JPH02113887A - プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 - Google Patents
プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法Info
- Publication number
- JPH02113887A JPH02113887A JP26556988A JP26556988A JPH02113887A JP H02113887 A JPH02113887 A JP H02113887A JP 26556988 A JP26556988 A JP 26556988A JP 26556988 A JP26556988 A JP 26556988A JP H02113887 A JPH02113887 A JP H02113887A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- proline iminopeptidase
- recombinant dna
- production
- dna
- proline
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 108010017378 prolyl aminopeptidase Proteins 0.000 title claims abstract 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 12
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims abstract description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 8
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 9
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 abstract description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 abstract 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 3
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M Bromide Chemical compound [Br-] CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910014812 CaC6 Inorganic materials 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000007018 DNA scission Effects 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- VVFWZJAFYTZHAI-UHFFFAOYSA-N Glorin Natural products CCOC(=O)C(NC(=O)CC)CCC(=O)NC1CCCNC1=O VVFWZJAFYTZHAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000120 Host translation inhibitor nsp1 Proteins 0.000 description 1
- 101800000517 Leader protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101800000512 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000282376 Panthera tigris Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 210000003323 beak Anatomy 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- RIPAYNTUTNFPLK-QWRGUYRKSA-N ethyl (2s)-5-amino-5-oxo-2-[[(3s)-2-oxopiperidin-3-yl]-propanoylamino]pentanoate Chemical compound CCOC(=O)[C@H](CCC(N)=O)N(C(=O)CC)[C@H]1CCCNC1=O RIPAYNTUTNFPLK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010012302 glorin Proteins 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 239000010985 leather Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 108020001775 protein parts Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は遺伝子組換え法による７’ ａ リンイミノ
−ｅｆグチダーゼ衾遣法に″関するものである。
−ｅｆグチダーゼ衾遣法に″関するものである。
（従来技術）
デロリンイミノペデチグーゼについてはこれまでにエシ
ェリヒア属、バチルス嘴およびブタ腎臓にその存在が認
められている（ ５ａｒｌｄ、８． 、Ｂ＠ｒｇｎｒ。
ェリヒア属、バチルス嘴およびブタ腎臓にその存在が認
められている（ ５ａｒｌｄ、８． 、Ｂ＠ｒｇｎｒ。
Ａ、＆ Ｋａｔａｈａｌｓｋｌ、１：、、 Ｊ、Ｂｌｏ
ｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２３７ 、２２ Ｕ ７（１９６２
） 、 ＹｏｍｈｌｍｏＬｏ 、 Ｔ、 ＆Ｔｇｕｒｕ
、 Ｄ、、 Ｊ、ＢＩｏａｈｅｍ、。
ｌ、Ｃｈｅｍ、、 ２３７ 、２２ Ｕ ７（１９６２
） 、 ＹｏｍｈｌｍｏＬｏ 、 Ｔ、 ＆Ｔｇｕｒｕ
、 Ｄ、、 Ｊ、ＢＩｏａｈｅｍ、。
９７．１４７７（１９ｄ５） 、Ｎｏｒｄｗｉｎｇ、Ａ
、＆Ｍａｙｏｒ＋Ｈ，。
、＆Ｍａｙｏｒ＋Ｈ，。
Ｈｏｐｐ＊−８ｅｙｌｅ ｒ’ｓ Ｚ、Ｐｈｙｍｌａｌ
、 Ｃｈｅｍ、 ３５４ 、３８０［９７３））。
、 Ｃｈｅｍ、 ３５４ 、３８０［９７３））。
しかしながら、これらの従来より知られている微生物又
は動物細）泡はプロリンイミノペグチダーゼの生産能が
極めて低いために、経済的なグＯＩＪンイばノペデチダ
ーゼの製造法としては不適である。
は動物細）泡はプロリンイミノペグチダーゼの生産能が
極めて低いために、経済的なグＯＩＪンイばノペデチダ
ーゼの製造法としては不適である。
（本発明が解決しようとする課Ｍ）
本発明が解決しようとする課題は遺伝子工学の手法を用
いてエシェリヒア属に属する政生物により経済的な！ロ
リンイばノ（グチダーゼの製造法全提供することにある
。
いてエシェリヒア属に属する政生物により経済的な！ロ
リンイばノ（グチダーゼの製造法全提供することにある
。
（課題を解決するための手段）
上述のａ題を解決するために、本発明者らはｒオキシリ
ボ核＃（以下ＤＮＡと記す）供与菌としてエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ菌ｔ−用い、これよりグロリンイｉノ
ペゾチｌ−ゼ生成に関与する遺伝情ｉｔ有するＤＮＡ
’ｉ油抽出、ついでこのプロリンイミノ（グチダーゼ生
成に関与する遺伝情報を有するＤＮＡを組み込んだプラ
スばドを得て、このプラスばドをエシェリヒア属の微生
物に尋人し、これらの中よりグロリンイミノペグチグー
ゼ活住の増強し九岨良え体微生物を選択し比。
ボ核＃（以下ＤＮＡと記す）供与菌としてエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ菌ｔ−用い、これよりグロリンイｉノ
ペゾチｌ−ゼ生成に関与する遺伝情ｉｔ有するＤＮＡ
’ｉ油抽出、ついでこのプロリンイミノ（グチダーゼ生
成に関与する遺伝情報を有するＤＮＡを組み込んだプラ
スばドを得て、このプラスばドをエシェリヒア属の微生
物に尋人し、これらの中よりグロリンイミノペグチグー
ゼ活住の増強し九岨良え体微生物を選択し比。
本発明の微生物を用いることによって、従来の天然法を
用いる方法に比べて極めて高い収率でグロリンイミノペ
！チグーゼを生産できることを見出した。すなわち、グ
ロリンイｔノペ！テダーゼ活性合有する微生物はいくつ
か知られて３シ（芳本忠・鶴大典、蛋白質核戯酵素２９
、３１７（１９８４））これより染色体ＤＮＡ 全常
法により抽出しく １（、５ａｉｋ。
用いる方法に比べて極めて高い収率でグロリンイミノペ
！チグーゼを生産できることを見出した。すなわち、グ
ロリンイｔノペ！テダーゼ活性合有する微生物はいくつ
か知られて３シ（芳本忠・鶴大典、蛋白質核戯酵素２９
、３１７（１９８４））これより染色体ＤＮＡ 全常
法により抽出しく １（、５ａｉｋ。
ａｎｄ Ｋ、 Ｍｌｕｒａ 、 Ｂｌｏｃｈｌｍ、 Ｂ
ｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ＋ ７２ ＋ ６１９（１９
６３））常法１ｃよ）ｌ！ｌＩＩ限エンドヌクレアーゼ
で処理する。
ｉｏｐｈｙｓ、 ＡｃＬａ＋ ７２ ＋ ６１９（１９
６３））常法１ｃよ）ｌ！ｌＩＩ限エンドヌクレアーゼ
で処理する。
我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとしてＰａｔ）
’ｉｉ用いてプロリンイミノ（グチダーゼ生成に関与す
る遺伝ｔ’ｓを担うＤＮＡフラグメントを得たが、他の
制限エンドヌクレアーゼ例えばＥｌ ｍｍＦ（Ｉ ＊Ｓ
＊１１ 、 Ｈｋｎｄ ｉｌｌ 、 Ｘｈｏ Ｉなどを
用いてもＰｓＬＪと同様の結果が得られる可能性がある
。
’ｉｉ用いてプロリンイミノ（グチダーゼ生成に関与す
る遺伝ｔ’ｓを担うＤＮＡフラグメントを得たが、他の
制限エンドヌクレアーゼ例えばＥｌ ｍｍＦ（Ｉ ＊Ｓ
＊１１ 、 Ｈｋｎｄ ｉｌｌ 、 Ｘｈｏ Ｉなどを
用いてもＰｓＬＪと同様の結果が得られる可能性がある
。
ベクターＤＮＡとしてはｐＢＲ３２２、ｐＵｃ１９など
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイググラスミド
より得られたものならばどのようなものでもよい、この
ベクターにプロリンイミノ−４ｆチダーゼ生成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを岨み込む方法は
特定の方法を要しない。
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイググラスミド
より得られたものならばどのようなものでもよい、この
ベクターにプロリンイミノ−４ｆチダーゼ生成に関与す
る遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを岨み込む方法は
特定の方法を要しない。
かくして得られたｆｅｌリンイミノペ！チグーゼ生成に
関与する遺伝情ｉｔ担うＤＮＡフラグメントを組み込ん
だプラスミド″全工／エリヒア属の微生物に富有せしめ
る方法もまた、従来知られているすべての形質転換方法
が可能である。
関与する遺伝情ｉｔ担うＤＮＡフラグメントを組み込ん
だプラスミド″全工／エリヒア属の微生物に富有せしめ
る方法もまた、従来知られているすべての形質転換方法
が可能である。
組換えプラスばドの受容菌としては、エシェリヒア属の
中でデロリンイば〕（ブチグーぜ活性をもたないものあ
るいは弱いものを用いる方が、グロリンイミノペグチダ
ーゼ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメント
を組み込んだプラスミドを保有する形質転換株全選別、
分離するのく都合よい。
中でデロリンイば〕（ブチグーぜ活性をもたないものあ
るいは弱いものを用いる方が、グロリンイミノペグチダ
ーゼ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメント
を組み込んだプラスミドを保有する形質転換株全選別、
分離するのく都合よい。
かくして得られ九グｏリフイミノペグチダーゼ生産Ｍ’
ｆｔ−培養する方法は、従来のエシェリヒア属のｊ＠養
方法と特に変らない。すなわち培地としては炭素源、窒
素源、無機イオン、さらに必要に応じアｉ）酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養Ａを社有する通常のものである。
ｆｔ−培養する方法は、従来のエシェリヒア属のｊ＠養
方法と特に変らない。すなわち培地としては炭素源、窒
素源、無機イオン、さらに必要に応じアｉ）酸、ビタミ
ン等の有機微量栄養Ａを社有する通常のものである。
ｆｆｌ、１１としてはグルコース、シュクロース等及び
これらを含有する澱粉加水分解、ｍ嬢等が用＾１、？Ｌ
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩、その他が便用できる。
これらを含有する澱粉加水分解、ｍ嬢等が用＾１、？Ｌ
る。窒素源としてはアンモニアガス、アンモニア水、ア
ンモニウム塩、その他が便用できる。
より好ましくはペプトン、トリプトン、肉エキス。
酵母エキス等の天然素材なども使われる。
培ｊｌＦは好気的条件下で培地の−及び温度を適宜８１
４節しつつ、実質的にグロリンイミノベグチダーゼの生
成Ｓ積が最高になるところまで行われる。
４節しつつ、実質的にグロリンイミノベグチダーゼの生
成Ｓ積が最高になるところまで行われる。
培養画体よりグロリンイミノペデチグーゼヲ採取するＫ
は通常以下のような方法が用いられる。
は通常以下のような方法が用いられる。
培養菌体を冷却遠心機等で集菌した後、適当なバッファ
ーＶｃ４濁し１．ｆｆｌ音波あるいはグイノビルなどで
酸体全破砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈
澱分画法（好ましくは、塩析分画として硫安４０−８０
％飽和画１缶）、ＤＥＡｌｉｒＴｏｙｏｐｅａｒｌ（東
ソー社製）などの高速液体りσマドグラフィーなどを行
い、さらにハイドロキシアノ卆タイトなどのイオン交換
クロマトグラフィーなどを行ってゾロリンイミノ４デチ
グーゼの槽製傾品乞得る。
ーＶｃ４濁し１．ｆｆｌ音波あるいはグイノビルなどで
酸体全破砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈
澱分画法（好ましくは、塩析分画として硫安４０−８０
％飽和画１缶）、ＤＥＡｌｉｒＴｏｙｏｐｅａｒｌ（東
ソー社製）などの高速液体りσマドグラフィーなどを行
い、さらにハイドロキシアノ卆タイトなどのイオン交換
クロマトグラフィーなどを行ってゾロリンイミノ４デチ
グーゼの槽製傾品乞得る。
以上１本発明の微生物を用いることにょシ、従来知られ
ているエシェリヒア・コリーのデロリンイミノペ！チグ
ーゼ生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生
産量が極めて高いことにより、プロリンイミノ（グチダ
ーゼの分離・精製）際に有利である。
ているエシェリヒア・コリーのデロリンイミノペ！チグ
ーゼ生産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生
産量が極めて高いことにより、プロリンイミノ（グチダ
ーゼの分離・精製）際に有利である。
ｔたグロリンイミノペデチグーゼの用途としては、本＃
累の基質％異性がＰｒｏ−Ｘ−・・・のＰｒｏの慢を特
異的に切断しＸ−・・・なる４グテドｔ−遊離するとこ
ろから、リコンビナント法で先導蛋白質と目的蛋白質を
連結した融合蛋白質を蓄積せしめる場合に、先導蛋白質
と目的蛋白質との間にＰｒｏを配オした融合蛋白質とし
て蓄積せしめ、先４蛋白質部分ヲアミノペデチダーゼ−
Ｍなどおよびアばノにブチダーゼ−Ｐによ＃）にｒｌ所
し、Ｎ末端１ｃＰｒｏが付加した目的蛋白質を取得し、
しかる後にプロリンイミノ（デチダーゼを作用式せるこ
とによりＮ末端の揃り之目的蛋白質金取得することなど
に用いられる。！’ＴｔＨ昭６３−６２８４ ）。
累の基質％異性がＰｒｏ−Ｘ−・・・のＰｒｏの慢を特
異的に切断しＸ−・・・なる４グテドｔ−遊離するとこ
ろから、リコンビナント法で先導蛋白質と目的蛋白質を
連結した融合蛋白質を蓄積せしめる場合に、先導蛋白質
と目的蛋白質との間にＰｒｏを配オした融合蛋白質とし
て蓄積せしめ、先４蛋白質部分ヲアミノペデチダーゼ−
Ｍなどおよびアばノにブチダーゼ−Ｐによ＃）にｒｌ所
し、Ｎ末端１ｃＰｒｏが付加した目的蛋白質を取得し、
しかる後にプロリンイミノ（デチダーゼを作用式せるこ
とによりＮ末端の揃り之目的蛋白質金取得することなど
に用いられる。！’ＴｔＨ昭６３−６２８４ ）。
実施例１゜
エシェリヒア・コリ）Ｈ３１０１（Ｂｏｙ＠ｒ 、 Ｈ
，Ｗ、 ｅｔａｌ、、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、４１，４５９
（１９６９））ｋプロリンイミノ−Ｚ ｆチダーゼを生
抜する原塊として、次のような方法でデロリンイミノペ
デチダーゼ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグ
メント金分離し、！ｆｒ規に著量のグロリンイミノベ！
チダーゼ全生産する菌を造成し比。
，Ｗ、 ｅｔａｌ、、Ｍｏ１．Ｂｌｏｌ、４１，４５９
（１９６９））ｋプロリンイミノ−Ｚ ｆチダーゼを生
抜する原塊として、次のような方法でデロリンイミノペ
デチダーゼ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグ
メント金分離し、！ｆｒ規に著量のグロリンイミノベ！
チダーゼ全生産する菌を造成し比。
（１）染色体ＤＮＡの調製
エシェリヒア・コリ）（ＢＩＯＩを４ＱＱａ７のＬ培地
（トリプトン１チ、酵母エキス０．５％、ＮａＣｔｏ、
５係、グルコース０．１憾、ｐＨ７，２に祠４）中３
７０で約３時間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体を嗅
菌凌フェノール法による通常のＤＮＡ抽出法（ＩＩ。
（トリプトン１チ、酵母エキス０．５％、ＮａＣｔｏ、
５係、グルコース０．１憾、ｐＨ７，２に祠４）中３
７０で約３時間振盪培養金行い、対数増殖期の菌体を嗅
菌凌フェノール法による通常のＤＮＡ抽出法（ＩＩ。
５ａｉｋｏ ａｎｄ Ｋ、Ｍｌｕｒａ 、Ｂｉｏｅ
ｈｌｒｎ、Ｂｌｏｐｈｙｍ、Ａｅｔａ。
ｈｌｒｎ、Ｂｌｏｐｈｙｍ、Ａｅｔａ。
７２．０１９（１９６３））によって染色体ＤＮＡを抽
出イぎ製し、ｆ＆終２０ηを得之。
出イぎ製し、ｆ＆終２０ηを得之。
（２） 染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）
で得た染色体ＤＮＡおよびベクターｐＢＲ３２２（タカ
ラ市販品）の各１０ Ａｌｌをとり、各々に制限エンド
ヌクレアーゼの１種、Ｐｓｔｌｔ−３７０，ｉ時間作用
させてＤＮＡ鎖を切断した。次に各々ｔ−フェノール処
理、クロロホルム処理（＆、エタノール１ｌｉｎ収し１
両ＤＮＡ切断物を１ｍＭＡＴＰ、及び１０−ジチオスレ
イトール、 ６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ’に含む６
６ ｒｎＭ Ｔｒｌ ５−ＨＣｔ％−７，５中でＴ４Ｄ
ＮＡすｆ−ゼ（タカラ）１００ユニツトと共に混合し、
混合物を４℃、−昼夜原石させ丸。
で得た染色体ＤＮＡおよびベクターｐＢＲ３２２（タカ
ラ市販品）の各１０ Ａｌｌをとり、各々に制限エンド
ヌクレアーゼの１種、Ｐｓｔｌｔ−３７０，ｉ時間作用
させてＤＮＡ鎖を切断した。次に各々ｔ−フェノール処
理、クロロホルム処理（＆、エタノール１ｌｉｎ収し１
両ＤＮＡ切断物を１ｍＭＡＴＰ、及び１０−ジチオスレ
イトール、 ６．６ ｍＭ ＭｇＣｌ２ ’に含む６
６ ｒｎＭ Ｔｒｌ ５−ＨＣｔ％−７，５中でＴ４Ｄ
ＮＡすｆ−ゼ（タカラ）１００ユニツトと共に混合し、
混合物を４℃、−昼夜原石させ丸。
（３） コンピテント細胞の調製
エシェリヒア・コリＤ）ｉｌ （Ｌｏｗ、Ｂ、 Ｐｒｏ
ａ、Ｎａｔｌ。
ａ、Ｎａｔｌ。
人ｃａｄ、 ８ｅｌ、、 ６０．１６０（１９６８）
） ｔ ５０ ａｔのＬ培地に接種し、培養液の６５０
ｍμにおける吸光反がおよそ０．４〜０．５ Ｋなるま
で３０℃で振盪培養した。
） ｔ ５０ ａｔのＬ培地に接種し、培養液の６５０
ｍμにおける吸光反がおよそ０．４〜０．５ Ｋなるま
で３０℃で振盪培養した。
培養終了後、培養液をＯＣにて２０分間放置し。
次に菌体を遠心分離により集め、５０ ｍＭ ＣａＣ６
２溶液２５ｍＫ懸濁し、０℃に１時間放置後、遠心分離
により菌体を集め、５０ ｍ）／Ｌ ＣａＣＺ２と２０
チグリセロール溶液５ｄに菌体ｆ：再び悟濁し、得られ
た菌体懸濁液を０．５ ＃Ｌ／ずつエツペンドルフチ、
−グに入れ、−７０℃にて凍結保存した７ （４） 形質転換と形質転換株の取得（３ンで調製し
九コンピテント細胞憑濁液２００μ２ＹＣ＜２） テｖ
４ｍし７’ｊ ＤＮＡ溶ｆｇ、１−加え、０℃、３０分
間放（ｌｆ俵、４２０で２分間のヒートショックを与え
皮袋、再び０℃に３０分間放置してＤＮＡ ｔ−細胞内
に取込ませた。
２溶液２５ｍＫ懸濁し、０℃に１時間放置後、遠心分離
により菌体を集め、５０ ｍ）／Ｌ ＣａＣＺ２と２０
チグリセロール溶液５ｄに菌体ｆ：再び悟濁し、得られ
た菌体懸濁液を０．５ ＃Ｌ／ずつエツペンドルフチ、
−グに入れ、−７０℃にて凍結保存した７ （４） 形質転換と形質転換株の取得（３ンで調製し
九コンピテント細胞憑濁液２００μ２ＹＣ＜２） テｖ
４ｍし７’ｊ ＤＮＡ溶ｆｇ、１−加え、０℃、３０分
間放（ｌｆ俵、４２０で２分間のヒートショックを与え
皮袋、再び０℃に３０分間放置してＤＮＡ ｔ−細胞内
に取込ませた。
次に、この＃ｉ濁液ＫＬ培地を１ｄ加え、３７℃で１時
間培養を行りた後、テトラサイクリン２０μｌｌＡｌを
含有するＬ培地寒天プレートに塗床し３７℃で１晩メン
キ、ベートした。出現したコロニーを今度はアンピアリ
ン２５μｂ電を富有するＬ培地寒天プレートにそれぞれ
塗床し、３７℃で一晩インキ、ベートし生育のＷｉｔ検
定し、テトラサイクリンを含む培地では生育するがアン
ピシリンを倉む培咄では生育しないコロニーをデロリ／
イξノイデチダーゼ生産を検定する候補法としてｐｌａ
ｋｕｐした。
間培養を行りた後、テトラサイクリン２０μｌｌＡｌを
含有するＬ培地寒天プレートに塗床し３７℃で１晩メン
キ、ベートした。出現したコロニーを今度はアンピアリ
ン２５μｂ電を富有するＬ培地寒天プレートにそれぞれ
塗床し、３７℃で一晩インキ、ベートし生育のＷｉｔ検
定し、テトラサイクリンを含む培地では生育するがアン
ピシリンを倉む培咄では生育しないコロニーをデロリ／
イξノイデチダーゼ生産を検定する候補法としてｐｌａ
ｋｕｐした。
（５） プロリンイはノペグチダーゼ生産の検定（４
）でｐｉａｋ ｕｐ した約１０００コロニーの検定候
補法をそれぞれテトラサイクリン２０μＩ／Ｗｉｔを含
むＬ−培地３ｏｏｐｔ Ｖｃ＊Ｗｉ （９６穴グレート
使用）シ。
）でｐｉａｋ ｕｐ した約１０００コロニーの検定候
補法をそれぞれテトラサイクリン２０μＩ／Ｗｉｔを含
むＬ−培地３ｏｏｐｔ Ｖｃ＊Ｗｉ （９６穴グレート
使用）シ。
３０℃で２４時間培養した。
この培養液の菌体懸濁／［０，ｌ ｒｎｌに、２０ ｍ
ＭＴｒｆｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８，５）を０．８ ＩＬｔ
加え、さらに基質であろ５ ｍＭＰｒｏ−β−Ｎａｐｈ
ｔｙｌａｍｌｄ＊ ｆ？、０．１ ｔＬｌ加えて、３７
℃で１０分間反応させ几１反応後この反応液に０、５
馴−イの Ｆａｇｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣ（１０
％ ト リ ト ン Ｘ −１００ｆｔ含む１Ｍ酢酸緩
衝液（メ１４，０沫」かして０．１チとしたもの）を加
え、不ｄ物と遠心する＄により除いた後、上清のアゾ色
素（赤色）の生成量ｔ−５５０ｎｍの吸収で測定した。
ＭＴｒｆｓ−ＨＣｌ （ｐＨ８，５）を０．８ ＩＬｔ
加え、さらに基質であろ５ ｍＭＰｒｏ−β−Ｎａｐｈ
ｔｙｌａｍｌｄ＊ ｆ？、０．１ ｔＬｌ加えて、３７
℃で１０分間反応させ几１反応後この反応液に０、５
馴−イの Ｆａｇｔ Ｇａｒｎｅｔ ＧＢＣ（１０
％ ト リ ト ン Ｘ −１００ｆｔ含む１Ｍ酢酸緩
衝液（メ１４，０沫」かして０．１チとしたもの）を加
え、不ｄ物と遠心する＄により除いた後、上清のアゾ色
素（赤色）の生成量ｔ−５５０ｎｍの吸収で測定した。
その結果、原塊のＨＢｌｏｌの対ｆｉｌｃ比べ約１０倍
程活性の強い候補法が得られた。
程活性の強い候補法が得られた。
この候補法について、さらに無細胞抽出物レペルでの＃
：Ｊｇ活性を検討するために以下の実験を行りた・ ２０／Ｊわ４１のテトラサイクリンを含むＬ−培地の１
００１ｎｔの入った坂ロフラスコに植菌し３００で一晩
振！ｉ培養し、培養終了後集画し２０ｍＭＴｒ１ｍ−Ｈ
Ｃｌ 、 ４８．５溶Ｆｇ、に懸濁し、ＯＣで超音波破
砕し４心により抽出液を得几。この細胞抽出液を用いて
次のようにグロリンイｉノペデチダーゼの活性を測定し
九。
：Ｊｇ活性を検討するために以下の実験を行りた・ ２０／Ｊわ４１のテトラサイクリンを含むＬ−培地の１
００１ｎｔの入った坂ロフラスコに植菌し３００で一晩
振！ｉ培養し、培養終了後集画し２０ｍＭＴｒ１ｍ−Ｈ
Ｃｌ 、 ４８．５溶Ｆｇ、に懸濁し、ＯＣで超音波破
砕し４心により抽出液を得几。この細胞抽出液を用いて
次のようにグロリンイｉノペデチダーゼの活性を測定し
九。
２０ ｍＭ Ｔｒ ｉｓ −ＨＣｌ ｔ ｐ）１８．５
のｌ ｍｌと細胞抽ｂａの０、２５ ａｔと１ｍＪｄの
Ｐｒｏ−βＮａｐｈｔｈｙｌａｒｎｉｄｅの０．２５１
とｋ ｒＡ合し、３０Ｃで１０分間反応し友、そして１
００℃で２分間の熱処理により反応全停止した後、１Ｍ
酢酸バッファー、ｐＨ４，０と１０声のＴｒｔ ｔｏｎ
Ｘ−１００からなる溶液中１η〜の濃度でＦｉｓｔ
ＧａｒｎａＬ ＧＢＣｆ含む試薬ｔｏ、ｓｉｇ加えて発
色させ友、この赤色度を５５０ ｒｕｎの吸収で測定し
た。
のｌ ｍｌと細胞抽ｂａの０、２５ ａｔと１ｍＪｄの
Ｐｒｏ−βＮａｐｈｔｈｙｌａｒｎｉｄｅの０．２５１
とｋ ｒＡ合し、３０Ｃで１０分間反応し友、そして１
００℃で２分間の熱処理により反応全停止した後、１Ｍ
酢酸バッファー、ｐＨ４，０と１０声のＴｒｔ ｔｏｎ
Ｘ−１００からなる溶液中１η〜の濃度でＦｉｓｔ
ＧａｒｎａＬ ＧＢＣｆ含む試薬ｔｏ、ｓｉｇ加えて発
色させ友、この赤色度を５５０ ｒｕｎの吸収で測定し
た。
そノ＆ｌｊ来、ｆｉｌＫ示スヨうに泳法ＨＢＩＯＩ ９
Ｌび宿主株ＤＩ（ｌ ｉｃ比し約８倍の比活性の上昇
が認められた。ｔた、このｆｆｌ換え菌株をｐＩＰ Ｏ
ｆ／ＤＨ１と命名した６なお、本菌株はＦＥＲＭ−Ｐ
１０３３／として存託されている。
Ｌび宿主株ＤＩ（ｌ ｉｃ比し約８倍の比活性の上昇
が認められた。ｔた、このｆｆｌ換え菌株をｐＩＰ Ｏ
ｆ／ＤＨ１と命名した６なお、本菌株はＦＥＲＭ−Ｐ
１０３３／として存託されている。
またユニットは
として表わした。
表 １
（６） ｐＩＰＯｌの挿入ＤＮＡ部分の割飼ｍ素地図
プロリ／イイノペグチダーゼ生成に関与する遺伝情報を
担うＤＮ人フラグメ／トを富むプラスミドｐＩＰＯ１は
常法により調製された（ Ｔ、Ｍａｎｌａｔｔｓａｔ
＠ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 ｐ９３（１９８２）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ ）。
プロリ／イイノペグチダーゼ生成に関与する遺伝情報を
担うＤＮ人フラグメ／トを富むプラスミドｐＩＰＯ１は
常法により調製された（ Ｔ、Ｍａｎｌａｔｔｓａｔ
＠ｔ、、Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ
、 ｐ９３（１９８２）、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈ
ａｒｂｏｒ ＬａｂｏｒａＬｏｒｙ ）。
そして主として６１基配列全認識する制限酵素での切断
により制限酵Ａ地囚全作製したところ図ＩＫ示すような
切断部位を有することが分った。
により制限酵Ａ地囚全作製したところ図ＩＫ示すような
切断部位を有することが分った。
ま次Ｐｓｔｌで切す出した挿入部分はほぼ７ｋｂの大き
さであった。
さであった。
′）Ａ施例２゜
次にｐＩＰＯｌの７１ｃｂの挿入フラグメント全Ｅｉ４
４Ａ化するためｔＣ以下のような検討を行った・先ずｐ
ｌＰＯｌより７ ｋｂのＰａｔ ｌフラグメントを切り
出し、プラスミドｐＵｃ１９のＰｍｔｌサイトに挿入し
たｐｒＰ０２ｆｔ構築した（図２）。すなわち、ｐｌＰ
Ｏ１２０μｇを制限酵素ＰｌＩで切断し、この反応液を
エチノウムブロマイドを含む０．９チアがロースグル電
気泳動により４．４ｋｂと７ ｋｂの２つのフラグメン
トを分離し、７ｋｂフラグメントのグルｔ−切り出した
。この）ｆ Ａ／ Ｉｅ透析チューブに入れ４気的に透
析チューブ中の９０ｒａＭＴｒ１ｇ−ホウ酸バッファー
−７，５に浴出させ、フェノール処刑、クロロホルム６
厘を行い、エタノール沈澱として７ ｋｂのフラグメン
トを５μｍ回収した。そしてこの７ ｋｂ ７ラグメン
トとＰｓｔｌで切断したグラスミドｐＵｃ１９と連結反
応を行い因２に示したｐＩＰ０２を選択した。
４Ａ化するためｔＣ以下のような検討を行った・先ずｐ
ｌＰＯｌより７ ｋｂのＰａｔ ｌフラグメントを切り
出し、プラスミドｐＵｃ１９のＰｍｔｌサイトに挿入し
たｐｒＰ０２ｆｔ構築した（図２）。すなわち、ｐｌＰ
Ｏ１２０μｇを制限酵素ＰｌＩで切断し、この反応液を
エチノウムブロマイドを含む０．９チアがロースグル電
気泳動により４．４ｋｂと７ ｋｂの２つのフラグメン
トを分離し、７ｋｂフラグメントのグルｔ−切り出した
。この）ｆ Ａ／ Ｉｅ透析チューブに入れ４気的に透
析チューブ中の９０ｒａＭＴｒ１ｇ−ホウ酸バッファー
−７，５に浴出させ、フェノール処刑、クロロホルム６
厘を行い、エタノール沈澱として７ ｋｂのフラグメン
トを５μｍ回収した。そしてこの７ ｋｂ ７ラグメン
トとＰｓｔｌで切断したグラスミドｐＵｃ１９と連結反
応を行い因２に示したｐＩＰ０２を選択した。
次にｐ ｌＰＯ２をＢａｍＨｌで切断し、そのまま再び
連結反応を行い、デロリンイｉノベデチダーゼ遺伝Ｆ部
分が若干小さくなったｐｌＰＯ３を得た（図２）。
連結反応を行い、デロリンイｉノベデチダーゼ遺伝Ｆ部
分が若干小さくなったｐｌＰＯ３を得た（図２）。
同じようにｐｌＰＯ２を５ａｉｌ ６るいは３ｔｕｌと
５ｒｎａ、ｌで切断して再連結反応を行いゾロリンイミ
ノイデチダーゼ遺伝子ｆ、短Ｒ６化したｐＩＰ（Ｊ４
、 ｐｌＰＯ５をそルぞれ得た（図２）。
５ｒｎａ、ｌで切断して再連結反応を行いゾロリンイミ
ノイデチダーゼ遺伝子ｆ、短Ｒ６化したｐＩＰ（Ｊ４
、 ｐｌＰＯ５をそルぞれ得た（図２）。
また、先に得た７ｋｂのＰｓＬ）フラグメンｈ２ｇａｏ
ＲＩと８ａｌｌで切断し、プラスばドＰＩＪＣ１８ｆｃ
＆ｏＲ［とＳｌ、１１で切断し几ものと連結反応を行
ってデａリンイｉノイプチダーゼ遺伝子のＥｃｏＲＪ
、 Ｓａｌ ＩＩ析片の挿入されたｐＩＰＯ８ｔ−得た
６さらに、ｐＩＰＯ４をＥｃｏＲｌで切断し、自己連結
することによりｐ ｌＰＯ７を得た。（図２） これらのｐｒＰＯ２、ｐＩＰＯ３、ｐｌＰＯ４、ｐＩＰ
Ｏ５。
ＲＩと８ａｌｌで切断し、プラスばドＰＩＪＣ１８ｆｃ
＆ｏＲ［とＳｌ、１１で切断し几ものと連結反応を行
ってデａリンイｉノイプチダーゼ遺伝子のＥｃｏＲＪ
、 Ｓａｌ ＩＩ析片の挿入されたｐＩＰＯ８ｔ−得た
６さらに、ｐＩＰＯ４をＥｃｏＲｌで切断し、自己連結
することによりｐ ｌＰＯ７を得た。（図２） これらのｐｒＰＯ２、ｐＩＰＯ３、ｐｌＰＯ４、ｐＩＰ
Ｏ５。
ｐ ｌＰＯ７およびｐＩＰＯ８でそれぞれエシェリヒア
・コＩＪ ＪＭＲＢ味を形質転換し念珠を実施例１によ
って述べた方法でグロリンイばノペデテダーゼ活性検定
し九ところｐ Ｉ Ｐ ０４／ＪＭ８３株、！： ＰＩ
ＰＬ）５／ＪＭ８３株＃ｉ ｒｔｎの）ＩＢＩＯＩある
いｒｉ宿主株ＪＭ８３に比べ約２５倍の比活性を示した
（表２）、またｐＸＰＯ７／ＪＭ８３とｐＩＰＯ８／Ｊ
Ｍ８３の両法は製法と同じ活性であるところからプロリ
／イイノベデチダーゼ生成九関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡフラグメントは７ ｋｂ中のＰｍｔｌ−Ｂａｌｌあ
るいはＰｓＬＩ−８ｔｕｌ ４〜４．５ｋｂのフラグメ
ント中に存在することが明らかとなりた。ここに高いコ
ピー数にまでエクエリヒア・コリ内でｒｉｍ製・】１能
なｐＵＣベクターを用いることによって着清のデａリン
イミノペデチグーぜを生産するｐｌＰＯ５／ＪＭ８３菌
沫を造成することに成功した０本Ｉ株はＦεＲＭ−Ｐ
ｔｏ３３２として詳託されている。
・コＩＪ ＪＭＲＢ味を形質転換し念珠を実施例１によ
って述べた方法でグロリンイばノペデテダーゼ活性検定
し九ところｐ Ｉ Ｐ ０４／ＪＭ８３株、！： ＰＩ
ＰＬ）５／ＪＭ８３株＃ｉ ｒｔｎの）ＩＢＩＯＩある
いｒｉ宿主株ＪＭ８３に比べ約２５倍の比活性を示した
（表２）、またｐＸＰＯ７／ＪＭ８３とｐＩＰＯ８／Ｊ
Ｍ８３の両法は製法と同じ活性であるところからプロリ
／イイノベデチダーゼ生成九関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡフラグメントは７ ｋｂ中のＰｍｔｌ−Ｂａｌｌあ
るいはＰｓＬＩ−８ｔｕｌ ４〜４．５ｋｂのフラグメ
ント中に存在することが明らかとなりた。ここに高いコ
ピー数にまでエクエリヒア・コリ内でｒｉｍ製・】１能
なｐＵＣベクターを用いることによって着清のデａリン
イミノペデチグーぜを生産するｐｌＰＯ５／ＪＭ８３菌
沫を造成することに成功した０本Ｉ株はＦεＲＭ−Ｐ
ｔｏ３３２として詳託されている。
第１図はｐＩＰＯｌのプロリンイミノ（ブチｒ−ゼの遺
伝子の制限酵素池図 第２図はｐｌＰＯｌより各種プロリンイミノペデチダー
ゼ発現プラス°ミドの構築図。 特許出題人 味の素株式余社 ｓｔＩ ＼ ＼ ＼
伝子の制限酵素池図 第２図はｐｌＰＯｌより各種プロリンイミノペデチダー
ゼ発現プラス°ミドの構築図。 特許出題人 味の素株式余社 ｓｔＩ ＼ ＼ ＼
Claims (1)
- エシェリヒア属の有するプロリンイミノペプチダーゼを
コードする遺伝子を組み込んだプラスミドを含有するエ
シェリヒア属細胞を培養し、プロリンイミノペプチダー
ゼを採取することを特徴とするプロリンイミノペプチダ
ーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26556988A JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP26556988A JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02113887A true JPH02113887A (ja) | 1990-04-26 |
Family
ID=17418935
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26556988A Pending JPH02113887A (ja) | 1988-10-21 | 1988-10-21 | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02113887A (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994026882A1 (en) * | 1993-05-18 | 1994-11-24 | Quest International B.V. | Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
-
1988
- 1988-10-21 JP JP26556988A patent/JPH02113887A/ja active Pending
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1994026882A1 (en) * | 1993-05-18 | 1994-11-24 | Quest International B.V. | Proline iminopeptidase, process for its preparation and its use in the flavouring of food compositions |
| EP1911839A1 (en) | 2001-07-26 | 2008-04-16 | Ajinomoto Co., Inc. | Peptide-forming enzyme gene, peptide-forming enzyme, and dipeptide producing method |
| WO2008126783A1 (ja) | 2007-04-06 | 2008-10-23 | Kyowa Hakko Bio Co., Ltd. | ジペプチドの製造法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JPH05292951A (ja) | 安定化された組換えｄｎａ宿主細胞 | |
| JPH0665305B2 (ja) | 組換えｄｎａ含有宿主細胞の安定化法 | |
| EP0334841A1 (de) | Microorganismen and plasmide für die 2,4-dichlorphenoxyessigsäure (2,4-d)-monooxigenase - bildung und verfahren zur herstellung dieser plasmide und stämme. | |
| Pierce et al. | Large-scale preparation of ribulosebisphosphate carboxylase from a recombinant system in Escherichia coli characterized by extreme plasmid instability | |
| FR2484448A1 (fr) | Procede pour produire de la l-arginine par fermentation | |
| KR910005626B1 (ko) | 아세테이트 저생성 능력을 갖는 미생물 및 그것을 이용한 유용물질의 생성방법 | |
| JPS60199386A (ja) | ヤロウイア・リポリテイカの形質転換方法 | |
| JPH02113887A (ja) | プロリンイミノペプチダーゼをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるプロリンイミノペプチダーゼの製造法 | |
| CA1187430A (en) | Mutant strain of escherichia coli and its use for the preparation of glutathione | |
| US5374554A (en) | Microorganism and process for preparing D-biotin using the same | |
| JP2587764B2 (ja) | Ｎ−アシルノイラミン酸アルドラーゼの製造法 | |
| RU2153535C1 (ru) | Рекомбинантная плазмидная днк psav27, кодирующая синтез растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii, и бактериальный штамм escherichia coli - продуцент растворимого стрептавидина из streptomyces avidinii | |
| JPS58158197A (ja) | 発酵法によるイノシンの製造法 | |
| EP0187138A2 (de) | Mikroorganismus und Plasmid für konstitutive Creatinamidino-hydrolase-Bildung sowie Verfahren zur Herstellung derselben | |
| KR910001811B1 (ko) | 배지의 당분농도제어에 의한 외래유전자 발현제어방법 및 그에 따른 외래유전자 산물의 생산방법 | |
| Brenner et al. | Spectroscopic characterization of the alternate form of S-methylcoenzyme M reductase from Methanobacterium thermoautotrophicum (strain ΔH) | |
| JPS5928470A (ja) | バチルス・ズブチリス | |
| CN100374570C (zh) | 一种将穿梭质粒导入黄色短杆菌的电转化方法 | |
| RU2441916C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pACYC-LANS(KM), ШТАММ Escherichia coli BL21(DE3), ТРАНСФОРМИРОВАННЫЙ РЕКОМБИНАНТНОЙ ДНК pACYC-LANS(KM), И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ L-АСПАРАГИНАЗЫ Erwinia carotovora | |
| SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
| JPS62259589A (ja) | β―チロシナーゼ活性を有するＤＮＡ断片および形質転換された原核生物細胞 | |
| JPH02265480A (ja) | アミノペプチダーゼｎをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるアミノペプチダーゼｎの製造法 | |
| Mielenz et al. | Potential for genetic engineering for salt tolerance | |
| JPS60248198A (ja) | バチルス属細菌によるインタ−ロイキン−２の製造法 | |
| JPS633800A (ja) | 菌体外分泌による蛋白質の製造法 |