KR102014826B1

KR102014826B1 - 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질

Info

Publication number: KR102014826B1
Application number: KR1020170157348A
Authority: KR
Inventors: 성백린; 권순빈; 손아현
Original assignee: (주)인테라
Priority date: 2017-11-23
Filing date: 2017-11-23
Publication date: 2019-08-28
Also published as: KR20190060024A

Abstract

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 혹은 그의 일부 시퀀스, 그리고 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진을 위해 상기 펩타이드는 수용성 증진 융합 단백질에도 적용될 수 있어서, 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질{Novel peptide for enhancing expression efficiency and fusion protein including the same}

본 발명은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 신규한 펩타이드 및 이를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다. 보다 상세하게 본 발명은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부를 포함하는 펩타이드, 및 상기 펩타이드와 이의 융합파트너로서 RID(RNA interacting domain)를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

현대의 생명공학에 있어서 핵심은 재조합 단백질의 생산이며 그 중에서도 중요한 것은 재조합 단백질의 양을 많이 생산하는 것이다. 많이 생산된 재조합 단백질은 활성 외래 단백질의 생산 및 회수, 기능 연구를 위한 결정화, 산업화 등에 매우 중요하다. 현재까지 대장균을 이용한 많은 재조합 단백질 생산 연구가 진행되어 왔는데, 이는 대장균이 조작이 쉽고, 짧은 성장시간, 안전한 발현, 저비용과 규모를 쉽게 바꿀 수 있는 장점이 있기 때문이다. 그러나, 대장균(E. coli)에서 생산된 외래 기원의 재조합 단백질은 발현 레벨이 낮거나, 적절한 "전사 후 샤페론(post-translational chaperons)"이나 "전사 후 과정(posttranslational processing)"이 없기 때문에, 생산된 재조합 단백질의 불가용성 단백질 응집체(inclusion body)로 형성되는 단점이 지적되고 있다(Francois Baneyx, Recombinant protein expression in Escherichia coli, Current Opinion in Biotechnology (1999), 10:411-421).

불용성으로 단백질이 생산되는 문제는, 수용성이 높은 단백질을 융합시켜 발현시키는 방법이 개발되어 있다(Dominic Esposito and Deb K Chatterjee, Enhancement of soluble protein expression through the use of fusion tags, Current Opinion in Biotechnology (2006), 17:353-358). 또한 LysRS(lysyl tRNA synthetase)와 같은 RNA 결합 도메인을 이용하여 재조합 단백질의 수용성을 증가시키는 방법이 시도되고 있다(Choi SI et al. Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677). 그러나 LysRS는 약 100 kDa(monomer size = 약 58 kDa)이 넘는 거대 단백질일 뿐만 아니라 이량체(dimer)를 이루어야 하는 구조적인 한계성으로 인한 입체적 간섭현상(steric hindrance) 때문에, 재조합 단백질이 원하는 활성 형태를 갖도록 3차원 구조 형성, 이량체 이상의 다량체, 또는 단량체로의 형성을 방해할 수 있다. 이에, LysRS를 대체하기 위한 RNA 결합 도메인으로 hRID(human LysRS RNA interacting domain, N-terminal appended RNA binding domain of human Lysyl tRNA synthetase)가 사용되고 있다. 하지만 hRID 자체는 발현 레벨이 매우 낮다는 크나 큰 단점이 있다.

단백질 발현 레벨은 여러가지 요인에 의해 결정될 수 있지만, 단백질의 N-말단 서열, 정확하게는 mRNA 서열이 단백질 발현 레벨에 중요한 것으로 알려져 있다(Qing, G. et al., Enhancement of translation initiation by A/T-rich sequences downstream of the initiation codon in Escherichia coli, Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology (2003), 6:133-44).

이에, 본 발명자들은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 단백질의 수용성 및 발현 효율에 대하여 연구하던 중 요산산화효소(urate oxidase) 단백질이 대장균에서 비정상적으로 발현이 잘 되는 것을 확인하였고, 요산산화효소의 N-말단 서열이 재조합 단백질의 발현 수준에 미치는 영향과, hRID의 발현에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 또는 그 일부 서열이 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는데 결정적인 역할을 하며, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드가 수용성 증진 파트너로 알려진 hRID(human LysRS RNA interacting domain)에도 적용됨을 확인하여, 목적 단백질의 발현 효율을 증진시킬 뿐만 아니라 수용성을 높일 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

이에 본 발명은 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 펩타이드, 상기 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 펩타이드를 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 또한, 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산 또는 그 일부 서열을 포함하는 펩타이드와 이의 융합파트너로서 hRID를 포함하는 융합 단백질, 상기 융합 단백질을 포함하는 발현벡터, 및 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계, 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계 및 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

제1구현예에 따르면,

본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "요산산화효소(urate oxidase)"(EC 1.7.3.3 (uricase)는 퓨린 분해 기작에 작용하는 효소이다. 우리카아제(uricase)는 요산을 알란토인으로 산화시키는 효소이다. 사람을 포함한 고등 영장류는 우리카아제가 존재하지 않으며, 요산은 퓨린 분해 대사의 최종 물질이다. 이 대사물인 유리산(free acid)과 요산염(urate salt) 모두 물에서 비수용성이므로, 개개인의 차이에 따라 침전되어 통풍을 유발한다. 통풍을 효율적으로 치료하기 위해, 사람에 존재하지 않은 우리카아제 를 직접 사람에게 주사하는 치료법이 실용화되어 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질(target protein)"은 당업자가 대량으로 생산하고자 하는 단백질로서, 재조합 발현벡터에 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 삽입하여 숙주세포에서 발현이 가능한 모든 단백질을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드" 또는 "expression enhancer tag(eet)"는 목적 단백질의 N-말단에 융합되어 함께 발현됨으로써 단백질의 발현 효율을 증진시키는 짧은 펩타이드 서열을 의미한다. 구체적으로 본 발명에서 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드는 서열번호 1로 표시되는 7개 아미노산 서열 또는 그 일부 서열을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "재조합 단백질(recombinant protein)" 또는 "융합 단백질(fusion protein)"은 원래의 목적 단백질 서열의 N-말단 또는 C-말단에 다른 단백질이 연결되거나 다른 아미노산 서열이 부가된 단백질을 의미한다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 서열번호 1의 일부 서열은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 N-말단에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 1을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3으로 표시되는 서열일 수 있다

본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서 상기 서열번호 2을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 4로 표시되는 서열일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터를 제공하고자 한다.

본 발명은 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "발현벡터"는 발현벡터의 전사에 제공되는 추가단편에 작동가능하게 연결된 관심의 폴리펩티드를 암호화하는 단편으로 구성되는 선형 또는 원형의 DNA 분자이다. 그와 같은 추가단편은 프로모터 및 종료암호 서열을 포함한다. 발현벡터는 하나 이상의 복제 개시점, 하나 이상의 선택 마커, 폴리아데닐화 신호 등을 또한 포함한다. 발현벡터는 일반적으로 플라스미드 또는 바이러스 DNA로부터 유도되거나, 또는 둘 다의 요소를 함유한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "작동 가능하게 연결된"은 프로모터에서 전사가 개시하고 암호화 서열을 통해 종료암호로 진행하는데 작용하도록 단편이 배열되는 것을 나타낸다.

본 발명에 따른 발현벡터에 있어서, 상기 발현벡터는 플라스미드, 바이러스 벡터, 파지 입자 또는 게놈 삽입물일 수 있다. 상기 발현벡터는 숙주세포 내로 형질전환된 후, 숙주세포의 게놈과 무관하게 복제되거나 숙주세포의 게놈 내로 통합될 수 있다.

본 발명은 또한 상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드를 포함하는 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "형질전환" 또는 "도입"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합 완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 발현벡터를 형질전환시키는 방법은 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄)법, 염화칼슘(CaCl₂)법, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법 또는 초산 리튬-DMSO법을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 숙주세포에 있어서, 상기 숙주세포는 DNA의 도입효율이 높고, 도입된 DNA의 발현 효율이 높은 숙주세포가 바람직하며, 원핵 및 진핵을 포함한 모든 미생물이 사용될 수 있다. 바람직하기는, 상기 숙주세포는 대장균(E. coli)일 수 있다.

본 발명은 또한 발현 효율이 증진된 목적 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 목적 단백질의 생산 방법은:

(A) N-말단에 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 그 일부를 포함하는 펩타이드가 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및

(C) 상기 숙주세포로부터 재조합 목적 단백질을 생산하는 단계를 포함할 수 있다.

제2구현예에 따르면,

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 hRID (human LysRS RNA interacting domain)를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질을 제공하고자 한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "hRID", "human LysRS RNA interacting domain", "N terminal appended RNA binding domain of human Lysyl tRNA synthetase)", 또는 "인간 LysRS RNA 결합 도메인(human LysRS RNA interacting domain)"는 인간으로부터 유래한 LysRS의 RNA와 기타 단백질 간의 상호작용에 관여하는 고유한 N-말단(N-terminal) 연장부위를 의미한다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 요산산화효소로부터 유래할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 펩타이드는 목적 단백질의 N-말단에 결합할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 hRID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질에 있어서, 상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.

본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 hRID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터를 제공하고자 한다.

본 발명의 발현벡터는 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 펩타이드 및 hRID의 융합 단백질일 수 있다.

본 발명은 또한 목적 단백질의 N-말단에 결합하고 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 hRID를 포함하는 융합 단백질을 갖는 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 발현벡터가 형질전환된 숙주세포를 제공하고자 한다.

본 발명은 또한 발현 효율 및 수용성이 증진된 목적 단백질의 생산 방법을 제공하고자 한다. 상기 목적 단백질의 생산 방법은:

(A) 목적 단백질의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산 또는 이의 일부 서열을 포함하는 펩타이드 및 이의 융합파트너로서 수용성을 높여 주는 hRID를 포함하는 융합 단백질이 결합된 재조합 목적 단백질을 포함하는 발현벡터를 제조하는 단계;

(B) 상기 발현벡터를 숙주세포에 도입하는 단계; 및

본 발명에 따른 요산산화효소로부터 유래한 7개의 아미노산을 포함하는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 수용성 증진 단백질로 잘 알려진 hRID에 상기 펩타이드를 결합한 융합 단백질은 목적 단백질의 발현 효율뿐만 아니라 수용성을 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드는 목적 단백질의 발현 효율을 향상시킬 수 있으며, 또한 상기 펩타이드와 이의 수용성 증진 융합파트너로 알려진 hRID와 함께 적용될 수 있어, 목적 단백질의 발현량과 수용성을 동시에 향상시킴으로써, 재조합 목적 단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 펩타이드(eet1)가 EGFP 단백질의 발현 효율에 미치는 영향을 나타내는 실험 결과이다. 도 1A는 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과이고, 도 1B는 IPTG 80 μM 이 처리된 대조군(EGFP)의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 1C는 IPTG 80 μM 이 처리된 대조군의 단백질 활성을 1로 하였을 때 각각의 상대적 활성을 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 펩타이드 혹은 그 일부가 EGFP 단백질의 발현 효율 및 활성에 미치는 영향을 비교한 결과이다. 도 2A는 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과이고, 도 2B는 IPTG 80 μM 이 처리된 대조군(MSEQHAQ-EGFP)의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량, 도 2C는 IPTG 80 μM 이 처리된 대조군의 단백질 활성을 1로 하였을 때 각각의 상대적 활성, 도 2D는 단위 단백질당 단백질 활성을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드가 대장균 유래 단백질인 TruB의 발현에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다. 도 3A는 각각의 융합 단백질 발현을 나타내는 SDS-PAGE 결과이고, 도 3B는 대조군의 발현량을 1로 하였을 때 각각의 상대적 발현량을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 펩타이드가 수용성 증진 융합파트너인 hRID에 미치는 영향을 나타내는 SDS-PAGE 결과(A) 및 상대적 발현량 변화를 나타낸 그래프(B)이다.
도 5는 본 발명의 펩타이드가 추가된 hRID 융합이 목적 단백질의 발현 효율에 미치는 영향을 나타내는 그래프이다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험 방법>

1. 단백질 발현 벡터의 제작

단백질 발현 벡터로 pGE-LysRS 발현 벡터를 사용하였다(Choi SI et al., Protein solubility and folding enhancement by interaction with RNA, PLoS ONE (2008), 3:e2677). pGE-LysRS는 T7 promoter에 의해 발현이 조절되고, LysRS 유전자를 Nde1과 MCS(Kpn1-BamH1-EcoRV-Sal1-Hind3)에 있는 절단 위치 중 하나를 사용하여 잘라내고, 그 위치에 EGFP 또는hRID, 또는 다른 단백질들을 삽입하였다. 이 때, 삽입된 단백질의 N-말단 위치에 서열번호 1의 아미노산 서열(eet1) 혹은 그 일부(eet2, 서열번호 2)를 삽입하였다. 그 다음, 제조된 hRID, 또는 서열번호 1의 아미노산 함유 hRID 벡터의 MCS에 있는 두 개의 절단효소 부위(enzyme site)를 사용하여, 발현하고자 하는 목적 단백질들을 삽입하였다.

2. 단백질 발현 및 SDS-PAGE

제조된 단백질 발현 벡터를 BL21(DE3), BL21(DE3)-pLysS, 또는 BL21(DE3)-pLysE competent cell에 형질전환 시켜 배양하였다. 모든 형질전환된 대장균은 50 μg/ml의 암피실린(Ampicillin)이 포함된 LB 배지에서 배양하였으며, BL21*(DE3)-pLysS 또는 BL21*(DE3)-pLysE에 형질전환된 대장균은 34 μg/ml의 클로람페니콜이 추가되어 있는 배지에서 배양하였다. 배양 온도는 단백질마다 다르며, 33 ~ 37℃의 조건에서 배양하였다. 대장균의 OD₆₀₀ 값이 0.5 이상이 되면, T7 promoter를 활성화 시키기 위해서 IPTG를 0 μM ~ 1 mM 수준으로 넣어주고, 단백질이 충분히 생산될 수 있도록, IPTG를 넣어준 이후부터 33℃ 또는 37℃에서 3시간 정도를 배양하였다. 충분히 배양된 대장균은 원심분리하여 상등액을 제거한 후에 보관하였다. 그 다음, LB 배지의 5 ml에 해당되는 대장균 수확물에 PBS 0.3 ml을 넣고 초음파 분쇄를 하여, 용해물(lysate)을 만들었다. 또는, 1 ml에 해당되는 대장균 수확물에 B-PER(Thermo Fisher Scientific) 60 μl를 적절한 농도의 DNA 가수분해효소(DNase) 및 라이소자임(lysozyme)과 함께 처리하여 용해물을 획득하였다. 그 후, 상기 용해물을 SDS-PAGE로 분석하였다.

3. EGFP 단백질의 형광 측정

분석하고자 하는 샘플에서 발현된 단백질의 활성을 확인하기 위해 Fluostar Optima(BMG Labtech)를 이용하여 Ex 485 nm / Em 520 nm에서 형광을 측정하였다.

< 실시예 >

실시예 1. 본 발명의 펩타이드가 EGFP 단백질의 발현 효율 및 활성에 미치는 효과

(1) SDS-PAGE 분석

pGE LysRS 플라스미드에서 Nde1과 Hind3 제한효소를 사용하여 LysRS를 떼어내고, 그 위치에 EGFP 유전자 서열과 EGFP 유전자 서열의 N-말단에 서열번호 1의 아미노산(eet1)을 코딩하는 유전자 서열(서열번호 3)이 추가된 융합 서열(fusion form, eet1-EGFP) 두 가지를 각각 집어 넣었다. 상기 벡터는 T7 promoter에 의해 발현되고, lac operator에 의해서 조절되는 형태로 IPTG에 의해서 프로모터 활성화가 조절된다. 두 개의 재조합 플라스미드를 각각 BL21*(DE3)-pLysE competent cell에 형질전환 시키고 37℃ 조건에서 3시간 동안 단백질을 발현하였다. 이때, IPTG는 0, 20, 40 및 80 μM 4가지 농도로 처리하였다.

그 결과, 도 1A 및 도 1B에 나타낸 바와 같이 EGFP 유전자의 융합 서열(eet1-EGFP)의 경우 대조군(EGFP)에 비해 발현이 잘 이루어졌다는 것을 확인할 수 있었다.

(2) 단백질 활성 분석

발현된 EGFP 단백질이 활성도 잘 띄고 있는지 확인하기 위해 각 조건에서 발현된 EGFP 시료를 용해물 형태로 Fluostar Optima 를 이용하여 485 nm/520 nm에서 형광 값을 측정하였다.

그 결과, 도 1C에 나타낸 바와 같이 eet1이 추가된 융합 서열의 경우 EGFP 단백질의 발현뿐만 아니라 활성도 증가된 것을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 본 발명의 펩타이드 중 일부 서열의 효과

상기 실시예 1에서 확인된 펩타이드(eet1)의 일부 서열(eet2, 서열번호 2)을 목적 단백질에 융합하였을 때의 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 EGFP 융합 단백질을 발현시켰다. 대조군으로는 서열번호 5로 표시되는 라이실 tRNA 합성효소(Lysyl tRNA synthetase) 유래 아미노산 서열(MSEQHAQ)을 코딩하는 유전자(서열번호 6)를 사용하였다. 다만, IPTG의 농도는 10, 20, 40및 80 μM로 처리하였다.

그 결과 도 2A 및 도 2B에 나타낸 바와 같이, 대조군의 펩타이드가 융합된 대조군 단백질(MSEQHAQ-EGFP) 대비, 본 발명의 신규 펩타이드가 추가된 EGFP 단백질(eet1-EGFP, eet2-EGFP)의 발현량이 더 적은 것으로 확인이 되었다. 그러나 도 2C에 나타난 바와 같이, 40 μM 이상의 IPTG 농도에서는 eet1 또는 eet2를 융합시킨 경우 활성 단백질의 양이 더 많은 것을 알 수 있었다. 이로부터 eet2 서열이 융합된 것은 eet1 보다 발현량이 더 낮았지만, 단백질 활성이 더 우수하여 80 μM 의 IPTG 농도에서 가장 많은 양의 활성 단백질이 만들어졌음을 알 수 있었다(도 2A 내지 2C).

아울러, 이를 단위 단백질당 활성 측면으로 계산하였을 때, eet1 서열을 융합하는 경우 대조군 대비 2배 이상, eet2 서열을 융합하는 경우 대조군 대비 3배 이상 양질의 단백질을 발현시킬 수 있다는 것을 확인하였다(도 2D). 이로부터 단백질의 발현량만 단순히 증가시키는 것보다 활성이 높은 단백질의 발현을 높이는 것이 단백질 발현 효율 향상에 실질적으로 더 좋다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3. 본 발명에 따른 펩타이드가 TruB 및 TruB - EGFP 단백질의 발현 효율에 미치는 효과

대장균에서 발현이 잘 안 되는 것으로 알려진 TruB 단백질의 발현에 본 발명에 따른 펩타이드가 미치는 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 TruB및 TruB-EGFP 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 각각의 서열에 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열이 추가된 융합 서열(fusion form)을 각각 pGE LysRS 플라스미드에 삽입하였다. 총 4개의 재조합된 플라스미드를 BL21*(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시키고, 37℃ 조건에서 단백질을 발현하였다. 이 때, IPTG는 1 mM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양하였다.

그 결과, 대조군(Tru 및 Tru-EGFP)은 잡밴드에 가려질 정도로 발현이 거의 안되었지만, TruB 및 TruB-EGFP 단백질에 각각 서열번호 1의 eet1를 융합시킨 경우 각각의 단백질이 발현되는 것을 확인하였고, 이때 발현량은 대조군의 3배 이상인 것을 알 수 있었다(도 3A 및 3B).

실시예 4. 본 발명에 따른 펩타이드가 hRID 단백질의 발현 효율에 미치는 효과

대장균에서 수용성 증진 융합파트너로 개발된 hRID 단백질(서열번호 7)의 발현에 본 발명에 따른 펩타이드가 미치는 효과를 알아보기 위하여, 상기 실시예 1과 동일한 방법을 이용하여 발현량을 확인하였다. 구체적으로, hRID 단백질을 코딩하는 유전자(서열번호 8) 및 hRID 의 N-말단에 eet1을 코딩하는 유전자가 연결된 융합 서열(서열번호 10)을 pGE LysRS plasmid에 각각 삽입하였다. 2개의 재조합된 플라스미드를 BL21*(DE3)-pLysS competent cell에 형질전환 시키고, 37℃ 조건에서 단백질을 발현하였다. 이 때, IPTG는 0, 20, 100 및 1000 μM 농도로 처리하고 3시간 동안 배양하였다.

그 결과 도 4에 나타낸 바와 같이, 대조군(hRID)은 발현이 거의 되지 않았으나, eet1이 추가된 융합 서열(eet1-hRID)은 발현이 잘 되는 것을 확인할 수 있었다(도 4A). 발현량의 정량 분석의 경우 대조군의 발현 레벨이 너무 낮아 기준으로 잡기 어려워, 1000 μM의 IPTG가 사용된 실험군을 기준으로 잡고 발현량을 비교하였다(도 4B).

실시예 5. 본 발명에 따른 펩타이드 및 hRID를 포함하는 융합 단백질이 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 총 3가지의 단백질의 발현 효율에 미치는 효과

대장균에서 발현이 잘 안되고, 발현이 되더라도 수용성 발현이 잘 안 되는 것으로 알려진 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 단백질의 발현량과 수용성 증가를 위한 융합파트너로서 hRID를 사용하였다. pGE LysRS 플라스미드에서 Nde1과 Kpn1을 이용하여 LysRS를 잘라내었고, 그 위치에 hRID를 코딩하는 유전자 서열(서열번호 8) 또는 eet1-hRID 융합 단백질을 코딩하는 유전자 서열(서열번호 10)을 각각 삽입하였다. 그 다음 pGE-hRID 플라스미드 및 pGE-eet1-hRID 플라스미드에 BamH1과 Hind3를 이용하여 CsTA1953 유전자, CsTA37 및 CsTA422 유전자를 각각 삽입하였다.

제작된 총 6개의 재조합 단백질을 상기 실시예4와 동일한 IPTG 농도 조건으로 발현시켰고, 그 중 CsTA37, 및 CsTA422가 포함된 4개의 재조합 단백질은 IPTG 1 mM이 처리된 조건에서만 실험을 진행하였다. 이 단백질들은 33℃ 조건에서 발현되었다.

그 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, eet1-hRID 융합 단백질을 결합시킨 경우 CsTA1953, CsTA37 및 CsTA422 단백질의 발현 효율이 개선된다는 것을 확인할 수 있었다. 여기서도 모든 대조군(hRID-)은 잡밴드에 가려질 정도로 발현이 잘 이뤄지지 않았으며(도 5A 및 도 5B), CsTA1953 의 경우는 대조군의 발현량이 너무 낮아서, 1000 μM의 IPTG가 사용된 실험군을 기준으로 잡고 정량 분석을 하였다(도 5B). CsTA37과 CsTA422 같은 경우, 대조군 대비 최소 7배 이상 발현이 증가된 것을 알 수 있었다(도 5D).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 저술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry-Academic Cooperation Foundation. Yonsei University <120> Novel Peptide for Enhancing Expression Efficiency and Fusion Protein Including the Same <130> 1063202 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA protein <400> 1 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala 1 5 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV protein <400> 2 Met Ser Ala Val 1 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAVKAA DNA <400> 3 atgtccgcag taaaagcagc c 21 <210> 4 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSAV DNA <400> 4 atgtccgcag ta 12 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ Protein <400> 5 Met Ser Glu Gln His Ala Gln 1 5 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MSEQHAQ DNA <400> 6 atgtctgaac aacacgcaca g 21 <210> 7 <211> 71 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID protein <400> 7 Met Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys Val Asp Gly Ser Glu Pro 1 5 10 15 Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg Leu Lys Ala Glu Lys Lys 20 25 30 Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu Leu Ser Glu Lys Gln Leu 35 40 45 Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His Thr Thr Asp Asn Gly Val 50 55 60 Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 <210> 8 <211> 213 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hRID DNA <400> 8 atggcggccg tgcaggcggc cgaggtgaaa gtggatggca gcgagccgaa actgagcaag 60 aatgagctga agagacgcct gaaagctgag aagaaagtag cagagaagga ggccaaacag 120 aaagagctca gtgagaaaca gctaagccaa gccactgctg ctgccaccaa ccacaccact 180 gataatggtg tgggtcctga ggaagagagc gtg 213 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID protein <400> 9 Met Ser Ala Val Lys Ala Ala Ala Ala Val Gln Ala Ala Glu Val Lys 1 5 10 15 Val Asp Gly Ser Glu Pro Lys Leu Ser Lys Asn Glu Leu Lys Arg Arg 20 25 30 Leu Lys Ala Glu Lys Lys Val Ala Glu Lys Glu Ala Lys Gln Lys Glu 35 40 45 Leu Ser Glu Lys Gln Leu Ser Gln Ala Thr Ala Ala Ala Thr Asn His 50 55 60 Thr Thr Asp Asn Gly Val Gly Pro Glu Glu Glu Ser Val 65 70 75 <210> 10 <211> 231 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eet1-hRID DNA <400> 10 atgtccgcag taaaagcagc cgcggccgtg caggcggccg aggtgaaagt ggatggcagc 60 gagccgaaac tgagcaagaa tgagctgaag agacgcctga aagctgagaa gaaagtagca 120 gagaaggagg ccaaacagaa agagctcagt gagaaacagc taagccaagc cactgctgct 180 gccaccaacc acaccactga taatggtgtg ggtcctgagg aagagagcgt g 231

Claims

하기 펩타이드를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 조성물:
목적 단백질의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드.
제1항에 있어서,
상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열은 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
하기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키기 위한 조성물:
목적 단백질의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제5항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 3 또는 서열번호 4로 표시되는 서열인 것을 특징으로 하는 조성물.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
상기 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드;
를 포함하는 발현벡터.
제7항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제8항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
목적 단백질의 N-말단에 결합되고 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드; 및
상기 펩타이드의 융합파트너로서 hRID(human LysRS RNA interacting domain)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 목적 단백질의 발현 효율 및 수용성을 증진시키기 위한 융합 단백질.
제10항에 있어서,
상기 hRID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제10항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
제10항에 있어서,
상기 목적 단백질은 항원, 항체, 세포수용체, 효소, 구조 단백질, 혈청 및 세포 단백질로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것을 특징으로 융합 단백질.
목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드; 및
상기 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 5`-말단에 결합된 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
제14항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제14항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주세포.
제16항에 있어서,
상기 숙주세포는 대장균(E. coli)인 것을 특징으로 하는 숙주세포.
(A) 목적 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 상기 폴리뉴클레오티드의 5'-말단에 결합된 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 수용성을 높여 주는 hRID를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
(B) 상기 발현 벡터를 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계: 및
(C) 상기 형질전환체를 배양하여 재조합 목적 단백질의 발현을 유도하고, 이를 수득하는 단계를 포함하고,
상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 것인, 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
제18항에 있어서,
상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드는 요산산화효소(urate oxidase)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
삭제
제18항에 있어서,
상기 목적 단백질의 발현 효율을 증진시키는 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드 서열 및 hRID가 결합된 융합 단백질인 것을 특징으로 하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
제21항에 있어서,
상기 hRID는 서열번호 7로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.
제21항에 있어서,
상기 융합 단백질은 서열번호 9로 표시되는 아미노산을 포함하는 것을 특징으로 하는 수용성 목적 단백질의 생산 방법.