KR102185312B1 - 목적 단백질의 가용화용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 함유하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물; 형질전환체; 키트 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다.

Description

목적 단백질의 가용화용 조성물 및 이의 용도{A composition for solubilization of target proteins and use thereof}
본 발명은 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터를 함유하는 목적 단백질의 가용화용 조성물; 형질전환체; 키트 및 이를 이용한 목적 단백질의 생산방법에 관한 것이다.
재조합 단백질을 이종의 세포에서 생산하는 경우 재조합 단백질이 불용성의 응집체를 형성하는 문제가 있어, 재조합 단백질의 가용화를 증가시키는 방법이 필요한 실정이다(Current opinion in biotechnology, 2001, 12, 202-207). 그러나, 아직 다양한 재조합 단백질에 대해 적용될 수 있는, 재조합 단백질의 가용화 방법이 개발되지는 않았다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 목적 단백질의 가용화를 증가시키는 방법을 개발하고자 예의 노력한 결과, 샤페론이 집적된 mRNA 지지체(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS) 시스템 및 샤페론-기질 동일 위치 발현(chaperone-substrate co-localized expression, CLEX) 시스템이 다양한 목적 단백질의 가용화를 증가시킴을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 프로모터; 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 조성물 또는 형질전환체를 포함하는, 목적 단백질 생산용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (i) (a) 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 및 (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 미생물에 도입하는 단계; 및
(ii) 상기 미생물을 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 목적 단백질의 가용화용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터를 포함하는 목적 단백질의 가용화용 조성물; 또는 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 포함하는, 목적 단백질 생산용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물을 제공한다.
상기 발현 카세트 또는 발현 벡터에 의해 발현되는, 융합 단백질은 RNA 결합 도메인 부분을 통해 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA와 결합하게 되고, 그 결과 융합 단백질의 샤페론 부분이 번역된 목적 단백질 근처에 존재하게 되어, 목적 단백질이 올바르게 접히게 된다. 즉, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 종류와 상관없이 범용적으로 목적 단백질의 가용화를 증가시킬 수 있다. 이 경우 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA는, 융합 단백질과의 결합을 위해, 3'UTR에 헤어핀 구조 (융합 단백질의 RNA 결합 도메인이 결합하는 RNA 사이트를 포함)를 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 “샤페론 (chaperone)”은 다른 단백질의 구조적 접힘(folding)과 펼침(unfolding), 또는 조립(assembly)과 해체(disassembly)에 관여하는 단백질을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 샤페론은 목적 단백질의 접힘을 유도 또는 도와주는 기능을 하여, 목적 단백질의 가용화를 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 샤페론은 RNA 결합 도메인과의 융합 단백질 형태로 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA와 결합하여, 결국 번역된 목적 단백질 근처에서 목적 단백질의 접힘을 도와준다.
본 발명에서 샤페론은 목적 단백질의 접힘에 관여하는 한 미생물 유래 및 구체적인 서열에 제한이 없으나, 구체적으로 원핵생물(박테리아 등), 진핵생물 또는 고세균(archaea) 유래 단백질일 수 있으며, 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank 등에서 그 서열을 얻을 수 있다. 구체적으로, 상기 샤페론은 DnaJ, Dnak, GroEL, GroES, HtpG, ClpA, ClpX, 또는 ClpP일 수 있으며, 더욱 구체적으로, DnaJ 또는 Dnak일 수 있다. 상기 DnaJ 또는 Dnak는 서열번호 74 또는 75의 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 샤페론은 Hsp40, Hsp60, Hsp70, Hsp90, Hsp100 또는 Hsp104일 수 있다.
본 발명에서 샤페론은 동종 또는 이종의 두 개 이상의 샤페론 단위가 결합된 형태일 수 있다. 구체적으로, 상기 샤페론은 DnaJ 및 Dnak가 결합된 형태(DnaJK)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어 “RNA 결합 도메인(RNA binding domain, RBD)”은 RNA와 결합하는 도메인을 의미한다. 구체적으로, 본 발명에서 RNA 결합 도메인은 샤페론과 결합체 또는 융합 단백질을 형성하여, 상기 샤페론을 포함하는 결합체 또는 융합단백질이 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA와 결합하도록 만들 수 있다. 즉, 상기 RNA 결합 도메인은 융합단백질의 샤페론을 리보솜에 의해 번역되는 목적 단백질 근처에 위치시키는 바, 목적 단백질은 근처에 존재하는 샤페론을 통해 올바르게 접히게 된다.
본 발명에서 RNA 결합 도메인은, 목적 단백질을 포함하는 mRNA에 결합할 수 있는 한 미생물 유래 및 구체적인 서열에 제한이 없으나, 구체적으로 KH(K Homology) 도메인, 박테리오파지 MS2 외피 단백질(coat protein), 박테리오파지 PP7 외피 단백질, sterile alpha motif(SAM) 또는 RRM(RNA recognition motif)일 수 있다. 상기 RNA 결합 도메인은 공지의 데이터 베이스인 NCBI의 GenBank에서 그 서열을 얻을 수 있다. 또한, 상기 KH 도메인은 서열번호 76의 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 융합 단백질은 상기 하나 이상의 샤페론과 상기 RNA 결합 도메인을 포함한다. 또한, 상기 융합단백질은 샤페론이 RNA 결합 도메인의 N-말단; C-말단; 또는 N-말단 및 C-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다. 또한 상기 융합단백질은 RNA 결합 도메인이 샤페론의 N-말단; C-말단; 또는 N-말단 및 C-말단에 직접적으로 연결될 수도 있고, 링커를 통해 연결될 수도 있다.
상기 링커는 융합단백질의 샤페론과 RNA 결합 도메인이 활성을 나타내게 하는 한 특별히 이에 제한되지 않으나, 구체적으로는 글라이신, 알라닌, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 리신, 아르기닌산 등의 아미노산을 사용하여 연결시킬 수 있고, 더욱 구체적으로는 발린, 루이신, 아스파르트산, 글라이신, 알라닌, 프롤린 등을 여러개 사용하여 연결시킬 수 있으며, 더더욱 구체적으로는 유전자 조작의 용이성을 고려하여 글라이신, 발린, 루이신, 아스파르트산 등의 아미노산을 1개 내지 10개씩 연결하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에서는 샤페론의 C-말단과 RNA 결합 도메인의 N-말단을 G4S linker를 통해 연결시켜서 융합단백질을 제조하였다.
상기 융합단백질은 이에 포함되는 각 단백질 또는 도메인의 야생형의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 상이한 서열을 가지는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 폴리펩타이드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다. 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Thy/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly 간의 교환이다. 또한, 아미노산 서열상의 변이 또는 수식에 의해서 단백질의 열, pH 등에 대한 구조적 안정성이 증가하거나 단백질 활성이 증가한 단백질을 포함할 수 있다.
상기 융합단백질 또는 상기 융합단백질을 구성하는 폴리펩타이드는 당해 분야에 공지된 화학적 펩타이드 합성방법으로 제조하거나, 상기 융합단백질을 코딩하는 유전자를 PCR(polymerase chain reaction)에 의해 증폭하거나 공지된 방법으로 합성한 후 발현벡터에 클로닝하여 발현시켜서 제조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로써, 상이 융합 단백질은 샤페론인 DnaJ 및 Dnak(DnaJK)와 RNA 결합 도메인인 KH 도메인이 결합된 형태(DnaJK-KH)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 상기 단백질은 각 서열번호로 기재한 염기 서열에 의해 코딩되는 아미노산 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 97% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이러한 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 나타내는 아미노산 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
아울러, 본 발명의 상기 단백질을 코딩하는 유전자는 각 서열번호로 기재한 염기 서열뿐만 아니라, 상기 서열과 80% 이상, 구체적으로는 90% 이상, 보다 구체적으로는 95% 이상, 더욱 구체적으로는 98% 이상, 가장 구체적으로는 99% 이상의 상동성을 나타내는 염기 서열로서 실질적으로 상기 각 단백질과 동일하거나 상응하는 효능을 나타내는 단백질을 코딩하는 염기 서열이라면 제한없이 포함한다. 또한 이러한 상동성을 갖는 염기 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 염기 서열도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
본 발명에서 사용되는 용어, "상동성"이란, 단백질을 코딩하는 유전자의 염기 서열이나 아미노산 서열의 유사한 정도를 의미하는데, 상동성이 충분히 높은 경우 해당 유전자의 발현 산물은 동일하거나 유사한 활성을 가질 수 있다.
본 발명에서 용어 "프로모터"란, 적당한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 다른 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미하며, 본 발명에서 "작동가능하게 연결(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결(functional linkage)되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 이러한 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열을 작동가능하게 연결시키는 방법은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명에서 용어 "발현 벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 단백질을 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된, 상기 발현 카세트를 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함할 수 있다. 벡터는 적당한 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 발현 벡터는 숙주세포 내에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계, pET계, pCP계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC, pCP22, pAMT7, pET16b 벡터 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 사용 가능한 벡터는 특별히 제한되는 것이 아니며 공지된 발현 벡터를 사용할 수 있다. 또한, 세포 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내에 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 삽입시킬 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염색체 내로의 삽입은 당업계에 알려진 임의의 방법, 예를 들면, 상동재조합에 의하여 이루어질 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다. 상기 염색체 삽입 여부를 확인하기 위한 선별 마커(selection marker)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉 목적 핵산 분자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.
본 발명의 조성물은 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 상기 프로모터 및 발현 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 발현 카세트 또는 발현 벡터에 의해 전사된 mRNA는 목적 단백질의 RNA 및 이의 3'-UTR에 헤어핀(haripin) 구조를 가지고 있고, 상기 헤어핀과 상기 융합 단백질의 RNA 결합 도메인 부위가 결합할 수 있다. 상기 결합에 의해 융합 단백질의 샤페론 부분이, 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA의 3'-UTR에 집적된 지지체가 형성된다. 본 발명에서는 상기 지지체를 샤페론이 집적된 mRNA 지지체(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS)라고 명명하였다.
본 발명에서 상기 “헤어핀(haripin)”은 단일 가닥의 DNA 또는 RNA의 내부 염기끼리의 수소 결합에 의해 형성된, 2중 가닥 부분(stem)과 그것에 낀 고리(loop)부분으로 구성되는 구조를 의미한다. 상기 헤어핀은 스템-루프(Stem-loop)와 혼용된다. 상기 헤어핀의 서열은 당업계에 알려진 임의의 서열을 이용할 수 있다.
또한, 상기 헤어핀 구조는 융합 단백질의 RNA 결합 도메인, 즉 샤페론에 연결된 RNA 결합 도메인이 결합하는 RNA 서열(사이트)를 가질 수 있다. 따라서, 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터에 포함된 헤어핀 구조의 유전자는 상기 RNA 결합 도메인이 결합하는 RNA 서열을 전사하는 서열을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 헤어핀 구조의 유전자 사이에 스페이서(spacer) 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 스페이서 유전자는 유전자 사이의 비암호화 (non-coding) 유전자를 의미하는 것으로, 당업계에 알려진 임의의 서열을 이용할 수 있다.
본 발명에서 헤어핀 구조의 유전자는 하나 이상의 헤어핀 구조의 유전자를 가질 수 있다. 이 경우 목적 단백질의 서열을 포함하는 mRNA에 본 발명의 융합 단백질이 결합할 수 있는 헤어핀이 하나 이상 존재하는 바, 상기 mRNA에 샤페론을 더 많이 집적시킬 수 있다.
상기 하나 이상의 헤어핀 구조의 유전자는 헤어핀 구조와 헤어핀 구조 사이에 스페이서 유전자를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 발현 카세트 또는 발현 벡터는 리보솜 결합 사이트를 추가로 포함할 수 있다. 상기 "리보솜 결합 사이트 (Ribosome binding site, RBS)"란, 단백질이 생합성을 개시할 때, DNA로부터 전사된 mRNA가 숙주세포 내에서 리보솜과 결합할 수 있도록 하는, 리보솜 결합부위를 의미한다. 상기 리보솜 결합 사이트는 당업계에 알려진 임의의 서열을 이용할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 프로모터; 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 형질전환체를 제공한다. 구체적으로, 상기 형질전환체는 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함할 수 있다.
상기 프로모터, 샤페론, RNA 결합 도메인, 융합 단백질, 헤어핀 구조의 유전자, 발현 카세트, 발현 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 형질전환체는 CRAS 시스템을 통해 가용성이 증가된 목적 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어 "형질전환"은 본 발명의 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 숙주세포 내에 도입하여 숙주세포 내에서 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현할 수 있도록 하는 것을 의미한다. 형질전환된 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내에서 발현될 수 있기만 한다면, 숙주세포의 염색체 내에 삽입되어 위치하거나 염색체 외에 위치하거나 상관없이 이들 모두를 포함할 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 표적 단백질을 코딩하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 상기 폴리뉴클레오티드는 숙주세포 내로 도입되어 발현될 수 있는 것이면, 어떠한 형태로 도입되는 것이든 상관없다. 예를 들면, 상기 폴리뉴클레오티드는 자체적으로 발현되는데 필요한 모든 요소를 포함하는 유전자 구조체인 발현 카세트 (expression cassette)의 형태로 숙주세포에 도입될 수 있다. 상기 발현 카세트는 통상 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결되어 있는 프로모터 (promoter), 전사 종결신호, 리보좀 결합부위 및 번역 종결신호를 포함할 수 있다. 상기 발현 카세트는 자체 복제가 가능한 발현 벡터 형태일 수 있다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 그 자체의 형태로 숙주세포에 도입되어 숙주세포에서 발현에 필요한 서열과 작동 가능하게 연결되어 있는 것일 수도 있으며, 이에 한정되지 않는다. 상기 형질전환 하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO4) 침전, 염화칼슘 (CaCl2) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 형질전환체는 본 발명의 발현 카세트 또는 발현 벡터의 폴리뉴클레오티드가 코딩하는 단백질이 발현될 수 있는 한 제한되지 않으나, 구체적으로 식물, 박테리아, 균류, 효모, 또는 동물 세포일 수 있으며, 더욱 구체적으로, 에스체리치아(Escherichia) 속 미생물일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 목적 단백질의 가용화용 조성물, 또는 상기 형질전환체를 포함하는 목적 단백질 생산용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 프로모터, 샤페론, RNA 결합 도메인, 융합 단백, 발현 카세트, 발현 벡터는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 프로모터, 헤어핀 구조의 유전자, 발현 카세트, 발현 벡터는 전술한 바와 같다.본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 조성물 또는 형질전환체를 포함하는, 목적 단백질 생산용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (i) (a) 프로모터 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 및 (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 프로모터, 샤페론, RNA 결합 도메인, 융합 단백질, 헤어핀 구조의 유전자, 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환체는 전술한 바와 같다.
상기 (i) 형질전환체를 준비하는 단계는, (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이미 가지고 있는 숙주 세포에, (a) 프로모터 및 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가적으로 도입시키는 단계일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (i) 형질전환체를 준비하는 단계는, (a) 프로모터 및 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 이미 가지고 있는 숙주 세포에, (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가적으로 도입시키는 단계일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 (i) 형질전환체를 준비하는 단계는, (a) 프로모터 및 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터와 (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를, 순차적, 동시 또는 역순으로 숙주 세포에 도입시키는 단계일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 생산방법에 있어서, 상기 형질전환체를 배양하는 단계는, 특별히 제한되지 않으나, 공지된 회분식 배양방법, 연속식 배양방법, 유가식 배양방법 등에 의해 수행될 수 있다. 이때, 배양조건은, 특별히 이에 제한되지 않으나, 염기성 화합물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물 (예: 인산 또는 황산)을 사용하여 적정 pH (예컨대, pH 5 내지 9, 구체적으로는 pH 6 내지 8, 가장 구체적으로는 pH 6.8)를 조절할 수 있고, 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물을 배양물에 도입시켜 호기성 조건을 유지할 수 있다. 배양온도는 20 내지 45 ℃, 구체적으로는 25 내지 40 ℃를 유지할 수 있고, 약 10 내지 160 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한 되는 것은 아니다. 상기 배양에 의하여 생산된 목적 단백질은 배지 중으로 분비되거나 세포 내에 잔류할 수 있다.
아울러, 사용되는 배양용 배지는 탄소 공급원으로는 당 및 탄수화물 (예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방 (예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산 (예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알코올 (예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산 (예: 아세트산) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 질소 공급원으로는 질소-함유 유기 화합물 (예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물 (예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄) 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 인 공급원으로 인산 이수소칼륨, 인산수소이칼륨, 이에 상응하는 나트륨 함유 염 등을 개별적으로 사용하거나 또는 혼합하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 배지에는 기타 금속염 (예: 황산마그네슘 또는 황산철), 아미노산 및 비타민과 같은 필수성장-촉진 물질을 포함할 수 있다.
상기 생산방법은 형질전환체 또는 이의 배양물에서 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 배양 단계에서 생산된 목적 단백질을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 목적 단백질을 수집할 수 있다. 예를 들어, 세포 파쇄, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 형질전환체 또는 이의 배양물로부터 목적 단백질을 회수 할 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 제공한다.
상기 샤페론, 발현 카세트, 발현 벡터는 전술한 바와 같다.
상기 발현 카세트 또는 발현 벡터에 의해 샤페론과 목적 단백질이 함께 번역되어, 샤페론이 목적 단백질의 올바른 접힘을 증가시킬 수 있다. 본 발명에서 상기 시스템을 CLEX(chaperone-substrate co-localized expression) 시스템으로 명명하였다.
상기 (a) 및 (b)는 5'에서 3' 방향으로 순차적으로 또는 역순으로 연결될 수 있으며, (a) 또는 (b)의 종결코돈은 (b) 또는 (a)의 개시코돈과 오버랩핑될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 목적 단백질의 가용화용 조성물을 제공한다.
상기 샤페론, 발현 카세트, 발현 벡터는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 제공한다.
상기 샤페론, 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트; 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터; 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터를 포함하는 목적 단백질의 가용화용 조성물; 또는 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 포함하는, 목적 단백질 생산용 키트를 제공한다.
상기 샤페론, 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환체는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 (a) 샤페론 코딩하는 시스트론 및 (b) 목적 단백질을 코딩하는 시스트론을 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 형질전환체를 준비하는 단계; 및
(ii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법을 제공한다.
상기 샤페론, 발현 카세트, 발현 벡터, 형질전환체, 배양, 생산방법은 전술한 바와 같다.
상기 생산방법은 형질전환체 또는 이의 배양물에서 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
3'UTR 헤어핀 서열이 도입된 목적 단백질의 mRNA; 및 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질을 이용한 본 발명의 CRAS 시스템은 다양한 목적 단백질의 가용화를 향상시킬 수 있다. 또한, 두 개의 시스트론을 가진 본 발명의 CLEX 시스템은 다양한 목적 단백질의 가용화를 향상시킬 수 있다.
도 1은 샤페론이 집적된 mRNA 지지체(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS) 시스템에 의한 재조합 단백질의 가용화를 나타낸 도이다:
(a)는 CRAS 시스템을 보여주는 도이다. 샤페론 분자(DnaJ, DnaK, 또는 DnaJ와 DnaK의 결합체(DnaJ-DnaK))와 Nova-1의 RNA 결합 도메인 KH의 융합 단백질가 (c)에 기재된 KH 동족(cognate) 스템-루프 서열이 삽입된 목적 재조합 단백질과 함께 발현된다. mRNA의 3'UTR 내에 KH-결합 구조를 도입함으로써, 샤페론 결합체가 초기 단백질에 결합하여 단백질의 응집을 방지하거나, 또는 올바른 접힘을 위해 다른 샤페론 분자로 단백질을 이동시킨다.
(b)는 8개의 선택된 응집하기 쉬운 재조합 단백질(ScFv, HIV-1 protease, BR2-ScFv, UGD, Adh1p, UbiC, Leptin, BMP2)이 DnaJ-KH 단독; 또는 DnaJ-KH 및 3'UTR 헤어핀 루프와 함께 발현될 때의 가용화 결과를 나타낸 도이다.
(d)는 DnaJ-KH를 이용한 CRAS 시스템에서 가용화 되지 않은 4개의 재조합 단백질에 대해, 키메릭 DnaJ-KH을 이용한 CRAS 시스템을 적용한 경우 (+)하나 또는 세 개(+++)의 3'UTR 서열에 따라 가용화되는 결과를 나타낸 도이다
(e)는 CRAS 시스템의 in vivo 단백질 가용화 활성을 관찰하기 위한, 분할 GFP 실험을 보여주는 도식이다.
(f)는 CRAS 시스템을 이용한 sfGFP N-말단의 in vivo 가용화 결과를 보여주는 도이다. (1) pET16b 및 pAMT7 (음성 대조군); (2) pET16b-sfGFP 및 pAMT7-DnaJK-KH (양성 대조군); (3) KH 결합 헤어핀 및 DnaJ-KH의 부존재 조건의 sfGFP N-말단과 C-말단의 플라스미드; (4) 결합 헤어핀 존재 및 DnaJ-KH 부존재 조건의 sfGFP N-말단과 C-말단의 플라스미드; (5) KH 결합 헤어핀의 부존재 및 DnaJ-KH 존재 조건의 sfGFP N-말단과 C-말단의 플라스미드; (6) KH 결합 헤어핀 및 DnaJ-KH 존재 조건(CRAS 시스템)의 sfGFP N-말단과 C-말단의 플라스미드를 포함하는 대장균 BL21(DE3) 세포의 형광 강도 측정. 가용성 ScFv의 정량은 ImageJ v1.48 software (NHI, USA)를 사용하여 쿠마시 블루 염색을 통해 얻은 SDS-PAGE 이미지에서 수행되었다. (b), (d) 및 (f)의 오차 막대는 세 번의 독립적 실험으로부터 얻은 ±표준편차를 나타낸다.
도 2는 대장균 BL21(DE3)에서 하나의 루프(a) 또는 3개의 루프(b)를 가진 CRAS 시스템을 적용한 결과 ScFv의 시간별 가용화를 보여주는 도이다:
레인 M, 마커(ELPIS, Daejeon, South Korea); 레인 W, 세포 용해물 전체; 레인 S, 가용성 분획; 레인 I, 불용성 분획.
도 3은 CRAS 시스템에서 종결 코돈과 3'UTR 결합 루프 사이의 스페이서 길이에 따른 가용화 결과를 보여주는 도이다. 발현 유도 4시간 후 ScFv 단독 발현의 경우(a)와 비교하여 CRAS 시스템을 적용한 경우(b) ScFv의 가용화가 증가되었다.
레인 1, 종결 코돈과 3'UTR 결합 루프 사이의 스페이서가 없을 때; 레인 2, 종결 코돈과 3'UTR 결합 루프 사이에 5 nt 스페이서가 있을 때; 레인 3, 종결 코돈과 3'UTR 결합 루프 사이에 30 nt 스페이서가 있을 때; 레인 M, 마커; 레인 W, 세포 용해물 전체; 레인 S, 가용성 분획; 레인 I, 불용성 분획.
도 4는 dnaK 넉아웃 균주에서 CRAS 시스템에 따라 ScFv의 가용화가 증가되는 것을 보여주는 도이다(레인 C-: pET16b 및 pAMT7을 가진 대장균 BL21(DE3)의 세포 용해물 전체(음성 대조군), 레인 1: KH 결합 헤어핀 및 DnaJ-KH의 부존재 조건, 레인 2: KH 결합 헤어핀 존재 및 DnaJ-KH의 부존재 조건, 레인 3: KH 결합 헤어핀 부존재 및 DnaJ-KH의 존재 조건, 레인 4: KH 결합 헤어핀 및 DnaJ-KH의 존재 조건(RNA Scaffold), 레인 M: 마커, 레인 W: 세포 용해물 전체, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획).
도 5는 CLEX 시스템에 의한 재조합 단백질의 가용화를 나타낸 도이다.
(a)는 CLEX 시스템을 보여주는 도이다. 단일 mRNA 전사물로부터 근접한 DnaJ와 목적 단백질의 번역을 위해 번역적으로 결합된 두 개의 시스트론 발현 시스템이 이용된다.
(b)는 두 번째 시스트론의 개시코돈(ATG) 앞에, 첫 번째 시스트론의 종결 코돈(TAA)을 오버랩시키거나, 일렬로 나열하거나(tandem), 또는 n nt의 거리를 갖도록 설계된 서열을 보여주는 도이다. 첫번째 시스트론의 3' 서열 내 12개의 뉴클레오티드는 두번째 시스트론을 위해 리보솜 결합 사이트(RBS) 역할을 한다.
(c)는 CLEX 시스템에서 샤페론 DnaJ가 첫 번째 또는 두 번째 시스트론으로 사용되었을 때, 응집하기 쉬운 5개 재조합 단백질의 가용화를 보여주는 도이다.
(d)는 정확히 접힌 렙틴의 수준을 확인하기 위해 하기 플라스미드를 가진 대장균 BL21(DE3)에서 얻은 샘플의 OD450을 측정한 결과이다: pET16b(음성 대조군), pET16b-Leptin(렙틴의 과발현) 및 pET16b-DnaJ/Leptin (CLEX 시스템에서 DnaJ 및 렙틴의 과발현, CLEX 시스템)
(e)는 번역적으로 결합된 두 개의 시스트론 발현 구조에서 DnaJ-표적 단백질의 순서에 따른 BMP2의 가용화 결과를 보여주는 도이다.
(f)는 번역적으로 결합된 두 개의 시스트론 발현 구조에서 시스트론 사이의 거리에 따른 BMP2의 가용화 결과를 보여주는 도이다.
단백질 간의 빗금(/) 표시는 mRNA 내 각 단백질을 인코딩하는 유전자의 순서를 나타낸다. 상대적 발현 수준을 SDS-PAGE의 결과를 토대로 ImageJ v1.48 software(NJI, USA)를 사용하여 정량하였다. (c), (d), (e) 및 (f)의 오차 막대는 세 번의 독립적 실험으로부터 얻은 ±표준편차를 의미한다.
도 6은 dnaJ 넉아웃 균주(a) 또는 dnaK 넉아웃 균주(b)에서 CLEX 시스템에 따라 BMP2의 가용화가 증가되는 것을 보여주는 도이다(레인 C-: pET16b 및 pAMT7을 가진 대장균 BL21(DE3)의 세포 용해물 전체(음성 대조군), 레인 only BMP2: DnaJ 부존재 조건에서 BMP2 발현, 레인 BMP2+DnaJ: DnaJ 존재 조건에서 BMP2 발현, 레인 DnaJ/BMP2: CLEX 시스템에서 첫 번째 시스트론에 DnaJ, 두 번째 시스트론에 BMP2가 위치한 경우, 레인 M: 마커, 레인 W: 세포 용해물 전체, 레인 S: 가용성 분획, 레인 I: 불용성 분획).
도 7은 CLEX 시스템에서 재조합 단백질의 크기에 따른 가용화 결과를 나타낸 도이다:
(a)는 지방분해효소 TliA 내 DnaJ/DnaK 결합 서열의 분포를 빨간 직사각형 으로 나타낸 도이다. 결합 사이트는 Limbo 샤페론 결합 사이트 추정기를 사용하여 예측되었다.
(b)는 CLEX 시스템을 이용한 TliA1 단편의 가용화를 나타낸 도이다. TliA1 + DnaJ는 TliA와 DnaJ의 단순 동시 발현을 나타내며, DnaJ/TliA1은 DnaJ가 첫 번째 시스트론으로 사용될 때의 CLEX 시스템을 나타낸다. 상대적 발현 수준을 SDS-PAGE의 결과를 토대로 ImageJ v1.48 software (NJI, USA)를 사용하여 정량하였다. (b)의 오차 막대는 세 번의 독립적 실험으로부터 얻은 ±표준편차를 의미한다.
이하, 실시예 및 제를 통하여 본 발명의 구성 및 효과를 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실험예 1. 미생물, 효소 및 화학약품
대장균 XL1-Blue(Stratagene, La Jolla, CA, USA) 및 BL21(DE3)(Novagen, Madison, WI, USA) 균주를 사용하였다. XL-1 Blue 균주를 모든 클론닝에 사용하였고, BL21(DE3) 균주를 유전자 발현을 위해 사용하였다. 공지된 P1 형질 도입(Current protocols in molecular biology, 2007, Chapter 1, Unit1 17)을 통해 dnaJ와 dnaK 유전자가 없는 균주를 제작하였다. 단일 녹아웃(ΔdnaJ 및 ΔdnaK)을 가진 BW25113 균주를 Keio collection을 통해 얻었고, BL21(DE3)을 위한 공여 균주로서 사용하였다. 목적 유전자의 주변에 있는 프라이머 쌍을 사용하여 결실 균주를 스크리닝하기 위해 Colony PCR을 사용하였다(표 1). 그 후, pCP22 플라스미드 유래 FLP 재조합 효소를 통해 숙주 게놈 내 통합 영역에서 카나마이신 저항성 카세트를 제거하였다. 본 발명에 사용된 올리고뉴클레오티드(Genotech, 대전, 한국)와 유전자(Bioneer, 대전, 한국)을 표 1에 기재하였다. 화학약품은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 구매하였다.
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실험예 2. CRAS 시스템을 위한 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질 또는 목적 재조합 단백질을 인코딩하는 발현벡터의 제작
샤페론이 집적된 mRNA 지지체(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS) 시스템을 위해 샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질 또는 목적 재조합 단백질을 인코딩하는 발현벡터를 제작하였다.
먼저, 두 개의 강력한 T7 프로모터를 가진 pACYCDuet-1 벡터(Novagen, Madison, WI, USA)를 기초로 중간 복제수 벡터(medium-copy number vector)를 제작하기 위해, 낮은 복제수의 복제 원점(origin of replication)인 p15A를 중간 복제수의 복제 원점인 pBR322로 교체하여, pAMT7 벡터를 제작하였다.
샤페론 유전자 dnaJ (서열번호 74) 및 dnaK (서열번호 75)는 대장균 BL21(DE3)의 게놈 DNA를 토대로 PCR에 의해 증폭되었다. dnaJ와 dnaJ - KH의 높은 발현을 위해, 리보솜 결합 사이트(ribosome binding site, RBS) 계산기를 이용하여 합성 리보솜 결합 사이트를 설계하였고, DnaJNcoF 프라이머의 5'말단에 포함시켰다.
샤페론과 RNA 결합 도메인의 융합 단백질의 제작을 위해, 대장균 내의 발현에 최적화된 서열을 가진, Nova-1 KH3 RNA 결합 도메인(KH)의 유전자(서열번호 76) 를 합성하여, recombinant PCR을 통해 dnaJ 또는 dnaJK의 하류에 결합시켰다.
목적 재조합 단백질을 인코딩하는 유전자를 다양한 기원을 토대로 PCR을 통해 증폭하였다: scfv 및 br2 - scfv는 pBR2ScFv을 토대로 증폭하였고(PloS one, 2013, 8, e66084), ugd 및 ubiC는 대장균 BL21(DE3)의 게놈 DNA을 토대로 증폭하였고, adh1p는 S. cerevisae의 게놈 DNA을 토대로 증폭하였다. HIV1-Pr 유전자를 recombinant PCR을 이용하여 제작하였다(Protein expression and purification, 2015, 116, 59-65). tliA는 pTliA을 토대로 증폭하였다(Acs Catal, 2015, 5, 5016-5025). 초록 형광 단백질(GFP) 상보성 분석법을 위해, 수퍼폴더 초록 형광 단백질(sfGFP)(bioneer, 대전, 한국)을 주형으로 sfGFP의 N-말단과 C-말단을 증폭하였다. sfGFP의 높은 발현을 위해 합성 RBS 및 sfGFP의 N-말단을 RBS 계산기를 이용하여 설계하였고, sfGFPXbaF 프라이머의 5'말단에 포함시켰다. 사용된 프라이머는 상기 표 1에 나타내었다.
정제 목적으로 6×His-tag를 HIV1-Pr의 경우 정방향 프라이머의 N-말단에, 목적 재조합 단백질의 경우 역방향 프라이머의 C-말단에 추가하였다. HIV1-Pr의 높은 발현을 위해 합성 RBS를 RBS 계산기를 이용하여 설계하였고, HIVPrXbaF 프라이머의 5'-말단에 포함시켰다. PCR 결과물과 그에 상응하는 발현 벡터를 표 1에 나타낸 제한효소를 사용하여 절단하고, 그 후 샤페론의 경우 pAMT7, 재조합 단백질의 경우 pET16b에 연결시켰다.
실험예 3. CRAS 시스템을 위한 RNA 지지체(scaffold)의 제작
샤페론이 집적된 mRNA 지지체(chaperone-recruiting mRNA scaffold, CRAS) 시스템을 위해 RNA 지지체를 제작하였다. 구체적으로, RNA 지지체 시스템에 사용되는 KH 도메인을 위한 결합 루프의 서열을 RNA Designer 및 mFold를 사용하여 설계하였다(Journal of molecular biology, 2004, 336, 607-624; Science 1989, 244, 48-52). 서열 제약(constraint)은 다음과 같다;
5'-NNNNNNNNACCTAGATCACC(서열번호 77)NNNNNNNN-3', 여기서 N은 8 bp의 스템 구조를 위한 임의의 뉴클레오티드를 나타내며, 밑줄로 표시된 서열은 KH RNA 결합 도메인을 위한, 결합 서열을 포함하는 루프 구조를 나타낸다.
다수의 결합 루프를 가진 RNA 지지체 시스템의 경우, 각각의 스템 루프 구조 사이에 5 nt 스페이서를 추가하는 유사 접근(similar approach)을 이용하여, 스템-루프 구조를 설계하였다. 3'UTR 내 스템-루프 구조의 서열을 가진 역방향 프라이머를 이용한 PCR에 의해 목적 단백질 유전자에 대한 스템-루프 구조를 제작하였다.
실험예 4. CLEX 시스템의 제작
DnaJ 샤페론과 재조합 단백질(ScFv, UbiC, Leptin, HIV1-Pr, BMP2 및 TliA)의 CLEX 시스템을 DnaJ가 첫 번째 또는 두 번째 시스트론에 배치되는 두 개의 다른 배열로 제작하였다. EEVE의 아미노산 서열(EEVE, 서열번호 78)을 인코딩하고, 샤인-달가노(Shine-Dalgarno, SD) 서열(밑줄 부분)을 포함하는 12 nt로 구성된 영역(5'-GAGGAGGTGGAA-3', 서열번호 79)이 두번째 시스트론 내 유전자의 번역 개시를 향상시키기 위해, 첫번째 시스트론 내 유전자의 C-말단에 도입되었다. 게다가 번역 공역(translational coupling)을 보장하고, DnaJ와 재조합 단백질 사이의 상호작용을 촉진하기 위해, 1 nt (5'-TAATG-3')을 통해 첫 번째 시스트론의 종결 코돈을 두 번째 시스트론의 개시 코돈과 오버랩핑되게 만들었다. CLEX 시스템을 제작하기 위해 DnaJ 샤페론과 재조합 단백질을 recombinant PCR을 이용하여 조립하였다. 프라이머 서열은 표 2에 나타내었다. PCR 결과물과 pET16b는 표 2에 기재된 제한 효소에 의해 절단되어, 발현 벡터에 연결되었다.
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실험예 5. 단백질 가용화 ( Solubilization ) 측정 방법
대장균 BL2(DE3)을 샤페론의 플라스미드와 목적 재조합 단백질의 플라스미드로 함께 형질전환하였다. 그 후 최종 농도가 각각 50μg/ml와 25μg/ml인 암피실린과 클로람페니콜이 보충된, 3ml의 LB(Lysogenic Broth) 배지(10 g/l 트립톤, 5 g/l 이스트 추출물, 및 10 g/l 염화나트륨)에 상기 대장균을 접종하여, 회전 진탕기(200rpm)에서 밤새 37℃로 배양하였다. 그 후 최종 농도가 각각 50μg/ml와 25μg/ml인 암피실린과 클로람페니콜이 보충된, 100ml LB 배지에 1ml의 배양물을 접종시킨 후, 200rpm에서 37℃로 배양하였다. OD600가 0.5-0.6에 도달했을 때, 0.5mM 아이소프로필 β-d-1-싸이오갈락토피라노사이드(Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside, IPTG)를 첨가하여 샤페론과 목적 단백질의 발현을 유도한 후, 4 시간 동안 추가 배양(37℃, 200rpm)하였다. 그 후, OD600값이 2일 때, 세포 배양액 3ml (약,1.6 × 109 cells 포함)를 원심분리한 후, 10mM Tris-EDTA(TE) 버퍼(pH 7.6) 500μl에 재현탁하고, 초음파처리에 의해 용해시켰다. 가용성 및 불용성 분획을 원심분리(21,600×g, 15분, 4℃)를 통해 분리하였다. 불용성 펠릿을 1% Triton X-100으로 두 번 세척하였고, 10mM TE 버퍼(pH 7.6)에 재현탁시킨 후 불용성 분획으로 사용하였다. 목적 재조합 단백질의 가용성을 도데실 황산 나트륨 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법(SDS-PAGE)을 이용하여 측정하였다. 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된 SDS-PAGE 겔 내 세포 용해물 전체 및 목적 재조합 단백질의 가용성 분획의 밴드 강도를 ImageJ 소프트웨어를 통해 비교하여, 가용성 목적 재조합 단백질의 상대적 백분율을 계산하였다.
실험예 6. 단백질 정제 방법
pAMT7-DnaJ-KH를 가진 대장균 BL21(DE3)을 최종 농도 25 μg/ml의 클로람페니콜이 보충된 LB 배지에서 배양하였다. 상기 대장균은 회전 진탕기(200rpm)에서 37℃로 밤새 배양되었다. 그 후 최종 농도 25 μg/ml의 클로람페니콜이 보충된 100ml LB 배지에 1ml 배양물을 접종시킨 후 200rpm에서 37℃로 배양하였다. OD600가 0.6에 도달했을 때, DnaJ-KH 단백질의 발현을 유도하기 위해 0.5mM IPTG를 첨가하여, 4시간 동안 추가적으로 배양하였다(37℃, 200rpm). 그 후, 20ml의 세포를 원심분리를 통해 수확하고, 1× Native IMAC 용해 버퍼(Biorad, Hercules, CA, USA)에 재현탁시켜, 초음파처리에 의해 용해시켰다. 투명해진 세포 용해물을 다시 원심분리하였다(21,600×g, 15분, 4℃). 자동화된 ProfiniaTM 단백질 정제 시스템(Biorad, Hercules, CA, USA)의 Native IMAC 방법을 이용하여, 가용성 분획에서 DnaJ-KH를 정제하였다. 그 후 인산완충식염수(PBS) pH 7.4와 5mM DTT, 100mM NaCl 및 10%의 글리세롤을 함유한, 25mM Tris-HCl 버퍼(pH 8.8)를 이용하여 정제된 DnaJ-KH를 투석하였다.
실험예 7. GFP 상보성 분석법
CRAS 시스템에서 재조합 단백질의 정확한 폴딩을 공지된 GFP 상보성 분석법(Nature methods, 2012, 9, 671-675)을 일부 변형하여 평가하였다. pAMT7-DnaJK-KH 및 pET16b-sfGFP/pET16b-CsfGFP-NsfGFP/pET16b-CsfGFP-NsfGFP3L을 가진 대장균 BL21(DE3)을 최종 농도가 각각 50μg/ml와 25μg/ml인 암피실린과 클로람페니콜이 보충된, LB 배지에서 접종하여, 회전 진탕기(200rpm)에서 밤새 37℃로 배양하였다. 그 후 최종 농도가 각각 50μg/ml와 25μg/ml인 암피실린과 클로람페니콜이 보충된, 100ml LB 배지에 1ml의 배양물을 접종시킨 후, 200rpm에서 37℃로 배양하였다. OD600가 0.6에 도달했을 때, 0.5mM IPTG를 첨가하여 DnaJK-KH와 목적 단백질의 발현을 유도한 후, 4 시간 동안 추가 배양(37℃, 200rpm)하였다. 그 후, 1ml의 세포를 원심분리를 통해 수확하고, 500μl PBS(pH 7.4)에 재현탁시킨 후, OD600가 1에 도달할 때까지 희석시켰다. 그 후 96웰의 black plate(SPL Life Sciences, 포천, 한국)에 로딩하였다. Tecan Infinite F200 PRO instrument (Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)를 사용하여 각 웰 마다 형광 강도를 측정하였다(λexc = 488 nm / λem = 530 nm).
실험예 8. 전기 영동성 변화 분석법 (Electric Mobility Shift Assay, EMSA )
루프가 없거나, 하나 및 세 개의 루프를 가진, anti p21ras-ScFvdml의 mRNA를 HiScribe™ T7 High Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolab, Beverly, MA)를 이용하여 제조하였다. 0.1nM mRNA를 함유한, PBS(pH 7.4)와 200μM의 정제된 DnaJ-KH를 혼합하였다. 그 후 혼합물을 25℃에서 30분간 배양하였고, 2% 아가로스 겔을 함유한, Tris-boric acid-EDTA 버퍼를 이용하여 전기영동을 통해 분석하였다. 전기영동은 50V에서 20분간 수행하였다. 그 후, 겔을 Gel-Doc gel documentation system (Bio-Rad, Hercules, CA)를 사용하여 시각화하였다.
실험예 9. 렙틴 활성 측정 방법
pET16b-DnaJLep 또는 pET16b-Lep을 가진 대장균 BL21(DE3)을 최종 농도 50 μg/ml의 암피실린이 보충된, LB 배지에서 회전 진탕기(200rpm)을 사용하여 37℃로 밤새 배양하였다. 그 후 최종 농도 50 μg/ml의 암피실린이 보충된, 100ml LB 배지에 1ml 배양물을 접종시킨 후 200rpm에서 37℃로 배양하였다. OD600가 0.6에 도달했을 때, 0.5mM IPTG를 첨가한 후 4시간 동안 추가 배양하여(37℃, 200rpm), DnaJ와 렙틴의 발현을 유도하였다. 그 후, 20ml의 세포를 원심분리를 통해 수확하고, 1× PBS(pH 7.4)에 재현탁시킨 후 초음파처리에 의해 용해시켰다. 투명해진 세포 용해물을 다시 원심분리하였다(21,600×g, 15분, 4℃). 정제된 렙틴의 활성을 ELISA을 사용하여 분석하였다. 투명해진 세포 용해물(8 mg/ml)의 40μg의 가용성 분획을 96웰 플레이트(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)에 탄산염-중탄산염 버퍼와 함께 37℃에서 1시간 동안 로딩하였다. 그 후 플레이트를 1× PBS-T (0.5% Tween-20을 함유한 1× PBS)로 세 번 씻어낸 후, 각 웰을 보바인 세럼 알부민(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)으로 1시간 동안 블럭시켰다 그 후 항-렙틴 항체(Abcam, Cambridge, UK)를 각 웰에 첨가하고, 1시간 동안 상온에서 배양하였다. 플레이트를 세척한 후 horseradish peroxide-conjugated anti-rabbit monoclonal antibody(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)와 함께 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 그 후 플레이트를 1× PBS-T로 4번 세척한 후 과산화효소 반응을 개시하기 위해 100　μl의 TMB (3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine) 과산화효소 기질(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)을 첨가하였다. 반응을 멈추기 위해, 50μl의 2M H2SO4를 각 웰에 첨가하였다. ELISA reader(Infinite M200 PRO; Tecan Group Ltd., Mannedorf, Switzerland)를 이용하여 각 웰의 450nm 흡광도를 측정하였다.
실시예 1. 다양한 볼용성 단백질에 CRAS 시스템 적용 결과
박테리아의 분자적 샤페론 시스템의 필수 요소인 DnaJ는, 번역되거나 또는 잘못 접힌 단백질과 상호작용하고, 바르게 접힌 단백질을 생산하기 위해 DnaK 또는 GroESL과 같은 폴다제(foldase) 샤페론과 단백질의 상호작용을 촉진한다. 번역 직후의 빠른 접힘을 위해 DnaJ를 목적 단백질의 번역 종결 사이트에 배치함으로써, DnaJ와 목적 단백질간의 공간 근접성을 증가시켰다. 고정(anchoring)을 위해, 인간 Nova-1 단백질에서 유래된 서열 특이적 RNA 결합 도메인(KH)과 DnaJ를 결합시켰다(도 1a). DnaJ-KH(DnaJ와 KH의 결합체)와 3'UTR 헤어핀 루프의 상호작용을 겔지체분석법(gel retardation assay)을 통해 확인하였다. 항-Ras ScFv(single chain variable fragment), ScFv와 항균 펩티드 BR2의 결합체(BR2-ScFv), UDP-6-글루코오스 탈수소효소(UDP-6-glucose dehydrogenase, UGD), UbiC(pyruvate chorismate lyase), BMP2(bone morphogenetic protein 2), 렙틴, Adh1p(alcohol dehydrogenase 1p) 및 대장균의 HIV-1 단백질 분해효소(HIV1-Pr) 등의 불용성 재조합 단백질의 용해도를 증가시키기 위해, 상기 단백질을 CRAS(chaperone recruiting mRNA scaffold) 시스템에 적용하였다.
그 결과, 단백질과 DnaJ-KH가 공간 제약 없이(결합 루프 없이) 함께 발현되거나, 또는 단백질 단독으로 발현되는 경우보다, CRAS 시스템이 적용된 경우 ScFv, BR2-ScFv 및 UGD의 용해도가 매우 높게 증가되었다(도 1b).
실시예 2. CRAS 시스템에서 3'UTR 헤어핀 루프의 수 및 종결 코돈과 첫 번째 루프 사이의 거리에 따른 가용화 결과
그러나, CRAS 시스템은 Adh1p, HIV1-Pr, UbiC, Leptin 및 BMP2의 용해도는 증가시키기 못하였다(도 1b). 이를 해결하기 위해, 3'UTR 헤어핀 루프의 수를 증가시켰다. 먼저, 다수의 3'UTR 헤어핀 루프를 원하는 구조로 만들기 위해 컴퓨터 시뮬레이션을 통해 설계 및 검증하였다(도 1c).
그러나, 3'UTR 헤어핀 루프의 3개까지도 단백질의 용해도 증가에 유의적인 영향은 없었다. 다만, 이 경우 ScFv의 가용성 분획의 비율은 18시간의 발현 동안 일정한 반면, 하나의 3'UTR 헤어핀 루프를 가진 단백질의 용해도는 점진적으로 감소하였다(도 2). 이는 단백질의 생산 수율을 높이기 위해 매우 중요하다.
또한, 종결 코돈과 첫 번째 루프 구조 사이에 30 nt 이하의 공간은 ScFv의 용해도 증가에 아무런 영향이 없었다(도 3). 이 결과는 종결 코돈과 DnaJ까지의 거리에 대해 시스템이 유연성을 가짐을 의미한다.
실시예 3. ΔdnaJ 균주와 ΔdnaK 균주에서 CRAS 시스템 적용 결과 확인
DnaK 샤페론 시스템은 대장균에 자연적으로 존재하고, 본 발명의 시스템은 DnaJ 샤페론을 번역 사이트에 고정시키는 것이기 때문에, 대장균의 게놈에서 dnaJ 또는 dnaK를 결손시킨 후 CRAS 시스템을 이용하여 ScFv의 용해도 증가 여부를 측정하였다. mRNA을 표적으로 하는 DnaJ만이 ScFv와 효율적으로 상호작용할 수 있고, ΔdnaK 균주에서는 폴다제 샤페론의 결핍으로 CRAS 시스템의 기능이 감소될 수 있기 때문에, ΔdnaJ 균주에서 용해도 증가 효율이 동일할 것이라 예상하였다. 그러나, ΔdnaJ 균주는 예상과 일치하였으나, ΔdnaK 균주는 ScFV의 용해도가 약간 증가하였다(도 4). 이는, DnaJ 단독이 재조합 단백질의 용해도를 증가시키는 샤페론으로서 기능할 수 있도록, CRAS 시스템이 DnaJ의 폴다제 활성을 증가시켰음을 시사한다.
실시예 4. DnaJ , DnaK 및 KH의 결합체 ( DnaJ - DnaK - KH )의 CRAS 시스템 적용 결과
샤페론 단백질의 공간 범위를 제한하는 방법과 각 샤페론의 회전수(turnover number)를 증가시키는 방법을 통해 CRAS 시스템의 효율을 증가시키고자 하였다. 이를 위해 DnaJ, DnaK 및 KH의 결합체인, 키메라 샤페론 DnaJ-DnaK-KH (DnaJK-KH)를 제작하여, CRAS 시스템에 적용하였다.
그 결과, 불용성 단백질의 용해도가 매우 높게 증가되어, 발현된 단백질의 90%까지 가용성 형태를 가짐을 확인하였다(도 1d). 또한, DnaJK-KH 및 KH 헤어핀 루프의 수를 증가시킬수록 DnaJ-KH의 경우보다 목적 단백질의 용해도가 단백질 발현 후 빠르게 증가함을 확인하였다(도 1d). 이는 번역 과정과 함께 근접한 샤페론의 수가 접힘 반응의 제한 요인이라는 것을 시사한다.
실시예 5. CRAS 시스템에서 GFP 상보성 분석 결과
In vivo에서 목적 단백질의 기능적 접힘을 관찰하기 위해, 수퍼폴더 초록 형광 단백질(sfGFP)를 N-말단(N-sfGFP)과 C-말단(C-sfGFP)으로 나누어, GFP 상보성 분석법을 설계했다(도 1e). N-sfGFP는 용해도가 낮은 바, CRAS 시스템의 기능을 증명하는 목적 단백질로 선정되었다. 형광의 수준은 가용화된 기능성 N-sfGFP의 수준을 나타낸다. DnaJK-KH 및 이와 상호작용하는 N-sfGFP를 발현시킴과 동시에 C-sfGFP를 발현시키는 것은, 두 단편을 함께 발현하는 세포의 형광 강도를 두배로 증가시킨 반면, DnaJ-KH와 상호작용하는 N-sfGFP의 3'UTR에 3개의 루프를 도입한 결과 약 8배의 형광 강도가 증가하였다. 이는 sfGFP의 전장 단백질에 의해 방출되는 형광 강도의 90%에 해당하는 수치이다. 이는 CRAS 시스템이 용해도뿐만 아니라, 기능적 활성 단백질의 발현도 증가시킬 수 있다는 것을 의미한다(도 1f).
실시예 6. CLEX 시스템 적용 결과
번역 기작에 근접한 샤페론의 수를 제한하지 않고, 샤페론과 기질에 대한 공간 제약의 중요성을 증명하기 위해, 불용성이 매우 강한 단백질을 가용화시킬 수 있는, 번역적으로 결합된 두 개의 시스트론 발현 시스템(translationally coupled two-cistron expression system)인 CLEX(chaperone-substrate co-localized expression) 시스템을 제작하였다(도 5a). 첫 번째와 두 번째 시스트론의 종결코돈과 시작코돈의 오버랩핑(5'-TAATG-3')을 통해 리보솜 복합체가 전사물을 빠져나오지 않고, 두번째 시스트론을 번역할 수 있도록 하였다. 또한, CLEX 시스템에서 DnaJ는 첫 번째 또는 두 번째 시스트론의 목적 단백질을 인코딩하는 유전자에 연결되어있고, 첫 번째 시스트론은 두 번째 시스트론을 위해 리보솜 결합 사이트(RBS)를 포함하는, 5'-GAGGAGGTGGAA-3' 서열(서열번호 79)을 가지도록 설계하였다(밑줄 서열: RBS 또는 Shine-Dalgarno sequence). 두 개의 시스트론 사이의 통합 서열과 관련하여, 오버랩핑된 두 개의 시스트론, 탠덤 형태의 두 개의 시스트론 및 n bp의 거리를 갖는 두 시스트론을 설계하였다(도 5b).
그 결과, 오버랩핑된 종결-개시 코돈을 가진 CLEX 시스템은 CRAS 시스템에 의해 가용화되지 않은 BMP2를 포함하여, 불용성이 매우 강한 단백질의 가용화에 매우 효과적이었다. 평균적으로 60%에서 90% 이상의 재조합 단백질들을 가용성 형태로 얻을 수 있었다(도 5c). 특히 렙틴의 경우 실험예 9의 방법에 따라 구조 특이적 항체를 이용하여 정확히 접힌 상태임을 확인하였다(도 5d).
또한, DnaJ의 역할은 발현 수준 및 반응 시간의 차이를 가져오는 두 시스트론의 순서에 따라 다름을 확인하였다(도 5c). 샤페론이 첫 번째 시스트론에서 발현되었을 때 더 많은 가용성 분획이 확인되었다. 이는 두 번째 시스트론의 번역에 앞서 이용가능한 샤페론을 준비할 수 있기 때문이다. 또한, DnaJ-BMP2 배열의 경우 이의 역순보다 더 긴 장기간의 단백질 발현(유도 후 18시간 까지)을 보여주었다(도 5e). 이는 샤페론과 단백질간의 시기적절한 상호작용이 샤페론 반응에 관련된 구성 성분의 양보다 더욱 중요하다는 것을 시사한다.
또한, 10 nt까지 유전자간 서열을 증가시켜 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 5f). 두 유전자 사이에 추가된 뉴클레오티드는 두 단백질 사이의 이론 공연비(stoichiometric ratio)뿐만 아니라, DnaJ와 목적 재조합 단백질의 근접성을 변화시켜, 전사물의 이차 구조 및 두 번째 시스트론의 번역 개시를 위한 친화도를 바꿀 수 있다.
실시예 6. ΔdnaK 균주에서 CLEX 시스템 적용 결과
CLEX 시스템의 재조합 단백질의 가용화에 있어서, DnaK의 역할을 확인하기 위해 ΔdnaK 균주를 이용하였다(도 6).
그 결과, CLEX 시스템에서 DnaJ는 DnaK가 없이도 BMP2 단백질을 충분히 가용화시킬 수 있음을 확인하였다. 이는 DnaJ가 DnaK에 비의존적인 폴다제 활성을 가지거나, 또는 대장균 내 단백질 접힘에 있어서 다른 샤페론 시스템이 관여함을 시사한다. 이를 통해, 단독 샤페론 DnaJ를 이용하는 CLEX 시스템이 매우 높은 효율을 가짐을 알 수 있었다.
실시예 7. TliA 1에 CLEX 시스템 적용 결과
비록 다양한 재조합 단백질이 성공적으로 가용화되었지만, TliA(52kDa 지방분해효소)와 같은 고분자 단백질의 용해도 증가에서는 미미한 증가만을 얻을 수 있었다. 이는 고분자 단백질은 잘못 접히기 쉬운 다수의 도메인을 가지는 경향이 있으며, 본 발명의 시스템이 비가역적인 잘못 접힘 전에 샤페론과 다수의 기질과의 상호작용을 촉진 시키기에는 불충분하기 때문인 것으로 판단되었다. 이를 확인하기 위해, tliA 유전자를 두 조각(tliA1 , tliA2)으로 자른 후 본 발명의 시스템에 적용하였다.
그 결과, TliA1은 매우 불용성인 반면, TliA2는 가용성이었다(도 3a 및 3b). tilA1을 두 번째 시스트론에서 발현시킨 CLEX 시스템의 경우 약 60%의 TliA1이 가용화된 반면, 단순히 TliA1과 DnaJ를 함께 발현시킨 경우 25%의 TliA1이 가용화되었다(도 3b). 이 결과는 단백질 길이 및 도메인 배열과 같은, TliA의 내재적 특성이 불용성의 주요 원인이며, 내부의 잘못 접히기 쉬운 영역을 샤페론에게 충분히 노출시킬 수 있는, 본 발명의 시스템을 통해 고분자 단백질의 용해도를 증가시킬 수 있음을 시사한다.
CRAS 시스템은 샤페론을 mRNA의 3'UTR에 위치시키는 반면, CLEX 시스템은 목적 단백질과 함께 계속 새로운 샤페론 분자를 생산하여, 그들의 빠른 상호작용을 촉진시켰다. 가용화 활성을 고려했을 때, CLEX 시스템은 CRAS 시스템보다 우수하다. 그러나, CLEX 시스템은 각 재조합 단백질 별로 dnaJ가 두 개의 시스트론 시스템으로 클로닝되어야 하기 때문에, 다수의 단백질을 동시에 가용화시키는 것에 한계가 있다. 이와 반대로, 세 개의 루프 및 DnaJK-KH를 가진 CRAS 시스템은, 각 mRNA에 간단히 3'UTR KH 결합 헤어핀 서열을 도입하여, 세포 내에서 발현된 다수의 단백질의 용해도를 향상시킬 수 있다. 따라서, CRAS 시스템은 대사 경로에 관여하는 기능성 효소들의 가용성 분획을 증가시키는 데에 사용될 수 있으며, CLEX 시스템은 치료용 펩티드, 효소 또는 펩티드처럼 한 종류의 재조합 단백질을 생산하는 데에 좀더 적합하다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Intelligent Synthetic Biology Center <120> A composition for solubilization of target proteins and use thereof <130> KPA161671-KR <160> 79 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DnaJNcoF <400> 1 tgataaccat ggaagattct acggttaaca caatggctaa gcaagattat tacg 54 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DnaJXhoR <400> 2 atttcactcg aggcgggtca ggtcgtcaaa 30 <210> 3 <211> 94 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHNcoF1 <400> 3 taatgaccat ggaaaccgac ggttctaaag acgttgttga aatcgctgtt ccggaaaacc 60 tggttggtgc tatcctgggt aaaggtggta aaac 94 <210> 4 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHRecR1 <400> 4 gcccggaaca aattcacctt ttttagaaat ctggatacga gcacctgtca gttcctggta 60 ttcaaccagg gttttaccac ctttacccag ga 92 <210> 5 <211> 92 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> KHRecF2 <400> 5 aaaaggtgaa tttgttccgg gcacccgtaa ccgtaaagtt accatcacag gcaccccggc 60 tgctacccag gctgctcagt acctgatcac ac 92 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900 actcgtgcga aactggaaag cctggttgaa gatctggtaa accgttccat tgagccgctg 960 aaagttgcac tgcaggacgc tggcctgtcc gtatctgata tcgacgacgt tatcctcgtt 1020 ggtggtcaga ctcgtatgcc aatggttcag aagaaagttg ctgagttctt tggtaaagag 1080 ccgcgtaaag acgttaaccc ggacgaagct gtagcaatcg gtgctgctgt tcagggtggt 1140 gttctgactg gtgacgtaaa agacgtactg ctgctggacg ttaccccgct gtctctgggt 1200 atcgaaacga tgggcggtgt gatgacgacg ctgatcgcga aaaacaccac tatcccgacc 1260 aagcacagcc aggtgttctc taccgctgaa gacaaccagt ctgcggtaac catccatgtg 1320 ctgcagggtg aacgtaaacg tgcggctgat aacaaatctc tgggtcagtt caacctagat 1380 ggtatcaacc cggcaccgcg cggcatgccg cagatcgaag ttaccttcga tatcgatgct 1440 gacggtatcc tgcacgtttc cgcgaaagat aaaaacagcg gtaaagagca gaagatcacc 1500 atcaaggctt cttctggtct gaacgaagat gaaatccaga aaatggtacg cgacgcagaa 1560 gctaacgccg aagctgaccg taagtttgaa gagctggtac agactcgcaa ccagggcgac 1620 catctgctgc acagcacccg taagcaggtt gaagaagcag gcgacaaact gccggctgac 1680 gacaaaactg ctatcgagtc tgcgctgact gcactggaaa ctgctctgaa aggtgaagac 1740 aaagccgcta tcgaagcgaa aatgcaggaa ctggcacagg tttcccagaa actgatggaa 1800 atcgcccagc agcaacatgc ccagcagcag actgccggtg ctgatgcttc tgcaaacaac 1860 gcgaaagatg acgatgttgt cgacgctgaa tttgaagaag tcaaagacaa aaaataa 1917 <210> 76 <211> 276 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nova-1 KH3 RNA binding domain <400> 76 accgacggtt ctaaagacgt tgttgaaatc gctgttccgg aaaacctggt tggtgctatc 60 ctgggtaaag gtggtaaaac cctggttgaa taccaggaac tgacaggtgc tcgtatccag 120 atttctaaaa aaggtgaatt tgttccgggc acccgtaacc gtaaagttac catcacaggc 180 accccggctg ctacccaggc tgctcagtac ctgatcacac agcgtatcac ctacgaacag 240 ggtgttcgtg ctgctaaccc gcagaaagtt ggttaa 276 <210> 77 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> loop having the binding site for KH RNA binding domain <400> 77 acctagatca cc 12 <210> 78 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a region introduced into the C-terminus of first cistron <400> 78 Glu Glu Val Glu 1 <210> 79 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a region introduced into the C-terminus of first cistron <400> 79 gaggaggtgg aa 12

Claims (19)

  1. 프로모터 및 샤페론과 RNA 헤어핀 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물로서,
    상기 샤페론이 DnaJ 및 DnaK이고,
    상기 목적 단백질이 HIV-1 protease, UbiC (pyruvate chorismate lyase) 또는 Leptin인, 조성물.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 RNA 헤어핀 결합 도메인은 KH(K Homology) 도메인, 박테리오파지 MS2 외피 단백질, 박테리오파지 PP7 외피 단백질, SAM(sterile alpha motif) 또는 RRM(RNA recognition motif)인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 샤페론이 RNA 헤어핀 결합 도메인의 N-말단 또는 C-말단에 결합된 것인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 융합 단백질은 샤페론 및 RNA 헤어핀 결합 도메인이 링커를 통하여 결합된 것인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  8. 제1항 또는 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터는 리보솜 결합 사이트(Ribosome binding site, RBS)를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 발현 카세트 또는 발현 벡터는 목적 단백질을 코딩하는 유전자와 헤어핀 구조의 유전자 사이에 스페이서(spacer) 유전자를 추가로 포함하는 것인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 헤어핀 구조의 유전자는 하나 이상의 헤어핀 구조의 유전자를 가지는 것인, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 헤어핀 구조는 헤어핀 구조와 헤어핀 구조 사이에 스페이서 유전자를 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  12. 제7항에 있어서, 상기 헤어핀 구조의 유전자는 샤페론에 연결된 RNA 결합 도메인이 결합하는, RNA 사이트를 전사하는 서열을 포함하는, 목적 단백질의 가용화용 조성물.
  13. 프로모터; 및 샤페론과 RNA 헤어핀 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는, 인간을 제외한 형질전환체로서,
    상기 샤페론이 DnaJ 및 DnaK인, 형질전환체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 형질전환체는 식물, 박테리아, 균류, 효모, 또는 분리된 동물 세포로부터 선택되는 것인, 형질전환체.
  15. 제13항에 있어서, 상기 형질전환체는 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 추가로 포함하는, 형질전환체로서,
    상기 목적 단백질이 HIV-1 protease, UbiC (pyruvate chorismate lyase) 또는 Leptin인, 형질전환체.
  16. 삭제
  17. 제1항 또는 제7항의 조성물, 또는 제13항 또는 제15항의 형질전환체를 포함하는, 목적 단백질 생산용 키트로서,
    상기 목적 단백질이 HIV-1 protease, UbiC (pyruvate chorismate lyase) 또는 Leptin인, 키트.
  18. (i) (a) 프로모터 및 샤페론과 RNA 헤어핀 결합 도메인의 융합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터 및
    (b) 프로모터; 목적 단백질을 코딩하는 유전자; 및 이의 3' 말단에 헤어핀(haripin) 구조의 유전자를 포함하는 발현 카세트, 또는 상기 발현 카세트를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 인간을 제외한 형질전환체를 준비하는 단계; 및
    (ii) 상기 형질전환체를 배양하는 단계를 포함하는, 목적 단백질의 생산방법으로서,
    상기 샤페론이 DnaJ 및 DnaK이고,
    상기 목적 단백질이 HIV-1 protease, UbiC (pyruvate chorismate lyase) 또는 Leptin인, 생산방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 방법은 (iii) 형질전환체 또는 이의 배양물에서 목적 단백질을 회수하는 단계를 추가로 포함하는, 목적 단백질의 생산방법.

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