KR102481388B1 - 내열성의 역전사 효소 돌연변이체 - Google Patents

내열성의 역전사 효소 돌연변이체 Download PDF

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Abstract

몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 역전사 효소 돌연변이체로써, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 역전사 효소 돌연변이체, 상기 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 상기 돌연변이체 및 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 제조방법, 상기 돌연변이체를 사용한 cDNA의 합성방법, 및 상기 돌연변이체를 포함하는 조성물 및 키트가 제공된다.

Description

내열성의 역전사 효소 돌연변이체
본 발명은 내열성의 역전사 효소 돌연변이체에 관한 것이다. 또, 기존의 역전사 효소의 내열성을 향상시키기 위한 방법, 및 상기 내열성의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다.
역전사 효소(RTase)는 일반적으로 RNA를 주형으로 해서 cDNA를 합성하는 활성, 소위 RNA 의존형 DNA 폴리머라아제 활성과, RNA/DNA 하이브리드 중의 RNA쇄를 분해하는 활성, 소위 리보뉴클레아제 H(RNase H) 활성을 가지고 있다.
역전사 효소는 RNA 의존형 DNA 폴리머라아제 활성을 가지고 있기 때문에, 생체 내에서 발현하고 있는 단백질의 아미노산 서열을 직접 반영하고 있는 mRNA의 염기서열 해석, cDNA 라이브러리의 구축, 게다가 RT-PCR 등에 사용할 수 있다. 이것들의 용도에는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 또는 조류 골수아구증 바이러스가 생산하는 역전사 효소가 자주 사용되고 있다.
이렇게 역전사 효소의 용도는 여러 갈래에 걸치어 있지만, RNA를 주형으로 한다는 점에서 여러 가지 문제점이 있다. 예를 들면, mRNA가 2차 구조를 형성하기 쉬운 염기서열을 가지는 경우, 당해 mRNA를 주형으로 한 역전사 효소에 의한 cDNA 합성이 상기 2차 구조에 의해서 방해받는 경우가 있다. 이 문제를 해결하기 위해서는 역전사 반응의 온도를 올림으로써 효과가 있지만, 상기 몰로니 마우스 백혈병 바이러스가 생산하는 역전사 효소 및 조류 골수아구증 바이러스가 생산하는 역전사 효소는 내열성이 낮고, RNA의 2차 구조형 성이 억제되는 것과 같은 온도조건에서는 비활성화되어 버린다. 그 때문에 내열성을 향상시킨 역전사 효소 돌연변이체가 제안되어 왔다(예를 들면, 특허문헌 1∼6을 참조).
일본 특허 제4193079호 국제공개 팸플릿 WO2004/024749 국제공개 팸플릿 WO2007/022045 국제공개 팸플릿 WO2009/125006 국제공개 팸플릿 WO2012/108672 국제공개 팸플릿 WO2015/112767
그렇지만, 가일층의 내열성 역전사 효소의 개발이 여전히 소망되고 있다. 본 발명의 목적은 내열성의 역전사 효소 돌연변이체를 제공하는 것에 있다.
본 발명자들은 내열성의 역전사 효소 돌연변이체를 개발하기 위해서 예의 연구한 결과, 놀랍게도, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus)(이하, 'MMLV'라고 약칭하기도 한다)가 생산하는 역전사 효소의 아미노산 서열에 있어서, 지금까지 돌연변이가 도입된 적이 없는 루프 구조의 안정화에 관련된다고 생각되는 55번째의 트레오닌을 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택된 다른 아미노산으로 치환하는 것에　의해서, 내열성을 가지는 역전사 효소가 수득되는 것을 알아냈다. 또 당해 아미노산 돌연변이를 기지의 내열성 역전사 효소의 아미노산 돌연변이와 조합시키는 것에　의해, 상기 기지의 역전사 효소 내열성을 더욱 향상시킬 수 있음을 알아냈다. 또 당해 아미노산 돌연변이를 신규인 다른 아미노산 돌연변이와 조합시키는 것에　의해, 내열성이 더욱 향상된 역전사 효소가 수득되는 것도 알아냈다. 이렇게 해서 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 루프 구조의 입체구조를 안정화시키기 위해서, 아미노산 서열에 53번 위치에서 56번 위치에 걸친 부위의 아미노산을 치환하는 것을 특징으로 한다. 본 발명이 제1 형태는 특별하게 한정은 되지 않지만, 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 역전사 효소 돌연변이체로써, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 역전사 효소 돌연변이체에 관한 것이다. 본 발명이 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체에 있어서, 상기 아미노산 돌연변이는 트레오닌으로부터, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산으로의 치환일 수도 있다. 또, 본 발명이 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체에 있어서, 상기 아미노산 돌연변이는 트레오닌으로부터, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산으로의 치환일 수도 있다.
본 발명이 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체의 일례로서, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 글리신 또는 아스파라긴산으로의 치환인 것을 특징으로 하는 역전사 효소 돌연변이체를 들 수 있다. 또, 본 발명이 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체는 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 아미노산 치환을 추가로 포함할 수도 있다:
(1) A54P,
(2) T287K,
(3) Q291K,
(4) T306K,
(5) D524A,
(6) D524N,
(7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
(8) D209P, 및 I212A.
또, 상기의 55번 위치의 아미노산 치환 및 상기 (1)의 54번 위치의 아미노산 치환과, 상기 (2)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 조합시켜서 포함하는 역전사 효소 돌연변이체도 본 발명의 범주이다. 또, 본 발명이 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체는 추가로 리보뉴클레아제 H 활성을 결손하고 있을 수도 있다.
또, 상기 (3)의 291번 위치의 아미노산 치환, 및 상기 (8)의 209번 위치 및 212번 위치의 아미노산 치환은 본 발명에 의해 처음으로 내열성과의 관련이 확인된 것이다. 예를 들면, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서 291번 위치의 글루타민으로부터 리신으로의 아미노산 치환, 혹은 209번 위치의 아스파라긴산으로부터 프롤린 및 212번 위치의 이소로이신으로부터 알라닌으로의 아미노산 치환을 가지는 역전사 효소 돌연변이체는 야생형에 비해서 내열성이 향상한다. 따라서 본 발명의 상기의 55번 위치의 아미노산 치환과 조합시키는 대상이 된다.
본 발명의 제2 형태는 상기 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산에 관한 것이다.
본 발명의 제3 형태는 상기 제2 형태의 핵산 및 발현 조절서열을 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.
본 발명의 제4 형태는 상기 제3 형태의 발현벡터로 형질전환된 역전사 효소 돌연변이체를 발현하는 세포에 관한 것이다.
본 발명의 제5 형태는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 코딩하는 코돈을, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하는 공정을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제5 형태에 있어서, 상기 트레오닌을 코딩하는 코돈은, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환할 수도 있다.
본 발명의 제5 형태에 있어서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산은 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소 또는 상기 효소의 돌연변이체를 코딩하는 핵산일 수도 있다.
본 발명의 제5 형태에 있어서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산은, 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 아미노산 치환을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산일 수도 있다:
(1) A54P,
(2) T287K,
(3) Q291K,
(4) T306K,
(5) D524A,
(6) D524N,
(7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
(8) D209P, 및 I212A.
본 발명의 제6 형태는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산에 치환하는 것을 특징으로 하는, 내열성의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제6 형태의 방법에 있어서, 상기 트레오닌은 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환할 수도 있다.
본 발명의 제7 형태는 상기 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체를 사용하여, 주형이 되는 RNA에 상보적인 DNA를 합성하는 공정을 포함하는 cDNA의 합성방법에 관한 것이다. 또, 당해 방법에 있어서, 추가로 cDNA를 증폭하는 공정을 포함할 수도 있다. 또 상기cDNA의 증폭이 등온 증폭반응 또는 PCR에 의해 실시되는 것일 수도 있다.
본 발명의 제8 형태는 상기 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 제9의 형태는 상기 제1 형태의 역전사 효소 돌연변이체를 포함하는 키트 에 관한 것이다.
본 발명의 제10의 형태는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산에 치환하는 것을 특징으로 하는, 역전사 효소의 내열성을 향상시키는 방법이다. 본 발명의 제10 형태에 있어서, 상기 트레오닌은 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환할 수도 있다. 또, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 코딩하는 코돈을, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하는 역전사 효소의 내열성 향상방법도 제공된다.
본 발명에 의해, 내열성 역전사 효소 돌연변이체 및 그 제조방법이 제공된다. 본 발명에 의하면, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 다른 아미노산으로 치환하는 것에　의해, 내열성 역전사 효소 돌연변이체가 제공된다. 또, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 다른 아미노산으로 치환하는 것에　의해, 기지의 내열성 역전사 효소의 내열성이 더욱 향상된다. 이러한 기지의 내열성 역전사 효소의 내열성을 더욱 향상시키는 효과를 가지는 아미노산 돌연변이는 지금까지 알려지고 있지 않고, 본 발명에 의해 처음으로 발견되었다. 또, 본 발명의 내열성 역전사 효소 돌연변이체는 역전사 효소의 특성, 예를 들면, RNA 결합활성, cDNA 신장 활성, 및 cDNA 신장 속도에 전혀 영향을 받지 않고, 향상된 내열성을 가진다.
본 발명에 있어서, 「내열성」이란 열처리 후에도 효소활성을 보유할 수 있는 성질을 의미한다. 예를 들면, 40℃, 5분의 처리에 의해 활성이 50% 상실되는 효소라면, 50℃ 이상, 60℃ 이상, 혹은 70℃ 이상의 조건으로 5분 처리한 후라도 50% 이상의 활성을 보유할 수 있었을 경우에 「내열성」이 향상했다고 말 할 수 있다. 이러한 내열성이 향상한 효소는 더 높은 온도에서의 반응에 제공할 수 있다. 예를 들면, 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소의 경우, 야생형 효소의 최적온도는 37∼42℃이므로, 예를 들면 43℃ 이상, 바람직하게는 45℃ 이상, 더욱 바람직하게는 50℃ 이상에서 효소활성을 보유하는 역전사 효소 돌연변이체는 「내열성이다」 또는 「향상한 내열성을 갖는다」고 말할 수가 있다.
본 발명에 있어서, 「잔존활성」이란 가열처리 후의 효소활성을 의미한다. 또, 「잔존활성율」이란 가열처리하지 않은(비가열처리) 단백질의 효소활성을 100%로 했을 경우의, 가열처리 후의 효소활성의 비율(%)을 의미한다.
본 발명에서 사용하고 있는 아미노산 번호(또는 아미노산 위치)는 개시코돈에 의해 코딩되는 메티오닌을 세지 않은 번호로 표시하고 있다. 따라서 1번째의 메티오닌을 세는 경우에는 본 명세서에 기재되는 아미노산 번호에 1을 더한 번호가 된다.
이하에 상세하게 설명한다.
1. 본 발명의 내열성 역전사 효소 돌연변이체
본 발명의 제1 형태는 내열성 역전사 효소 돌연변이체, 즉 내열성을 획득한(또는 내열성이 향상한) 역전사 효소의 돌연변이체에 관한 것이다. 상기 역전사 효소 돌연변이체는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소 또는 그 돌연변이체에 있어서, 야생형 역전사 효소의 루프 구조부분인 아미노산 서열에 53번 위치에서 56번 위치에 걸친 입체구조를 보다 안정된 구조로 하는 아미노산으로 돌연변이시키는 것을 특징으로 한다. 예를 들면, 야생형 아미노산 서열에 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌이, 상기 역전사 효소에서의 본 루프 구조의 입체구조를 안정화시키기 위한 아미노산, 예를 들면, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산으로 치환되어 있는 것을 특징으로 한다. 상기 「비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산」이란 바꿔 말하면, 비극성에서 소수성의 아미노산이고, 이소로이신, 로이신, 발린, 글리신, 프롤린, 및 알라닌이 예시된다. 상기 「극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산」이란 카복실산기를 가지는 아미노산이고, 아스파라긴산 및 글루탐산이 예시된다. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 특히, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 글리신 또는 아스파라긴산으로의 아미노산 치환인 것이 호적하다.
또 입체구조를 안정화시키는 아미노산으로의 치환이라고 하는 관점으로부터, 예를 들면, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 한다. 상기 「극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산」으로서는 아르기닌 및 리신이 예시된다. 상기 「극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산」으로서는 세린이 예시된다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산인 역전사 효소 돌연변이체일 수도 있고, 예를 들면, 상기 아미노산 돌연변이는 트레오닌으로부터 글리신, 아르기닌, 리신 또는 세린으로의 아미노산 치환일 수도 있다.
또, 예를 들면, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하고, 상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 다른 아미노산으로의 치환이고, 상기 다른 아미노산이 이소로이신, 로이신, 발린, 글리신, 프롤린, 알라닌, 아스파라긴산, 글루탐산, 아르기닌, 리신, 및 세린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산인 역전사 효소 돌연변이체일 수도 있다. 또 다른 예로서, 상기 다른 아미노산은 글리신, 아스파라긴산, 리신, 및 세린으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산일 수도 있다.
본 명세서에 있어서, 「몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치」란 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 루프 구조의 입체구조에 관여하는 위치이고, 구체적으로는 아미노산 서열에 55번 위치, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소 돌연변이체의 아미노산 서열에서의, 상기 야생형 아미노산 서열에 55번 위치에 상당하는 위치를 의미한다. 역전사 효소 돌연변이체의 아미노산 서열에서의 「몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치」는 예를 들면, 공지의 알고리즘 등을 사용하고, 상기 야생형 서열과 상기 돌연변이체의 아미노산 서열과의 비교 및 얼라인먼트에 의해 용이하게 특정할 수 있다. 동일하게, 본원 명세서에서 아미노산 위치로 언급하는 경우, 야생형 아미노산 서열에서의 아미노산 위치를 기재하고 있지만, 상기 아미노산 위치는 그 대응하는 돌연변이체에서의, 상기 야생형 아미노산 서열의 당해 위치에 상당하는 위치를 포함한다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 야생형서열에 55번 위치에 상당하는 위치로서, 돌연변이체의 아미노산 서열 53번 위치에서 56번 위치에 걸친 부위가 예시된다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 상기한 「몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치」에 있어서의 트레오닌의 아미노산 치환(이하, 「55번 위치의 아미노산 치환」 라고도 한다)에 부가해서, 55번 위치 이외의 아미노산 위치의 돌연변이(이하, 「다른 아미노산 위치의 돌연변이」 라고도 한다)를 포함할 수도 있다. 다른 아미노산 위치의 돌연변이는 아미노산 치환 돌연변이, 아미노산 삽입 변이, 또는 아미노산 결실 돌연변이의 어느 것일 수도 있고, 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 2이상의 다른 아미노산 위치의 돌연변이를 포함하고 있을 수도 있다. 다른 아미노산 위치의 돌연변이는, 특별하게 한정되지 않고, 어느쪽의 아미노산 돌연변이 일 수도 있다.
다른 아미노산 위치의 돌연변이 예로서는 한정하는 것은 아니지만, 내열성을 부여하기 위한 돌연변이, 내열성을 향상시키기 위한 돌연변이, 및 역전사 효소의 특성을 개선시키기 위한 아미노산 돌연변이를 들 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체가 상기 55번 위치의 아미노산 치환과, 다른 아미노산 위치의 돌연변이로서 내열성의 부여 또는 향상에 관여하는 돌연변이를 조합해서 포함하는 경우, 그 내열성이 더욱 향상한다.
특별하게 한정은 되지 않지만, 다른 아미노산 위치의 돌연변이 바람직한 예로서, 이하의 (1)∼(8)에 나타나는 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 들 수 있다.
(1) A54P,
(2) T287K,
(3) Q291K,
(4) T306K,
(5) D524A,
(6) D524N,
(7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
(8) D209P, 및 I212A.
여기에서, 상기 다른 아미노산 위치의 돌연변이 가운데 상기 (3)의 291번 위치 및 상기 (8)의 209번 위치 및 212번 위치의 아미노산 돌연변이에 대해서는, 본 발명에 의해 처음으로 내열성과의 관련이 확인된 것이다. 예를 들면, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서 291번 위치의 글루타민으로부터 리신으로의 아미노산 치환, 혹은 209번 위치의 아스파라긴산으로부터 프롤린 및 212번 위치 이소로이신으로부터 알라닌으로의 아미노산 치환을 가지는 역전사 효소 돌연변이체는 야생형에 비해서 내열성이 향상한다. 따라서 본 발명의 상기 55번 위치의 아미노산 치환과 조합시키는 것에　의해, 내열성이 더욱 향상한 역전사 효소를 얻을 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 상기 55번 위치의 아미노산 치환에 부가해서, 상기 (1)∼(8)로부터 선택되는 1 이상의 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 포하고 있을 수도 있다 예를 들면, 상기 55번 위치의 아미노산 치환과, 상기 (1)의 54번 위치의 아미노산 치환을 포함하고, 추가로 상기 (2)∼(8)로부터 선택되는 1이상의 아미노산 치환 또는 아미노산 치환의 조합을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체도 본 발명의 범주이다. 예를 들면, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신으로 아미노산 치환하고, 추가로 상기 (2)∼(8)의 아미노산 치환을 조합시킨 것이 예시된다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 추가로 RNase H 활성을 결실하는 돌연변이를 포함하고 있을 수도 있다. RNase H 활성 결실 돌연변이로서는 특별하게 한정은 되지 않지만, 583번 위치 “G/또는 524번 위치의 아스파라긴산을 다른 아미노산으로 치환시킨 것, 또는 RNase H 활성 도메인을 결실시킨 것이 예시된다. 이리 하여, 본 발명은 내열성을 가지며, 또 RNase H 활성을 결실한 역전사 효소 돌연변이체를 제공한다. 이러한 돌연변이체는 RNA를 주형으로 한 역전사 반응에 호적하게 사용된다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체로서 특별하게 한정은 되지 않지만, 서열번호 1의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌이 글리신으로 치환된 아미노산 서열(서열번호 2)을 포함하는 돌연변이체, 또는 아스파라긴산으로 치환된 아미노산 서열(서열번호 3)을 포함하는 단백질이 예시된다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 예로서, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체, 및 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체를 들 수 있다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체로서 특별하게 한정은 되지 않지만, 서열번호 4∼10, 39∼44, 52, 55∼62의 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이체가 예시된다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 예로서, 서열번호 4∼10, 39∼44, 52, 55∼62의 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어지는 돌연변이체를 들 수 있다. 상기 아미노산 서열에 있어서는 추가로 내열성을 향상시키기 위한 다른 돌연변이나 역전사 효소의 특성을 개선시키기 위한 돌연변이 등을 포함하고 있을 수도 있다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 예로서, 서열번호 1과 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 가지는 아미노산 서열을 포함하며, 또, 내열성을 가지는 돌연변이체로써, 상기 아미노산 서열에 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌이, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산, 예를 들면, 글리신 또는 아스파라긴산으로 치환된 역전사 효소 돌연변이체를 들 수 있다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 새로운 예로서, 서열번호 1과 적어도 80%, 예를 들면, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%의 동일성을 가지는 아미노산 서열로 이루어지며, 또, 내열성을 가지는 돌연변이체로써, 상기 아미노산 서열에 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌이 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산, 예를 들면, 글리신 또는 아스파라긴산으로 치환된 역전사 효소 돌연변이체를 들 수 있다.
야생형 역전사 효소에서는 37∼42℃에서 활성을 나타내는 것에 대해, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 40℃ 이상, 예를 들면, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 또는 60℃ 이상의 온도조건하에서도 활성을 나타낸다. 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 50∼55℃의 고온역에서도 야생형과 비교해서 높은 활성을 나타내고, 상기 고온역에서 보온된 후의 잔존활성도 야생형과 비교해서 높아진다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 내열성을 가지고며, 또, 역전사 효소의 특성, 예를 들면 RNA 결합활성, cDNA 신장 활성 등을 보유한다. 즉, 상기 「55번 위치의 아미노산 치환」은 역전사 효소에 내열성을 부여하지만, 역전사 효소의 특성, 예를 들면 RNA 결합활성, cDNA 신장 활성, cDNA 신장 속도에 대하여 영향을 끼치지 않는다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 상기 55번 위치의 아미노산 치환과 다른 내열화 돌연변이를 조합시켜서 포함하는 경우, 더욱 향상된 내열성을 갖는다.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 발현시킨 폴리펩티드의 정제를 쉽게 하기 위한 어피니티 태그를 포함하고 있을 수도 있다. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 역전사 효소 활성 및 고유의 내열성을 유지하는 한, 어피니티 태그 등의 펩티드 혹은 폴리펩티드를, 예를 들면 N말단 또는 C말단에 가지고 있을 수 있다. 이러한 태그는 당해 돌연변이체의 생성에 유용하다. 태그의 예로서는 His잔기가 4개∼8개 연속하는 히스티딘 태그, Flag 태그, HA 태그, c-myc 태그, GST 태그 등의 공지의 것을 들 수 있다. 소망에 의해, 이것들 태그는 1∼15개의 아미노산을 포함하는 링커를 통해서 본 발명의 돌연변이체와 연결할 수 있다.
2. 본 발명의 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산
본 발명에 있어서는 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 제공할 수 있다. 구체적으로는 상기한 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산으로서, 특별하게 한정은 되지 않지만, 서열번호 2∼10, 39∼44, 52, 또는 55∼62 중 어느 하나에 기재된 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열을 포함하는 핵산이 예시된다. 추가로, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 예로서, 서열번호 2∼10, 39∼44, 52 또는 55∼62에 기재된 어느 하나의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열로 이루어지는 핵산을 들 수 있다. 더 적합하게는, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산으로서, 서열번호 12∼20, 45∼50, 54 또는 63∼70 중 어느 하나에 기재된 염기서열을 포함하는 핵산이 예시된다. 추가로, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 예로서, 서열번호 12∼20, 45∼50, 54 또는 63∼70 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 이루어지는 핵산을 들 수 있다. 상기 핵산은 추가로 내열성을 부여 또는 향상시키기 위한 다른 핵산 돌연변이나 역전사 효소의 특성을 개선시키기 위해서 핵산 돌연변이를 포함하고 있을 수도 있다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산은 사용하는 숙주(host)에 있어서 발현 가능 또한 역전사 효소 활성을 가지는 단백질을 코딩하는 코돈으로 구성된 것이라면 특별하게 한정은 없고, 사용하는 숙주에 있어서 발현 가능하게 하기 위한, 또는 발현량을 증가시키기 위해서 코돈의 최적화를 실시할 수도 있다. 상기 코돈 최적화는 본 분야에 있어서 통상 사용되고 있는 방법에 의해 실시하는 것이 바람직하다.
3. 본 발명의 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현벡터
본 발명의 발현벡터는 본 발명의 돌연변이체 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산, 및 상기 핵산과 작동 가능하게 연결된 발현 조절서열을 포함하는 것이 바람직하다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 삽입하는 발현벡터로서는 본 분야에서 통상 사용되고 있는 발현벡터라면, 특별하게 한정은 없다. 숙주세포에 있어서 자립 복제가 가능한 벡터나 숙주 염색체에 편입될 수 있는 벡터를 사용할 수 있다. 숙주에 적합한 벡터를 사용할 수도 있다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 삽입하는 발현벡터로서 예를 들면, 플라스미드 벡터, 파지 벡터, 바이러스 벡터 등을 사용할 수 있다. 플라스미드 벡터로서는 사용하는 숙주에 적합한 플라스미드, 예를 들면 대장균 유래의 플라스미드, 바실루스속 세균 유래의 플라스미드, 효모 유래의 플라스미드가 당업자에게 주지이고, 또, 시판되고 있는 것도 많다. 본 발명에는 이들 공지의 플라스미드나 그 개변체를 사용할 수 있다. 파지 벡터로서는 예를 들면, 람다파지(예를 들면, Charon 4A, Charon 21A, EMBL3, EMBL4, λgt10, λgt11, λZAP) 등을 사용할 수 있고, 바이러스 벡터로서는 예를 들면, 레트로 바이러스, 백시니아 바이러스 등의 동물바이러스, 바큘로 바이러스 등의 곤충 바이러스를 사용할 수 있다. 또, 효모, 곤충 세포, 포유동물 세포를 숙주로 하는 이종 단백질 발현계도 수많이 구축되고 있고, 또, 이미 시판도 되고 있다. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조에는 이들 발현계를 사용할 수 있다.
본 발명의 발현벡터에 탑재하는 프로모터는 숙주에 따라서 선택할 수 있고, 예를 들면 대장균에서는 trp 프로모터, lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터 등의 대장균이나 파지 등에 유래하는 프로모터나 그것들의 개변체를 사용할 수 있지만, 상기의 것에 한정되는 것은 아니다. 또, 파지 유래의 프로모터와 RNA 폴리머라아제 유전자를 조합시킨 발현계(예를 들면 pET 발현계 등)을 이용할 수도 있다.
발현시킨 폴리펩티드의 정제를 쉽게 하기 위해서, 본 발명의 발현벡터는 어피니티 태그를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하고 있을 수도 있다. 어피니티 태그를 코딩하는 핵산은 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체와 당해 어피니티 태그의 융합 단백질이 발현되도록 벡터에 삽입된다. 본 발명을 전혀 한정하는 것은 아니지만, 어피니티 태그로서는, 예를 들면, 히스티딘(His) 태그, 글루타티온 S-트랜스페라아제(GST) 태그, 말토오스 결합 단백질(maltose binding protein; MBP) 태그, 8잔기의 아미노산(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)으로부터 이루어지는 Strep(II) 태그 등을 코딩하는 핵산이 예시된다. 당해 태그를 부가하는 위치는 본 발명의 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 유래의 역전사 효소(MML V RTase) 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 5'-말단 및/또는 3'-말단측의 어느 것일 수 있고, 발현 및 태그 기능의 장애가 안되는 위치에 적당하게 부가하면 좋다. 또, 상기 태그는 발현시킨 폴리펩티드의 정제 단계에서 절단할 수 있는 태그가 바람직하다. 본 발명을 전혀 한정하는 것은 아니지만, 이러한 절단할 수 있는 태그로서는 예를 들면, Facror Xa, PreScission Protease, 트롬빈(Thrombin), 엔타로키나스(enterokinase), TEV 프로테아제(Tobacco etchVirus Protease) 등의 융합 폴리펩티드 절단용 프로테아제의 인식 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 태그가 예시된다.
본 발명의 발현벡터는 추가로 1 또는 복수의 발현 조절서열을 포함하고 있을 수도 있다. 당해 발현 조절서열은 특히 한정되는 것은 아니지만, 프로모터 및 프로모터의 제어에 관계하는 유전자, 리보솜 결합 서열, 포리아데닐화 시그널, 전사종결서열(전사 터미네이터), 인핸서 등을 들 수 있다. 또 복제기점(origin)이나 형질전환체의 선별에 사용되는 마커(약제내성 유전자, 형광 마커, 발광 마커)를 코딩하는 유전자, 번역효율을 높이기 위한 염기서열, 등을 들 수 있다.
4. 본 발명의 발현벡터에서 형질전환된 세포
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 발현하는 벡터로 형질전환하는 세포(숙주)로서는, 본 분야에서 통상 사용되고 있는 숙주라면, 특별하게 한정은 없다. 예를 들면 세균(대장균, 고초균 등), 효모, 사상균, 곤충세포, 진핵세포, 동물세포(인간 세포를 포함하는 포유동물 세포 등)을 사용할 수 있다.
원핵세포를 숙주세포로 하는 경우, 예를 들면, Escherichia coli(대장균) 등의 에세리키아속, 바실루스ㆍ서브틸리스(Bacillus subtilis) 등의 바실루스속, Pseudomonas putida 등의 슈우도모나드속, Rhizobium meliloti 등의 리조븀속에 속하는 세균을 숙주세포로서 사용할 수 있다. 이종 단백질의 제조에 사용 가능한 대장균은 당업자에 주지이며, 또, 시판되고 있는 것도 많다(예를 들면, Escherichia coli BL21T1R, Escherichia coli BL21, E.coli XL1-Blue, E.coli XL2-Blue, E.coli DH1, E.coli JM109, E.coli HB101등). 또, 바실루스속 세균인 Bacillus subtilis MI114, B.subtilis 207-21등, Brevibacillus속 세균이나 Brevibacillus choshinensis 등이 이종 단백질의 제조용 숙주로서 알려져 있다. 이것들의 숙주세포를 적절한 발현벡터와 조합시키고, 본 발명의 융합 폴리펩티드의 제조에 사용할 수 있다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 대장균주의 BL21계통인, E.coli BL21T1R이나 BL21DE3을 호적하게 사용할 수 있다.
발현벡터의 숙주에의 도입방법으로서는 숙주에 핵산을 도입할 수 있는 방법이라면 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면, 칼슘이온을 사용하는 방법, 일렉트로포레이션법, 스페로플라스트법, 초산리튬법 등을 사용할 수 있다. 곤충세포로의 재조합 벡터의 도입방법은 곤충세포에 DNA를 도입할 수 있는 한 특별하게 한정되지 않고, 예를 들면, 칼슘인산염법, 리포펙션법, 일렉트로포레이션법 등을 사용할 수 있다. 파지 벡터나 바이러스 벡터는 이것들 벡터에 따른 방법으로 숙주세포로의 감염을 실시하고, 본 발명의 융합 폴리펩티드를 발현하는 형질전환체를 얻을 수 있다.
상기 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 취득할 수 있다. 배양조건은 사용하는 발현벡터, 숙주 등에 적합한 조건이라면 특별하게 한정은 없다. 본 발명을 전혀 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, pET 벡터로 대장균을 형질전환했을 경우, 형질전환체를 LB 배지에 접종해서 37℃에서 진탕 배양한다. 배양액의 OD가 0.2∼0.8이 된 시점에서 IPTG를 첨가하고, 목적 단백질의 발현을 유도하기 위해서 예를 들면 15∼30℃에서 2∼5시간, 바람직하게는 25℃에서 4∼5시간 진탕 배양한다. 그 후에 배양액을 원심분리하고, 수득된 균체를 세정 후, 초음파 파쇄 처리 또는 리소자임에 의한 용균처리에 의해 본 발명의 돌연변이체를 포함하는 파쇄물을 얻을 수 있다. 파쇄물은 오염물질이 많기 때문에, 본 분야에서 사용되고 있는 정제 방법, 예를 들면, 황산암모늄 침전법, 음이온 교환컬럼, 양이온 교환칼럼, 겔여과 칼럼, 어피니티 크로마토컬럼, 투석 등을 적당하게 조합시키는 것에 의해서 본 발명의 돌연변이체 정제를 실시하는 것이 바람직하다. 어피니티 태그가 부가된 돌연변이체는 당해 어피니티 태그의 성질에 따른 어피니티 담체를 사용해서 간편하게 정제하는 것이 가능하다. 또, 사용하는 숙주 또는 발현벡터의 종류에 따라서는, IPTG에 부가해서 L-아라비노오스 등 그 외에 필요한 유도물질을 적절한 타이밍으로 첨가할 수 있다.
5. 본 발명의 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 제조방법
본 발명의 핵산 제조방법은 예를 들면, MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 코딩하는 코돈을, 입체구조를 안정화시키는 아미노산, 예를 들면 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하는 공정을 포함한다. 입체구조를 안정화시키는 아미노산에 대해서는, 상기 1.에서 설명한 바와 같다. 특별하게 한정은 되지 않지만, 상기 트레오닌에 대응하는 코돈의 치환은 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산에 대응하는 코돈으로의 치환이 호적하고, 글리신 또는 아스파라긴산에 대응하는 코돈으로의 치환이 추가로 호적하다.
상기 1.에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 예를 들면, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에서의 트레오닌을 입체구조를 안정화시키는 아미노산, 예를 들면 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명에 있어서, 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 역전사 효소의 아미노산 서열은 야생형 아미노산 서열, 또는 돌연변이형 아미노산 서열, 예를 들면 내열성 돌연변이체의 아미노산 서열의 어느 것일 수도 있다. 따라서 본 발명의 핵산 제조방법에 있어서, 상기의 코돈 치환을 도입하는 MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산은 MMLV 유래의 야생형 역전사 효소를 코딩하는 핵산, 또는 상기 효소의 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 어느 것일 수도 있다.
예를 들면, MMLV 유래의 내열성 역전사 효소 돌연변이체에 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 경우, 상기 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산 상의, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소 아미노산 서열에 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌에 대응하는 코돈을, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산의 코돈으로 변환시키는 것에　의해, 상기 코돈 변환전의 내열성 역전사 효소의 내열성보다도 향상한 내열성을 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 제조할 수 있다.
예를 들면, 상기의 코돈 치환을 도입하는 MMLV 유래의 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산으로서는, 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1 이상의 아미노산 치환을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 들 수 있다.
(1) A54P,
(2) T287K,
(3) Q291K,
(4) T306K,
(5) D524A,
(6) D524N,
(7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
(8) D209P, 및 I212A.
상기 코돈 변환은 공지의 방법에 의해 실시할 수 있고, 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 예를 들면, 돌연변이 도입 프라이머를 사용한 부위 특이적 돌연변이 도입 등 공지의 수법에 의한 돌연변이 도입, 또는 돌연변이 후의 서열(혹은 서열의 일부)을 가지는 핵산의 인공합성에 의해 실시할 수 있다. 또, 사용하는 숙주에 있어서 발현 가능하게 하기 위해서 또는 발현량을 증가시키기 위해서 코돈의 최적화를 실시할 수도 있다. 상기 코돈 최적화는 본 분야에 있어서 통상 사용되고 있는 방법에 의해 실시할 수 있다.
또, 본 발명의 핵산 제조방법에서는 MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하기 위한 코돈 치환에 부가해서, 1이상의 다른 코돈 치환을 실시할 수도 있다. 다른 코돈 치환으로서는 예를 들면, 내열성을 부여하기 위한 돌연변이를 도입하기 위한 코돈 치환, 내열성을 향상시키기 위한 아미노산 치환을 도입하기 위한 코돈 치환, 역전사 효소의 특성을 개선시키기 위한 돌연변이를 도입하기 위한 코돈 치환, RNase H 활성결실 돌연변이를 도입하기 위한 코돈 치환 등을 들 수 있다. 내열성을 부여 또는 향상시키기 위한 아미노산 치환을 도입하기 위한 코돈 치환으로서는 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 상기 (1)∼(8)에 나타나는 아미노산 치환을 도입하기 위한 코돈 치환을 들 수 있다. 또, 숙주 내에서 단백질 생산을 안정ㆍ향상시키기 위한 코돈 치환을 조합할 수도 있다.
본 발명의 핵산 제조방법에는 상기 2.에서 설명한 핵산을 적용할 수 있다.
6. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법 및 역전사 효소 의 내열성 향상 방법
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법은 MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을, 입체구조를 안정화시키는 아미노산, 예를 들면, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 한다. 또, 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법은 MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 아미노산 서열 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을, 입체구조를 안정화시키는 아미노산, 예를 들면, 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 극성의 염기성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산, 및 극성의 수산기 지방족 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 한다. 입체구조를 안정화시키는 아미노산에 대해서는, 상기 1.에서 설명한 바와 같다. 바람직하게는 상기 55번 위치의 아미노산 치환은 비극성의 지방족 측쇄를 가지는 아미노산 및 극성의 산성 작용기 측쇄를 가지는 아미노산으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로의 치환이고, 더욱 바람직하게는 글리신 또는 아스파라긴산으로의 치환이다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법 및 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법은 MMLV 유래의 역전사 효소 아미노산 서열에 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 것을 포함한다. 상기 MMLV 유래의 역전사 효소 아미노산 서열은 야생형 아미노산 서열, 또는 돌연변이형 서열의 어느 것일 수도 있다. 상기 돌연변이형 서열로서, MMLV 유래의 내열성 역전사 효소 돌연변이체의 아미노산 서열을 사용하는 경우, 본 발명의 방법에 따라서 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 것에　의해, 상기 아미노산 치환을 도입하기 전의 역전사 효소 내열성보다도 향상한 내열성을 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 제조할 수 있다.
따라서 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법에 의하면, MMLV 유래의 내열성 역전사 효소 돌연변이체의 아미노산 서열에 상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 것에　의해, 상기 아미노산 치환을 도입하기 전의 역전사 효소 내열성을 향상시킬 수 있다. 이 기술에 의해, 기존의 내열성 역전사 효소의 내열성을 추가로 향상시킬 수 있다. 당해 기술은 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법으로서 유용하다.
상기 55번 위치의 아미노산 치환을 도입하는 MMLV 유래의 내열성 역전사 효소 돌연변이체로서는, 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택 지난 1이상의 아미노산 치환을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체를 들 수 있다.
(1) A54P,
(2) T287K,
(3) Q291K,
(4) T306K,
(5) D524A,
(6) D524N,
(7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
(8) D209P, 및 I212A.
또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법, 및 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법에서는 MMLV 유래의 역전사 효소 아미노산 서열에 있어서, 상기 55번 위치의 아미노산 치환에 부가해서 1이상의 다른 아미노산 위치의 돌연변이를 도입할 수도 있다. 다른 아미노산 위치의 돌연변이로서는 예를 들면, 내열성을 부여하기 위한 돌연변이, 내열성을 향상시키기 위한 돌연변이, 역전사 효소의 특성을 개선시키기 위한 돌연변이, 및 RNase H 활성결실 돌연변이 등을 들 수 있다. 내열성을 부여 또는 향상하기 위한 돌연변이로서는 예를 들면, 한정하는 것은 아니지만, 상기 (1)∼(8)에 나타나는 아미노산 치환을 들 수 있다.
상기 아미노산 치환 또는 기타의 돌연변이의 도입은 대응하는 핵산서열에 PCR법을 사용해서 돌연변이 도입하는 방법, 인공 유전자에서 전체 핵산을 합성하는 방법 등의 이미 알고 있는 방법에 의해 실시할 수 있다. 예를 들면, 상기 5.에서 기재한 바와 같이, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 제조하고, 적당한 발현벡터를 사용해서 숙주세포 중에서 상기 역전사 효소 돌연변이체를 발현시키고, 상기 세포배양물로 상기 역전사 효소 돌연변이체를 취득할 수도 있다.
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법 및 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법에 의하면, 예를 들면 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 또는 60℃ 이상의 온도조건하에서도 사용할 수 있는 역전사 효소를 얻을 수 있다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법 및 본 발명의 역전사 효소 내열성 향상 방법은 역전사 효소의 특성, 예를 들면, RNA 결합활성, cDNA 신장 활성, cDNA 신장 속도에 대하여 영향을 끼치는 않고 내열성을 향상시킬 수 있다.
7. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 사용한 cDNA의 합성방법
본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 RNA에 상보적인 DNA를 합성하는 공정을 포함하는 cDNA의 합성에 사용할 수 있다. 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 내열성을 가지므로, 야생형 MMLV 역전사 효소보다 고온에서 역전사 반응을 실시할 수 있다. 또, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 종래의 내열성 역전사 효소보다도 향상한 내열성을 가지므로, 종래의 내열성 역전사 효소와 비교해서 추가로 고온 조건하에서 역전사 반응을 실시할 수 있다. 따라서 지금까지 기존의 내열성 역전사 효소를 사용해서 40℃, 45℃, 50℃, 또는 55℃에서 cDNA를 합성하고 있었던 것에 대해, 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체를 사용하면, 40℃ 이상, 45℃ 이상, 50℃ 이상, 55℃ 이상, 60℃ 이상, 또는 70℃ 이상이라고 하는, 지금까지 상정되지 않고 있었던 고온 조건하에서 역전사 반응을 실시하는 것이 가능하다. 이것에 의해, 지금까지의 온도조건으로는 말할 수 없었던 mRNA의 고차 구조 파괴를 달성할 수 있고, 그 결과적으로 mRNA 전장의 cDNA 합성이 용이하게 된다.
상기 cDNA의 합성방법을 실시할 때는, 통상, 2가 금속염, dNTPs, pH유지를 위한 완충 성분(완충액), 환원제 등을 포함하는 반응액이 조제된다. 상기 2가 금속염을 구성하는 2가 금속 이온으로서는 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 망간이온, 마그네슘이온, 코발트이온이 예시된다. 역전사 효소에 적합한 2가 금속 이온과 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다. 2가 금속 이온은 염화물, 황산염, 또는 아세트산염 등의 염 형태로 공급될 수 있다. 본 발명을 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 본 발명의 조성물 중의 2가 금속 이온의 농도로서는 예를 들면 0.5∼20mM이 바람직하게 예시된다. 상기 dNTP로서는 dATP, dCTP, dGTP 및 dTTP, 또는 그것들의 유도체의 적어도 1종이 사용된다. 적합하게는 dATP, dCTP, dGTP, 및 dTTP의 4종류의 혼합물이 사용된다.
pH 유지를 위한 완충 성분으로서는 당해 분야에서 알려져 있는 약산과 그 짝염기나 약염기와 그 짝산을 혼합한 것을 사용할 수 있다. 특별하게 한정하는 것은 아니지만, 트리스(Tris) 완충액, HEPES 완충액, 초산 완충액혹은 인산 완충액이 예시된다. 예를 들면, 역전사 효소에 적합한 완충 성분과 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다. 환원제로서는 특별하게 한정하는 것은 아니지만, DTT(dithiothreitol), 2-mercaptoethanol이 예시된다. 역전사 효소에 적합한 환원제와 그 농도는 당해 분야에서 알려져 있다.
프라이머를 사용해서 cDNA 합성을 실시하는 경우, 예를 들면 random 6 mers, Oligo dT primer, 및 유전자 특이적 프라이머가 프라이머로서 사용할 수 있다. 당해 프라이머의 쇄길이는 하이브리다이제이션의 특이성 관점으로부터, 바람직하게는 6뉴클레오타이드 이상이고, 더 바람직하게는 10뉴클레오타이드 이상이고, 올리고뉴클레오타이드의 합성 관점으로부터, 바람직하게는 100뉴클레오타이드 이하이고, 더 바람직하게는 30뉴클레오타이드 이하이다. 또, 비특이적인 cDNA 합성을 목적으로 한 랜덤 프라이머로서는 쇄길이 6∼8뉴클레오타이드의 올리고뉴클레오타이드 혼합물을 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 공지의 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다. 또, 생물 시료 유래의 올리고뉴클레오타이드일 수도 있고, 예를 들면 천연의 시료에서 조제한 DNA의 제한 엔도뉴클레아제 소화물로부터 단리해서 제작할 수도 있다.
상기 방법에서 수득된 cDNA를 주형으로 하고, 추가로 cDNA를 증폭할 수도 있다. DNA 증폭반응으로서는 PCR법이나 여러 등온 증폭법이 예시된다. 핵산 증폭법은 상기 cDNA의 합성방법에서 수득된 cDNA를 주형으로 한 상보쇄 합성 반응에 의해 실시되는 점에서, 예를 들면, 상기 반응액에 추가로 DNA 폴리머라아제를 첨가해서 실시하는 것이 가능하다. 당해 DNA 폴리머라아제로서는 내열성 DNA 폴리머라아제가 바람직하다.
이렇게 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체는 뛰어난 내열성을 가지고 있기 때문에, 복잡한 2차 구조를 형성하는 RNA를 주형으로 한 역전사 반응에 의한 cDNA 합성이나 RT-PCR 등에 유용하다.
8. 본 발명의 조성물 또는 키트
본 발명의 조성물은 역전사 반응용 조성물이다. 본 발명의 조성물은 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체에 부가해서 역전사 반응에 필요한 성분, 예를 들면, 2가 금속염, dNTPs, 완충 성분, 환원제, 멸균수 등을 함유한다. 본 발명의 조성물은 프라이머를 추가로 포함하고 있을 수도 있다. 본 발명의 키트는 역전사 반응용 키트이다. 본 발명의 키트로서는 본 발명의 역전사 효소 돌연변이체, 2가 금속염, dNTP, 완충 성분, 환원제 등을 함유하고, 사용 시에 이들을 혼합해서 역전사 반응액을 조제하기 위한 키트, 상기의 본 발명의 조성물을 함유하고, 사용시에 주형 DNA와 물(멸균수 등)을 첨가하는 것만으로 사용 가능한 키트, 추가로 상기의 본 발명의 조성물이 건조 상태에서 함유된 키트, 등이 예시된다. 특정한 RNA의 검출을 목적으로 한, 표적 RNA에 특이적인 프라이머나 양성 컨트롤용의 RNA를 함유하는 키트도 본 발명에 포함된다. 또, 상기 2가 금속염, dNTPs, 완충 성분, 및 환원제는 상기 7.에서 설명한 바와 같다.
또 본 발명의 키트는 더블-스트랜드 핵산 합성에 필요한 성분, 예를 들면, 내열성 DNA 폴리머라아제 등, 및 증폭된 더블-스트랜드 핵산의 검출에 필요한 성분, 예를 들면, Intercalator나 형광 표지 프로브 등을 함유할 수도 있다. Intercalator로서는 SYBR(등록상표) Green I나 기타의 핵산결합성 색소가, 형광 표지 프로브로서는 TaqMan(등록상표)프로브, Cycleave(등록상표) 프로브 혹은 분자비콘 프로브 등을 각각 들 수 있다. 상기 키트는 더블-스트랜드 핵산 합성용의 프라이머 세트를 추가로 포함하고 있을 수도 있다.
실시예
이하에 본 발명을 실시예에 더 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 이것들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실험방법 1
(1) 역전사 효소 돌연변이체의 조제 A
Molony Murine Leukemia Virus유래의 야생형 역전사 효소를 코딩하는 유전자의 염기서열은 Genbank Acc. No. AF033811.1에 개시되어 있다. 본 명세서에서는 그 염기서열을 바탕으로 특정한 부위에 돌연변이를 도입한 인공 유전자를 통상의 방법에 의해 조제했다. 수득된 인공 유전자는, In-Fusion(등록상표) HD Cloning Kit(다카라바이오 USA사)를 사용하고, 플라스미드 pET6xHN-C(다카라바이오 USA사)에 도입했다. 수득된 플라스미드는 C말단측에 히스티딘 태그가 부가된 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 염기서열을 가지고 있다.
다음에, 당해 플라스미드에서 대장균 BL21 DE3주(TAKARA BIO INC.)를 형질전환하고, 100㎍/㎖ 농도의 암피실린을 포함하는 1.5% 아가로오스 LB 플레이트 상에서 37℃에서 철야 배양을 실시했다. 이 플레이트로부터 3개의 싱글 콜로니를 선택해서 100㎍/㎖ 농도의 암피실린을 포함하는 LB 배지(이하, LB-AP배지라고 부른다)에 접종하고, 37℃에서 철야 진탕배양을 실시했다. 추가로 상기 배양액 300㎕을 LB-AP배지 6ml에 접종하고, 37℃에 철야 진탕배양했다. OD 600값이 0.6이 되었을 때에, 배양액에 최종농도 1mM의 IPTG를 첨가해서 추가로 25℃에서 4시간 유도 배양을 실시했다. 그 후 OD 600값이 4가 되었을 때에 균체를 채취했다.
상기에서 수득된 균체를 400㎕의 50mM Tris·HCl pH7.5, 300mM NaCl, 5% 글리세롤 및 0.15% 트리톤(Triton) X-100을 포함하는 용액(이하, Buffer S라고 부른다)에 현탁하고, 4℃에서 초음파 파쇄장치(Sonic&Materials사)를 사용한 30초간의 초음파 처리를 3회 반복하는 조작을 실시했다. 이 조작에 의해 현탁액은 투명하게 되었다. 초음파 파쇄후의 현탁액을 4℃에서 11000×g로 10분간 원심하고, 상청액을 회수했다. 이렇게 해서 얻은 조추출액을 Ni 수지 정제에 제공했다.
Ni 수지정제는 아래와 같이 실시했다. 즉, 50㎕의 Ni-NTA Agarose(Qiagen사)를 1.5㎖의 튜브에 넣고, 250㎕의 멸균증류수로 2회 세정한 뒤 Buffer A(50mM Tris·HCl pH7.5, 300mM NaCl, 5% 글리세롤 및 5mM 이미다졸) 250㎕로 2회 평형화했다. 평형화한 Ni-NTA Agarose를 조추출액 400㎕에 현탁하고, 30분간 방치시켰다. 그 후에 4℃에서 12000회전 10분간 원심했다. 상청액을 제거한 후의 Ni-NTA Agarose를 100㎕의 Buffer A로 3회 세정했다. 그 후에 100㎕의 Buffer B(50mM Tris·HCl pH7.5, 300mM NaCl, 5% 글리세롤 및 300mM 이미다졸)로 Ni-NTA Agarose로부터 흡착물을 용출시켰다. 수득된 용출액을 역전사 효소 돌연변이체 용액으로 해서 이하의 시험에 사용했다.
(2) 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 A
상기 (1)에서 수득된 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 이하의 방법으로 내열성을 시험했다. 즉, 당해 역전사 효소 돌연변이체 용액에 대해서, 최종농도가 0.25%의 소 혈청 알부민(Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.)을 포함하는 희석 Buffer(50mM Tris·HCl pH8.3, 2mM DTT, 0.1% NP-40 및 10% 글리세롤)로 2배 희석했다. 당해 희석액을 미가열 처리, 혹은 44℃ 또는 50℃에서 15분간의 가열처리에 제공했다. 그 후에 미가열 처리, 혹은 열처리후의 희석액을 상기 희석 Buffer로 추가로 5배 희석한 뒤, 역전사 효소 활성을 측정했다.
측정은 아래와 같이 실시했다. 즉, 0.01㎍/㎕ 농도의 폴리(리보아데닌 뉴클레오타이드), 0.1ng/㎕ 농도의 올리고(dT) 12-18, 85mM 염화칼륨, 8mM 염화마그네슘, 50mM Tris·HCl pH8.3, 10mM DTT, 0.1% NP-40을 포함하는 반응액 35㎕에 상기 미가열 처리, 혹은 열처리 후의 희석액 5㎕을 첨가하고, 37℃에서 5분간 가온했다. 다음에, 반응액에 2.5mM dTTP을 10㎕ 첨가하고, 37℃, 10분간 반응시켰다. 반응 정지는 100mM EDTA 용액 5㎕을 첨가해서 실시했다. 반응 정지 후의 용액으로부터 5㎕를 96웰 플레이트에 분취했다. 이 플레이트의 각각의 웰에 1×SYBR Green I(Thermo Scientific Inc.)를 150㎕씩 분주하고, 플레이트 믹서(TIETECH Co., Ltd.)를 사용해서 혼합시켰다. 그 후에 플레이트를 플레이트 원심기(Allegra사)를 사용해서 1000rpm으로 1분간의 조건으로 원심했다. 원심 후, 플레이트를 TECAN infinite 200pro(Tecan사)에 세팅하고, 여기 파장 485nm, 검출 파장 520nm의 조건으로 각 웰의 형광량을 측정하는 것으로 역전사 효소 활성 측정을 실시했다.
실험방법 2
(1) 역전사 효소 돌연변이체의 조제 B
균체 처리방법을 초음파 처리부터 리소자임에 의한 용균처리로 변경한 점을 제외하고, 실험방법 1(1)과 동일한 조제방법으로 역전사 효소 돌연변이체를 조제했다.
(2) 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 B
상기 (1)에서 수득된 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 내열성을 시험했다. 또, 가열 처리온도를 55℃, 60℃, 65℃, 및 70℃로 변경한 점을 제외하고, 실험방법 1(2)과 동일한 시험 방법이다.
실시예 1: 역전사 효소 돌연변이체의 조제 1
(1) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1∼O3 및 P12, P13의 조제( T55G , T55A , T55S, T55D, T55K)
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치에 트레오닌으로부터 글리신으로의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1으로 명명했다. 또, 55번 위치의 트레오닌을 알라닌으로 바꿔 놓은 역전사 효소 돌연변이체, 55번 위치의 트레오닌을 세린으로 바꿔 놓은 역전사 효소 돌연변이체를 각각 O2 및 O3으로 명명했다. 또, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산으로 바꿔 놓은 역전사 효소 돌연변이체, 55번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 역전사 효소 돌연변이체를 각각 P12 및 P13으로 명명했다. 이것들의 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 21∼26에 나타낸다.
(2) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3의 조제( T55G + A54P )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신으로 바꿔 놓고, 동시에 54번 위치의 알라닌을 프롤린으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치와 55번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 4 및 14에 나타낸다.
(3) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 D1의 조제( T287K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 287번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 287번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 D1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 27 및 33에 나타낸다.
(4) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+D1의 조제( T55G + T287K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 287번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 287번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+D1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 5 및 15에 나타낸다.
(5) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+D1의 조제( T55G + A54P + T287K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신, 54번 위치의 알라닌을 프롤린 및 287번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치, 54번 위치 및 287번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+D1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 39 및 45에 나타낸다.
(6) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 LT의 조제( H204R + M289L + T306K + F309N )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 204번 위치의 히스티딘을 아르기닌, 289번 위치의 메티오닌을 로이신, 306번 위치의 트레오닌을 리신, 또한 309번 위치의 페닐알라닌을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는, 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 204번 위치, 289번 위치, 306번 위치 및 309번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 LT로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 32 및 38에 나타낸다.
(7) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+ LT의 조제(T55G+H204R+M289L+T306K+F309N)
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신, 204번 위치의 히스티딘을 아르기닌, 289번 위치의 메티오닌을 로이신, 306번 위치의 트레오닌을 리신, 추가로 309번 위치의 페닐알라닌을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치, 204번 위치, 289번 위치, 306번 위치 및 309번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+LT로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 10 및 20에 나타낸다.
(8) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+ LT의 조제(T55G+A54P+H204R+M289L+T306K+F309N)
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신, 204번 위치의 히스티딘을 아르기닌, 289번 위치의 메티오닌을 로이신, 306번 위치의 트레오닌을 리신, 추가로 309번 위치의 페닐알라닌을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치, 204번 위치, 289번 위치, 306번 위치 및 309번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+LT로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 44 및 50에 나타낸다.
(9) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 K1의 조제( Q291K )
MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 291번 위치의 글루타민을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 291번 위치에 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 K1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열목록의 서열번호 28 및 34에 나타낸다.
(10) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+K1의 조제( T55G + Q291K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 291번 위치의 글루타민을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 291번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+K1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 6 및 16에 나타낸다.
(11) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+K1의 조제( T55G + A54P + Q291K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 291번 위치의 글루타민을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치 및 291번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+K1으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 40 및 46에 나타낸다.
(12) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 K2의 조제( D524N )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 524번 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 K2로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 31 및 37에 나타낸다.
(13) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+K2의 조제( T55G + D524N )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 524번 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+K2로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 9 및 19에 나타낸다.
(14) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+K2의 조제( T55G + A54P + D524N )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 524번 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+K2로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 43 및 49에 나타낸다.
(15) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 K3의 조제( D524A )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 524번 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 K3으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 30 및 36에 나타낸다.
(16) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+K3의 조제( T55G + D524A )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 524번 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+K3으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 8 및 18에 나타낸다.
(17) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+K3의 조제( T55G + A54P + D524A )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 524번 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+K3으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 42 및 48에 나타낸다.
(18) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 K4의 조제( T306K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 306번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 306번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 K4로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 29 및 35에 나타낸다.
(19) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+K4의 조제( T55G + T306K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 306번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 306번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+K4로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 7 및 17에 나타낸다.
(20) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+K4의 조제( T55G + A54P + T306K )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신 및 306번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치 및 306번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+K4로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 41 및 47에 나타낸다.
(21) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C5의 조제( D209P + I212A )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 209번 위치의 아스파라긴산을 프롤린 및 212번 위치의 이소로이신을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 209번 위치 및 212번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C5로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 51 및 53에 나타낸다.
(22) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 C3+C5의 조제( T55G + A54P + D209P + I212A )
실험방법 1(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 54번 위치의 알라닌을 프롤린, 55번 위치의 트레오닌을 글리신, 209번 위치의 아스파라긴산을 프롤린 및 212번 위치의 이소로이신을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 1(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 54번 위치, 55번 위치, 209번 위치 및 212번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 C3+C5로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 52 및 54에 나타낸다.
실시예 2: 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 1
실시예 1(1)에서 조제한 역전사 효소 돌연변이체 및 야생형 역전사 효소에 대해서, 실험방법 1(2)에 따라서 내열성 평가시험을 실시했다. 그 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112019067929692-pct00001
표 1에 나타나 있는 바와 같이, 특히 돌연변이체 O1, P12 또는 C3의 돌연변이체는 야생형의 아미노산 서열을 가지는 역전사 효소와 비교해서 44℃ 및 50℃, 15분의 가열처리의 어느 경우에도 잔존활성이 1.3∼4.7배로 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 돌연변이체 O3 및 P13은 44℃, 15분의 가열처리에서, 야생형 역전사 효소보다도 1.1∼1.3배 높은 잔존활성을 가졌다.
실시예 3: 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 2
본 발명의 아미노산 치환과 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 기지의 돌연변이, 혹은 본 연구에서 처음으로 내열성에 대한 관여를 확인할 수 있었던 돌연변이와의 조합에 대해서 검토했다. 즉, 실시예 1(3)과 (5), (6)과 (8), (9)과 (11), (12)과 (14), (15)과 (17), (18)과 (20), (21)과 (22)에서 조제한 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 실험방법 1(2)에 따라서 내열성 평가시험을 실시했다. 그 결과를 표 2에 나타낸다.
Figure 112019067929692-pct00002
표 2에 나타나 있는 바와 같이, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 돌연변이 D1, LT, K2, K3, K4와, 본 발명의 C3 아미노산 치환을 조합시키는 것에　의해, 어느 것의 돌연변이 조합에서도 44℃ 혹은 50℃, 15분의 가열처리에 있어서의 잔존활성이 1.3∼11.7배로 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 본원에서 처음으로 내열성에 관여하고 있는 것을 확인할 수 있었던 돌연변이 K1과 본 발명의 C3 아미노산 치환을 조합에 대해서 검토한 바, 상기 돌연변이의 조합에서도 44℃ 혹은 50℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 1.4∼12.8배로 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또 돌연변이C5와 C3 아미노산 치환을 조합시켰을 경우도 동일한 결과가 수득되었다. 이것으로부터, 본 발명은 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 내열성을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다.
실시예 4: 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 3
본 발명의 아미노산 치환과 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 기지의 돌연변이, 혹은 본 연구에서 처음으로 내열성과의 관여를 확인할 수 있었던 돌연변이와의 조합에 대해서 추가로 검토했다. 즉, 실시예 1(9)과 (10), (15)과 (16) 및 (18)과 (19)에서 조제한 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 실험방법 1(2)에 따라서 내열성 평가시험을 실시했다.
그 결과, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 돌연변이 K3, K4와, 본 발명의 O1 아미노산 치환을 조합시키는 것에　의해, K3과 O1+K3의 비교에서 4.2배, K4와 O1+K4의 비교에서 4.8배로 어느 쪽의 돌연변이의 조합에서도 50℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 본원에서 처음으로 내열성에 관여하고 있는 것을 확인할 수 있었던 돌연변이 K1과 본 발명의 O1 아미노산 치환을 조합에 대해서도, K1과 O1+K1의 비교에서 50℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 4배 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 것으로부터, 본 발명의 O1 아미노산 치환도, 실시예 3의 C3 아미노산 치환과 마찬가지로, 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 내열성을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다. 또 본 발명의 O1 아미노산 치환은 D1, LT, K2 및 C5 돌연변이와의 조합에서도 내열성을 더욱 향상시킬 수 있다.
실시예 5: 역전사 효소 돌연변이체의 조제 2
(1) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+D1의 조제( T55D + T287K )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산 및 287번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 287번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+D1로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 55 및 63에 나타낸다.
(2) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+ LT의 조제(T55D+H204R+M289L+T306K+F309N)
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산, 204번 위치의 히스티딘을 아르기닌, 289번 위치의 메티오닌을 로이신, 306번 위치의 트레오닌을 리신, 추가로 309번 위치의 페닐알라닌을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치, 204번 위치, 289번 위치, 306번 위치, 및 309번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+LT로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 56 및 64에 나타낸다.
(3) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+K1의 조제( T55D + Q291K )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산 및 291번 위치의 글루타민을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 291번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+K1로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 57 및 65에 나타낸다.
(4) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+K2의 조제( T55D + D524N )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산 및 524번 위치의 아스파라긴산을 아스파라긴으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+K2로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 58 및 66에 나타낸다.
(5) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+K3의 조제( T55D + D524A )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산 및 524번 위치의 아스파라긴산을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 524번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+K3으로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 59 및 67에 나타낸다.
(6) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+K4의 조제( T55D + T306K )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산 및 306번 위치의 트레오닌을 리신으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치 및 306번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+K4로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 60 및 68에 나타낸다.
(7) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 O1+C5의 조제( T55G + D209P + I212A )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 글리신, 209번 위치의 아스파라긴산을 프롤린 및 212번 위치의 이소로이신을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치, 209번 위치 및 212번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 O1+C5로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 61 및 69에 나타낸다.
(8) MMLV 역전사 효소 돌연변이체 P12+C5의 조제( T55D + D209P + I212A )
실험방법 2(1)에 따라서, MMLV 역전사 효소의 야생형 아미노산 서열에 있어서, 55번 위치의 트레오닌을 아스파라긴산, 209번 위치의 아스파라긴산을 프롤린 및 212번 위치의 이소로이신을 알라닌으로 바꿔 놓은 돌연변이체 단백질을 코딩하는 인공 유전자를 조제했다. 수득된 인공 유전자는 실험방법 2(1)에 따라서 단백 발현 및 정제를 실시했다. 본 명세서에 있어서, 당해 55번 위치, 209번 위치 및 212번 위치의 치환 돌연변이를 가지는 역전사 효소 돌연변이체를 P12+C5로 명명했다. 당해 단백질의 아미노산 서열 및 핵산서열을 서열번호 62 및 70에 나타낸다.
실시예 6: 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 4
본 발명의 아미노산 치환과, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 기지의 돌연변이 혹은 본 연구에서 처음으로 내열성으로의 관여를 확인할 수 있었던 돌연변이와의 조합에 대해서 검토했다. 즉, 실시예 1(3), 실시예 1(4)와 실시예 5(1); 실시예 1(6), 실시예 1(7)과 실시예 5(2); 실시예 1(9), 실시예 1(10)과 실시예 5(3); 실시예 1(12), 실시예 1(13)과 실시예 5(4); 실시예 1(15), 실시예 1(16)과 실시예 5(5); 실시예 1(18), 실시예 1(19)과 실시예 5(6); 실시예 1(21)과 실시예 5(7), 실시예 1(22)과 실시예 5(8)에서 조제한 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 실험방법 2(2)에 따라서 내열성 평가시험을 실시했다. 그 결과를 표 3 및 표 4에 나타낸다.
Figure 112019067929692-pct00003
표 3에 나타나 있는 바와 같이, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 돌연변이 D1, LT, K2, K3, K4와, 본 발명의 O1, P12 아미노산 치환을 조합시키는 것에　의해, 어느 것의 돌연변이 조합에서도 55℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 1.3∼7.1배로 대폭 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
또, 본원에서 처음으로 내열성에 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었던 돌연변이 K1과 본 발명의 O1, P12 아미노산 치환을 조합에 대해서 검토한 바, 상기 돌연변이의 조합에서도 55℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 3.0∼8.4배로 대폭 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 것으로부터, 본 발명은 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 내열성을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다.
Figure 112019067929692-pct00004
표 4에 나타나 있는 바와 같이, 본원에서 처음으로 내열성에 관여하고 있다는 것을 확인할 수 있었던 돌연변이 C5와, 본 발명의 O1, P12 아미노산 치환을 조합시키는 것에　의해, 어느 것의 돌연변이 조합에서도 55℃, 15분의 가열처리에서의 잔존활성이 2.0∼9.0배로 대폭 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, 돌연변이 C5와 C3 아미노산 치환을 조합시켰을 경우도 동일한 결과가 수득되었다.
이상의 것으로부터, 본 발명은 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 내열성을 더욱 향상시킬 수 있다는 것을 확인했다.
실시예 7: 역전사 효소 돌연변이체의 내열성 평가시험 5
본 발명의 아미노산 치환과, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 기지의 돌연변이 혹은 본 연구에서 처음으로 내열성으로의 관여를 확인할 수 있었던 돌연변이와의 조합에 대해서 검토했다. 즉, 실시예 1(7)과 실시예 5(2)에서 조제한 역전사 효소 돌연변이체에 대해서, 실험방법 2(2)에 따라서 내열성 평가시험을 실시했다.
그 결과, 내열성에 관여하고 있다고 보고되어 있는 돌연변이 LT와, 본 발명의 O1+LT의 비교에서, 60℃, 15분 가열처리에서 6.7배, 65℃, 15분 가열처리에서 1.9배, 70℃, 15분 가열처리에서 1.9배로 더욱 고온의 가열처리에서도 잔존활성이 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다. 또, LT와, 본 발명의 P12+LT의 비교에서, 60℃, 15분 가열처리에서 2.4배, 65℃, 15분 가열처리에서 1.9배, 70℃, 15분 가열처리에서 1.9배로 더욱 고온의 가열처리에서도 잔존활성이 향상하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
이상의 것으로부터, 본 발명은 내열성이 향상한 역전사 효소 돌연변이체의 내열성을 더욱 향상시킬 수 있음을 확인했다.
(산업상의 이용 가능성)
본 발명에 의해 내열성 역전사 효소 돌연변이체를 제공할 수 있고, 당해 역전사 효소 돌연변이체를 사용하는 것에　의해, 지금까지 역전사 효소 반응이 곤란했던 강고한 2차 구조를 가지는 RNA를 주형으로 한 cDNA 합성이 가능하게 되었다. 당해 내열성 역전사 효소 돌연변이체는 유전자 공학, 생물학, 의학, 농업 등 폭넓은 넓은 분야에 있어서 유용하다.
SEQ ID NO: 1: Molony Murine Leukemia Virus reverse transcriptase amino acid sequence
SEQ ID NO: 2: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) amino acid sequence
SEQ ID NO: 3: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) amino acid sequence
SEQ ID NO: 4: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) amino acid sequence
SEQ ID NO: 5: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 6: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 7: Reverse transcriptase mutant O1+K4(T55G+T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 8: Reverse transcriptase mutant O1+K3(T55G+D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 9: Reverse transcriptase mutant O1+K2(T55G+D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 10: Reverse transcriptase mutant O1+LT(T55G+H204R +M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 11: Molony Murine Leukemia Virus reverse transcriptase nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 12: Reverse transcriptase mutant O1(T55G) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 13: Reverse transcriptase mutant P12(T55D) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 14: Reverse transcriptase mutant C3(T55G+A54P) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 15: Reverse transcriptase mutant O1+D1(T55G+T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 16: Reverse transcriptase mutant O1+K1(T55G+Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 17: Reverse transcriptase mutant O1+K4(T55G+T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 18: Reverse transcriptase mutant O1+K3(T55G+D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 19: Reverse transcriptase mutant O1+K2(T55G+D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 20: Reverse transcriptase mutant O1+LT(T55G+H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 21: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 22: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) amino acid sequence
SEQ ID NO: 23: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 24: Reverse transcriptase mutant O2(T55A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 25: Reverse transcriptase mutant O3(T55S) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 26: Reverse transcriptase mutant P13(T55K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 27: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 28: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 29: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) amino acid sequence
SEQ ID NO: 30: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 31: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 32: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) amino acid sequence
SEQ ID NO: 33: Reverse transcriptase mutant D1(T287K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 34: Reverse transcriptase mutant K1(Q291K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 35: Reverse transcriptase mutant K4(T306K) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 36: Reverse transcriptase mutant K3(D524A) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 37: Reverse transcriptase mutant K2(D524N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 38: Reverse transcriptase mutant LT(H204R+M289L+T306K+F309N) nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 39: Reverse transcriptase mutant C3+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 40: Reverse transcriptase mutant C3+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 41: Reverse transcriptase mutant C3+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 42: Reverse transcriptase mutant C3+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 43: Reverse transcriptase mutant C3+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 44: Reverse transcriptase mutant C3+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 45: Reverse transcriptase mutant C3+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 46: Reverse transcriptase mutant C3+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 47: Reverse transcriptase mutant C3+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 48: Reverse transcriptase mutant C3+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 49: Reverse transcriptase mutant C3+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 50: Reverse transcriptase mutant C3+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 51: Reverse transcriptase mutant C5(D209P+I212A) amino acid sequence
SEQ ID NO: 52: Reverse transcriptase mutant C3+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 53: Reverse transcriptase mutant C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 54: Reverse transcriptase mutant C3+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 55: Reverse transcriptase mutant P12+D1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 56: Reverse transcriptase mutant P12+LT amino acid sequence
SEQ ID NO: 57: Reverse transcriptase mutant P12+K1 amino acid sequence
SEQ ID NO: 58: Reverse transcriptase mutant P12+K2 amino acid sequence
SEQ ID NO: 59: Reverse transcriptase mutant P12+K3 amino acid sequence
SEQ ID NO: 60: Reverse transcriptase mutant P12+K4 amino acid sequence
SEQ ID NO: 61: Reverse transcriptase mutant O1+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 62: Reverse transcriptase mutant P12+C5 amino acid sequence
SEQ ID NO: 63: Reverse transcriptase mutant P12+D1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 64: Reverse transcriptase mutant P12+LT nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 65: Reverse transcriptase mutant P12+K1 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 66: Reverse transcriptase mutant P12+K2 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 67: Reverse transcriptase mutant P12+K3 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 68: Reverse transcriptase mutant P12+K4 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 69: Reverse transcriptase mutant O1+C5 nucleic acid sequence
SEQ ID NO: 70: Reverse transcriptase mutant P12+C5 nucleic acid sequence
SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Thermostable reverse transcriptase <130> 673732 <150> JP 2016-242171 <151> 2016-12-14 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 673 <212> PRT <213> Moloney murine leukemia virus <400> 1 Met Thr Leu Asn Ile Glu Asp Glu His Arg Leu His Glu Thr Ser Lys 1 5 10 15 Glu Pro Asp Val Ser Leu Gly Ser Thr Trp Leu Ser Asp Phe Pro Gln 20 25 30 Ala Trp Ala Glu Thr Gly Gly Met Gly Leu Ala Val Arg Gln Ala Pro 35 40 45 Leu Ile Ile Pro Leu Lys Ala Thr Ser Thr Pro Val Ser Ile Lys Gln 50 55 60 Tyr Pro Met Ser Gln Glu Ala Arg Leu Gly Ile Lys Pro His Ile Gln 65 70 75 80 Arg Leu Leu Asp Gln Gly Ile Leu Val Pro Cys Gln Ser Pro Trp Asn 85 90 95 Thr Pro Leu Leu Pro Val Lys Lys Pro Gly Thr Asn Asp Tyr Arg Pro 100 105 110 Val Gln Asp Leu Arg Glu Val Asn Lys Arg Val Glu Asp Ile His Pro 115 120 125 Thr Val Pro Asn Pro Tyr Asn Leu Leu Ser Gly Leu Pro Pro Ser His 130 135 140 Gln Trp Tyr Thr Val Leu Asp Leu Lys Asp Ala Phe Phe Cys Leu Arg 145 150 155 160 Leu His Pro 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Glu Lys Gln Gly Tyr Ala Lys Gly Val Leu Thr Gln 370 375 380 Lys Leu Gly Pro Trp Arg Arg Pro Val Ala Tyr Leu Ser Lys Lys Leu 385 390 395 400 Asp Pro Val Ala Ala Gly Trp Pro Pro Cys Leu Arg Met Val Ala Ala 405 410 415 Ile Ala Val Leu Thr Lys Asp Ala Gly Lys Leu Thr Met Gly Gln Pro 420 425 430 Leu Val Ile Leu Ala Pro His Ala Val Glu Ala Leu Val Lys Gln Pro 435 440 445 Pro Asp Arg Trp Leu Ser Asn Ala Arg Met Thr His Tyr Gln Ala Leu 450 455 460 Leu Leu Asp Thr Asp Arg Val Gln Phe Gly Pro Val Val Ala Leu Asn 465 470 475 480 Pro Ala Thr Leu Leu Pro Leu Pro Glu Glu Gly Leu Gln His Asn Cys 485 490 495 Leu Asp Ile Leu Ala Glu Ala His Gly Thr Arg Pro Asp Leu Thr Asp 500 505 510 Gln Pro Leu Pro Asp Ala Asp His Thr Trp Tyr Thr Asp Gly Ser Ser 515 520 525 Leu Leu Gln Glu Gly Gln Arg Lys Ala Gly Ala Ala Val Thr Thr Glu 530 535 540 Thr Glu Val Ile Trp Ala Lys Ala Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ala Gln 545 550 555 560 Arg Ala Glu Leu Ile Ala Leu Thr Gln Ala Leu Lys Met Ala Glu Gly 565 570 575 Lys Lys Leu Asn 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acaacctctt gagcgggctc 420 ccaccgtccc accagtggta cactgtgctt gatttaaagg atgccttttt ctgcctgaga 480 ctccacccca ccagtcagcc tctcttcgcc tttgagtgga gagatccaga gatgggaatc 540 tcaggacaat tgacctggac cagactccca cagggtttca aaaacagtcc caccctgttt 600 gatgaggcac tgcacagaga cctagcagac ttccggatcc agcacccaga cttgatcctg 660 ctacagtacg tggatgactt actgctggcc gccacttctg agctagactg ccaacaaggt 720 actcgggccc tgttacaaac cctagggaac ctcgggtatc gggcctcggc caagaaagcc 780 caaatttgcc agaaacaggt caagtatctg gggtatcttc taaaagaggg tcagagatgg 840 ctgactgagg ccagaaaaga gactgtgatg gggcagccta ctccgaagac ccctcgacaa 900 ctaagggagt tcctagggac ggcaggcttc tgtcgcctct ggatccctgg gtttgcagaa 960 atggcagccc ccttgtaccc tctcaccaaa acggggactc tgtttaattg gggcccagac 1020 caacaaaagg cctatcaaga aatcaagcaa gctcttctaa ctgccccagc cctggggttg 1080 ccagatttga ctaagccctt tgaactcttt gtcgacgaga agcagggcta cgccaaaggt 1140 gtcctaacgc aaaaactggg accttggcgt cggccggtgg cctacctgtc caaaaagcta 1200 gacccagtag cagctgggtg gcccccttgc ctacggatgg tagcagccat tgccgtactg 1260 acaaaggatg caggcaagct aaccatggga cagccactag tcattctggc cccccatgca 1320 gtagaggcac tagtcaaaca accccccgac cgctggcttt ccaacgcccg gatgactcac 1380 tatcaggcct tgcttttgga cacggaccgg gtccagttcg gaccggtggt agccctgaac 1440 ccggctacgc tgctcccact gcctgaggaa gggctgcaac acaactgcct tgatatcctg 1500 gccgaagccc acggaacccg acccgaccta acggaccagc cgctcccaga cgccgaccac 1560 acctggtaca cggctggaag cagtctctta caagagggac agcgtaaggc gggagctgcg 1620 gtgaccaccg agaccgaggt aatctgggct aaagccctgc cagccgggac atccgctcag 1680 cgggctgaac tgatagcact cacccaggcc ctaaagatgg cagaaggtaa gaagctaaat 1740 gtttatactg atagccgtta tgcttttgct actgcccata tccatggaga aatatacaga 1800 aggcgtgggt tgctcacatc agaaggcaaa gagatcaaaa ataaagacga gatcttggcc 1860 ctactaaaag ccctctttct gcccaaaaga cttagcataa tccattgtcc aggacatcaa 1920 aagggacaca gcgccgaggc tagaggcaac cggatggctg accaagcggc ccgaaaggca 1980 gccatcacag agactccaga cacctctacc ctcctcata 2019 <210> 68 <211> 2019 <212> DNA <213> Artificial Seuence <220> <223> Reverse transcriptase mutant P12+K4 nucleic acid sequence <400> 68 atgaccctaa atatagaaga tgagcatcgg ctacatgaga cctcaaaaga gccagatgtt 60 tctctagggt ccacatggct gtctgatttt cctcaggcct gggcggaaac cgggggcatg 120 ggactggcag ttcgccaagc tcctctgatc atacctctga aagcagactc tacccccgtg 180 tccataaaac aataccccat gtcacaagaa gccagactgg ggatcaagcc ccacatacag 240 agactgttgg accagggaat actggtaccc tgccagtccc cctggaacac gcccctgcta 300 cccgttaaga aaccagggac taatgattat aggcctgtcc aggatctgag agaagtcaac 360 aagcgggtgg aagacatcca ccccaccgtg cccaaccctt acaacctctt gagcgggctc 420 ccaccgtccc accagtggta cactgtgctt gatttaaagg atgccttttt ctgcctgaga 480 ctccacccca ccagtcagcc tctcttcgcc tttgagtgga gagatccaga gatgggaatc 540 tcaggacaat tgacctggac cagactccca cagggtttca aaaacagtcc caccctgttt 600 gatgaggcac tgcacagaga cctagcagac ttccggatcc agcacccaga cttgatcctg 660 ctacagtacg tggatgactt actgctggcc gccacttctg agctagactg ccaacaaggt 720 actcgggccc tgttacaaac cctagggaac ctcgggtatc gggcctcggc caagaaagcc 780 caaatttgcc agaaacaggt caagtatctg gggtatcttc taaaagaggg tcagagatgg 840 ctgactgagg ccagaaaaga gactgtgatg gggcagccta ctccgaagac ccctcgacaa 900 ctaagggagt tcctagggaa agcaggcttc tgtcgcctct ggatccctgg gtttgcagaa 960 atggcagccc ccttgtaccc tctcaccaaa acggggactc tgtttaattg gggcccagac 1020 caacaaaagg cctatcaaga aatcaagcaa gctcttctaa ctgccccagc cctggggttg 1080 ccagatttga ctaagccctt tgaactcttt gtcgacgaga agcagggcta cgccaaaggt 1140 gtcctaacgc aaaaactggg accttggcgt cggccggtgg cctacctgtc caaaaagcta 1200 gacccagtag cagctgggtg gcccccttgc ctacggatgg tagcagccat tgccgtactg 1260 acaaaggatg caggcaagct aaccatggga cagccactag tcattctggc cccccatgca 1320 gtagaggcac tagtcaaaca accccccgac cgctggcttt ccaacgcccg gatgactcac 1380 tatcaggcct tgcttttgga cacggaccgg gtccagttcg gaccggtggt agccctgaac 1440 ccggctacgc tgctcccact gcctgaggaa gggctgcaac acaactgcct tgatatcctg 1500 gccgaagccc acggaacccg acccgaccta acggaccagc cgctcccaga cgccgaccac 1560 acctggtaca cggatggaag cagtctctta caagagggac agcgtaaggc gggagctgcg 1620 gtgaccaccg agaccgaggt aatctgggct 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cagctgggtg gcccccttgc ctacggatgg tagcagccat tgccgtactg 1260 acaaaggatg caggcaagct aaccatggga cagccactag tcattctggc cccccatgca 1320 gtagaggcac tagtcaaaca accccccgac cgctggcttt ccaacgcccg gatgactcac 1380 tatcaggcct tgcttttgga cacggaccgg gtccagttcg gaccggtggt agccctgaac 1440 ccggctacgc tgctcccact gcctgaggaa gggctgcaac acaactgcct tgatatcctg 1500 gccgaagccc acggaacccg acccgaccta acggaccagc cgctcccaga cgccgaccac 1560 acctggtaca cggatggaag cagtctctta caagagggac agcgtaaggc gggagctgcg 1620 gtgaccaccg agaccgaggt aatctgggct aaagccctgc cagccgggac atccgctcag 1680 cgggctgaac tgatagcact cacccaggcc ctaaagatgg cagaaggtaa gaagctaaat 1740 gtttatactg atagccgtta tgcttttgct actgcccata tccatggaga aatatacaga 1800 aggcgtgggt tgctcacatc agaaggcaaa gagatcaaaa ataaagacga gatcttggcc 1860 ctactaaaag ccctctttct gcccaaaaga cttagcataa tccattgtcc aggacatcaa 1920 aagggacaca gcgccgaggc tagaggcaac cggatggctg accaagcggc ccgaaaggca 1980 gccatcacag agactccaga cacctctacc ctcctcata 2019 <210> 70 <211> 2019 <212> DNA <213> Artificial Seuence <220> <223> Reverse transcriptase mutant P12+C5 nucleic acid sequence <400> 70 atgaccctaa atatagaaga tgagcatcgg ctacatgaga cctcaaaaga gccagatgtt 60 tctctagggt ccacatggct gtctgatttt cctcaggcct gggcggaaac cgggggcatg 120 ggactggcag ttcgccaagc tcctctgatc atacctctga aagcaggttc tacccccgtg 180 tccataaaac aataccccat gtcacaagaa gccagactgg ggatcaagcc ccacatacag 240 agactgttgg accagggaat actggtaccc tgccagtccc cctggaacac gcccctgcta 300 cccgttaaga aaccagggac taatgattat aggcctgtcc aggatctgag agaagtcaac 360 aagcgggtgg aagacatcca ccccaccgtg cccaaccctt acaacctctt gagcgggctc 420 ccaccgtccc accagtggta cactgtgctt gatttaaagg atgccttttt ctgcctgaga 480 ctccacccca ccagtcagcc tctcttcgcc tttgagtgga gagatccaga gatgggaatc 540 tcaggacaat tgacctggac cagactccca cagggtttca aaaacagtcc caccctgttt 600 gatgaggcac tgcacagaga cctagcaccg ttccgggctc agcacccaga cttgatcctg 660 ctacagtacg tggatgactt actgctggcc gccacttctg agctagactg ccaacaaggt 720 actcgggccc tgttacaaac cctagggaac ctcgggtatc gggcctcggc 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1620 gtgaccaccg agaccgaggt aatctgggct aaagccctgc cagccgggac atccgctcag 1680 cgggctgaac tgatagcact cacccaggcc ctaaagatgg cagaaggtaa gaagctaaat 1740 gtttatactg atagccgtta tgcttttgct actgcccata tccatggaga aatatacaga 1800 aggcgtgggt tgctcacatc agaaggcaaa gagatcaaaa ataaagacga gatcttggcc 1860 ctactaaaag ccctctttct gcccaaaaga cttagcataa tccattgtcc aggacatcaa 1920 aagggacaca gcgccgaggc tagaggcaac cggatggctg accaagcggc ccgaaaggca 1980 gccatcacag agactccaga cacctctacc ctcctcata 2019

Claims (17)

  1. 몰로니 마우스 백혈병 바이러스(MMLV) 유래의 야생형 역전사 효소의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 개시코돈에 의해 코딩되는 메티오닌을 세지 않은 번호로 하여 55번 위치에 상당하는 위치에 아미노산 돌연변이를 포함하는 역전사 효소 돌연변이체로서,
    상기 아미노산 돌연변이가 트레오닌으로부터 글리신, 세린, 아스파라긴산 및 리신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로의 치환이고, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 것을 특징으로 하는 역전사 효소 돌연변이체.
  2. 제1 항에 있어서, 상기 아미노산 돌연변이가 트로오닌으로부터 글리신 또는 아스파라긴산으로의 치환인 역전사 효소 돌연변이체.
  3. 제1 항에 있어서, 추가로 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 아미노산 치환을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체:
    (1) A54P,
    (2) T287K,
    (3) Q291K,
    (4) T306K,
    (5) D524A,
    (6) D524N,
    (7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
    (8) D209P, 및 I212A.
  4. 제1 항에 있어서, 리보뉴클레아제 H 활성이 결손된 역전사 효소 돌연변이체.
  5. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산.
  6. 제5 항에 기재된 핵산 및 발현 조절서열을 포함하는 발현벡터.
  7. 제6 항에 기재된 발현벡터로 형질전환 된 역전사 효소 돌연변이체를 발현하는 세포.
  8. 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산의 제조방법으로서,
    MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 개시코돈에 의해 코딩되는 메티오닌을 세지 않은 번호로 하여 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 코딩하는 코돈을, 글리신, 세린, 아스파라긴산 및 리신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하는 공정을 포함하고, 여기에서, 당해 역전사 효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 방법.
  9. 제8 항에 있어서, MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산이, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소 또는 상기 효소의 돌연변이체 단백질을 코딩하는 핵산인 방법.
  10. 제9 항에 있어서, MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산이, 하기 (1)∼(8)로 이루어지는 그룹에서 선택되는 1이상의 아미노산 치환을 포함하는 역전사 효소 돌연변이체를 코딩하는 핵산인 방법:
    (1) A54P,
    (2) T287K,
    (3) Q291K,
    (4) T306K,
    (5) D524A,
    (6) D524N,
    (7) H204R, M289L, T306K 및 F309N, 및
    (8) D209P, 및 I212A.
  11. 내열성 역전사 효소 돌연변이체의 제조방법으로서,
    MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 개시코돈에 의해 코딩되는 메티오닌을 세지 않은 번호로 하여 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을, 글리신, 세린, 아스파라긴산 및 리신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산으로 치환하는 것을 특징으로 하고, 여기에서, 당해 내열성 역전사 효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 방법.
  12. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소 돌연변이체를 사용하여, 주형이 되는 RNA에 상보적인 DNA를 합성하는 공정을 포함하는 cDNA의 합성방법.
  13. 제12 항에 있어서, 추가로 cDNA를 증폭하는 공정을 포함하는 방법.
  14. 제13 항에 있어서, cDNA의 증폭이 등온 증폭반응 또는 PCR에 의해 실시되는 방법.
  15. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소 돌연변이체를 포함하는 조성물.
  16. 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 기재된 역전사 효소 돌연변이체를 포함하는 키트.
  17. 역전사 효소의 내열성 향상방법으로서,
    MMLV 유래의 역전사 효소를 코딩하는 핵산에 있어서, MMLV 유래의 야생형 역전사 효소의 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, 개시코돈에 의해 코딩되는 메티오닌을 세지 않은 번호로 하여 55번 위치에 상당하는 위치에 있는 트레오닌을 코딩하는 코돈을, 글리신, 세린, 아스파라긴산 및 리신으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 아미노산을 코딩하는 코돈으로 치환하는 것을 특징으로 하고, 여기에서, 당해 역전사 효소 돌연변이체는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 방법.
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