JPH09173078A - 分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法 - Google Patents

分子シャペロンを用いる蛋白質の製造方法

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JPH09173078A
JPH09173078A JP8228252A JP22825296A JPH09173078A JP H09173078 A JPH09173078 A JP H09173078A JP 8228252 A JP8228252 A JP 8228252A JP 22825296 A JP22825296 A JP 22825296A JP H09173078 A JPH09173078 A JP H09173078A
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protein
gene encoding
molecular chaperone
cell
gene
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Tadayuki Imanaka
忠行 今中
Masahiro Takagi
昌宏 高木
Katsunori Koda
勝典 幸田
Tomoko Kubomi
朋子 久保見
Yan Tsuen
ヤン ツェン
Shinsuke Fujiwara
伸介 藤原
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 細菌菌体内で、目的の蛋白質を不溶化するこ
となく発現させること。 【解決手段】 第一のプロモーターに分子シャペロンを
コードする遺伝子が作動可能に結合した配列と、第二の
プロモーターを有し、該第二のプロモーターの下流に該
目的の蛋白質をコードする遺伝子を組み込んだ発現ベク
ターで形質転換することにより、分子シャペロンと目的
蛋白質を同時に発現させて、目的の蛋白質を不溶化させ
ずに、細菌菌体内で生産させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本願発明は、細胞内で、分子
シャペロン遺伝子を用いて目的の蛋白質を効率よく生産
させる方法に関する。さらに詳しくは、従来、細菌菌体
内で、不溶性かつ不活性の蛋白質として発現されていた
蛋白質を、不溶化させることなく発現させる方法、その
方法に用いる発現カセット、発現ベクター、および形質
転換株に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞はそれぞれの環境下で生長・生存す
るが、必ずしも常にそれらの至適条件下に置かれるとは
限らない。温度変化などさまざまなストレスにさらされ
ることもある。細胞は例えば高温のストレスにさらされ
た時、そのストレスに対応するために、ヒートショック
タンパクプロテイン（heat shock protein:以下、HSPと
いう）と呼ばれる特殊なタンパク質の一群を多量に生産
する（Ellis, R.J.ら、(1990) Molecular Chaperons: T
he plant connection. Science 250: 954-959）。このH
SPは、分子シャペロンと呼ばれ、細胞内に構成的に発現
している。この分子シャペロンは細胞内においてタンパ
ク質の高次構造の形成・維持、タンパク質の膜透過、細
胞周期の調節、個体の発生・分化、免疫系など多くの生
物種に共通する生理機能に関与していることが明らかに
されてきた。（Zeilstra-Ryalls,J., O. Fayet および
C.Georgo. (1991) The universally conserved GroE(Hs
p60) chaperonins. Annu. Rev. Microbiol. 45: 301-32
5、Ellis, R.J.ら、(1991)Molecular Chaperons. Annu.
Rev. Biochem. 60: 321-347）。HSPはその分子量など
から、以下に示すような５つのファミリーに分けられ
る。
【０００３】 １．HSP60（シャペロニン）ファミリー GroEL、Hsp60、Cpn60 ２．Hsp70ファミリー DnaK、Hsp70、Bip ３．Hsp90ファミリー HtpG、Hsp90、Grop94 ４．TRiCファミリー TF55、TRiC（TCP1） ５．その他のファミリー GroES、Hsp28、Hsp45 最近、これらHSPの中に、in vitroでもタンパク質の立
体構造・高次構造形成を助ける働きをもつものが存在す
ることが明らかになり、その構造と機能発現への関心が
高まってきた。タンパク質の立体構造および構造変化に
関与するタンパク質の一つにGroELがある。このGroELは
サブユニット分子量１万のGroESとともに、in vivo、in
vitroを問わずさまざまなタンパ質の立体構造形成反応
を手助けすることが明らかになりつつある。GroELは、
７個のサブユニットが環状になった、「ドーナツ型」が
二段に積み重なった「ダブルドーナツ型」で合計１４量
体からなる特徴的な四次構造を形成しており、ATPase活
性を有している。GroESも７量体でGroELと同様、「ドー
ナツ型」をしていると考えられている。in vivoではこ
の１４量体のGroELと７量体のGroESとがさらに１対１の
複合体を形成し、GroEタンパク質として機能している
（図19：河田康志 BIO VIEW(1993))。シャペロニンタ
ンパク質の中で、タンパク質の構造形成に関する研究が
最もよくなされているのがこのGroEタンパク質である。
真核生物ではｔ-コンプレックスポリペプチド−１（TCP
1）と呼ばれるタンパク質がin vitroでATPに依存したア
クチンやチューブリンなどの構造形成を促進することが
示された（Gaoら、(1992) Acytoplasmic chaperonin th
at catalyzes β-actin folding. Cell 69: 1043-105
0、Yaffeら、(1992) TCP1 complex is a molecular cha
peron tubulin biogenesis. Nature 358: 245-248）。
また最近、超好熱始原菌にもTCP1類似の分子シャペロン
（TF55)が存在することも報告されている（Jonathern
D.ら、(1991) A molecular chaperon from thermophili
c archaebacterium is related to the eukaryotic pro
tein t-complex polypeptide-1. Nature 354: 490-49
3）。
【０００４】好熱菌では高温環境に耐えるために全生体
高分子が安定化されている。従って、好熱菌由来のタン
パク質はポリメラーゼ連鎖反応（PCR)をはじめとして、
バイオセンサーなど広い分野にわたって応用が進められ
ている（Saikiら、(1988) Primer-directed enzymatic
amplification of DNA with a thermostable DNA polym
erase. Science 239: 487-491、Kagawaら、(1989) Biot
echnological applications of thermophilic ATP synt
hetase. membrane electronics and genetics.J. Membr
ane Sci. 41: 237-247）。好熱菌及び超好熱始原菌由来
の分子シャペロンも非常に高い安定性を有していると考
えられ、タンパク質の高次構造形成メカニズムの研究を
含め人工的にタンパク質の高次構造形成あるいは再生を
行わせるのに非常に有用であると考えられる。
【０００５】ところで、遺伝子組換えの分野において
は、目的とする蛋白質を大量に生産させ、かつ容易に回
収するために、増殖が早く、取り扱いが簡単な細菌を宿
主とする場合が多い。
【０００６】しかし、細菌で発現される異種蛋白質は、
例えば、インクルージョンボディなどの不溶性のかつ不
活性の蛋白質として発現されることが多い。また、細菌
で機能する異種プロモーターを用いる場合にも、不溶性
の蛋白質として発現されることがある。そして、回収し
た不溶性の蛋白質を、種々の手段で、例えば、不溶性の
蛋白質が耐熱性酵素である場合、加熱処理を加えること
により、その耐熱性酵素を可溶化および活性化する方法
が試みられている。しかし、その回収率は良好ではな
い。そこで、細菌内で、目的の蛋白質を不溶化させるこ
となく発現させる方法が求められているが、いまだ、有
効な手段がないのが現状である。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】本願発明は、上記問題
点を解決すべく行われたものであり、細胞内において、
目的蛋白質と同時にHSPを発現させることにより、細胞
内で目的蛋白質が不溶化されることなく、大量に生産さ
れることを発見し、本願発明を完成させたものである。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本願発明は、細胞内で目
的の蛋白質を発現させ得る発現カセットであって、該発
現カセットは、第一のプロモーターに分子シャペロンを
コードする遺伝子が作動可能に結合した配列と、該目的
の蛋白質をコードする遺伝子を組み込み得る部位とを有
する、発現カセットに関する。
【０００９】好適な実施態様においては、上記発現カセ
ットは細菌で機能する。
【００１０】好適な実施態様においては、上記発現カセ
ットは細菌内では分子シャペロン非存在下では不溶性蛋
白質として発現される目的の蛋白質を不溶化することな
く発現させる。
【００１１】好適な実施態様においては、上記発現カセ
ットは第二のプロモーターを有し、該第二のプロモータ
ーが前記組み込み部位の上流で、かつ、組み込まれた遺
伝子が発現し得るように配置されている。
【００１２】さらに好適な実施態様においては、前記分
子シャペロンをコードする遺伝子の下流、および前記目
的の蛋白質をコードする遺伝子を組み込み得る部位の下
流に、それぞれターミネーター配列を有する。
【００１３】好適な実施態様においては、前記遺伝子の
組み込み得る部位に、前記目的の遺伝子が発現し得る状
態で組み込まれている。
【００１４】さらに好適な実施態様においては、前記分
子シャペロンをコードする遺伝子が、超好熱始原菌KOD-
1株由来のヒートショックプロテイン（HSP）の遺伝子、
あるいはBacillus stearothermophilus SICI株由来のGr
oESLである。
【００１５】より好適な実施態様においては、前記第一
および第二のプロモーターが、ともにＴ７プロモーター
である。
【００１６】また、本願発明は、前記発現カセットの遺
伝子を組み込み得る部位に、前記目的の遺伝子が発現し
得る状態で組み込まれている、発現ベクターに関する。
【００１７】さらに本願発明は、目的の蛋白質を発現さ
せ得る細胞に関し、第一のプロモーターに分子シャペロ
ンをコードする遺伝子が作動可能に結合した配列と、第
二のプロモーターに該目的の蛋白質をコードする遺伝子
が作動可能に結合した配列とを有する発現カセット、あ
るいは該発現カセットを有する発現ベクターで形質転換
された細胞に関する。
【００１８】さらに本願発明は、目的の蛋白質を発現さ
せる細胞であって、分子シャペロンをコードする遺伝子
を発現し得るベクターと、目的の蛋白質をコードする遺
伝子を発現し得るベクターとで同時形質転換された細胞
に関する。
【００１９】好適な実施態様においては、細胞は細菌で
ある。
【００２０】好適な実施態様においては、目的の蛋白質
が不溶化することなく発現される細胞である。
【００２１】好適な実施態様においては、前記細菌に導
入される分子シャペロンをコードする遺伝子が、超好熱
始原菌KOD-1株由来のHSPの遺伝子あるいは、Bacillus s
tearothermophilus SICI株由来のGroESLである。
【００２２】また、本願発明は、細胞内で目的の蛋白質
を発現させる方法に関し、分子シャペロンをコードする
遺伝子と目的の蛋白質をコードする遺伝子とを同時に発
現させ得る細胞を培養する工程を包含する、方法に関す
る。
【００２３】好適な実施態様においては、第一のプロモ
ーターに分子シャペロンをコードする遺伝子が作動可能
に結合した配列と、第二のプロモーターに該目的の蛋白
質をコードする遺伝子が作動可能に結合した配列とを有
する発現ベクターで形質転換された細胞を培養する工程
を含む。
【００２４】好適な実施態様においては、分子シャペロ
ンをコードする遺伝子を発現し得るベクターと、目的の
蛋白質をコードする遺伝子を発現し得るベクターとで同
時形質転換された細胞を培養する工程を含む。
【００２５】好適な実施態様においては、分子シャペロ
ンをコードする遺伝子は、超好熱始原菌KOD-1株由来の
ヒートショックプロテインの遺伝子あるいは、Bacillus
stearothermophilus SICI株由来のGroESLである。
【００２６】好適な実施態様においては、細胞は細菌で
ある。
【００２７】好適な実施態様においては、目的の蛋白質
が不溶化することなく発現され得る。
【００２８】また、本願発明は、目的の蛋白質を生産さ
せる方法であって、分子シャペロンをコードする遺伝子
と目的の蛋白質をコードする遺伝子とを同時に発現させ
得る発現カセットあるいは発現ベクターを有する細胞を
培養し、該目的の蛋白質を同時に発現させる工程、およ
び、該発現された目的蛋白質を回収する工程を包含す
る。
【００２９】好適な実施態様においては、第一のプロモ
ーターに分子シャペロンをコードする遺伝子が作動可能
に結合した配列と、第二のプロモーターに該目的の蛋白
質をコードする遺伝子が作動可能に結合した配列とを有
する発現ベクターで形質転換された細胞を培養する工程
を包含する。
【００３０】また、好適な実施態様においては、分子シ
ャペロンをコードする遺伝子を発現し得るベクターと、
目的の蛋白質をコードする遺伝子を発現し得るベクター
とで同時形質転換された細胞を培養する工程を包含す
る。
【００３１】さらに好適な実施態様においては、前記方
法は、分子シャペロンをコードする遺伝子として、超好
熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックプロテインの遺
伝子、あるいはBacillus stearothermophilus SICI株由
来のGroESLを用いる。
【００３２】好適な実施態様においては、細胞は細菌で
ある。
【００３３】好適な実施態様においては、目的の蛋白質
が不溶化することなく発現され得る。
【００３４】また、本願発明は、熱に不安定な蛋白質を
熱に安定にする方法であって、熱に不安定な蛋白質と耐
熱性の分子シャペロンとを混合する工程を含む。
【００３５】好適な実施態様においては、分子シャペロ
ンは超好熱性始原菌KOD-1由来のヒートショックプロテ
インである。
【００３６】さらに、本願発明は、熱に不安定な蛋白質
を精製する方法であって、熱に不安定な蛋白質と耐熱性
の分子シャペロンとを混合する工程、および、該混合物
を加熱する工程を含む。
【００３７】好適な実施態様においては、分子シャペロ
ンは超好熱性始原菌KOD-1由来のヒートショックプロテ
インである。
【００３８】さらに、本願発明は配列番号７で示される
アミノ酸配列を有するKOD-1 ヒートショックプロテイン
に関する。
【００３９】さらに、本願発明は配列番号７で示される
アミノ酸配列をコードするKOD-1 ヒートショックプロテ
イン遺伝子に関する。
【００４０】上記のような本願各発明により、上記の目
的が達成され得る。
【００４１】
【発明の実施の形態】本願明細書で細胞は、原核細胞、
真核細胞を含み、特に、細菌、酵母、植物細胞、哺乳動
物細胞を含む概念である。
【００４２】本願明細書では、「細菌」とは、いわゆる
原核生物と始原菌とを含む。原核生物には、グラム陽
性、およびグラム陰性の両方の菌をも含む。
【００４３】本願明細書で、「異種蛋白質」とは、宿主
細菌には通常存在しない蛋白質をいう。また、「異種プ
ロモーター」とは、宿主細菌には通常存在しないプロモ
ーターおよび、ある蛋白質が天然に発現される際に使用
されるプロモーターとは異なるプロモーターをいう。
【００４４】本願明細書で、「不溶化することなく」と
は、顕微鏡による観察で、顆粒状の物質がほとんど観察
されないことをいう。
【００４５】以下、細菌の場合について記述するが、酵
母、植物細胞、および哺乳動物細胞においても、細菌の
例が適用されることは当業者に容易に理解される。
【００４６】（発現カセット）本願発明の発現カセット
は、第一のプロモーターに分子シャペロンをコードする
遺伝子が作動可能に結合した配列と、該目的の蛋白質を
コードする遺伝子を組み込み得る部位とを有する。上記
の発現カセットは、当業者に周知の、細胞で発現可能な
プロモーター、分子シャペロンをコードする遺伝子を用
いて作製され得る。必要に応じて、ターミネーター配列
が使用され得る。
【００４７】細菌で発現するプロモーターとしては、当
業者に周知のプロモーターが使用され得る。例えば、細
菌のプロモーター、ファージのプロモーターが使用され
得、また、構成的なあるいは誘導性のプロモーターも用
いられ得る。ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター
などが好適に使用され得る。Ｔ７プロモーターが高発現
である点から、特に好適に使用され得る。
【００４８】分子シャペロンとしては、超好熱始原菌の
ヒートショックプロテイン、 好熱性のBacillus stearo
thermophilus 由来のGroEL、GroES、Hsp90、SecB等が用
いられ得る。
【００４９】この中でも、超好熱始原菌のHSPが好適に
用いられ得る。始原菌（Archaea）は、原核生物と真核
生物とは異なる第３の生物群として提唱され、一般に受
け入れられている。この始原菌は進化的な観点からも興
味ある生物群であり、高度好塩菌、メタン生成菌、およ
び超好熱菌が含まれる。超好熱菌KOD-1株のHSPは１分子
からなるので、特に好適に用いられ得る。
【００５０】本願発明に好適に用いられる好熱菌は60℃
以上で生育し得るものをいう。超好熱菌は、80℃以上で
生育する微生物であると定義される。超好熱始原菌の中
でも、KOD-1株が好適に用いられ得る。KOD-1株は、本願
発明者らにより、鹿児島県小宝島の硫気孔から単離した
耐熱性チオールプロテアーゼ産生菌KOD-1株（Appl. Env
iron. Microbiol. 60(12), 4559-4566(1994)）である。
KOD-1株は工業技術院生命工学工業技術研究所に寄託さ
れており、その受託番号はFERM P-15007号である。なお
このKOD-1株は分離された当初Pyrococcus属に分類され
ていたが、上記文献にも記載されているとおり、16S rR
NAの配列からはPyrococcus属よりはむしろThermococcus
属により近縁であることが示唆されている。
【００５１】好熱性細菌由来のGroELおよびGroESは、折
り畳み中間体であるモルテングロビュールに結合し、蛋
白質の折り畳みを促進させる機能を有することが知られ
ており、好適に使用され得る。分子シャペロンをコード
する遺伝子は、上記の蛋白質のアミノ酸配列から決定さ
れ得る。
【００５２】大腸菌由来のGroELおよびGroESのアミノ酸
配列および塩基配列はNature 333巻、330-334(1988)に
記載されている。
【００５３】本願発明の発現カセットの作製に使用され
得る出発ベクターとしては、細菌宿主で安定に保持さ
れ、かつ複製可能なものであれば、どのようなベクター
でも、用いられ得る。例えば、pBR322、pUC18、pUC119
等が挙げられる。好適には、pET-8cが用いられ得る。こ
のpET-8cは、バクテリオファージT7 f10プロモーターを
有している。
【００５４】以下に、発現カセットの作製方法の１例を
示す。が、本願発明の発現カセットの作製は、以下に述
べる方法に限定されないことはいうまでもない。
【００５５】まず、第一のプロモーター配列を出発ベク
ターに導入する。次に、第一プロモーターの下流に分子
シャペロン遺伝子配列を結合させる。これらの配列の導
入、結合は、当業者に周知の方法で行われ得る。また、
第一のプロモーター配列と分子シャペロン遺伝子間の距
離は、最適なプロモーター活性を有するように、調節さ
れ得る。
【００５６】分子シャペロン遺伝子配列としては、既知
の配列が用いられ得る。超好熱始原菌、例えば、KOD-1
株からの分子シャペロン遺伝子であるHSP遺伝子は、既
知のHSP遺伝子がコードするシャペロニン遺伝子の保存
アミノ酸配列に着目してスクリーニングし得る。詳細は
実施例で述べる。
【００５７】分子シャペロン遺伝子の下流には、ターミ
ネーター配列が配置され得る。ターミネーター配列とし
ては、T7ファージ由来の配列が好適に用いられ得る。こ
れらのターミネーター配列は、発現効率の向上に有用で
ある。分子シャペロン遺伝子とターミネーター遺伝子と
の結合も、当業者に周知の方法で行われ得る。
【００５８】また、プロモーターおよびターミネーター
配列を有するプラスミド（例えば、pET-8C）を用い、プ
ロモーター配列とターミネーター配列との間に、分子シ
ャペロン遺伝子を組み込むことにより、プロモーター配
列−分子シャペロン遺伝子ーターミネーター配列を有す
る分子シャペロン発現ベクターが作製され得る。
【００５９】このようにして得られた、分子シャペロン
発現ベクターに適切なは、目的の遺伝子のクローニング
部位があれば、この分子シャペロン発現ベクターは、本
願発明の発現カセットである。適切なクローニング部位
がない場合には、クローニング部位が導入されて、発現
カセットとなり得る。
【００６０】クローニング部位としては、種々の制限部
位を有するマルチリンカーが使用され得る。マルチリン
カーとしては、市販のあるいは合成されたものが用いら
れ得る。
【００６１】発現カセットのこのクローニング部位に
は、のプロモーター配列−分子シャペロン遺伝子（必要
に応じてさらにターミネーター配列）の上流にあるいは
下流に、さらに、第二のプロモーター配列と作動可能に
結合した目的蛋白質をコードする遺伝子のクローニング
部位が導入され得る。
【００６２】クローニング部位の上流に、第二のプロモ
ーター配列を導入した発現カセットも用いられ得る。導
入される第二のプロモーターは、第一のプロモーターと
同一であってもよいし、異なっていてもよい。さらに、
クローニング部位に導入された目的の蛋白質をコードす
る遺伝子が効率よく発現するように、リンカーの長さが
調節され得る。
【００６３】また、クローニング部位の下流にターミネ
ーター配列を導入し得る。
【００６４】クローニング部位としては、種々の制限部
位有するマルチリンカーが使用され得る。マルチリンカ
ーは、市販のものでもよく、合成してもよい。
【００６５】クローニング部位に導入された目的の蛋白
質をコードする遺伝子が効率よく発現するように、リン
カーの長さが調節され得る。
【００６６】以上のようにして、発現カセットが作製さ
れ得る。
【００６７】（発現ベクター）本願発明で、発現ベクタ
ーとは、目的の蛋白質を発現する遺伝子が組み込まれた
ベクターを意味し、発現カセットに目的の遺伝子が作動
可能に組み込まれたものが含まれる。遺伝子の組み込み
は、当業者に周知の方法を用いて行われ得る。
【００６８】（形質転換）細菌を宿主として、形質転換
する方法は、当業者に周知である。例えば大腸菌を宿主
とする場合には、塩化カルシウムで処理する方法などが
挙げられる。形質転換株のスクリーニングもまた、当業
者に周知である。薬剤耐性の利用、栄養要求性の利用、
などがあるが、前者が一般的に使用され得る。発現ベク
ターの出発材料となるベクターが有する薬剤耐性遺伝
子、例えば、アンピシリン耐性、クロラムフェニコール
耐性、テトラサイクリン耐性等の遺伝子が使用され得
る。
【００６９】本願発明において、目的の形質転換株は、
分子シャペロン遺伝子および目的の蛋白質をコードする
遺伝子が同一のベクター上になくてもよい。本願発明の
形質転換株は、第一のプロモーター配列と分子シャペロ
ンをコードする遺伝子とを有するベクターと、第二のプ
ロモーターと目的の蛋白質をコードする遺伝子とを有す
るベクターとで同時形質転換された細菌であり得る。こ
の場合、形質転換株の選択のために、それぞれのベクタ
ーは、それぞれ異なる薬剤耐性を有し得る （目的蛋白質の製造）上記で選択された形質転換株は、
当業者に周知の方法で培養され得る。培養後、当業者に
周知の方法、たとえば、超音波処理、リゾチーム処理な
どの方法で細菌が破砕され、当業者に周知の方法、例え
ば、遠心分離、硫酸アンモニウム処理、イオン交換クロ
マトグラフィー、カラムクロマトグラフィー、アフィニ
ティークロマトグラフィー等の方法を、単独または組み
合わせて、目的の蛋白質が回収され得る。
【００７０】通常に細菌菌体内で生産されたときにイン
クルージョンボディを形成する蛋白質としては、抗体な
どの動物由来の蛋白質あるいは植物由来の蛋白質などが
挙げられるが、これらに限定されないことは言うまでも
ない。
【００７１】以下に実施例を挙げて本願発明を説明する
が、本願発明が実施例のみに限定されないことは言うま
でもない。
【００７２】
【実施例】
（実施例１：発現カセットの構築）Bacillus stearothe
rmophilus SICI株由来のGroESLを分子シャペロンとして
用いた。Bacillus stearothermophilus SICI株は、工業
技術院生命工学工業技術研究所に受託番号FERM P-9629
として寄託されているBacillus stearothermophilusSＩ
１株からプラスミドをキュアリングして得られた株であ
る。従って、このGroESL遺伝子は、Bacillus stearothe
rmophilus SＩ１株からも得られ得る。
【００７３】図１に、GroESL遺伝子のクローニング方法
を示す。出発材料SICI株から定法により染色体DNAを単
離した。この染色体DNAをSspIで消化し、環状化させ
た。ついで、EcoRIで切断し、以下の配列を有するプラ
イマー１およびプライマー２： でPCRを行った。PCRの条件は、94℃、1分30秒；56℃、2
分30秒；72℃、3分であった。
【００７４】PCRで増幅したDNAを制限酵素BamHIとEcoRI
とで切断し、pBR322にクローニングし、EcoRIで切断し
た（断片１）。
【００７５】他方で、SICI株の染色体を制限酵素EcoRV
１とBamHIとで切断し、GroEL遺伝子のC末端領域を有す
る約2.5Kb断片をpUC19にクローニングし、pUC-groELCを
作製した。得られたpUC-groELCをEcoRIで切断した。得
られたEcoRI断片（断片２）を、EcoRIで切断した上記断
片（断片１）に接続して、GroESL遺伝子を有するプラス
ミドpBR-GroESLを得た。
【００７６】図２に、GroESLを有するベクター、pET-Gr
oESLの作製の模式図を示す。GroESLをPCRで増幅させ
た。用いたプローブ、Ｐ11およびＰ12は、以下の配列を
有しており、GroESL遺伝子にXbaIおよびBamHI部位を導
入した。
【００７７】 PCRの条件は、上記と同じであった。増幅後、制限酵素X
baIとBamHIとで切断し、断片を回収した。
【００７８】他方で、T7プロモーターおよびターミネー
ター配列を有するプラスミドpET-8Cを制限酵素XbaIとBa
mHIとで切断し、上記で調製したGroESLを含むXbaI-BamH
I断片を挿入し、pET-GroESLを作製した。
【００７９】得られたpET-GroESLをBglIIで切断し、平
滑末端とした後、HindIIIで切断した。pET-8cを制限酵
素NheIで切断した後、平滑末端とし、HindIIIで切断し
た。この２つの断片を結合して、NcoI-BamHI間にマルチ
リンカーを導入して発現カセットを作製した。図３に発
現カセットを示す。
【００８０】（実施例２：発現ベクターの作製）分子シ
ャペロンと抗gp130抗体GPX7の一本鎖Fv(sFV)（目的の蛋
白質）とを同時に発現させるベクターを作製した。
【００８１】sFVを有するプラスミドpET-sFVを図４、お
よび図５に示す方法で作成した。プラスミドpET-8cをNc
oIで切断し、Klenow断片で平滑末端として、BamHIで切
断した。他方、図４に示すDNAプライマーを用いて、VL
およびVH遺伝子を増幅し、結合して、制限酵素FspIおよ
びBglIIで切断し、この断片と、前記pET-8cとを結合し
た。生じたプラスミドをXhoIおよびBamHIで切断して、
図５に示すsFV3リンカーを結合して、pET-sFVを作製し
た。
【００８２】次に、pET-GroESLとpET-sFVとから、図６
に示す方法でpET-sFV-ESLを構築した。実施例１で作製
したpET-GroESLを、BglIIで切断し、クレノー断片で平
滑末端とし、HindIIIで切断し、短い断片を回収した。p
ET-sFVをNheIで切断し、クレノー断片で平滑末端とし、
ついで、HindIIIで切断し、長い断片を回収した。この
断片を、Ｔ４DNAリガーゼを用いて結合し、pEt-sFV-ESL
を作製した。pET-sFV-ESLは、宿主ゲノムに組み込まれ
たlac制御下のT7プロモーターを有しており、その発現
はIPTGで誘導し得る。
【００８３】（実施例３：形質転換およびsFVの発現）
大腸菌BL21(DE3)株を、LB培地40mlに植菌し、37℃、３
時間、培養した。集菌し50mMCaCl2で処理し、pET-sFV-E
SL １μｇを添加して、42℃、2.5分処理した。その
後、アンピシリン50μg/mlを含むLB培地にプレートし
て、３７℃、１８時間培養し、形質転換株を得た。
【００８４】得られたpEt-sFV-ESL形質転換株を、NZCYM
培地100mlで、37℃で培養した。NZCYM培地の組成は以下
の通りである：NZアミン 1％、NaCl 0.5％、イースト
エキス 0.5％、カザミノ酸 0.1％、MgSO4・7H2O 0.2
%、NaOHでpH7に調整。培養開始から2時間後、IPTG 0.1m
Mで3時間、誘導した。誘導後、遠心分離して、菌体を集
め、30mM Tris-NaCl緩衝液(pH8.0)で洗浄し、1mlの同緩
衝液に懸濁し、超音波処理して、菌体を破砕した。遠心
分離して、上清区分（可溶性画分）と沈澱区分（不溶性
画分）とに分離し、不溶性画分はTritonX-100処理を行
い、可溶化して、sFVの発現を、SDS-PAGEで確認した。
コントロールとして、プラスミドpET-sFVで形質転換さ
れた大腸菌BL21(DE3)を同様に培養して、可溶性画分お
よび不溶性画分を得た。顕微鏡で観察したところ、pEt-
sFV-ESL形質転換株ではほとんどインクルージョンボデ
ィはみられなかったが、pEt-sFV形質転換株ではインク
ルージョンボディがみられた。
【００８５】SDS-PAGEの結果を図７に示す。図７の左側
は、コントロールであり、可溶性画分にはsFVがほとん
どみられないが、不溶性画分には、sFVがみられた。他
方、図７の右側は、分子シャペロンGroESLを同時に発現
させた場合である。sFVのほとんどが可溶性画分にみら
れ、不溶性画分には、わずかしかsFVが認められなかっ
た。
【００８６】（実施例４：KOD-1株のHSP遺伝子のクロー
ニング）KOD-1株をAppl. Environ. Microbiol. 60(12),
4559-4566(1994)に記載の0.5×2216マリンブロース培
地（2216マリンブロース18.7g/L、3.48 PIPESg/L、CaCl
2・H2O g/L、0.4 mL 0.2%レザズリン、475mL人工海水（N
aCl 28.16 g/L、KCl 0.7g/L、MgCl2・6H2O 5.5 g/L、MgS
O4・7H2O 6.9 g/L）、蒸留水500 mL、pH7.0）1,000mlに
接種して、２リットルの発酵槽で培養した。培養に際し
ては、発酵槽内を窒素ガスに置換し、同ガスで内圧を0.
1Kg/cm2に維持し、培養温度85±１℃にて14時間培養し
た。なお、培養は静置培養で実施し、培養中窒素ガスの
通気および撹拌は行わなかった。培養終了後、培養液
（約1,000ml）を10,000rpmで10分間遠心分離して菌体を
集めた。
【００８７】常法に従って、染色体DNAを抽出し、EcoRI
-HindIIIで切断した。約4.5kb断片を集め、pUC18に連結
して、E.coli JM109に形質転換し、遺伝子ライブラリー
を作成した。この遺伝子ライブラリーを用いて超好熱始
原菌KOD-1株のHSP遺伝子をクローニングした。超好熱始
原菌のプロモーターは大腸菌では効率よく機能しない
が、pUC18にはlacプロモーターがクローニング部位の直
前にあるので、このlacプロモーターで発現される。さ
らに、超好熱始原菌の遺伝子の翻訳に必要な16SrRNA結
合配列は大腸菌でも機能するため、クローン化された遺
伝子は発現し得る。
【００８８】既知のHSP遺伝子がコードするシャペロニ
ン遺伝子の保存アミノ酸配列に着目して、以下のクロー
ニングプローブを作成した。
【００８９】 ＰN：5'-GGGNGTACCACNATHACNAAYGAYGGNGC-3' （配列番号５） ＰC：5'-GGCATNCCRAARAGGATHGARAAYGC-3' （配列番号６） Nは、G、A、T、Cのいずれかを、YはTまたはCを、HはA、
T、Cのいずれかを、RはGまたはAを表す。
【００９０】形質転換体約1000株について、上記２つの
プローブを用いてコロニーハイブリダイゼーションを行
った。７つの陽性コロニーが得られた。二次スクリーニ
ングとしてサザンハイブリダイゼーションを行い、ハイ
ブリダイズすることを確認した。図８に得られた4.5Kb
断片の制限酵素地図を示す。使用したプローブは、図８
の斜線部で示される位置でハイブリダイズした。
【００９１】配列番号５および６で示される配列をプラ
イマーとして、PCRを行い、DNA配列を蛍光標識プライマ
ー(AutoReadTM、ファルマシア、ウプサラ、スエーデ
ン）を用いるdideoxy chain termination methodで行
い、DNA配列データをDNASISTM（日立ソフトウエア）を用いて
解析した。
【００９２】超好熱始原菌KOD-1株のHSPの遺伝子配列と
推定アミノ酸配列（546アミノ酸）を図９（配列番号
７）に示す。開始コドンの上流には、SD配列が認められ
た。表１にKOD-1由来のHSPと他の株由来のHSPとアミノ
酸配列の相同性を比較した結果を示す。
【００９３】
【表１】
【００９４】表１に示したように、KOD-1株由来のHSPは
Sulfolobus shibataeのTF55と56.3％という高いアミノ
酸配列の相同性があった。酵母とマウス由来のt-コンプ
レックスポリペプチド-1とは、それぞれ38.4％、42.8％
という相同性を示した。B.stearothermophilus SICI株
由来のGroELとは21.1％という低い相同性しか示さなか
った。
【００９５】（実施例５：KOD-1株のHSP遺伝子を有する
発現カセットの構築）以下のプライマー： を増幅用プライマーとして用いて、上記遺伝子のPCRを
行った。PCRの条件は、94℃、1分30秒；56℃、2分30
秒；72℃、3分であった。
【００９６】得られた遺伝子をNcoI-BamHIで切断し、pE
T-8cのNcoI-BamHI部位に導入して、プラスミドpET-KOD
Hspを得た。pET-KOD Hspは、宿主ゲノムに組み込まれた
lac制御下のT7プロモーターを有しており、その発現はI
PTGで誘導し得る。
【００９７】（実施例６：HSPの精製）プラスミドpET-K
OD Hspで大腸菌BL21(DE3)株を形質転換した。形質転換
株を37℃、NZCYM培地で培養した。0.1mM IPTGで、３時
間、誘導して集菌し、TE50-1バッファー（50mM Tris HC
l, pH8.0, 1mM EDTA）に縣濁し、氷上で、30X40秒、20
秒の氷冷インターバルの超音波処理を行った。４℃で、
8、000rpm、10分遠心分離して可溶性画分と不溶性画分と
を分離した。可溶性画分を４℃、一晩、80%硫酸アンモ
ニウムで沈殿させ、4℃で、8,000rpm、20分、遠心分離
した。沈殿をTE50-1バッファーに再縣濁して、一晩透析
した。この溶液を94℃、20分、加熱処理し、遠心分離
（12,000rpm, 20分、4℃）し、HiTraP DEAE陰イオン交
換クロマトグラフィー（FPLCシステム、ファルマシア、
スエーデン）の２溶媒系濃度勾配を用いて、1ml/分の速
度で、精製を行った。溶媒Ａは50mM リン酸、pH 6.2、
溶媒Ｂは溶媒Ａに1.5MのNaClが含まれていた。HSPは0.5
M NaClで溶出した。SDS-PAGEで、60KDaの単一のバンド
を示し（図10）、計算値と一致した。ゲル濾過（スーパ
ーデックス 200 HR 10/30、FPLCシステム、ファルマシ
ア）パターンは、ダイマー形態（120KDa）およびポリマ
ー形態（約950KDa：16mer）を示した（図11）。
【００９８】（実施例７：HSPを用いるADHの耐熱性向
上）HSPの分子シャペロン機能を検討するために、イン
ビトロでのADHの熱安定性を熱ストレス下で検討した。
【００９９】図12は、インビトロでのADHの熱安定性を
示す。ADHは、30℃で最高の活性を示すが、50℃を越え
ると急激に活性が減少する。70℃ではほとんど活性がな
くなる。しかし、ADHとHSPとを共存させたときには、熱
による活性の減少はスローダウンする（図13)。このこ
とは、HSPが、熱的に折り畳まれていないあるいは部分
的に折り畳まれていないADHと結合していることを示唆
する。
【０１００】インビトロで、50℃でADHの酵素的活性状
態を維持するシャペロンの機能を再現させた。結果を図
14に示す。20分の酵素反応後、ADHの残存活性は約11％
であったのに対して、HSP（0.25μM）の存在下100％に
近づいた。HSP濃度が増加するに従い、その効果は顕著
であった（図14）。
【０１０１】さらに、低濃度のHSPにおいて、ATPが熱安
定性を増加させることが示された。高濃度のHSPでは、A
TPがなくても機能するようである。データに示していな
いがダイマーおよびポリマー形態もシャペロン機能を有
していた。ポリマー形態の方がダイマー形態よりもはる
かに強い効果を示した。
【０１０２】なお、ADHは、エタノール依存性のNADの34
0nmの吸光度の減少をモニターしてアッセイした。ADH活
性は、モル吸光係数を6.22mM.cm-1として、1分間に生産
されるNADHをμmoleで表した。標準ADHアッセイは100mM
Glycine-KOH バッファー(pH 8.8)、1mM NAD、および10
0mM エタノールを含む反応液中で、25℃で行った。340n
mの吸光度は、Shimazu UV-可視記録型吸光光度計UV-16
0を用いて測定した。
【０１０３】（実施例８：同時形質転換用プラスミドの
作製および形質転換）HSPの蛋白質安定化の効果が確認
されたので、HSPと目的の蛋白質を同時に発現する系を
検討した。
【０１０４】実施例５で得られたpET-KOD Hspを制限酵
素BamHIおよびBglIIで切断し、T7プロモーター−KOD Hs
p−T7ターミネーター配列を有する断片を取得した。こ
の断片を、pET系ベクターと和合性があるpACYC184のBam
HI部位に導入して、pACYC-KOD Hspを作成した。このpAC
YC-KOD Hspは、クロラムフェニコール耐性遺伝子を有し
ている。
【０１０５】得られたプラスミドpACYC-KOD HspとpET-8
cとを、E.coli BL21(DE3)に同時形質転換した。同時形
質転換株は、アンピシリンおよびクロラムフェニコール
耐性株としてスクリーニングされた。実施例6と同様の
方法で蛋白質を精製し、SDS-PAGEで60KDaの単一のバン
ドを示し、また約950KDaを示すポリマー形態の蛋白質が
確認された。同時形質転換が可能であることから、pET-
8cのクローニング部位に目的の蛋白質をコードする遺伝
子を組み込んで、HSPとその目的の蛋白質を同時発現す
ることができる。その模式図を図15に示す。
【０１０６】（実施例９：HSPと中性アミラーゼとの同
時発現）実施例８で得られたシステムを用いて、HSPと
中性アミラーゼとを同時発現させた。
【０１０７】KOD-1株の中性アミラーゼ遺伝子を以下の
方法でスクリーニングした。実施例４で得られたKOD-1
染色体DNAを制限酵素EcoRIで切断し、約7.5Kbの断片を
単離し、pUC18の制限酵素EcoRI部位に挿入し、E.coli J
M109を形質転換して、遺伝子ライブラリーを作製した。
形質転換株をアンピシリンを含むstarch azure寒天培地
（starch azureを終濃度で0.25%含むＬ寒天培地：アミ
ラーゼ活性指示培地）で生育させた後、60℃で、一昼夜
熱処理し、ハローを作るコロニーを選択した。このコロ
ニーから得られたアミラーゼは至適pHが５から７であ
り、中性アミラーゼであることが確認された。
【０１０８】この形質転換株からクローニングされたDN
A断片を抽出し、塩基配列を決定した。
【０１０９】ついで、以下のプライマー： を用いてPCRを行った。
【０１１０】得られた中性アミラーゼ遺伝子を制限酵素
NcoIおよびBamHIで切断し、pET-8cのNcoIおよびBamHI部
位に組み込み、プラスミドpET-NAmyを作製した。プラス
ミドpACYC-KOD HspとpET-NAmyとを、E.coli BL21(DE3)
に同時形質転換し、アンピシリンおよびクロラムフェニ
コール耐性株を選択した。実施例６と同様にNZCYM培地
で培養し、IPTGで3時間誘導した。コントロールとし
て、pET-NAmyのみをE.coli BL21(DE3)に形質転換した株
を用いた。結果を図16に示す。中性アミラーゼは、pH5.
0では凝集し、pH8.0では可溶化する。pH5.0およびpH8.0
で菌体を超音波破砕し、分画した。SDS-PAGEおよび活性
染色の結果、同時発現株では菌体あたりのアミラーゼ生
産量の増加が認められた。さらに、pH8.0ではアミラー
ゼの可溶性画分の発現量増加が認められた。
【０１１１】（実施例１０：Cobyric acid synthetase
(CobQ)とHSPとの同時発現）KOD-1株由来のCobQは、大腸
菌で単独で発現すると可溶性のCobQと不溶性顆粒のCobQ
とが等量生じる。
【０１１２】CobQ遺伝子は、KOD-1株のゲノム解析中
に、Salmonella属あるいはPseudomonas属のcobyric aci
d synthetaseの配列との相同性から見いだされたもので
あり、4.5KbのHindIII断片に含まれていた。このCobQ遺
伝子は以下の２つのプライマー： を用いてPCRを行い、増幅した。
【０１１３】得られたCobQ遺伝子を制限酵素NcoIおよび
BamHIで切断し、pET-8cのNcoIおよびBamHI部位に組み込
み、プラスミドpET-CobQを作製した。プラスミドpACYC-
KODHspとpET-CobQとを、E.coli BL21(DE3)に同時形質転
換し、アンピシリンおよびクロラムフェニコール耐性株
を選択した。実施例６と同様にNZCYM培地で培養し、IPT
Gで3時間誘導した。コントロールとして、pET-CobQのみ
をE.coli BL21(DE3)に形質転換した株を用いた。結果を
図17に示す。CobQは、HSPを同時に発現したときは不溶
性顆粒が減少し、可溶性CobQの生産量が増加した。
【０１１４】（実施例１１：sFVとHSPとの同時発現）プ
ラスミドpACYC-KOD Hspと実施例２で作製したプラスミ
ドpET-sFVとをE.coliBL21(DE3)に形質転換した。形質転
換株をNZCYM培地で培養し、O.D.660nmが0.3、および1.0
になったところで、それぞれ、IPTGを加え、１時間およ
び５時間誘導した。同時発現により、sFVが可溶性画分
に生産された（図18）。
【０１１５】
【発明の効果】本願発明の分子シャペロンと目的の遺伝
子を同時に発現させ得るベクターを用いることにより、
従来、顆粒状のインクルージョンボディとして、不溶性
の蛋白質として発現されていた蛋白質が、可溶性の蛋白
質として、効率よく回収され得る。
【０１１６】
【配列表】
【０１１７】
【配列番号１】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTATG CGGAT CCTGG GCGGC ATGAT GTAAT CC 32
【０１１８】
【配列番号２】 配列の長さ：３４ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GAGCT CGAAT TCCGA AGTAG TTTCT TCAAG TTGC 34
【０１１９】
【配列番号３】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGTGC TCTAG AGAAC GGCGA AAACT ATCG ２
９
【０１２０】
【配列番号４】 配列の長さ：３２ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列： TTTTT GGATC CGGTT TATTA CATCA TGCCG CC 32
【０１２１】
【配列番号５】 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GGGNG TACCA CNATH ACNAA YGAYG GNGC 29
【０１２２】
【配列番号６】 配列の長さ：26 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ＧＧＣＡＴ ＮＣＣＲＡ ＡＲＡＧＧ ＡＴＨＧＡ ＲＡＡＹＧ Ｃ
２６
【０１２３】
【配列番号７】 配列の長さ：１７４１ 配列の型：核酸 鎖の数：両形態 トポロジー：不明 配列の種類：染色体DNA 配列： GCTTTTAATC ATTACCGAAA ACTTTATAAA TAGCACAAAA GAACAATAGC GCGGAAAACA -61 CGAATTGTAA CTAAAACTCA TCCACCCTCA AAAACAAAAA AAGGGTGGGG GTGAGGGGAG -1 ATG GCC CAG CTC GCA GGC CAG CCA GTT GTT ATT CTG CCC GAG GGA ACC 48 Met Ala Gln Leu Ala Gly Gln Pro Val Val Ile Leu Pro Glu Gly Thr 1 5 10 15 CAG AGG TAT GTT GGA AGG GAC GCC CAG AGG CTC AAC ATT CTT GCT GCC 96 Gln Arg Tyr Val Gly Arg Asp Ala Gln Arg Leu Asn Ile Leu Ala Ala 20 25 30 AGG ATT ATA GCC GAG ACG GTT AGA ACC ACC CTC GGT CCA AAG GGA ATG 144 Arg Ile Ile Ala Glu Thr Val Arg Thr Thr Leu Gly Pro Lys Gly Met 35 40 45 GAC AAG ATG CTC GTT GAC AGC CTC GGC GAC ATC GTC ATC ACC AAC GAC 192 Asp Lys Met Leu Val Asp Ser Leu Gly Asp Ile Val Ile Thr Asn Asp 50 55 60 GGT GCA ACC ATT CTC GAC GAG ATG GAC ATC CAG CAC CCT GCT GCT AAG 240 Gly Ala Thr Ile Leu Asp Glu Met Asp Ile Gln His Pro Ala Ala Lys 65 70 75 80 ATG ATG GTT GAG GTT GCT AAG ACT CAG GAC AAG GAG GCC GGT GAC GGA 288 Met Met Val Glu Val Ala Lys Thr Gln Asp Lys Glu Ala Gly Asp Gly 85 90 95 ACC ACC ACT GCC GTT GTC ATC GCC GGT GAG CTT CTG AGG AAG GCT GAG 326 Thr Thr Thr Ala Val Val Ile Ala Gly Glu Leu Leu Arg Lys Ala Glu 100 105 110 GAG CTT CTC GAC CAG AAC ATT CAC CCG AGC ATA ATC ATC AAG GGT TAC 384 Glu Leu Leu Asp Gln Asn Ile His Pro Ser Ile Ile Ile Lys Gly Tyr 115 120 125 GCC CTC GCG GCA GAG AAA GCC CAG GAA ATA CTC GAC GAG ATA GCC AAG 432 Ala Leu Ala Ala Glu Lys Ala Gln Glu Ile Leu Asp Glu Ile Ala Lys 130 135 140 GAC GTT GAC GTC GAG GAC AGG GAG ATT CTC AAG AAG GCC GCG GTC ACC 480 Asp Val Asp Val Glu Asp Arg Glu Ile Leu Lys Lys Ala Ala Val Thr 145 150 155 160 TCC ATC ACC GGA AAG GCT GCC GAG GAG GAG AGG GAG TAC CTC GCT GAG 528 Ser Ile Thr Gly Lys Ala Ala Glu Glu Glu Arg Glu Tyr Leu Ala Glu 165 170 175 ATA GCA GTT GAG GCC GTC AAG CAG GTT GCC GAG AAG GTT GGC GAG ACC 576 Ile Ala Val Glu Ala Val Lys Gln Val Ala Glu Lys Val Gly Glu Thr 180 185 190 TAC AAG GTC GAC CTC GAC AAC ATC AAG TTC GAG AAG AAG GAA GGT GGA 624 Tyr Lys Val Asp Leu Asp Asn Ile Lys Phe Glu Lys Lys Glu Gly Gly 195 200 205 AGC GTC AAG GAC ACC CAG CTC ATA AAG GGT GTC GTC ATC GAC AAG GAG 672 Ser Val Lys Asp Thr Gln Leu Ile Lys Gly Val Val Ile Asp Lys Glu 210 215 220 GTC GTC CAC CCA GGC ATG CCG AAG AGG GTC GAG GGT GCT AAG ATC GCC 720 Val Val His Pro Gly Met Pro Lys Arg Val Glu Gly Ala Lys Ile Ala 225 230 235 240 CTC ATC AAC GAG GCC CTC GAG GTC AAG GAG ACC GAG ACC GAC GCC GAG 768 Leu Ile Asn Glu Ala Leu Glu Val Lys Glu Thr Glu Thr Asp Ala Glu 245 250 255 ATC AGG ATC ACC AGC CCG GAG CAG CTC CAG GCC TTC CTT GAG CAG GAG 816 Ile Arg Ile Thr Ser Pro Glu Gln Leu Gln Ala Phe Leu Glu Gln Glu 260 265 270 GAG AAG ATG CTC AGG GAG ATG GTC GAC AAG ATC AAG GAG GTC GGC GCG 864 Glu Lys Met Leu Arg Glu Met Val Asp Lys Ile Lys Glu Val Gly Ala 275 280 285 AAT GTC GTC TTC GTC CAG AAG GGC ATT GAC GAC CTC GCC CAG CAC TAC 912 Asn Val Val Phe Val Gln Lys Gly Ile Asp Asp Leu Ala Gln His Tyr 290 295 300 CTT GCC AAG TAC GGC ATA ATG GCC GTT AGA AGG GTC AAG AAG AGC GAC 960 Leu Ala Lys Tyr Gly Ile Met Ala Val Arg Arg Val Lys Lys Ser Asp 305 310 315 320 ATG GAG AAG CTC GCC AAG GCC ACC GGC GCC AAG ATC GTC ACC AAC GTC 1008 Met Glu Lys Leu Ala Lys Ala Thr Gly Ala Lys Ile Val Thr Asn Val 325 330 335 CGC GAC CTC ACT CCG GAG GAC CTC GGT GAG GCC GAG CTC GTC GAC CAG 1056 Arg Asp Leu Thr Pro Glu Asp Leu Gly Glu Ala Glu Leu Val Asp Gln 340 345 350 AGG AAG GTC GCC GGC GAG AAC ATG ATC TTC GTC GAG GGC TGC AAG AAC 1104 Arg Lys Val Ala Gly Glu Asn Met Ile Phe Val Glu Gly Cys Lys Asn 355 360 365 CCG AAG GCC GTC ACA ATA CTC ATC AGG GGC GGC ACC GAG CAC GTC GTT 1152 Pro Lys Ala Val Thr Ile Leu Ile Arg Gly Gly Thr Glu His Val Val 370 375 380 GAT GAG GTC GAG AGG GCC CTT GAG GAC GCC GTC AAG GTC GTC AAG GAC 1200 Asp Glu Val Glu Arg Ala Leu Glu Asp Ala Val Lys Val Val Lys Asp 385 390 395 400 ATC GTC GAG GAC GGC AAG ATC GTC GCC GCC GGT GGT GCT CCG GAG ATC 1248 Ile Val Glu Asp Gly Lys Ile Val Ala Ala Gly Gly Ala Pro Glu Ile 405 410 415 GAG CTC GCC ATC AGG CTC GAC GAG TAC GCG AAG GAG GTC GGC GGC AAG 1296 Glu Leu Ala Ile Arg Leu Asp Glu Tyr Ala Lys Glu Val Gly Gly Lys 420 425 430 GAG CAG CTC GCC ATC GAG GCC TTT GCC GAG GCC CTC AAG GTC ATC CCG 1344 Glu Gln Leu Ala Ile Glu Ala Phe Ala Glu Ala Leu Lys Val Ile Pro 435 440 445 AGG ACC CTC GCC GAG AAC GCC GGT CTC GAC CCG ATC GAG ACC CTC GTT 1392 Arg Thr Leu Ala Glu Asn Ala Gly Leu Asp Pro Ile Glu Thr Leu Val 450 455 460 AAG GTC ATC GCC GCC CAC AAG GAG AAG GGA CCG ACC ATC GGT GTT GAC 1440 Lys Val Ile Ala Ala His Lys Glu Lys Gly Pro Thr Ile Gly Val Asp 465 470 475 480 GTC TTC GAG GGC GAG CCG GCC GAC ATG CTC GAG CGC GGC GTT ATC GCC 1488 Val Phe Glu Gly Glu Pro Ala Asp Met Leu Glu Arg Gly Val Ile Ala 485 490 495 CCG GTC AGG GTT CCG AAG CAG GCC ATC AAG AGC GCC AGC GAG GCT GCC 1536 Pro Val Arg Val Pro Lys Gln Ala Ile Lys Ser Ala Ser Glu Ala Ala 500 505 510 ATA ATG ATC CTC AGG ATC GAC GAC GTC ATC GCC GCC AGC AAG CTC GAG 1584 Ile Met Ile Leu Arg Ile Asp Asp Val Ile Ala Ala Ser Lys Leu Glu 515 520 525 AAG GAC AAG GAG GGC GGC AAG GGC GGT AGC GAG GAT TTC GGA AGC GAC 1632 Lys Asp Lys Glu Gly Gly Lys Gly Gly Ser Glu Asp Phe Gly Ser Asp 530 535 540 CTT GAC TGAAGCCCTT TGATTTCTTT TCTCTTCAAA TTTGTGTTCT TA
１６８０ Ｌｅｕ Ａｓｐ ５４５ ５４６
【０１２４】
【配列番号８】 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AGGGG CCATG GCCCA GCTCG CAGGC CAGC 29
【０１２５】
【配列番号９】 配列の長さ：28 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： AAAAG GGATC CAAGG TCATC AGTCA AGG 28
【０１２６】
【配列番号１０】 配列の長さ：30 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： ＴＧＧＴＡ ＣＣＡＴＧ ＧＣＡＡＡ ＧＴＡＴＴ ＣＣＧＡＡ ＣＴＣＧＡ
３０
【０１２７】
【配列番号１１】 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CGGAT CCGAT ATCAG CTATG ACCTT TA 27
【０１２８】
【配列番号１２】 配列の長さ：29 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： GTGAC CATGG GAAAG GCGCT GATGG TTCA 29
【０１２９】
【配列番号１３】 配列の長さ：32 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列： CTAGG ATCCA AGTCT CTGGA TTATG TACTG GA
３２
【図面の簡単な説明】
【図１】ＧｒｏＥＳＬ遺伝子のクローニング方法を示
す。
【図２】pET-GroESLの作製を示す模式図である。
【図３】本願発明の発現カセットを示す図である。
【図４】プラスミドpET-sFVの作製を示す図である。
【図５】図４の続きである。
【図６】発現ベクターpET-sFV-ESLの作製を示す図であ
る。
【図７】分子シャペロンを同時に発現させた時にsFVが
可溶化されることを示す図である。
【図８】超好熱始原菌KOD-1株染色体のEcoRI-HindIII断
片の制限地図および配列番号５および６のプローブの結
合位置を示す図である。
【図９】超好熱始原菌KOD-1株のHSPの遺伝子配列と推定
アミノ酸配列（546アミノ酸）を示す図である。
【図１０】プラスミドpACYC-KOD Hspを形質転換して発
現した蛋白質のSDS-PAGEである。
【図１１】ダイマー形態（120KDa）およびポリマー形態
（約950KDa：16mer）のHSPのゲル濾過パターンを示す図
である。
【図１２】インビトロでのADHの熱安定性を示す図であ
る。
【図１３】ADHとHSPとを共存させたときのADHの熱安定
性を示す図である。
【図１４】インビトロで、50℃でADHの熱安定性を示す
図である。
【図１５】本願発明の同時形質転換を示す模式図であ
る。
【図１６】HSPと同時発現させたKOD-1の中性アミラーゼ
の生産量の増加を示す図である。
【図１７】CobQとHSPとの同時発現によりCobQが可溶化
されることを示す図である。
【図１８】HSPを同時に発現させた時にsFVが可溶化され
ることを示す図である。
【図１９】GroELとGroESとが複合体を形成し、GroEタン
パク質として機能することを示す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ツェン ヤン 中華人民共和国 シアン 710032，ウェス ト チャングル ロード ナンバー17 ザ フォース ミリタリー メディカル ユ ニバーシティ ザ センター オブ バイ オテクノロジー (72)発明者 藤原 伸介 兵庫県西宮市田近野町３ 仁川合同宿舎６ −302

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 細胞内で、目的の蛋白質を発現させ得る
    発現カセットであって、該発現カセットは、第一のプロ
    モーターに分子シャペロンをコードする遺伝子が作動可
    能に結合した配列と、該目的の蛋白質をコードする遺伝
    子を組み込み得る部位とを有する、発現カセット。
  2. 【請求項２】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャペ
    ロン非存在下では不溶性蛋白質として発現される目的の
    蛋白質を不溶化することなく発現させる、請求項１に記
    載の発現カセット。
  3. 【請求項３】 さらに、第二のプロモーターを有し、該
    第二のプロモーターが前記組み込み部位の上流にあり、
    かつ、組み込まれた遺伝子が発現し得るように配置され
    た、請求項１または２に記載の発現カセット。
  4. 【請求項４】 前記分子シャペロンをコードする遺伝子
    の下流、および前記目的の蛋白質をコードする遺伝子を
    組み込み得る部位の下流に、それぞれターミネーター配
    列を有する、請求項１または２に記載の発現カセット。
  5. 【請求項５】 前記分子シャペロンをコードする遺伝子
    が、超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックプロテ
    インの遺伝子である、請求項１ないし４いずれかの項に
    記載の発現カセット。
  6. 【請求項６】 前記分子シャペロンをコードする遺伝子
    が、Bacillus stearothermophilus SICI株由来のGroESL
    である、請求項１ないし４いずれかの項に記載の発現カ
    セット。
  7. 【請求項７】 前記第一および第二のプロモーターが、
    ともにＴ７プロモーターである、請求項２に記載の発現
    カセット。
  8. 【請求項８】 請求項１ないし７のいずれかの項に記載
    の発現カセットの遺伝子を組み込み得る部位に、前記目
    的の遺伝子が発現し得る状態で組み込まれている、発現
    ベクター。
  9. 【請求項９】 目的の蛋白質を発現させ得る細胞であっ
    て、第一のプロモーターに分子シャペロンをコードする
    遺伝子が作動可能に結合した配列と、第二のプロモータ
    ーに該目的の蛋白質をコードする遺伝子が作動可能に結
    合した配列とを有する発現カセット、あるいは該発現カ
    セットを有する発現ベクターで形質転換された細胞。
  10. 【請求項１０】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャ
    ペロン非存在下では不溶性蛋白質として発現される目的
    の蛋白質を不溶化することなく発現させる、請求項９に
    記載の細胞。
  11. 【請求項１１】 目的の蛋白質を発現させ得る細胞であ
    って、分子シャペロンをコードする遺伝子を発現し得る
    ベクターと、目的の蛋白質をコードする遺伝子を発現し
    得るベクターとで同時形質転換された細胞。
  12. 【請求項１２】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャ
    ペロンをコードする遺伝子が、超好熱始原菌KOD-1株由
    来のヒートショックプロテインの遺伝子である、請求項
    １１に記載の細胞。
  13. 【請求項１３】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャ
    ペロンをコードする遺伝子が、Bacillus stearothermop
    hilus SICI株由来のGroESLである、請求項１１に記載の
    細胞。
  14. 【請求項１４】 目的の蛋白質を発現させる方法であっ
    て、該方法は、分子シャペロンをコードする遺伝子と目
    的の蛋白質をコードする遺伝子とを同時に発現させ得る
    細胞を培養する工程を包含する、方法。
  15. 【請求項１５】 前記細胞が、第一のプロモーターに分
    子シャペロンをコードする遺伝子が作動可能に結合した
    配列と第二のプロモーターに該目的の蛋白質をコードす
    る遺伝子が作動可能に結合した配列とを有する発現ベク
    ターで形質転換された細胞である、請求項１４に記載の
    方法。
  16. 【請求項１６】 前記細胞が、分子シャペロンをコード
    する遺伝子を発現し得るベクターと、目的の蛋白質をコ
    ードする遺伝子を発現し得るベクターとで同時形質転換
    された細胞である、請求項１４に記載の方法。
  17. 【請求項１７】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャ
    ペロン非存在下では不溶性蛋白質として発現される目的
    の蛋白質を不溶化することなく発現させる、請求項１４
    ないし１６いずれかの項に記載の方法。
  18. 【請求項１８】 前記分子シャペロンをコードする遺伝
    子が、超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックプロ
    テインの遺伝子である、請求項１４ないし１７いずれか
    の項に記載の方法。
  19. 【請求項１９】 前記分子シャペロンをコードする遺伝
    子が、Bacillus stearothermophilus SICI株由来のGroE
    SLである、請求項１４ないし１７いずれかの項に記載の
    方法。
  20. 【請求項２０】 目的の蛋白質を生産させる方法であっ
    て：分子シャペロンをコードする遺伝子と目的の蛋白質
    をコードする遺伝子とを同時に発現させ得る発現カセッ
    トあるいは発現ベクターを有する細胞を培養し、該分子
    シャペロンと該目的の蛋白質とを同時に発現させる工
    程：細胞の培養液あるいは目的蛋白質を含む画分を加熱
    する工程：不溶画分を分離する工程、および該目的の蛋
    白質を回収する工程、 を包含する、方法。
  21. 【請求項２１】 前記細胞が、第一のプロモーターに分
    子シャペロンをコードする遺伝子が作動可能に結合した
    配列と、第二のプロモーターに該目的の蛋白質をコード
    する遺伝子が作動可能に結合した配列とを有する発現ベ
    クターで形質転換された細胞である、請求項２０に記載
    の方法。
  22. 【請求項２２】 前記細胞が、分子シャペロンをコード
    する遺伝子を発現し得るベクターと、目的の蛋白質をコ
    ードする遺伝子を発現し得るベクターとで同時形質転換
    された細胞である、請求項２０に記載の方法。
  23. 【請求項２３】 前記分子シャペロンをコードする遺伝
    子が、超好熱始原菌KOD-1株由来のヒートショックプロ
    テインの遺伝子である、請求項２０に記載の方法。
  24. 【請求項２４】 前記分子シャペロンをコードする遺伝
    子が、Bacillus stearothermophilus SICI株由来のGroE
    SLである、請求項２０に記載の方法。
  25. 【請求項２５】 前記細胞が細菌であり、前記分子シャ
    ペロン非存在下では不溶性蛋白質として発現される目的
    の蛋白質を不溶化することなく発現させる、請求項２０
    ないし２４いずれかの項に記載の方法。
  26. 【請求項２６】 熱に不安定な蛋白質を熱に安定にする
    方法であって、熱に不安定な蛋白質と耐熱性の分子シャ
    ペロンとを混合する工程を含む、方法。
  27. 【請求項２７】 熱に不安定な蛋白質を精製する方法で
    あって、熱に不安定な蛋白質と耐熱性の分子シャペロン
    とを混合する工程：および該混合物を加熱する工程：を
    含む、方法。
  28. 【請求項２８】 配列番号７で示されるアミノ酸配列を
    有するKOD-1 ヒートショックプロテイン。
  29. 【請求項２９】 配列番号７で示されるアミノ酸配列を
    コードするKOD-1 ヒートショックプロテイン遺伝子。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6162626A (en) * 1998-07-31 2000-12-19 Oriental Yeast Co., Ltd. Thermostable glutamate dehydrogenase and process for producing the same
JP2002335959A (ja) * 2001-04-30 2002-11-26 F Hoffmann La Roche Ag フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法
US6579699B1 (en) 1998-08-11 2003-06-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing fermentative product and stress-resistant microorganism
JP2005537796A (ja) * 2002-09-04 2005-12-15 イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム 変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性シャペロン様オリゴマータンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、これらの使用、およびこれらの比活性を増加させる方法
WO2012027930A1 (zh) * 2010-08-31 2012-03-08 上海交通大学 用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法

Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1111602C (zh) * 1998-05-15 2003-06-18 中国科学院上海生物化学研究所 一种使用分子伴侣促进蛋白质分泌的方法
EP1048732A1 (de) * 1999-04-26 2000-11-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen
FI109361B (fi) * 1999-05-04 2002-07-15 Korpela Timo Mikrobinen proteiinin ilmentämisjärjestelmä
GB9913437D0 (en) * 1999-06-09 1999-08-11 Medical Res Council Fusion proteins
EP1077263A1 (de) * 1999-07-29 2001-02-21 F.Hoffmann-La Roche Ag Verfahren zur Herstellung von natürlich gefalteten und sekretierten Proteinen durch Co-Sekretion von Chaperonen
CN1311236A (zh) * 2000-03-02 2001-09-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人分子伴侣cpn60蛋白26和编码这种多肽的多核苷酸
CN1324814A (zh) * 2000-05-24 2001-12-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——分子伴侣cpn60蛋白10和编码这种多肽的多核苷酸
CN1324816A (zh) * 2000-05-24 2001-12-05 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——分子伴侣cpn60蛋白15和编码这种多肽的多核苷酸
DE10046960A1 (de) * 2000-09-22 2002-04-11 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung einer aktiven, heterodimeren AMW-RT in prokaryotischen Zellen
EP1481061B1 (en) 2001-03-05 2011-06-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Denaturant stable and/or protease resistant, chaperone-like oligomeric proteins, polynucleotides encoding same and their uses
EP2487182B1 (en) 2005-07-07 2019-10-23 FULCRUM SP Ltd. Sp1 polypeptides, modified sp1 polypeptides and uses thereof
WO2010005708A2 (en) * 2008-06-16 2010-01-14 University Of Maryland Biotechnology Institute Improved folding of recombinant proteins via co-expression of archaeal chaperones
IL243838A (en) 2016-01-28 2017-07-31 Sp Nano Ltd The composition containing sp1 protein and carbon nanoparticles and its uses
IL243839B (en) 2016-01-28 2018-01-31 Sp Nano Ltd Conductive wires
KR102185312B1 (ko) * 2017-10-25 2020-12-02 재단법인 지능형 바이오 시스템 설계 및 합성 연구단 목적 단백질의 가용화용 조성물 및 이의 용도
CN116640710B (zh) * 2022-10-08 2024-08-02 科赫生物科技（北京）有限公司 生产鲎凝血因子FGβ＇的菌株、制备方法和应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5428131A (en) * 1988-10-24 1995-06-27 Yale University Archaebacterial chaperonin-mediated protein stabilization
NL9102009A (nl) * 1991-11-29 1993-06-16 Stichting Katholieke Univ Produktie van bioactieve peptiden met recombinante cellen.
WO1993025681A1 (en) * 1992-06-11 1993-12-23 New York University A cytoplasmic chaperonin and methods of making and using it
DE4239969A1 (de) * 1992-11-27 1994-06-01 Boehringer Mannheim Gmbh Verfahren zur Stabilisierung von Proteinen

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6162626A (en) * 1998-07-31 2000-12-19 Oriental Yeast Co., Ltd. Thermostable glutamate dehydrogenase and process for producing the same
US6579699B1 (en) 1998-08-11 2003-06-17 Ajinomoto Co., Inc. Method for producing fermentative product and stress-resistant microorganism
JP2002335959A (ja) * 2001-04-30 2002-11-26 F Hoffmann La Roche Ag フォールディング補助タンパク質の共発現を伴うｉｎｖｉｔｒｏ翻訳系でのタンパク質の発現方法
JP2005537796A (ja) * 2002-09-04 2005-12-15 イッサム リサーチ ディベロップメント カンパニー オブ ザ ヘブリュー ユニバーシティー オブ エルサレム 変性剤安定および／またはプロテアーゼ耐性シャペロン様オリゴマータンパク質、これらをコードするポリヌクレオチド、これらの使用、およびこれらの比活性を増加させる方法
WO2012027930A1 (zh) * 2010-08-31 2012-03-08 上海交通大学 用于外源蛋白可溶性表达的质粒及其制备和应用方法

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