JPH02231085A - ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子 - Google Patents
ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子Info
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- JPH02231085A JPH02231085A JP5069989A JP5069989A JPH02231085A JP H02231085 A JPH02231085 A JP H02231085A JP 5069989 A JP5069989 A JP 5069989A JP 5069989 A JP5069989 A JP 5069989A JP H02231085 A JPH02231085 A JP H02231085A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
この発明は遺伝子組換え法によるγ−グルタミルトラン
スベプチダーゼ（ＧＧＴ）の製造法に関するものである
。
スベプチダーゼ（ＧＧＴ）の製造法に関するものである
。
（従来技術）
細菌のＧＯＴに関しては多《の報告があり、生産を目的
としたものとしては本発明者らにより見いだされたＰｒ
ｏ ｔｅｕｓ属細菌を用いる方法（蛋白質核酸酵素、３
３巻、１５４５、１９８Ｂ）がある。しかしながら、従
来より知られている方法は工業的な製造法としては未だ
生産性が低かった。
としたものとしては本発明者らにより見いだされたＰｒ
ｏ ｔｅｕｓ属細菌を用いる方法（蛋白質核酸酵素、３
３巻、１５４５、１９８Ｂ）がある。しかしながら、従
来より知られている方法は工業的な製造法としては未だ
生産性が低かった。
（本発明が解決しようとする問題点）
本発明が解決しようとする課題は遺伝子工学の手法を用
い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ属に属する微生物により経
済的なＧＧＴの製造法を提供することにある。
い、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｔａ属に属する微生物により経
済的なＧＧＴの製造法を提供することにある。
Ｅ． ｃｏｌｔ組換え体を用いるＧＧＴの大量生産に関
しては、本発明者らが種々検討してきた（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１５０．３３．１９８８ ）が、本発明で初めて
、本酵素に関連するポリペプチドをコードする遺伝子の
塩基配列を明かにした。
しては、本発明者らが種々検討してきた（Ｂｉｏｃｈｅ
ｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕ
ｎ．，１５０．３３．１９８８ ）が、本発明で初めて
、本酵素に関連するポリペプチドをコードする遺伝子の
塩基配列を明かにした。
（課題を解決するための手段）
上述の課題を解決する為に、本発明者らは以下の検討を
行った。まずＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２のＧＧＴが低温
（２０℃）培養で高生産されるとともに、本酵素がｐｅ
ｒｉｐｌａｓｍｉｃ部位に局在することを見いだし（Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．． １６８． １３３２＋ １
９８６）、これを結晶状に単離しその性質を明かにした
（Ｊ ． Ｂａｃ ｔｅｒ−ｉｏ１．， １６８， １
３２５． １９８６）。更に、ＧＧＴ欠損変異株を誘導
し、ＧＧＴをコードする遺伝子（ＩＬ±）の染色体上で
の座位（染色体上７６分の一邦僅一と＝（ｎ伊一の間）
を明らかにした（Ｊ．Ｂａｃｔ− ｅｒｉｏｌ．，１６
９， ３９２６． １９８７）。次に目的とするＣＧＴ
をコードする遺伝子の近傍の遺伝子をのせているブラス
ミドを含む菌株をＣｌａｒｋｅ−Ｃａｒｂｏｎのコロニ
ーバンクから検索し、これらの中よりＧＧＴ活性の増強
した組換え体を選択した。さらに、本プラスミドをサブ
クローン化することにより、ＧＧＴ活性が更に増強され
た組換え体を得た（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．，１５０，３３．
１９８８ ） ．次に、本プラスミド上に存在するｇｇ
ｔ挿入部の塩基配列をＭ−１３ファージを用いたジデオ
キシヌクレオシド鎖終結法により決定した。
行った。まずＥ． ｃｏｌｉ Ｋ−１２のＧＧＴが低温
（２０℃）培養で高生産されるとともに、本酵素がｐｅ
ｒｉｐｌａｓｍｉｃ部位に局在することを見いだし（Ｊ
．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．． １６８． １３３２＋ １
９８６）、これを結晶状に単離しその性質を明かにした
（Ｊ ． Ｂａｃ ｔｅｒ−ｉｏ１．， １６８， １
３２５． １９８６）。更に、ＧＧＴ欠損変異株を誘導
し、ＧＧＴをコードする遺伝子（ＩＬ±）の染色体上で
の座位（染色体上７６分の一邦僅一と＝（ｎ伊一の間）
を明らかにした（Ｊ．Ｂａｃｔ− ｅｒｉｏｌ．，１６
９， ３９２６． １９８７）。次に目的とするＣＧＴ
をコードする遺伝子の近傍の遺伝子をのせているブラス
ミドを含む菌株をＣｌａｒｋｅ−Ｃａｒｂｏｎのコロニ
ーバンクから検索し、これらの中よりＧＧＴ活性の増強
した組換え体を選択した。さらに、本プラスミドをサブ
クローン化することにより、ＧＧＴ活性が更に増強され
た組換え体を得た（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．，１５０，３３．
１９８８ ） ．次に、本プラスミド上に存在するｇｇ
ｔ挿入部の塩基配列をＭ−１３ファージを用いたジデオ
キシヌクレオシド鎖終結法により決定した。
本発明の微生物を用いることによって、従来の天然株を
用いる方法に比べて極めて高い収率でＧＧＴを生産でき
ることを見いだした。すなわち、ＧＧＴを有する微生物
は種々知られており（蛋白質 核酸 酵素、３３巻、１
５４５、１９８８） 、これより染色体ＤＮＡを常法に
より抽出することにより（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ． Ａｃｔａ，７２， ６１９． １９６３）、
あるいは本酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドよ
り常法により制限酵素で処理すればよい。我々の実験で
は、制限酵素ＢｇｌｌＩを用いることによりＧＧＴ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを得たが
、他の制限酵素、例えばＢａｍＨ Ｉ ，Ｐｓｔ Ｉ，
Ｓａｔ Ｉ， Ｈｉｎｄｌ［， ＥｃｏＲ１等を用
いてもＢｇＩ ｎと同様の結果が得られる可能性がある
。
用いる方法に比べて極めて高い収率でＧＧＴを生産でき
ることを見いだした。すなわち、ＧＧＴを有する微生物
は種々知られており（蛋白質 核酸 酵素、３３巻、１
５４５、１９８８） 、これより染色体ＤＮＡを常法に
より抽出することにより（Ｂｉｏｃｈｉｍ． Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ． Ａｃｔａ，７２， ６１９． １９６３）、
あるいは本酵素をコードする遺伝子を含むプラスミドよ
り常法により制限酵素で処理すればよい。我々の実験で
は、制限酵素ＢｇｌｌＩを用いることによりＧＧＴ生成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラグメントを得たが
、他の制限酵素、例えばＢａｍＨ Ｉ ，Ｐｓｔ Ｉ，
Ｓａｔ Ｉ， Ｈｉｎｄｌ［， ＥｃｏＲ１等を用
いてもＢｇＩ ｎと同様の結果が得られる可能性がある
。
ベクターＤＮＡとしてはｐＵｃ １Ｂ． ｐＵＣ １９
， ｐＢＲ３２２等の他、発現可能であるならばいずれ
のプラスミドより得られたものでも構わない。このベク
ターにＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラ
グメントを組み込む方法は特定の方法を要しない。かく
して得られたＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａフラグメントを組み込んだブラスミドをエシエリヒア
属の微生物に含有せしめる方法も、また従来知られてい
る全ての形質転換方法が可能である。
， ｐＢＲ３２２等の他、発現可能であるならばいずれ
のプラスミドより得られたものでも構わない。このベク
ターにＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡフラ
グメントを組み込む方法は特定の方法を要しない。かく
して得られたＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａフラグメントを組み込んだブラスミドをエシエリヒア
属の微生物に含有せしめる方法も、また従来知られてい
る全ての形質転換方法が可能である。
組替えプラスミドの受容菌としては、エシエリヒア属の
中でＧＧＴ活性を持たないもの、あるいは弱いものを用
いる方が、ＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ
フラグメントを組み込んだプラスミドを保有する形質転
換株を選別あるいは分離するのに都合よい。
中でＧＧＴ活性を持たないもの、あるいは弱いものを用
いる方が、ＧＧＴ生成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ
フラグメントを組み込んだプラスミドを保有する形質転
換株を選別あるいは分離するのに都合よい。
かくして得られたＧＧＴ生産菌を培養する方法は、従来
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属によるＧＧＴ生産のための
培養と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素源
、窒素源、無機イオン、更に必要に応じてアミノ酸、ビ
タミンの有機微量元素源等を含有する通常のものである
。
のＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属によるＧＧＴ生産のための
培養と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素源
、窒素源、無機イオン、更に必要に応じてアミノ酸、ビ
タミンの有機微量元素源等を含有する通常のものである
。
炭素源としては、グルコース、シュークロース、糖蜜、
澱粉加水分解物、・澱粉等のＩｌ！質、フマール酸、ク
エン酸等の有機酸等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、硫安等のアンモニウム塩
、硝安等の硝酸塩等の他、ペブトン、トリプトン、酵母
エキス、肉エキス等の有機窒素源が使われる。無機イオ
ンとしては通常Ｐ源としての燐酸塩、Ｓ源としての硫酸
塩、微量元素としての鉄イオン、マンガンイオン等を含
む塩等が使われる。
澱粉加水分解物、・澱粉等のＩｌ！質、フマール酸、ク
エン酸等の有機酸等が用いられる。窒素源としては、ア
ンモニアガス、アンモニア水、硫安等のアンモニウム塩
、硝安等の硝酸塩等の他、ペブトン、トリプトン、酵母
エキス、肉エキス等の有機窒素源が使われる。無機イオ
ンとしては通常Ｐ源としての燐酸塩、Ｓ源としての硫酸
塩、微量元素としての鉄イオン、マンガンイオン等を含
む塩等が使われる。
培養は好気的条件下で培地のｐｏおよび温度を適，宜調
節しつつ、実質的にＧＧＴの生成が最高になるところま
で行われる。培養菌体よりＧＧＴを採取する方法は通常
の方法を用いれば良い。
節しつつ、実質的にＧＧＴの生成が最高になるところま
で行われる。培養菌体よりＧＧＴを採取する方法は通常
の方法を用いれば良い。
以上、本発明微生物を用いることにより、従来知られて
いるＧＧＴ生産菌を用いる場合に比べ、単位あたりの生
産量が極めて高い。
いるＧＧＴ生産菌を用いる場合に比べ、単位あたりの生
産量が極めて高い。
また、ＧＧＴの用途としては、医薬として有用なγ−グ
ルタミルドーパ等のγ−グルタミル化合物の生産に利用
される。
ルタミルドーパ等のγ−グルタミル化合物の生産に利用
される。
実験例１
以下のようにして、著量の一〇〇Ｔを生産する菌株を造
成した。（Ｃ，ＧＴをコードする遺伝子ののったブラス
ミドを含む菌株の選出） Ｅ．ｃｏ−Ｉｔ Ｋ１２の染
色体ＤＮＡの断片をＣｏｌＥ１プラスミドにクローニン
グしたｐＬＣプラスミドを保有するＣｌａｒｋｅ−Ｃａ
ｒｂｏｎのコロニーバンクの菌株の中より、ｐＬＣプラ
スミド上に７６分付近の遺伝子をのせていることが知ら
れている８つの菌株についてＧＧＴ活性を調べ、１がプ
ラスミド上にのっている株としてＳＨ ２０９株（プラ
スミドｐＬＣ９−１２）を選出した（親株のＧＧＴ活性
を１００とすると選出株は１４４０の活性を有していた
） （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｙｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．， １５０， ３３． １９
８８ ） ．本菌はＦＥＲＭ−Ｐとして寄託されている
。
成した。（Ｃ，ＧＴをコードする遺伝子ののったブラス
ミドを含む菌株の選出） Ｅ．ｃｏ−Ｉｔ Ｋ１２の染
色体ＤＮＡの断片をＣｏｌＥ１プラスミドにクローニン
グしたｐＬＣプラスミドを保有するＣｌａｒｋｅ−Ｃａ
ｒｂｏｎのコロニーバンクの菌株の中より、ｐＬＣプラ
スミド上に７６分付近の遺伝子をのせていることが知ら
れている８つの菌株についてＧＧＴ活性を調べ、１がプ
ラスミド上にのっている株としてＳＨ ２０９株（プラ
スミドｐＬＣ９−１２）を選出した（親株のＧＧＴ活性
を１００とすると選出株は１４４０の活性を有していた
） （Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｂｙｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎ．， １５０， ３３． １９
８８ ） ．本菌はＦＥＲＭ−Ｐとして寄託されている
。
（サブクローニング株の取得）
ＳＨ ２０９は大量のＧＧＴを生産したが、更にこの菌
株よりρＬＣ９−１２を抽出し、』ＬＩＩで切断するこ
とによりＧＧＴをコードする遺伝子を含むフラグメント
を得、ｐｕｃ １８のＢａｍＨＩ部位で連結することに
よりｐＳＨ １０１を取得した（第１図）。更にこのｐ
ｓｌ＋ １０１をＪＭ−１０９にトランスホームし、Ｇ
ＧＴ活性の高い株としてＳＨ−６２７を取得した（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｃｅａｒｃｈ Ｃ
ｏｍｍｕｎ．＋ １５（Ｌ３３＋ １９８９）。
株よりρＬＣ９−１２を抽出し、』ＬＩＩで切断するこ
とによりＧＧＴをコードする遺伝子を含むフラグメント
を得、ｐｕｃ １８のＢａｍＨＩ部位で連結することに
よりｐＳＨ １０１を取得した（第１図）。更にこのｐ
ｓｌ＋ １０１をＪＭ−１０９にトランスホームし、Ｇ
ＧＴ活性の高い株としてＳＨ−６２７を取得した（Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ． Ｒｅｃｅａｒｃｈ Ｃ
ｏｍｍｕｎ．＋ １５（Ｌ３３＋ １９８９）。
実施例１
ｐｉ，ｃ ９−１２のエエエ挿入部の塩基配列を決定し
た．塩基配列はＭ−１３ファージ（Ｊ． Ｍｅｓｓｉ゛
ｎｇ ｅｔａｌ．， Ｇｅｎｅ． １９， ２６９．
１９８２）を使ったジデオキシヌクレオチド鎖終結法（
Ｆ． Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａ＋．， Ｐｒｏｃ，Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７
４， ５４６３． １９７７）により決定した。決定さ
れた塩基配列およびアミノ酸配列を第１図に示した。こ
こに決定された大小各サブユニットのＮ末端対応部位は
、精製各サブユニットのＮ末端分析より（ｉ１！認した
。
た．塩基配列はＭ−１３ファージ（Ｊ． Ｍｅｓｓｉ゛
ｎｇ ｅｔａｌ．， Ｇｅｎｅ． １９， ２６９．
１９８２）を使ったジデオキシヌクレオチド鎖終結法（
Ｆ． Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａ＋．， Ｐｒｏｃ，Ｎａ
ｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．， Ｕ．Ｓ．Ａ．， ７
４， ５４６３． １９７７）により決定した。決定さ
れた塩基配列およびアミノ酸配列を第１図に示した。こ
こに決定された大小各サブユニットのＮ末端対応部位は
、精製各サブユニットのＮ末端分析より（ｉ１！認した
。
手続補正書
第ｌ図は、ｒ−グルタミルトランスベプチダーゼをコー
ドする遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図
示したものである．
ドする遺伝子の塩基配列及び対応するアミノ酸配列を図
示したものである．
Claims (6)
- （１）γ−グルタミルトランスペプチダーゼをコードす
る遺伝子（￥ｇｇｔ￥）に関与する、２５アミノ酸より
なるリーダーペプチドおよび３６５アミノ酸よりなる大
サブユニット、および１９０アミノ酸よりなる小サブユ
ニットのポリペプチドをコードする遺伝子。 - （２）￥ｇｇｔ￥の２５アミノ酸よりなるリーダーペプ
チドをコードする第１請求項記載の遺伝子。 - （３）￥ｇｇｔ￥の３６５アミノ酸よりなる大サブユニ
ットのペプチドをコードする第１請求項記載の遺伝子。 - （４）￥ｇｇｔ￥の１９０アミノ酸よりなる小サブユニ
ットのペプチドをコードする第１請求項記載の遺伝子。 - （５）遺伝子が下記の塩基配列を有するものである特許
請求の範囲第１項の遺伝子。 - （６）遺伝子が下記のアミノ酸配列に対応する塩基配列
を有するものである第１請求項記載の遺伝子。 【遺伝子配列があります。】
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5069989A JPH02231085A (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5069989A JPH02231085A (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02231085A true JPH02231085A (ja) | 1990-09-13 |
Family
ID=12866153
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5069989A Pending JPH02231085A (ja) | 1989-03-01 | 1989-03-01 | ｒ―グルタミルトランスペプチダーゼをコードする遺伝子 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH02231085A (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013051685A1 (ja) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | 味の素株式会社 | 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法 |
| WO2014025023A1 (ja) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | 味の素株式会社 | γ－グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法 |
-
1989
- 1989-03-01 JP JP5069989A patent/JPH02231085A/ja active Pending
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013051685A1 (ja) | 2011-10-07 | 2013-04-11 | 味の素株式会社 | 変異型γ－グルタミルトランスフェラーゼ、及び、γ-グルタミルバリルグリシン又はその塩の製造法 |
| US9580696B2 (en) | 2011-10-07 | 2017-02-28 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing γ-glutamylvalylglycine or a salt thereof |
| US9677106B2 (en) | 2011-10-07 | 2017-06-13 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing gamma-glutamylvalylglycine or a salt thereof |
| WO2014025023A1 (ja) | 2012-08-10 | 2014-02-13 | 味の素株式会社 | γ－グルタミルバリルグリシン結晶の製造方法 |
| US9512177B2 (en) | 2012-08-10 | 2016-12-06 | Ajinomoto Co., Inc. | Method for producing γ-glutamyl-valyl-glycine crystal |
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