JPH02265480A - アミノペプチダーゼｎをコードする遺伝子を有する組換えｄｎａ及び該組換えｄｎａを有する細胞を用いるアミノペプチダーゼｎの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） この発明は遺伝子組換え法によるアミノペプチダーゼＮ
の製造法に関するものである。

（従来技術） アミノペプチダーゼＮについてはこれまでにエシェリヒ
ア属およびサルモネラ属にその存在が認められている。

　　（旧１１ｅｒ、Ｃ，＆Ｍａｃｋｉｎｎｏｎ＋に、＋
Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏ１．．１２０，３５５（１９７４
）　、　Ｙｏｓｈｉｍｏｔｏ、↑、。

Ｔａａ＋ｅｓａ＋Ｙ、、Ｇｕｓｈｉ＋に、、Ｍｕｒａｙ
ａｍａ、Ｎ、＆Ｔｓｕｒｕ、Ｄ、＋Ａｇｒｉｃ、Ｂｉｏ
ｌ　、Ｃｈｅ＋ｓ、　、　５２ｔ　２１７　（１９８Ｂ
）　、　ｎｉｌ　１ｅｒ＋　Ｃ，Ｇ、　、　＆Ｓｃｈｗ
ａｒｔｚ、Ｇ、　、　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　
１３５，６０３（１９７Ｂ））　　。

しかしながら、これらの従来より知られている微生物は
アミノペプチダーゼＮの生産能が極めて低いために、経
済的なアミノペプチダーゼＮの製造法としては不適であ
る。

（本発明が解決しようとする課題） 本発明が解決しようとする課題は遺伝子工学の手法を用
いてエシェリヒア属に属する微生物により経済的なアミ
ノペプチダーゼＮの製造法を提供することにある。

（課題を解決するための手段） 上述の課題を解決するために、本発明者らはデオキシリ
ボ核酸（以下ＤＮＡと記す）供与国としてエシェリヒア
・コリＨＢＩＯＩ菌を用い、これよりアミノペプチダー
ゼＮ生成に関与する遺伝情報を有するＤＮ＾を抽出し、
ついでこのアミノペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情
報を有するＤＮＡを組み込んだプラスミドを得て、この
プラスミドをエシェリヒア属の微生物に導入し、これら
の中妻りアミノペプチダーゼＮ活性の増強した組換え体
微生物を選択した。

本発明の微生物を用いることによって、従来の天然株を
用いる方法に比べて極めて高い収率でアミノペプチダー
ゼＮを生産できることを見出した。

すなわち、アミノペプチダーゼＮ活性を有する微生物は
いくつか知られており、！→１−騎これより染色体 ＤＮＡを常法により抽出しくＨ，５ａｉｔｏ　ａｎｄ　
Ｋ、Ｍｉｕｒａ＋Ｂｉｏｃｈｉｍ、Ｂｉｏｐｈｙａ、Ａ
ｃｔａ、−６１９（１９６３））常法により制限エンド
ヌクレアーゼで処理する。

我々の実験では制限エンドヌクレアーゼとしてＰｓｔｌ
を用いてアミノペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情報
を担うＤＮＡフラグメントを得たが、七の制限エンドヌ
クレアーゼ例えばＢａ嘗）Ｉ　Ｉ　、　５ａｔＩ、　Ｈ
ｉｎｄｌＩ、　　ＸｈｏＩなどを用いてもＰｓｔｌと同
様の結果が得られる可能性がある。

ベクターＤＮＡとしてはｐＢＲ３２２，ｐＵｃ１９など
のエシェリヒア・コリーのリラックスタイププラスミド
より得られたものならばどのようなものでもよい。この
ベクターにアミノペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情
報を担うＤＮＡフラグメントを組み込む方法は特定の方
法を要しない。

か（して得られたアミノペプチダーゼＮ生成に関与する
遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込んだプラス
ミドをエシェリヒア属の微生物に含有せしめる方法もま
た、従来知られているすべての形質転換方法が可能であ
る。

組換えプラスミドの受容菌としては、エシェリヒア属の
中でアミノペプチダーゼＮ活性をもたないものあるいは
弱いものを用いる方が、アミノペプチダーゼＮ生成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを組み込んだ
プラスミドを保有する形質転換株を選別、分離するのに
都合よい。

かくして得られたアミノペプチダーゼＮ生産菌を培養す
る方法は、従来のエシェリヒア属の培養方法と特に変ら
ない、すなわち培地としては炭素源、窒素源、無機イオ
ン、さらに必要に応じアミノ酸、ビタミン等の有機微量
栄養素を含有する通常のものである。

炭素源としてはグルコース、シェフロース等及びこれら
を含有する澱粉加水分解、糖蜜等が用いられる。窒素源
としてはアンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム
塩、その他が使用できる。

より好ましくはペプトン、トリプトン、肉エキス。

酵母エキス等の天然素材なども使われる。

培養は好気的条件下で培地のｐＦｌ及び温度を適宜調節
しつつ、実質的にアミノペプチダーゼＮの生成蓄積が最
高になるところまで行われる。

培養菌体よりアミノペプチダーゼＮを採取するには通常
以下のような方法が用いられる。

培養菌体を冷却遠心機等で集菌した後、適当なバッファ
ーに懸濁し、超音波あるいはダイノミルなどで菌体を破
砕して抽出液を得る。この菌体抽出液を硫安沈澱分画法
（好ましくは、塩析分画として硫安４０−８０％飽和画
分）　、ＤＢＡＩＥ−Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ（東ソー社製
）などのイオン交換クロマトグラフィーなどを行い、さ
らにハイドロキシアパタイトなどの吸着クロマトグラフ
ィーなどを行ってアミノペプチダーゼＮの精製標品を得
る。

以上、本発明の微生物を用いることにより、従来知られ
ているエシェリヒア・コリーのアミノペプチダーゼＮ生
産菌を用いる場合に比べ、単位蛋白質あたりの生産量が
極めて高いことにより、アミノペプチダーゼＮの分離・
精製の際に有利である。

またアミノペプチダーゼＮの用途としては、本酵素の基
質特異性が・・・−Ｘ−Ｐｒｏ−・・・（Ｘはｒ’ｒ。

以外のアミノ酸、）の必・の前までを切断し、Ｘ−Ｐｒ
ｏ・・・　なるペプチドを遊離するところから、リコン
ビナント法で先導蛋白質と目的蛋白質を連結した融合蛋
白質を蓄積せしめる場合に、先導蛋白質と目的蛋白質と
の間にＰｒｏを配置した融合蛋白質として蓄積せしめ、
先導蛋白質部分をアミノペプチダーゼＮにより切断し、
Ｎ末端にＸ　−Ｐｒ。

が付加した目的蛋白質を取得し、しかる後にアミノペプ
チダーゼＰおよびプロリンイミノペプチダーゼを作用さ
せることによりＮ末端の揃った目的蛋白質を取得するこ
となどに用いられる。（特願昭６３−６２８４　）　。

実施例１゜ エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩ　　（Ｂｏｙｅｒ、Ｈ，
Ｗ、ｅｔｌ！１．。

Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、４１．４５９（１９６９）　）をア
ミノペプチダーゼＮを生産する原株として、次のような
方法でアミノペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情報を
担うＤＮＡフラグメントを分離し、新規に著量のアミノ
ペプチダーゼＮを生産する菌を造成した。

（１）染色体１）ＨＡの調製 エシェリヒア・コリＨＢＩＯＩを４００＋ｊ！のし培地
（トリプトン１％、酵母エキス０．５％、ＮａＣ１０，
５％、グルコース０．１％、ｐＨ７，２に調整）中３７
°Ｃで約３時間振盪培養を行い、対数増殖期の菌体を集
菌後フェノール法による通常のｔｌＮＡｌＮ法（Ｈ，５
ａｉｔｏ　ａｎｄ　Ｋ、Ｍｉｕｒａ、ＢｉｏｃｈｉＩＩ
＋、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ。

７２．６１９（１９６３））　ニヨッテ染色体０Ｆ４Ａ
ヲ抽出精！ｌ、最終２０■を得た。

（２）染色体ＤＮＡ断片のベクターへの挿入（１）で得
た染色体ＤＮＡおよびベクターｐＢＲ３２２（タカラ市
販品）の各１０μｇをとり、各々に制限エンドヌクレア
ーゼの１種、ＰｓｔＩを３７℃、１時間作用させてＤＩ
ＪＡ　ｔＸを切断した。次に各々をフェノール処理、ク
ロロホルム処理後、エタノール沈澱回収し、両ＤＮＡ切
断物を１ｍＭＡＴＰ及び１０５Ｍジチオスレイトール、
６．６ｍＭＭｇＣ１ｇを含む６６ｗＭＴｒｉｓ−ＩＣＥ
、ｐｉ（７，５中で？、　［ｌＮＡリガーゼ（タカラ）
１００ユニット共に混合し、混合物を４℃、−昼夜反応
させた。

（３）コンピテント細胞の調製 エシェリヒア・コリＤＨＩ　（Ｌｏｗ、Ｂ、、Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、６０，１６０（１９６８））を５
０ｍｊ！のし培地に接種し、培養液の６５０ｍμにおけ
る吸光度がおよそ０．４〜０．５になるまで３０℃で振
盪培養した。

培養終了後、培養液を０°Ｃにて２０分間放置し、次に
菌体を遠心分離により集め、５０ｍＭ　ＣａＣｆ！ｚ溶
液２５ＩＩＩｆｆｉに懸濁し、０℃に１時間放置後、遠
心分離により菌体を集め、５０ａ＋Ｍ　Ｃａ（／！ｚと
２０％グリセロール溶液５　ｍｌに菌体を再び懸濁し、
得られた菌体懸濁液を０．５−ずつエッベンドルフチェ
ーブに入れ、−７０℃にて凍結保存した。

（４）形質転換と形質転換株の取得 （３）で調製したコンピテント細胞懸鵠液２００μｉに
（２）で調製したＤＮＡ溶液を加え、０°Ｃ，３０内に
取込ませた。

次に、この懸濁液にＬ培地を１　ａｊ２加え、３７°Ｃ
で１時間培養を行った後、テトラサイクリン２０μｇ／
ｄを含有するし培地寒天プレートに塗抹し３７°Ｃで１
晩インキユベートした。出現したコロニーを今度はアン
ピシリン２５μｇ／ｍｌを含有するし培地寒天プレート
にそれぞれ塗抹し、３７℃で一晩インキエベートし生育
の有無を検定し、テトラサイクリンを含む培地では生育
するがアンピシリンを含む培地では生育しないコロニー
をアミノペプチダーゼＮ生産を検定する候補株としてｐ
ｉｃｋ　ｕｐ　Ｌｔだ。

（５）アミノペプチダーゼＮ生産の検定（４）でｐｉｃ
ｋ　ｕｐ　した約１０００コロニーの検定候補株をそれ
ぞれテトラサイクリン２０μｇ／ｍｌを含むＬ−培地３
００μｌに植菌（９６穴プレート使用）し、３０℃で２
４時間培養した。

この培養液の菌体懸Ｓ液０．１ｉ＋ｊ！に、２０１Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｆ　（ｐ）Ｉ　８．５　）を０．８ｏ＋４２
加え、さらに基質である５ｍＭＬｅｕ−β−Ｎａｐｈｔ
ｙｌａｎ＋ｉｄｅをｏ、　ｉ　＊加えて、３７℃で５分
間反応させた０反応後この反応液に０．５　ｄのＦａｓ
ｔ　Ｇａｒｎｅｔ　ＧＢＣ（１０％トリトンＸ−１００
を含む１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ４，０）に溶かして０．１
％としたもの）を加え、不溶物を遠心する事により除い
た後、上清のアゾ色素（赤色）の生成量を５５０ｎｍの
吸収で測定した。その結果、原株のＨＢＩＯＩの対照に
比べ約１０倍程活性の強い候補株が得られた。

この候補株について、さらに無細胞抽出物レベルでの酵
素活性を検討するために以下の実験を行った。

２０μｇ／ｄのテトラサイクリンを含むし一培地の１０
０ｄの入った坂ロフラスコに植菌し３０°Ｃで一晩振盪
培養し、培養終了後集菌し２０　ｍＭＴｒｉｓ−ｌ１Ｃ
ｆｆｉ　、　ｐｉ（８，５溶液に懸濁し、０゛Ｃで超音
波破砕し遠心により抽出液を得た。この細胞抽出液を用
いて次のようにアミノペプチダーゼＮの活性を測定した
。

２０＋ｎＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣｊ！、　ｐｌ（８，５の
１−と細胞抽出液の０．２５　ｊｔｆと１ｍＭのＬｅｕ
−βＮａｐｈｔｈｙｌａｍｉｄｅのｏ、、１ＩＩｉとを
混合し、３０″Ｃで１０分間反応した。

そして１Ｍ酢酸バッファー、ｐＨ４，０と１０％のＴｒ
ｉｔｏｎ　　Ｘ　　Ｉ　ＯＯからなる溶液中１ｍｇ／ｄ
の濃度でＰａ５ｔ　Ｇａｒｎｅｔ　ＧＢＣを含む試薬を
０．５−加えて発色させた。この赤色度を５５０ｎｍの
吸収で測定した。

その結果、表１に示すように原株ＨＢＩＯＩおよび宿主
株ＤＨＩに比し約８倍の比活性の上昇が認められた。ま
た、この組換え菌株をｐＡＮ　１／ＤＨＩと命名した。

なお、本菌株はＦＥＲＭ−Ｐ１０３３１として寄託され
ている。

また酵素活性、すなわちユニットは として表わした。

表 ７Ｊ （６）ｐ汁０１の挿入ＤＮＡ部分の制限酵素地図アミノ
ペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフ
ラグメントを含むプラスミドｐＡＮ　１は常法により調
製された（　Ｔ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ａｔ　ａｌ、＋Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　　Ｃｌｏｎｉｎｇ　　、　　ｐ９３
（１９８２）、　　Ｃｏ１ｄ　　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　）　＊そして主として６
塩基配列を認識する制限酵素での切断により制限酵素地
図を作製したところ図１に示すような切断部位を有する
ことが分った。

またＰｓｔｌで切り出した挿入部分はほぼ７ｋｂの大き
さであった。

実施例２ 次にｐＡＮ　１の７ｋｂの挿入フラグメントを短縮化す
るために以下のような検討を行った。

先ずｐＡＮ　１より７ｋｂのＰｓｔｌフラグメントを切
り出し、プラスミドｐＵｃ１９のＰｓｔＩサイトに挿入
しｐＡＮ　２を構築した（図２）。すなわち、ｐＡＮ　
１２０μｇを制限酵素Ｐｓｔ［で切断し、この反応液を
エチジウムブロマイドを含む０．９％アガロースゲル電
気泳動により４．４　ｋｂと７ｋｂの２つのフラグメン
トを分離し、７ｋｂフラグメントのゲルを切り出した。

このゲルを透析チューブに入れ電気的に透析チューブ中
の９　Ｑｍ？Ｉ　Ｔｒｉｓ−ホウ酸バッファーｐＨ７，
５に溶出させ、フェノール処理、クロロホルム処理を行
い、エタノール沈澱として７ｋｂのフラグメントを５μ
ｇ回収した。そしてこの７ｋｂフラグメントとＰｓｔｌ
で切断したプラスミドｐＵｃ１９と連結反応を行い図２
に示したＧＩＡＮ　２を選択した。

次にｐＡＮ２をＢａｔａＨＩで切断し、そのまま再び連
結反応を行い、アミノペプチダーゼＮ遺伝子部分が若干
小さくなったｐＡＮ　３を得た（図２）、同じようにＧ
）ＡＮ　２を５ａｉｌあるいはＳｔｕ［とＳｗａ　Ｉで
切断して再連結反応を行いアミノペプチダーゼＮ遺伝子
を短縮化したρＡＮ４．ｐＡＮ５をそれぞれ得た（図２
）。

また、先に得た７ｋｂのＰｓｔｌフラグメントをＥｃｏ
ＲＩと５ａｌｔで切断し、プラスミドｐｔｌｃ１８をＥ
ｃｏＲＩと５ａｉｌで切断したものと連結反応を行って
アミノペプチダーゼＮ遺伝子のＥｃｏＲＩ　、　　Ｓａ
ｌ　Ｉ断片の挿入されたｐＡＮ　８を得た。さらに、ｐ
ＡＮ　４をＩ！ｃｏＲＩで切断し、自己連結することに
よりｐＡＮ７を得た。（図２） これらのｐＡＮ　２　、　　ｐＡＮ　３　、　　ｐＡＮ
　４　、　　ｐＡＮ　５　。

ｐＡＮ　７およびｐＡＮ　８でそれぞれエシェリヒア・
コリＪＭ８３株を形質転換した株を実施例１によって述
べた方法でアミノペプチダーゼＮ活性検定したところｐ
ＡＮ４／Ｊ月８３株とｐＡＮ　５　／ＪＭ８３株は原株
のＨＢＩＯＩあるいは宿主株ＪＭ８３に比べ約２５倍の
比活性を示した（表２）、またｐＡＮ７／ＪＭ８３とｐ
ＡＮ　８／ＪＭ８３の両株は原株と同じ活性であるとこ
ろからアミノペプチダーゼＮ生成に関与する遺伝情報を
（旦うＤＮＡフラグメントは７ｋｂ中のＰｓｔ　Ｉ　−
Ｓａｌ　ＩあるいはＰｓｔ　Ｉ　−Ｓｔｕ　Ｉ　４〜４
．５　ｋｂのフラグメント中に存在することが明らかと
なった。ここに高いコピー数にまでエシェリヒア・コリ
内で複製可能なｐＵＣベクターを用いることによって著
量のアミノペプチダーゼＮを生産するｐＡＮ５／ＪＭ８
３菌株を造成することに成功した。本菌体はＦＥＲ？１
−Ｐ１０３３２として寄託されている。

【図面の簡単な説明】

第１図はρＡＮＩのアミノペプチダーゼＮの遺伝子の制
限酵素地図 第２図はｐＡＮ　ｌより各種アミノペプチダーゼＮ発現
プラスミドの構築図。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. エシェリヒア属の有するアミノペプチダーゼＮをコード
   する遺伝子を組み込んだプラスミドを含有するエシェリ
   ヒア属細胞を培養し、アミノペプチダーゼＮを採取する
   ことを特徴とするアミノペプチダーゼＮの製造法。