einer Reaktionslösung, die aus Boratpuffer (pH 9,0) in einer Endkon zentration von 0,1 M, EDTA bei 10 mM, L-Alaninmethylesterhydrochlorid bei 100 mM und L-Glutamin bei 150 mM zusammengesetzt war, durchgeführt, und die Menge des hergestellten L-Alanyl-L-glutamins wurde durch HPLC bestimmt. Die Aktivität, die 1 μM L-Alanyl-L-glutamin in 1 Minute produzierte, wurde als 1 Einheit definiert.
Es wurde eine L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität von 0,051 Einheiten pro 1 ml Kulturflüssigkeit nachgewiesen.
2. Synthese von L-Alanyl-L-glutamin durch Escherichia coli, welches Proliniminopeptidase exprimiert
Die L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität wurde unter Einsatz des vorstehend beschriebenen zellfreien Extrakts gemessen. Als Ergebnis wurde eine L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität von 7,88 U/mg nachgewiesen, wenn pUCPPPEPI eingeführt wurde, und es wurde bestätigt, dass das klonierte pepI-Gen ein Gen für ein L-Alanyl-L-glutamin-bildendes Enzym war. Die maximale Anhäufung von L-Alanyl-L-glutamin war 25 mM.
(Beispiel 11) Isolierung des Proliniminopeptidase (pepI)-Gens aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 und Expression in Escherichia coli
1. Gewinnung des Proliniminopeptidase (pepI)-Genabschnitts
Eine DNA wurde aus kultivierten Zellen (50 ml Kultur) des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8123 unter Einsatz desselben Verfahrens wie in Beispiel 1 isoliert, wobei Proliniminopeptidase (pepI) aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 erhalten wurde.
Andererseits wurde zuerst eine Southern-Hybridisierung auf dieselbe Weise wie in Abschnitt 5 des Beispiels 9 beschrieben unter Einsatz des Teilfragments des pep1-Gens des Stammes Pseudomonas putida ATCC 12633, das in Beispiel 9 amplifiziert worden war, als Sonde hybridisiert. Als Ergebnis wurde eine Bande bei etwa 6,5 kb in dem mit PstI geschnittenen Produkt nachgewiesen.
Dieses 6,5 kb-Fragment wurde gewonnen und an die PstI-Stelle von pUC18 gekoppelt, wobei eine Bibliothek (200 Stämme) mit Escherichia coli JM109 hergestellt wurde. Dann wurde eine Koloniehybridisierung auf dieselbe Weise wie in dem Beispiel durchgeführt, und es wurden 2 positive Klone selektiert.
2. Hasensequenz des Proliniminopeptidasegens des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8123
Die Plasmide, die in den selektierten Transformanten enthalten waren, wurden gemäß dem in Molecular Cloning, 2nd edition, Cold Spring Harbor Press (1989), beschriebenen Verfahren präpariert, und die Rasensequenz des Abschnitts, bei dem die Hybridisierung mit der Sonde auftrat, und der benachbarten Abschnitte wurde bestimmt. Ein offener Leserahmen (ORF) war vorhanden, der für ein Protein kodierte, das aus 323 Aminosäuren bestand, sodass gezeigt wurde, dass das vollständige Gen erhalten worden war. Die Hasensequenz des vollständigen Proliniminopeptidasegens ist in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls gezeigt. Der erhaltene ORF zeigte eine Basensequenzhomologie von 83% und eine Aminosäurehomologie von 85% mit der Proliniminopeptidase des Stammes Pseudomonas putida ATCC 12633.
3. Expression des Proliniminopeptidasegens in Escherichia coli
Ein Plasmid, das an das pep1-Gen stromabwärts des lac-Promotors von pUC18 gekoppelt war, wurde konstruiert, um das pep1- Gen in Escherichia coli zu exprimieren. Fragmente, die durch PCR unter Einsatz einer chromosomalen DNA als Matrize und der in SEQ ID NO: 12 und 13 (SEQ ID NO: 12: CCC GAA TTC TTA CGG AGC GCG CAA TG; SEQ ID NO: 13: CGG GGA TCC CTT CAT GCT TOT TCA GG) gezeigten Oligonucleotide als Primer amplifiziert wurden, wurden behandelt und nach der Ligation mit den geschnittenen Produkten von pUC18 eingesetzt, um Escherichia coli JM109 zu transformieren. Stämme mit den Zielplasmiden wurden unter den Ampicillin-resistenten Stämmen selektiert, und das konstruierte Expressionsplasmid wurde als pUCPGPEPI bezeichnet.
Die Escherichia-coli-Transformante mit pUCPGPEPI wurde eingesetzt, um einen zellfreien Extrakt unter Einsatz desselben Verfahrens wie in Beispiel 8 herzustellen, und wenn die Proliniminopeptidaseaktivität gemessen wurde, wurde eine Aktivität von (3,48 × 10¹ U/mg) nachgewiesen, sodass gezeigt werden konnte, dass das klonierte pep1-Gen in Escherichia coli exprimiert worden war.
(Beispiel 12) Synthese von L-Alanyl-L-glutamin durch Proliniminopeptidase des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8123
1. Nachweis der L-Alanyl-L-glutamin-bildenden Aktivität in dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123
Die Enzymaktivität wurde durch Kultivieren des Stammes Pseudomonas putida FERM BP-8123 auf dieselbe Weise wie in Beispiel 10 gemessen. Es wurde eine L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität von 0,054 Einheiten pro 1 ml Kulturflüssigkeit nachgewiesen.
2. Nachweise der L-Alanyl-L-glutamin-bildenden Enzymaktivität
Die L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität wurde unter Einsatz eines zellfreien Extrakts von pUCPGPEPI tragenden Escherichia-coli-Transformanten gemessen. Als Ergebnis wurde eine L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität von 0,470 U/mg nachgewiesen, wenn pUCPGPEPI eingeführt wurde, sodass gezeigt wurde, dass das klonierte pep1-Gen das für L-Alanyl-L-glutamin-bildende Enzym kodierende Gen war. Die maximale Anhäufung von L-Alanyl-L-glutamin war 30 mM.
(Beispiel 13) Synthese von L-Alanyl-L-glutamin durch ein Enzym mit Proliniminopeptidaseaktivität des Stammes Bacillus coagulans EK01
Die L-Alanyl-L-glutamin-bildende Aktivität wurde gemäß dem in Beispiel 10 beschriebenen Verfahren unter Einsatz des gereinigten Enzyms (3,93 × 10⁵ U/mg) aus dem Stamm Bacillus coagulans EK01, der von Toyobo Co., Ltd. käuflich erworben werden kann, gemessen. Als Ergebnis wurde eine Aktivität von 52,0 U/mg nachgewiesen, sodass gezeigt wurde, dass diese Proliniminopeptidase ein Enzym mit L-Alanyl-L-glutamin-bildender Aktivität ist. Die maximale Anhäufung von L-Alanyl-L-glutamin war 18 mM.
(Beispiel 14) Wirkung von Inhibitoren auf die gewonnene Enzymaktivität
Die Wirkungen von Inhibitoren auf die gewonnene Proliniminopeptidase wurden untersucht. Die Enzymreaktion wurde 30 Minuten bei 30°C mit einer Reaktionslösung, die aus 0,1 M Boratpuffer (pH 9,0), 10 mM EDTA, 100 mM L-Alaninmethylesterhydrochlorid, 150 mM L-Glutamin und 1 mM Inhibitor bestand, durchgeführt, und danach wurde die L-Alanyl-L-glutaminsynthese gemessen. Die Enzymaktivität wurde nahezu vollständig inhibiert, wenn NEM (N-Ethylmaleimid) in einer Konzentration von 1 mM zugegeben wurde, wenn der Stamm Bacillus coagulans EK01, der Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633 und der Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123 eingesetzt wurde. Zudem wurden die Aktivitäten ebenfalls bis zu einem gewissen Grad verringert, wenn IAA (Iodacetamid) in einer Konzentration von 1 mM zugegeben wurde. Andererseits hatte die Zugabe von PMSF (Phenylmethylsulfonylfluorid) in einer Konzentration von 1 mM keine Auswirkung auf die Enzymaktivität. Die Aktivität wurde durch keinen der für den Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13286 untersuchten Inhibitoren beeinträchtigt.
[Sequenzprotokoll, freier Text]

SEQ ID NO: 1: N-terminale Aminosäuresequenz des Peptid-bildenden Enzyms aus Corynebacterium glutamicum
SEQ ID NO: 2: PCR-Primer
SEQ ID NO: 3: PCR-Primer
SEQ ID NO: 4: Kodierende Sequenz des Peptid-bildenden Enzyms aus Corynebacterium glutamicum
SEQ ID NO: 5: Aminosäuresequenz eines Peptid-bildenden Enzyms aus Corynebacterium glutamicum
SEQ ID NO: 6: Primer
SEQ ID NO: 7: Primer
SEQ ID NO: 8: Primer
SEQ ID NO: 9: Primer
SEQ ID NO: 10: Primer
SEQ ID NO: 11: Primer
SEQ ID NO: 12: Primer
SEQ ID NO: 13: Primer
SEQ ID NO: 14: Kodierende Sequenz eines Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633
SEQ ID NO: 15: Aminosäuresequenz eines Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Pseudomonas putida ATCC 12633
SEQ ID NO: 16: Kodierende Sequenz eines Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123
SEQ ID NO: 17: Aminosäuresequenz eines Peptid-bildenden Enzyms aus dem Stamm Pseudomonas putida FERM BP-8123

INDUSTRIELLE ANWENDBARKEIT
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden kann ein Dipeptid unter Verwendung eines L-Aminosäureesters und einer L-Aminosäure hergestellt werden, wobei das Dipeptid kostengünstig ohne Durchführung komplexer Syntheseverfahren erhalten werden kann, wodurch die Kosten für die Produktion von Dipeptiden, die als Arzneimittelmaterialien, funktionelle Nahrungsmittel und dergleichen einsetzbar sind, gesenkt werden können. Zudem können durch das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden verschiedene Arten von Dipeptiden unter Einsatz verschiedener Arten von L-Aminosäureestern und L-Aminosäuren als Ausgangsmaterialien produziert werden. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz.
Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz.
DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in der in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht.
DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht.
Vektor-DNA, welche darin einverleibt die DNA nach Anspruch 3 oder 4 enthält.
Transformierte Zelle, die mit der Vektor-DNA nach Anspruch 5 transformiert ist.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptid-bildenden Enzyms, welches umfasst: Kultivieren der transformierten Zellen gemäß Anspruch 6 in einem Medium und Anhäufen eines Proteins mit der Aktivität, das Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure in dem Medium und/oder in der transformierten Zelle herzustellen.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: Herstellen eines Dipeptids aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure unter Verwendung eines Proteins mit der Aktivität, das Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure, die in Zellen produziert wird, die mit der Vektor-DNA transformiert worden sind, zu bilden, wobei die Vektor-DNA darin einverleibt eine DNA enthält, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus (c) bis (f) besteht: (c) eine DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in einer in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, (d) eine DNA mit einer Homologie von 90 oder mehr mit der DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 486 bis 1496 in der in SEQ ID NO: 14 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, und welche für ein Protein mit der Aktivität kodiert, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure zu bilden, (e) eine DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Hasensequenz besteht, (f) eine DNA mit einer Homologie von 90 oder mehr zu der DNA, die aus der Rasensequenz besteht, die aus den Basen der Nummern 311 bis 1279 in der in SEQ ID NO: 16 des Sequenzprotokolls beschriebenen Rasensequenz besteht, und die für ein Protein mit der Aktivität kodiert, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure zu bilden.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Anspruch 8, wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, einem Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Leucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Anspruch 8 oder 9, wobei die L-Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L- Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: das Zulassen, dass ein Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität auf einen L-Aminosäureester und eine L-Aminosäure wirkt, um ein Dipeptid zu bilden, wobei das Protein aus (C) bis (F) ausgewählt ist: (C) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (D) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen, (E) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (F) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Anspruch 11, wobei das Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität von einer Mikrobe der Gattung Corynebacterium, Pseudomonas oder Bacillus abgeleitet ist.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Anspruch 11, wobei das Protein mit Proliniminopeptidaseaktivität von einer beliebigen Art, die unter Corynebacterium glutamicum, Pseudomonas putida und Bacillus coagulans ausgewählt ist, abgeleitet ist.
Verfahren zum Herstellen eins Dipeptids nach einem der Ansprüche 11 bis 13, wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Isoleucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach einem der Ansprüche 11 bis 14, wobei die L-Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids, welches umfasst: das Herstellen des Dipeptids aus einem Aminosäureester und einer Aminosäure unter Verwendung einer Kultur einer Mikrobe der Gattung Corynebacterium, Pseudomonas oder Bacillus, das Herstellen eines Proteins mit der Fähigkeit, das Dipeptid aus dem Aminosäureester und der Aminosäure herzustellen, unter Verwendung mikrobieller Zellen, die aus der Kultur isoliert worden sind, oder eines behandelten mikrobiellen Produkts der Mikrobe, wobei das Protein unter (C) bis (F) ausgewählt ist: (C) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (D) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 15 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen, (E) ein Protein mit der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls gezeigten Aminosäuresequenz, (F) ein Protein, das aus einer Aminosäuresequenz besteht, die Substitution, Deletion, Insertion, Addition oder Inversion einer bis 50 Aminosäuren in der in SEQ ID NO: 17 des Sequenzprotokolls beschriebenen Aminosäuresequenz umfasst, und welches die Aktivität hat, ein Dipeptid aus einem L-Aminosäureester und einer L-Aminosäure herzustellen.
Das Verfahren zum Herstellen eins Dipeptids nach Anspruch 16, wobei der L-Aminosäureester ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus einem L-Alaninester, Glycinester, L-Valinester, L-Isoleucinester, L-Methioninester, L-Phenylalaninester, L-Serinester, L-Threoninester, L-Glutaminester, L-Tyrosinester, L-Argininester, L-Asparaginsäure-α-ester, L-Asparaginsäure-β-ester, L-Leucinester, L-Asparaginester, L-Lysinester, L-Asparaginsäure-α,β-dimethylester und L-Glutamin-γ-ester besteht.
Verfahren zum Herstellen eines Dipeptids nach Anspruch 16, wobei die Aminosäure ein oder mehrere Typen ist, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus L-Glutamin, L-Asparagin, Glycin, L-Alanin, L-Leucin, L-Methionin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Tryptophan, L-Serin, L-Threonin, L-Tyrosin, L-Lysin, L-Arginin, L-Histidin und L-Glutamat besteht.