CN110291196A

CN110291196A - 耐热逆转录酶突变体

Info

Publication number: CN110291196A
Application number: CN201780086415.7A
Authority: CN
Inventors: 石川一彦; 上森隆司; 高津成彰
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 2016-12-14
Filing date: 2017-12-13
Publication date: 2019-09-27
Anticipated expiration: 2037-12-13
Also published as: JPWO2018110595A1; KR20190091499A; KR102481388B1; EP3556854A4; US20210277367A1; WO2018110595A1; US11220677B2; EP3556854A1; CN110291196B; JP7061078B2

Abstract

本发明提供：一种逆转录酶突变体，其在对应于源自莫洛尼鼠白血病病毒的野生型逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变，其中所述逆转录酶突变体的特征在于所述氨基酸突变为从苏氨酸取代成另一种氨基酸，并且另一种氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸；一种编码所述突变体的核酸；一种用于产生所述突变体和编码所述突变体的核酸的方法；一种其中使用所述突变体用于合成cDNA的方法；和一种包含所述突变体的组合物和试剂盒。

Description

耐热逆转录酶突变体

技术领域

本发明涉及耐热逆转录酶突变体。此外，本发明涉及用于增加现有逆转录酶的耐热性的方法以及用于产生耐热逆转录酶突变体的方法。

背景技术

逆转录酶(RTase)通常具有RNA依赖性DNA聚合酶活性(其为从模板RNA合成cDNA的活性)和核糖核酸酶H (RNase H)活性(其为降解RNA/DNA杂交体的RNA链的活性)。

由于逆转录酶具有RNA依赖性DNA聚合酶活性，它们可用于mRNA (其直接反映在活生物体中表达的蛋白质的氨基酸序列)的测序、cDNA文库的构建、RT-PCR等。对于这些用途，经常使用由莫洛尼鼠白血病病毒或禽类成髓细胞白血病病毒产生的逆转录酶。

因此，逆转录酶具有各种用途。然而，由于模板RNA引起了各种问题。例如，在其中mRNA具有易于形成二级结构的核苷酸序列的情况下，通过使用逆转录酶从mRNA作为模板合成cDNA可能受到二级结构的阻碍。为了解决这个问题，升高逆转录反应的温度是有效的。然而，由莫洛尼鼠白血病病毒或禽类成髓细胞白血病病毒产生的逆转录酶具有差的耐热性，并且它们在抑制RNA二级结构形成的这种温度条件下失活。因此，已经提出了具有增加的耐热性的逆转录酶突变体(参见例如专利文献1-6)。

引文列表

专利文献

专利文献1：JP 4193079 A

专利文献2：WO2004/024749

专利文献3：WO2007/022045

专利文献4：WO2009/125006

专利文献5：WO2012/108672

专利文献6：WO2015/112767

发明概述

本发明要解决的问题

然而，仍然期望开发另外的耐热逆转录酶。本发明的一个目的为提供耐热逆转录酶突变体。

问题的解决办法

作为开发耐热逆转录酶突变体的深入研究的结果，本发明人出乎意料地发现，通过用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换由莫洛尼鼠白血病病毒(下文有时称为MMLV)产生的逆转录酶的氨基酸序列中的第55位苏氨酸(其从未被突变并且认为参与环结构的稳定)，获得了具有耐热性的逆转录酶。此外，他们发现通过组合第55位的氨基酸突变与已知耐热逆转录酶的已知氨基酸突变，进一步增加了已知逆转录酶的耐热性。此外，他们发现通过组合第55位的氨基酸突变与不同的新氨基酸突变，获得了具有进一步增加的耐热性的逆转录酶。因此，完成了本发明。

具体地讲，本发明的特征为置换第53位至56位范围内的氨基酸以稳定野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的氨基酸序列中的环结构的立体结构。本发明的第一方面涉及(但不限于)在对应于第55位的位置包含氨基酸突变的逆转录酶突变体，其中氨基酸突变为用不同的氨基酸置换苏氨酸并且不同的氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸。在作为本发明第一方面的逆转录酶突变体中，氨基酸突变可为用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸。进一步地，在作为本发明第一方面的逆转录酶突变体中，氨基酸突变可为用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸。

例如，在作为本发明第一方面的逆转录酶突变体中，氨基酸突变为用甘氨酸或天冬氨酸置换苏氨酸。作为本发明第一方面的逆转录酶突变体可进一步包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

本发明包括逆转录酶突变体，其包含在第55位的上述氨基酸置换和在第54位的上述氨基酸置换(1)与一个或多个选自上述氨基酸置换(2)-(8)的氨基酸置换的组合。进一步地，作为本发明第一方面的逆转录酶突变体可能缺少核糖核酸酶H活性。

在本发明中首次发现第291位的上述氨基酸置换(3)和第209位和第212位的上述氨基酸置换(8)涉及耐热性。例如，与野生型MMLV逆转录酶相比较，在野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列中包含第291位的谷氨酰胺用赖氨酸进行氨基酸置换或第209位的天冬氨酸用脯氨酸和第212位的异亮氨酸用丙氨酸进行氨基酸置换的逆转录酶突变体具有增加的耐热性。因此，这些氨基酸置换可与本发明中第55位的上述氨基酸置换组合。

本发明的第二方面涉及编码作为本发明第一方面描述的逆转录酶突变体的核酸。

本发明的第三方面涉及表达载体，其包含作为本发明第二方面描述的核酸和表达调控序列。

本发明的第四方面涉及用作为本发明第三方面描述的表达载体转化并表达逆转录酶突变体的细胞。

本发明的第五方面涉及用于产生编码逆转录酶突变体的核酸的方法，方法包括在编码MMLV逆转录酶的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子的步骤。在本发明的第五方面，编码苏氨酸的密码子可用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换。

在本发明的第五方面，编码MMLV逆转录酶的核酸可为编码野生型MMLV逆转录酶或其突变体的核酸。

在本发明的第五方面，编码MMLV逆转录酶的核酸可为编码包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换的逆转录酶突变体的核酸：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

本发明的第六方面涉及用于产生耐热逆转录酶突变体的方法，方法包括在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸的步骤。在本发明第六方面的方法中，苏氨酸可用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸置换。

本发明的第七方面涉及用于合成cDNA的方法，方法包括使用作为本发明第一方面描述的逆转录酶突变体合成与模板RNA互补的DNA的步骤。进一步地，方法可包括扩增cDNA的步骤。进一步地，在该方法中，cDNA的扩增可通过等温扩增反应或PCR进行。

本发明的第八方面涉及包含作为本发明第一方面描述的逆转录酶突变体的组合物。

本发明的第九方面涉及一种试剂盒，其包含作为本发明第一方面描述的逆转录酶突变体。

本发明的第十方面涉及用于增加逆转录酶耐热性的方法，方法包括在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸的步骤。进一步地，本发明提供用于增加逆转录酶耐热性的方法，方法包括在编码MMLV逆转录酶的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子的步骤。

发明效果

本发明提供耐热逆转录酶突变体和用于产生突变体的方法。根据本发明，通过在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置用不同的氨基酸置换苏氨酸来提供耐热逆转录酶突变体。另外，通过在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置用另一种氨基酸置换苏氨酸，进一步增加已知的耐热逆转录酶的耐热性。本发明首次发现了这种产生进一步增加已知的耐热逆转录酶的耐热性的效果的氨基酸置换。另外，本发明的耐热逆转录酶突变体具有增加的耐热性，而逆转录酶的性质比如RNA结合活性、cDNA延伸活性和cDNA延伸速率不受影响。

实施本发明的方式

本文使用的“耐热性”是指即使在加热处理之后仍保持酶活性的性质。例如，当通过在40℃下处理5分钟通常丧失其50%活性的酶即使在50℃或更高、60℃或更高或者70℃或更高下处理5分钟之后仍保持50%或更高活性时，该酶具有增加的“耐热性”。这种具有增加的耐热性的酶可经受在更高温度下进行反应。例如，在使用莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶的情况下，由于野生型酶的最适温度在37-42℃的范围内，因此在例如43℃或更高，优选地45℃或更高，更优选地50℃或更高下保持酶活性的逆转录酶突变体为“耐热的”或“具有增加的耐热性”。

本文使用的“残留活性”是指加热处理之后剩余的酶活性。“残留活性率”也指当未经热处理的蛋白质(未加热的蛋白质)的酶活性为100%时，加热处理之后剩余的酶活性的比率(%)。

本文使用的氨基酸编号(或氨基酸位置)由未计数由起始密码子编码的甲硫氨酸时的编号表示。因此，当计数第一个甲硫氨酸时，应将1添加到本文所述的氨基酸编号。

在下文中，将详细解释本发明。

1. 本发明的耐热逆转录酶突变体

本发明的第一方面涉及耐热逆转录酶突变体，即已获得耐热性(或具有增加的耐热性)的逆转录酶的突变体。逆转录酶突变体的特征为包含突变，以使野生型MMLV逆转录酶或其突变体的氨基酸序列中的从第53位至第56位范围的立体结构(其对应于野生型莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶中的环结构部分)变为更稳定的结构。例如，逆转录酶突变体的特征为包括在对应于野生型氨基酸序列的第55位的位置用稳定逆转录酶中的环结构的立体结构的氨基酸，比如选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸置换苏氨酸。换句话说，“具有非极性脂肪族侧链的氨基酸”为非极性和疏水性氨基酸，并且其实例包括异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸和丙氨酸。“具有极性酸性官能团侧链的氨基酸”为具有羧酸基团的氨基酸，并且其实例包括天冬氨酸和谷氨酸。特别优选的是，本发明的逆转录酶突变体中的氨基酸突变为用甘氨酸或天冬氨酸对苏氨酸进行氨基酸置换。

从用氨基酸置换以稳定立体结构的观点出发，例如，本发明的逆转录酶突变体在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变，其中氨基酸突变为用不同的氨基酸置换苏氨酸，并且不同的氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸。优选地，本发明的逆转录酶突变体在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变，其中氨基酸突变为用不同的氨基酸置换苏氨酸，并且不同的氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸。“具有极性碱性官能团侧链的氨基酸”的实例包括精氨酸和赖氨酸。“具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸”的实例包括丝氨酸。

本发明的逆转录酶突变体可为在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变的逆转录酶突变体，其中氨基酸突变为用不同的氨基酸置换苏氨酸，并且不同的氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸。例如，氨基酸突变可为用甘氨酸、精氨酸、赖氨酸或丝氨酸置换苏氨酸。

例如，本发明的逆转录酶突变体可为在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变的逆转录酶突变体，其中氨基酸突变为将苏氨酸置换为不同的氨基酸，并且不同的氨基酸为选自异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、精氨酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸。作为进一步的实例，不同的氨基酸可为选自甘氨酸、天冬氨酸、赖氨酸和丝氨酸的氨基酸。

本文使用的“对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置”是指与野生型MMLV逆转录酶中的环结构的立体结构相关的位置，并且具体地讲意指MMLV逆转录酶突变体的氨基酸序列中的第55位或氨基酸序列中对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列中的第55位的位置。“MMLV逆转录酶突变体的氨基酸序列中对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列中的第55位的位置”可通过比较或比对突变体的氨基酸序列与野生型的氨基酸序列，例如使用已知的算法等易于确定。类似地，本文使用的氨基酸位置是指野生型的氨基酸序列中的氨基酸位置，并且包括突变体的氨基酸序列中对应于相应野生型的氨基酸序列中的氨基酸位置的位置。对应于野生型氨基酸序列的第55位的位置的实例包括(但不限于)突变体的氨基酸序列中的从第53位至第56位范围内的位置。

本发明的逆转录酶突变体可包含在“对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置”的苏氨酸的氨基酸置换(下文也称为“第55位的氨基酸置换”)以及除第55位以外的氨基酸位置的突变(下文也称为“不同氨基酸位置的突变”)。不同氨基酸位置的突变可为氨基酸置换、氨基酸插入或氨基酸缺失。本发明的逆转录酶突变体可在不同的氨基酸位置包含两个或更多个突变。不同氨基酸位置的突变没有特别限制，并且可为任何氨基酸突变。

不同氨基酸位置的突变的实例包括(但不限于)用于赋予耐热性的突变、用于增加耐热性的突变和用于改善逆转录酶的性质的氨基酸突变。例如，当本发明的逆转录酶突变体包含第55位的氨基酸置换与用于赋予或增加耐热性的突变(作为不同氨基酸位置的突变)的组合时，耐热性进一步增加。

不同氨基酸位置的突变的优选实例包括(但不限于)如以下(1)-(8)所示的氨基酸置换和氨基酸置换的组合：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

在上述不同氨基酸位置的突变中，在本发明中首次发现第291位的上述氨基酸置换(3)和第209位和第212位的上述氨基酸置换(8)涉及耐热性。例如，与野生型MMLV逆转录酶相比较，在野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列中包含第291位的谷氨酰胺用赖氨酸进行氨基酸置换或第209位的天冬氨酸用脯氨酸和第212位的异亮氨酸用丙氨酸进行氨基酸置换的逆转录酶突变体具有增加的耐热性。因此，通过组合这种不同氨基酸位置的突变与本发明的第55位的氨基酸置换，可获得具有进一步增加的耐热性的逆转录酶。

例如，除第55位的氨基酸置换之外，本发明的逆转录酶突变体还可包含一个或多个选自上述氨基酸置换(1)-(8)的氨基酸置换或氨基酸置换的组合。例如，包含第55位的氨基酸置换和第54位的上述氨基酸置换(1)以及一个或多个选自上述氨基酸置换(2)-(8)的氨基酸置换或氨基酸置换的组合的逆转录酶突变体也包括在本发明中。这种逆转录酶突变体的实例包括包含第54位的丙氨酸用脯氨酸进行氨基酸置换和第55位的苏氨酸用甘氨酸进行氨基酸置换与一个或多个选自上述氨基酸置换(2)-(8)的氨基酸置换的组合的逆转录酶突变体。

本发明的逆转录酶突变体可进一步包含缺失RNase H活性的突变。RNase H活性缺失突变的实例包括(但不限于)第583位和/或第524位的天冬氨酸用不同的氨基酸置换和缺失RNase H活性结构域的突变。因此，本发明提供具有耐热性且缺少RNase H活性的逆转录酶突变体。这种突变体适合用于使用RNA作为模板的逆转录反应。

本发明的逆转录酶突变体的实例包括(但不限于)包含氨基酸序列(SEQ ID NO:2)的突变体(其中SEQ ID NO: 1的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换)和包含氨基酸序列(SEQ ID NO: 3)的蛋白质(其中SEQ ID NO: 1的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换)。本发明的逆转录酶突变体的进一步实例包括由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列组成的突变体和由SEQ ID NO: 3所示的氨基酸序列组成的突变体。本发明的逆转录酶突变体的另外实例包括(但不限于)包含SEQ ID NO: 4-10、39-44、52和55-62的任何氨基酸序列的突变体。本发明的逆转录酶突变体的进一步实例包括由SEQ ID NO:4-10、39-44、52和55-62的任何氨基酸序列组成的突变体。上述氨基酸序列可包含用于进一步改善耐热性的其他突变、用于改善逆转录酶的性质的突变等。

此外，本发明的逆转录酶突变体的实例包括具有耐热性并且包含与SEQ ID NO: 1具有至少80%，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列的突变体，其中在对应于该氨基酸序列中第55位的位置的苏氨酸用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸例如甘氨酸或天冬氨酸置换。本发明的逆转录酶突变体的进一步实例包括具有耐热性并且由与SEQ ID NO: 1具有至少80%，例如至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%同一性的氨基酸序列组成的突变体，其中在对应于该氨基酸序列中第55位的位置的苏氨酸用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸例如甘氨酸或天冬氨酸置换。

本发明的逆转录酶突变体即使在40℃或更高，例如45℃或更高、50℃或更高、55℃或更高或者60℃或更高的温度条件下也呈现出活性，而野生型逆转录酶在37℃-42℃下呈现出活性。例如，本发明的逆转录酶突变体与野生型相比较，即使在50-55℃的高温范围下也呈现出高活性，并且与野生型相比较在维持在高温范围下之后也具有高残留活性。

本发明的逆转录酶突变体具有耐热性并保持逆转录酶的性质，比如RNA结合活性、cDNA延伸活性等。换句话说，“第55位的氨基酸置换”赋予逆转录酶耐热性，但不影响逆转录酶的性质，比如RNA结合活性、cDNA延伸活性和cDNA延伸速率。

当本发明的逆转录酶突变体包含第55位的氨基酸置换与用于热稳定的其他突变的组合时，其具有进一步增加的耐热性。

此外，本发明的逆转录酶突变体可包含亲和标签以促进所表达多肽的纯化。本发明的逆转录酶突变体可包含肽或多肽，比如亲和标签，例如在N-末端或C-末端，只要保持逆转录酶活性和特有的耐热性即可。这种标签可用于制备突变体。标签的实例包括已知标签，比如由4-8个连续His残基组成的组氨酸标签、Flag标签、HA标签、c-myc标签和GST标签。如果期望，标签可经包含1-15个氨基酸的接头连接于本发明的突变体。

2. 编码本发明的耐热逆转录酶突变体的核酸

根据本发明，提供编码耐热逆转录酶突变体的核酸。具体地讲，提供编码如上所述的本发明的逆转录酶突变体的核酸。

编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的实例包括(但不限于)包含编码SEQ IDNOs: 2 -10、39-44、52和55-62的任何氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的进一步实例包括由编码SEQ ID NO: 2-10、39-44、52和55-62的任何氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸。更优选地，编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的实例包括包含编码SEQ ID NO: 12-20、45-50、54和63-70的任何氨基酸序列的核苷酸序列的核酸。编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的进一步实例包括由编码SEQ ID NO: 12-20、45-50、54和63-70的任何氨基酸序列的核苷酸序列组成的核酸。核酸可进一步包含用于赋予或增加耐热性的不同核酸突变或用于改善逆转录酶的性质的核酸突变。

编码本发明的逆转录酶突变体的核酸没有特别限制，只要其由编码可在待使用的宿主中表达的蛋白质的密码子构成并具有逆转录酶活性即可。可优化密码子以使得能够在宿主中表达或增加表达水平。密码子优化优选地通过本领域常用的方法进行。

3. 包含编码本发明的耐热逆转录酶突变体的核酸的表达载体

本发明的表达载体优选地包含编码本发明的逆转录酶突变体的核酸和可操作地连接于核酸的表达调控序列。

其中将插入编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的表达载体没有特别限制，并且可为本领域常用的任何表达载体。可使用能够在宿主细胞中自主复制的载体或可整合到宿主染色体中的载体。可使用与宿主相容的载体。

其中将插入编码本发明的逆转录酶突变体的核酸的表达载体的实例包括质粒载体、噬菌体载体、病毒载体等。作为质粒载体，适合于待使用的宿主的质粒，例如源自大肠杆菌(E. coli)的质粒、源自芽孢杆菌属(Bacillus)细菌的质粒或源自酵母的质粒为本领域技术人员熟知的。许多质粒载体可市售获得。在本发明中，可使用这些已知的质粒和从已知质粒改变的质粒。作为噬菌体载体，例如可使用λ噬菌体(例如Charon 4A、Charon 21A、EMBL3、EMBL4、λgt10、λgt11、λZAP)等。作为病毒载体，例如可使用动物病毒比如逆转录病毒或痘苗病毒，或昆虫病毒比如杆状病毒。另外，已经构建了许多使用酵母、昆虫细胞和哺乳动物细胞作为宿主的异源蛋白表达系统，并且已可市售获得。这些表达系统可用于制备本发明的逆转录酶突变体。

可根据宿主选择掺入到本发明的表达载体中的启动子。宿主为大肠杆菌(E.coli)时的启动子的实例包括(但不限于)来自大肠杆菌(E. coli)或噬菌体的启动子，比如trp启动子、lac启动子、PL启动子和PR启动子以及从上述启动子改变的启动子。此外，可使用包含噬菌体来源的启动子和RNA聚合酶基因的组合的表达系统(例如pET表达系统等)。

为了促进所表达多肽的纯化，本发明的表达载体可进一步包含编码亲和标签的核酸。将编码亲和标签的核酸插入到载体中，以使得能够表达本发明的逆转录酶突变体和亲和标签的融合蛋白。亲和标签的实例包括(但不限于)编码组氨酸(His)标签、谷胱甘肽S-转移酶(GST)标签、麦芽糖结合蛋白(MBP)标签、由8个氨基酸残基(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys)组成的Strep (II)标签等的核酸。可将标签添加到编码本发明的MMLV逆转录酶(MMLV RTase)突变体的核酸的5'末端和/或3'末端，并且可适当地添加到不损害表达和标签功能的这种位置。标签优选地为可在所表达多肽的纯化步骤中切割的标签。这种可切割标签的实例包括(但不限于)包含编码融合多肽-切割蛋白酶比如Facror Xa、PreScission蛋白酶、凝血酶、肠激酶和TEV蛋白酶(烟草蚀刻病毒蛋白酶)的识别序列的核酸的标签。

本发明的表达载体可进一步含有一种或多种表达调控序列。表达调控序列的实例包括(但不限于)启动子和参与启动子控制的基因、核糖体结合序列、多腺苷酸化信号、转录终止序列(转录终止子)和增强子。表达调控序列的进一步实例包括复制起点(起始点)、编码用于选择转化子的标记的基因(耐药基因、荧光标记、发光标记)和用于提高翻译效率的碱基序列。

4. 用本发明的表达载体转化的细胞

用表达本发明的逆转录酶突变体的载体转化的细胞(宿主)可为本领域常用的任何宿主，并且没有特别限制。例如，可使用细菌(大肠杆菌(E. coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)等)、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、真核细胞和动物细胞(哺乳动物细胞，包括人细胞等)。

当原核细胞用作宿主细胞时，例如属于埃希氏菌属(Escherichia)的细菌比如大肠杆菌(E.coli)、属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌比如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、属于假单胞菌属(Pseudomonas)的细菌比如恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)或属于根瘤菌属(Rhizobium)的细菌比如苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)可用作宿主细胞。可用于产生异源蛋白质的大肠杆菌为本领域的技术人员熟知的，并且其许多菌株可市售获得(例如大肠杆菌BL21T1R、大肠杆菌BL21、大肠杆菌XL1-Blue、大肠杆菌XL2-Blue、大肠杆菌DH1、大肠杆菌JM109、大肠杆菌HB101等)。另外，已知属于芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌MI114、枯草芽孢杆菌207-21等以及属于短芽孢杆菌属(Brevibacillus)的桥石短芽孢杆菌(Brevibacillus choshinensis)等作为用于产生异源蛋白质的宿主。宿主细胞和适合于宿主的表达载体的组合可用于产生本发明的融合多肽。优选地(但不限于)，可使用大肠杆菌BL21T1R或BL21DE3，其为大肠杆菌BL2菌株。

用于将表达载体引入到宿主中的方法没有特别限制，只要其可将核酸引入到宿主中即可，并且其实例包括：包括使用钙离子的方法、电穿孔法、原生质球法和醋酸锂法。用于将重组载体引入到昆虫细胞中的方法没有特别限制，只要其可将DNA引入到昆虫细胞中即可，并且其实例包括磷酸钙法、脂质转染法和电穿孔法。在其中使用噬菌体载体或病毒载体的情况下，可通过适合于用于获得表达本发明的融合多肽的转化子的载体的方法用载体感染宿主细胞。

在培养转化子之后，可从培养物中获得本发明的逆转录酶突变体。培养条件没有特别限制，只要其适合于所用的表达载体、所用的宿主等即可。例如，在其中用pET载体转化大肠杆菌的情况下，将转化子接种到LB培养基中并在37℃下伴随振荡进行培养。当培养物达到0.2-0.8的OD时，将IPTG加入到培养基中，并继续振荡培养，例如在15-30℃下培养2-5小时，优选地在25℃下培养4-5小时，以诱导感兴趣的蛋白质的表达。之后，离心培养液，并洗涤所获得的细胞，然后用溶菌酶进行声处理或细胞溶解，得到含有本发明的突变体的破坏的产物。由于破坏的产物含有许多污染物，优选的是通过适当组合使用本领域使用的纯化方法比如硫酸铵沉淀、阴离子交换柱色谱法、阳离子交换柱色谱法、凝胶过滤、亲和柱色谱法、透析法等纯化本发明的突变体。添加亲和标签的突变体可使用根据亲和标签的性质选择的亲和载体便利地纯化。除IPTG之外，可根据所用宿主或表达载体的类型在适当的时间添加其他必需的诱导物比如L-阿拉伯糖。

5. 产生编码本发明的耐热逆转录酶突变体的核酸的方法

用于产生本发明核酸的方法包括例如在编码MMLV逆转录酶的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用编码稳定立体结构的氨基酸，比如选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子的步骤。稳定立体结构的氨基酸如以上第1部分所述。编码苏氨酸的密码子为(但不限于)优选地用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换，和更优选地用编码甘氨酸或天冬氨酸的密码子置换。

如以上第1部分所述，本发明的逆转录酶突变体的特征为例如包含突变，所述突变为在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用稳定立体结构的氨基酸，比如选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的氨基酸置换苏氨酸。在本发明中，将引入第55位氨基酸置换的逆转录酶氨基酸序列可为野生型氨基酸序列或突变氨基酸序列，比如耐热突变体的氨基酸序列。因此，在用于产生本发明的核酸的方法中，将引入上述密码子置换的编码MMLV逆转录酶的核酸可为编码野生型MMLV逆转录酶的核酸或编码MMLV逆转录酶突变体的核酸。

例如，在其中将第55位的氨基酸置换引入到MMLV耐热逆转录酶突变体中的情况下，在编码MMLV耐热逆转录酶突变体的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子，并从而可产生编码与密码子置换之前的逆转录酶突变体的耐热性相比较具有增加的耐热性的逆转录酶突变体的核酸。

例如，将引入上述密码子置换的编码MMLV耐热逆转录酶突变体的核酸可为编码包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换的逆转录酶突变体的核酸：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

上述密码子置换可通过已知方法进行。例如，密码子置换可通过使用已知方法诱变来进行，比如使用用于诱变的引物进行定点诱变，或者具有突变序列(或序列的一部分)的核酸的人工合成。另外，可进行密码子优化以使得能够在所用的宿主中表达或增加表达水平。密码子优化可通过本领域常用的方法进行。

此外，在本发明的核酸产生方法中，可在编码MMLV逆转录酶的核酸中进行一个或多个其他密码子置换以及在第55位引入氨基酸置换的密码子置换。其他密码子置换的实例包括引入用于赋予耐热性的突变的密码子置换、引入用于增加耐热性的氨基酸置换的密码子置换、引入用于改善逆转录酶的性质的突变的密码子置换以及引入RNase H活性缺失突变的密码子置换。引入用于赋予或增加耐热性的氨基酸置换的密码子置换的实例包括(但不限于)引入上述氨基酸置换(1)-(8)的密码子置换。进一步地，稳定或增加宿主中的蛋白质产生的密码子置换可与上述密码子置换组合进行。

本发明的核酸产生方法适用于产生如以上第2部分所述的核酸。

6. 用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法和用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法

用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法的特征为在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用稳定立体结构的氨基酸，比如选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸。用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法的特征为在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置用稳定立体结构的氨基酸，比如选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸、具有极性酸性官能团侧链的氨基酸、具有极性碱性官能团侧链的氨基酸和具有极性羟基脂肪族侧链的氨基酸的不同氨基酸置换苏氨酸。稳定立体结构的氨基酸如以上第1部分所述。第55位的氨基酸置换优选地为用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸置换，更优选地为用甘氨酸或天冬氨酸置换。

用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法和用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法包括将第55位的氨基酸置换引入到MMLV逆转录酶的氨基酸序列中。MMLV逆转录酶的氨基酸序列可为野生型氨基酸序列或突变体序列。在其中使用MMLV耐热逆转录酶突变体的氨基酸序列作为突变体序列的情况下，通过根据本发明在第55位引入氨基酸置换，可产生与在第55位引入氨基酸置换之前的逆转录酶突变体的耐热性相比较具有增加的耐热性的逆转录酶突变体。

因此，根据用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法，通过将第55位的氨基酸置换引入到MMLV耐热逆转录酶突变体的氨基酸序列中，与在第55位引入氨基酸置换之前的逆转录酶突变体的耐热性相比较，可增加MMLV耐热逆转录酶突变体的耐热性。根据该技术，可进一步增加现有的耐热逆转录酶的耐热性。所述技术可用作用于产生具有增加的耐热性的逆转录酶突变体的方法。

其中将引入第55位氨基酸置换的MMLV耐热逆转录酶突变体的实例包括(但不限于)包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换的逆转录酶突变体：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

此外，在用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法和用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法中，可在MMLV逆转录酶的氨基酸序列中引入一个或多个其他氨基酸位置的突变以及第55位的氨基酸置换。在一个或多个其他氨基酸位置的突变的实例包括用于赋予耐热性的突变、用于增加耐热性的突变、用于改善逆转录酶的性质的突变和RNase H活性缺失突变。用于赋予或增加耐热性的突变的实例包括(但不限于)上述氨基酸置换(1)-(8)。

上述氨基酸置换和其他突变的引入可通过已知方法进行，例如，通过使用PCR将突变引入到相应的核苷酸序列中的方法、或人工合成基因的完整核酸的方法。例如，可如以上第5部分所述制备编码本发明的逆转录酶突变体的核酸，可使用合适的表达载体在宿主细胞中表达逆转录酶突变体，并且可从细胞培养物中获得逆转录酶突变体。

根据用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法和用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法，例如，获得即使在40℃或更高、45℃或更高、50℃或更高、55℃或更高或者60℃或更高的温度条件下也可使用的逆转录酶。用于产生本发明的逆转录酶突变体的方法和用于改善本发明的逆转录酶的耐热性的方法可在不影响逆转录酶的性质比如RNA结合活性、cDNA延伸活性和cDNA延伸速率的情况下增加耐热性。

7. 使用本发明的逆转录酶突变体合成cDNA的方法

本发明的逆转录酶突变体可用于cDNA合成方法，方法包括合成与RNA互补的DNA的步骤。由于本发明的逆转录酶突变体具有耐热性，因此使用本发明的逆转录酶突变体使得能够在比野生型MMLV逆转录酶更高的温度下进行逆转录反应。此外，由于本发明的逆转录酶突变体与常规耐热逆转录酶相比较具有增加的耐热性，因此使用本发明的逆转录酶突变体使得能够与常规耐热逆转录酶相比较在更高的温度条件下进行逆转录反应。尽管使用已知的耐热逆转录酶在40℃、45℃、50℃或55℃下进行了cDNA的合成，但是使用本发明的逆转录酶突变体使得能够在从未预料到的高温条件，比如40℃或更高、45℃或更高、50℃或更高、55℃或更高、60℃或更高或者70℃或更高下进行逆转录反应。因此，通过使用本发明的逆转录酶突变体，可实现在常规温度条件下不能实现的mRNA的高级结构的破坏。结果，cDNA易于从全长mRNA合成。

为了进行如上所述的cDNA合成方法，通常制备含有二价金属盐、dNTP、用于维持pH的缓冲液组分(缓冲溶液)、还原剂等的反应溶液。构成二价金属盐的二价金属离子的实例包括(但不限于)锰离子、镁离子和钴离子。用于逆转录酶的合适的二价金属离子及其浓度为本领域已知的。二价金属离子可以盐的形式提供，比如氯化物、硫酸盐或乙酸盐。本发明的组合物中的二价金属离子的浓度的实例包括(但不限于)优选地为0.5-20 mM。作为dNTP，使用选自dATP、dCTP、dGTP和dTTP及其衍生物的至少一种。优选地，使用dATP、dCTP、dGTP和dTTP的混合物。

作为用于维持pH的缓冲液组分，可使用本领域已知的弱酸与其共轭碱的混合物或弱碱与其共轭酸的混合物。用于维持pH的缓冲液组分的实例包括(但不限于)Tris缓冲液、HEPES缓冲液、乙酸盐缓冲液和磷酸盐缓冲液。例如，适合于逆转录酶的缓冲液组分及其浓度为本领域已知的。还原剂的实例包括(但不限于) DTT (二硫苏糖醇)和2-巯基乙醇。用于逆转录酶的合适的还原剂及其浓度为本领域已知的。

对于使用引物的cDNA合成，例如可使用随机6聚体、寡聚dT引物和基因特异性引物作为引物。从杂交特异性的观点出发，引物的长度优选地为6个核苷酸或以上，更优选地为10个核苷酸或以上，和从寡核苷酸合成的观点出发，优选为100个核苷酸或以下，更优选地为30个核苷酸或以下。作为用于非特异性cDNA合成的随机引物，可使用长度为6-8个核苷酸的寡核苷酸的混合物。寡核苷酸可例如通过已知方法化学合成，或者可源自生物样品。例如，寡核苷酸可通过从天然样品制备DNA，用限制性内切核酸酶消化DNA并从消化的产物中分离寡核苷酸来制备。

通过上述方法获得的cDNA可用作进一步扩增cDNA的模板。DNA扩增反应的实例包括PCR法和各种等温扩增法。由于使用通过上述cDNA合成方法获得的cDNA作为模板，经互补链合成反应进行核酸扩增，因此可向反应溶液中进一步添加DNA聚合酶。DNA聚合酶的优选实例为耐热DNA聚合酶。

由于本发明的逆转录酶突变体具有如上所述的极好的耐热性，因此其可用于利用其中形成复杂二级结构的RNA用作模板的逆转录反应的cDNA合成或RT-PCR。

8. 本发明的组合物或试剂盒

本发明的组合物为用于逆转录反应的组合物。除本发明的逆转录酶突变体之外，本发明的组合物还含有逆转录所必需的组分，比如二价金属盐、dNTP、缓冲液成分、还原剂、无菌水等。本发明的组合物可进一步含有引物。本发明的试剂盒为用于逆转录反应的试剂盒。本发明的试剂盒的实例包括含有本发明的逆转录酶突变体、二价金属盐、dNTP、缓冲液组分、还原剂等的试剂盒，并且在使用试剂盒时其用于通过混合内容物制备逆转录反应溶液；含有本发明的组合物的试剂盒，当使用试剂盒时，仅需添加模板DNA和水(比如无菌水)；和含有干燥状态的本发明的组合物的试剂盒。本发明还包括用于检测特定RNA的试剂盒，其含有对靶RNA特异性的引物和用于阳性对照的RNA。二价金属盐、dNTP、缓冲液组分和还原剂如以上第7部分所述。

此外，本发明的试剂盒可含有双链核酸合成所必需的组分(比如耐热DNA聚合酶)和用于检测扩增的双链核酸所必需的组分(比如嵌入剂和荧光标记的探针)。嵌入剂的实例包括SYBR (注册商标)Green I和其他核酸结合染料。荧光标记的探针的实例包括TaqMan(注册商标)探针、Cycleave (注册商标)探针和分子信标探针。试剂盒可进一步含有用于双链核酸合成的引物组。

实施例

在下文中，将通过实施例更具体地解释本发明，本发明不限于这些实施例。

实验方法1

(1) 逆转录酶突变体的制备-A

编码来自莫洛尼鼠白血病病毒的野生型逆转录酶的基因的核苷酸序列公开于GenbankAcc. No. AF033811.1中。基于核苷酸序列，通过常规方法在特定位点引入突变以制备人工基因。使用In-Fusion (注册商标)HD克隆试剂盒(由Takara Bio USA制造)将由此获得的人工基因引入到质粒pET6xHN-C (由Takara Bio USA制造)中。由此获得的质粒具有编码逆转录酶突变体的核苷酸序列，该突变体具有与其C-末端侧连接的组氨酸标签。

接下来，用该质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)菌株(由Takara Bio Inc.生产)，并在含有100 μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂糖LB平板上于37℃下培养过夜。从该平板选择3个单一菌落，接种到含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(下文称为“LB-AP培养基”)中，并在37℃下振荡培养过夜。然后，将300 μl培养液接种到6 ml LB-AP培养基中，并在37℃下振荡培养过夜。当OD600值达到0.6时，将IPTG以1 mM的最终浓度加入到培养液中，并在25℃下进一步培养4小时进行诱导。当OD600值达到4时，收获细菌细胞。

使以上获得的细胞悬浮于含有400 μl 50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mM NaCl、5%甘油和0.15% Triton X-100的溶液(下文称为“缓冲液S”)中，并使用声波发生器(由Sonic& Materials, Inc.制造)在4℃下声处理3次，持续30秒。因此悬浮液变得澄清。声处理之后将悬浮液在4℃下以11000 × g离心10分钟，并收集上清液。使由此获得的粗提取物经受Ni树脂纯化。

Ni树脂纯化如下进行。将50 μl Ni-NTA琼脂糖(由Qiagen制造)在1.5 ml管中用250 μl无菌蒸馏水洗涤两次，并然后用250 μl缓冲液A (50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mMNaCl、5%甘油和5mM咪唑)平衡两次。使平衡的Ni-NTA琼脂糖悬浮于400 μl粗提取物中，静置30分钟，并然后在4℃下以12000 × g离心10分钟。去除上清液之后，用100 μl缓冲液A将沉淀的Ni-NTA琼脂糖洗涤3次。然后，使用100 μl缓冲液B (50 mM Tris-HCl pH 7.5、300 mMNaCl、5%甘油和300 mM咪唑)从Ni-NTA琼脂糖中洗脱吸附的物质。由此获得的洗脱液用作下一个测试中的逆转录酶突变体溶液。

(2) 逆转录酶突变体的耐热性评估测试-A

通过以下方法测试以上(1)中获得的逆转录酶突变体溶液的耐热性。用含有最终浓度为0.25%的牛血清白蛋白(由Takara Biotechnology (Dalian) Co., Ltd.制造)的稀释缓冲液(50 mM Tris-HCl pH 8.3、2 mM DTT、0.1% NP-40和10%甘油)将逆转录酶突变体溶液稀释2倍。稀释的溶液不加热，或在44℃或50℃下加热15分钟。将未加热的稀释溶液和加热的稀释溶液用稀释缓冲液稀释5倍，并然后进行逆转录酶活性的测量。

测量如下进行。向35 μl含有0.01 μg/μl聚(核腺嘌呤核苷酸)、0.1 ng /μl寡聚(dT)_12-18、85 mM氯化钾、8 mM氯化镁、50 mM Tris-HCl pH 8.3、10 mM DTT和0.1% NP-40的反应溶液中加入5 μl未加热或加热的稀释溶液并在37℃下加热5分钟。接下来，将10 μl2.5 mM dTTP加入到反应溶液中，并在37℃下反应10分钟。通过加入5 μl 100 mM EDTA溶液终止反应。终止反应之后，将5 μl反应溶液加入到96孔板中。在该板的每孔中，放入150 μl的1X SYBR Green I (由Thermo Scientific Inc.制造)并使用板混合器(由TaitecCorporation制造)混合。然后，使用板离心机(由Allegra制造)将板以1000 rpm离心1分钟。离心之后，将板置于TECAN infinite 200 pro (由Tecan制造)中，并通过测定每孔中在485nm的激发波长和520 nm的检测波长下的荧光量来测量逆转录酶活性。

实验方法2

(1) 逆转录酶突变体的制备-B

除了将细胞处理方法从声处理变为用溶菌酶进行细胞溶解之外，通过与实验方法1-(1)中所述相同的方法制备逆转录酶突变体。

(2) 逆转录酶突变体的耐热性评估测试-B

除了将加热温度变为55℃、60℃、65℃或70℃之外，通过与实验方法1-(2)中所述相同的方法测试以上(1)中获得的逆转录酶突变体的耐热性。

实施例1：逆转录酶突变体的制备-1

(1) MMLV逆转录酶突变体O1-O3和P12、P13 (T55G、T55A、T55S、T55D、T55K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55位具有从苏氨酸置换突变成甘氨酸的逆转录酶突变体命名为“O1”。将其中第55位的苏氨酸用丙氨酸置换的逆转录酶突变体和其中第55位的苏氨酸用丝氨酸置换的逆转录酶突变体分别命名为“O2”和“O3”。将其中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换的逆转录酶突变体和其中第55位的苏氨酸用赖氨酸置换的逆转录酶突变体分别命名为“P12”和“P13”。这些蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:21-26所示。

(2) MMLV逆转录酶突变体C3 (T55G + A54P)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第54位的丙氨酸用脯氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54和55位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:4和14所示。

(3) MMLV逆转录酶突变体D1 (T287K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第287位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第287位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“D1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 27和33所示。

(4) MMLV逆转录酶突变体O1 + D1 (T55G + T287K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第287位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和287位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 + D1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 5和15所示。

(5) MMLV逆转录酶突变体C3 + D1 (T55G + A54P + T287K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换、第54位的丙氨酸用脯氨酸置换和第287位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55、54和287位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + D1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 39和45所示。

(6) MMLV逆转录酶突变体LT (H204R + M289L + T306K + F309N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第204位的组氨酸用精氨酸置换、第289位的甲硫氨酸用亮氨酸置换、第306位的苏氨酸用赖氨酸置换和第309位的苯丙氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第204、289、306和309位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“LT”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO:32和38所示。

(7) MMLV逆转录酶突变体O1 + LT (T55G + H204R + M289L + T306K + F309N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换、第204位的组氨酸用精氨酸置换、第289位的甲硫氨酸用亮氨酸置换、第306位的苏氨酸用赖氨酸置换和第309位的苯丙氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55、204、289、306和309位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 + LT”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 10和20所示。

(8) MMLV逆转录酶突变体C3 + LT (T55G + A54P + H204R + M289L + T306K +F309N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换、第204位的组氨酸用精氨酸置换、第289位的甲硫氨酸用亮氨酸置换、第306位的苏氨酸用赖氨酸置换和第309位的苯丙氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55、204、289、306和309位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + LT”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 44和50所示。

(9) MMLV逆转录酶突变体K1 (Q291K)的制备

制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第291位的谷氨酰胺用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第291位具有突变的逆转录酶突变体命名为“K1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO: 28和34所示。

(10) MMLV逆转录酶突变体O1 + K1 (T55G + Q291K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第291位的谷氨酰胺用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和291位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 + K1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 6和16所示。

(11) MMLV逆转录酶突变体C3 + K1 (T55G + A54P + Q291K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第291位的谷氨酰胺用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55和291位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + K1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 40和46所示。

(12) MMLV逆转录酶突变体K2 (D524N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第524位的天冬氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“K2”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 31和37所示。

(13) MMLV逆转录酶突变体O1 + K2 (T55G + D524N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第524位的天冬氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 + K2”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 9和19所示。

(14) MMLV逆转录酶突变体C3 + K2 (T55G + A54P + D524N)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第524位的天冬氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55和524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + K2”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 43和49所示。

(15) MMLV逆转录酶突变体K3 (D524A)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第524位的天冬氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“K3”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 30和36所示。

(16) MMLV逆转录酶突变体O1 + K3 (T55G + D524A)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第524位的天冬氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和524位具有置换突变的逆转录酶变体命名为“O1 + K3”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 8和18所示。

(17) MMLV逆转录酶突变体C3 + K3 (T55G + A54P + D524A)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第524位的天冬氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55和524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + K3”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 42和48所示。

(18) MMLV逆转录酶突变体K4 (T306K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第306位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第306位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“K4”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 29和35所示。

(19) MMLV逆转录酶突变体O1 + K4 (T55G + T306K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第306位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和306位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 + K4”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 7和17所示。

(20) MMLV逆转录酶突变体C3 + K4 (T55G + A54P + T306K)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换和第306位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55和306位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + K4”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 41和47所示。

(21) MMLV逆转录酶突变体C5 (D209P + I212A)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第209位的天冬氨酸用脯氨酸置换和第212位的异亮氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第209和212位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C5”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 51和53所示。

(22) MMLV逆转录酶突变体C3 + C5 (T55G + A54P + D209P + I212A)的制备

根据实验方法1-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第54位的丙氨酸用脯氨酸置换、第55位的苏氨酸用甘氨酸置换、第209位的天冬氨酸用脯氨酸置换和第212位的异亮氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法1-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第54、55、209和212位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“C3 + C5”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 52和54所示。

实施例2：逆转录酶突变体的耐热性评估测试-1

根据实验方法1-(2)测试实施例1-(1)中制备的逆转录酶突变体和野生型逆转录酶的耐热性。结果如表1所示。

[表1]

如表1所示，在44℃和50℃下加热处理15分钟之后，与具有野生型氨基酸序列的逆转录酶相比，突变体O1、P12和C3特别具有1.3-4.7倍的残留活性。在44℃下加热处理15分钟之后，与野生型逆转录酶相比，突变体O3和P13具有1.1-1.3倍的残留活性。

实施例3：逆转录酶突变体的耐热性评估测试-2

检查了本发明的氨基酸置换与已报道涉及耐热性的已知突变或本发明首次发现涉及耐热性的新突变的组合。具体地讲，根据实验方法1-(2)测试了实施例1-(3)和(5)、实施例1-(6)和(8)、实施例1-(9)和(11)、实施例1-(12)和(14)、实施例1-(15)和(17)、实施例1-(18)和(20)和实施例1-(21)和(22)中制备的逆转录酶突变体的耐热性。结果如表2所示。

[表2]

如表2所示，已报道涉及耐热性的突变D1、LT、K2、K3和K4与本发明的氨基酸置换C3的任何组合，在44℃或50℃下加热处理15分钟之后使残留活性增加到1.3-11.7倍。本发明首次发现涉及耐热性的突变K1与本发明的氨基酸置换C3的组合，在44℃或50℃下加热处理15分钟之后使残留活性增加到1.4-12.8倍。此外，突变C5与氨基酸置换C3的组合显示出类似的结果。这些结果表明本发明进一步增加了具有增加的耐热性的逆转录酶突变体的耐热性。

实施例4：逆转录酶突变体的耐热性评估测试-3

检查了本发明的氨基酸置换与已报道涉及耐热性的已知突变或本发明首次发现涉及耐热性的新突变的组合。具体地讲，根据实验方法1-(2)测试实施例1-(9)和(10)、实施例1-(15)和(16)和实施例1-(18)和(19)中制备的逆转录酶突变体的耐热性。

结果发现，已报道涉及耐热性的突变K3和K4与本发明的氨基酸置换O1的任何组合，在50℃下加热处理15分钟之后使残留活性增加。具体地讲，与K3相比，O1 + K3的组合具有4.2倍的残留活性，和与K4相比，O1 + K4的组合具有4.8倍的残留活性。本发明首次发现涉及耐热性的突变K1与本发明的氨基酸置换O1的组合，在50℃下加热处理15分钟之后，当K1和O1 + K1进行比较时，使剩余活性增加到4倍。这些结果表明，与实施例3所示的氨基酸置换C3类似，本发明的氨基酸置换O1进一步增加了具有增加的耐热性的逆转录酶突变体的耐热性。另外，当与突变D1、LT、K2和C5中的任何一种组合时，本发明的氨基酸置换O1可进一步增加耐热性。

实施例5：逆转录酶突变体的制备-2

(1) MMLV逆转录酶突变体P12 + D1 (T55D + T287K)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换和第287位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和287位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + D1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 55和63所示。

(2) MMLV逆转录酶突变体P12 + LT (T55D + H204R + M289L + T306K + F309N)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换、第204位的组氨酸用精氨酸置换、第289位的甲硫氨酸用亮氨酸置换、第306位的苏氨酸用赖氨酸置换和第309位的苯丙氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55、204、289、306和309位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + LT”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 56和64所示。

(3) MMLV逆转录酶突变体P12 + K1 (T55D + Q291K)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换和第291位的谷氨酰胺用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和291位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + K1”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 57和65所示。

(4) MMLV逆转录酶突变体P12 + K2 (T55D + D524N)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换和第524位的天冬氨酸用天冬酰胺置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + K2”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 58和66所示。

(5) MMLV逆转录酶突变体P12 + K3 (T55D + D524A)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换和第524位的天冬氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和524位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + K3”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 59和67所示。

(6) MMLV逆转录酶突变体P12 + K4 (T55D + T306K)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换和第306位的苏氨酸用赖氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55和306位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 + K4”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 60和68所示。

(7) MMLV逆转录酶突变体O1 + C5 (T55G + D209P + I212A)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用甘氨酸置换、第209位的天冬氨酸用脯氨酸置换和第212位的异亮氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55、209和212位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“O1 +C5”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 61和69所示。

(8) MMLV逆转录酶突变体P12 + C5 (T55D + D209P + I212A)的制备

根据实验方法2-(1)，制备编码突变体蛋白的人工基因，其中在MMLV逆转录酶的野生型氨基酸序列中第55位的苏氨酸用天冬氨酸置换、第209位的天冬氨酸用脯氨酸置换和第212位的异亮氨酸用丙氨酸置换。使用由此获得的人工基因，根据实验方法2-(1)进行蛋白质表达和纯化。本文使用的在第55、209和212位具有置换突变的逆转录酶突变体命名为“P12 +C5”。蛋白质的氨基酸序列和核苷酸序列如SEQ ID NO: 62和70所示。

实施例6：逆转录酶突变体的耐热性评估测试-4

检查了本发明的氨基酸置换与已报道涉及耐热性的已知突变或本发明首次发现涉及耐热性的新突变的组合。具体地讲，根据实验方法2-(2)测试实施例1-(3)、实施例1-(4)和实施例5-(1)；实施例1-(6)、实施例1-(7)和实施例5-(2)；实施例1-(9)、实施例1-(10)和实施例5-(3)；实施例1-(12)、实施例1-(13)和实施例5-(4)；实施例1-(15)、实施例1-(16)和实施例5-(5)；实施例1-(18)、实施例1-(19)和实施例5-(6)；实施例1-(21)和实施例5-(7)；和实施例1-(22)和实施例5-(8)中制备的逆转录酶突变体的耐热性。结果如表3和4所示。

[表3]

如表3所示，已报道涉及耐热性的突变D1、LT、K2、K3和K4与本发明的氨基酸置换O1和P12的任何组合，在55℃下加热处理15分钟之后使残留活性大大地增加到1.3-7.1倍。

本发明首次发现涉及耐热性的突变K1与本发明的氨基酸置换O1和P12的组合，在55℃下加热处理15分钟之后使残留活性大大地增加到3.0-8.4倍。

这些结果表明本发明进一步增加了具有增加的耐热性的逆转录酶突变体的耐热性。

[表4]

如表4所示，本发明首次发现涉及耐热性的突变C5与本发明的氨基酸置换O1和P12的任何组合，在55℃下加热处理15分钟之后使残留活性大大地增加到2.0-9.0倍。氨基酸置换C5和C3的组合也显示出类似的结果。

实施例7：逆转录酶突变体的耐热性评估测试-5

检查了本发明的氨基酸置换与已报道涉及耐热性的已知突变或本发明首次发现涉及耐热性的新突变的组合。具体地讲，根据实验方法2-(2)测试实施例1-(7)和实施例5-(2)中制备的逆转录酶突变体的耐热性。

结果发现，O1 + LT的组合(其中突变LT已报道涉及耐热性和O1为本发明的氨基酸置换)与LT相比较，在60℃下加热处理15分钟之后具有6.7倍的残留活性，在65℃下加热处理15分钟之后具有1.9倍的残留活性，和在70℃下加热处理15分钟之后具有1.9倍的残留活性。另外发现，P12 + LT的组合(其中P12为本发明的氨基酸置换)与LT相比较，在60℃下加热处理15分钟之后具有2.4倍的残留活性，在65℃下加热处理15分钟之后具有1.9倍的残留活性，和在70℃下加热处理15分钟之后具有1.9倍的残留活性。

工业适用性

本发明提供耐热逆转录酶突变体。使用逆转录酶突变体使得能够从具有强二级结构的模板RNA合成cDNA，尽管迄今为止这种RNA的逆转录酶反应是困难的。耐热逆转录酶突变体可用于广泛范围的领域，比如基因工程、生物学、医学、农业等。

序列表自由文本

SEQ ID NO: 1：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶氨基酸序列

SEQ ID NO: 2：逆转录酶突变体O1(T55G)氨基酸序列

SEQ ID NO: 3：逆转录酶突变体P12(T55D)氨基酸序列

SEQ ID NO: 4：逆转录酶突变体C3(T55G+A54P)氨基酸序列

SEQ ID NO: 5：逆转录酶突变体O1+D1(T55G+T287K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 6：逆转录酶突变体O1+K1(T55G+Q291K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 7：逆转录酶突变体O1+K4 (T55G+T306K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 8：逆转录酶突变体O1+K3 (T55G+D524A)氨基酸序列

SEQ ID NO: 9：逆转录酶突变体O1+K2 (T55G+D524N)氨基酸序列

SEQ ID NO: 10：逆转录酶突变体O1+LT (T55G+H204R +M289L+T306K+F309N)氨基酸序列

SEQ ID NO: 11：莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶核酸序列

SEQ ID NO: 12：逆转录酶突变体O1(T55G)核酸序列

SEQ ID NO: 13：逆转录酶突变体P12(T55D)核酸序列

SEQ ID NO: 14：逆转录酶突变体C3(T55G+A54P)核酸序列

SEQ ID NO: 15：逆转录酶突变体O1+D1(T55G+T287K)核酸序列

SEQ ID NO: 16：逆转录酶突变体O1+K1(T55G+Q291K)核酸序列

SEQ ID NO: 17：逆转录酶突变体O1+K4 (T55G+T306K)核酸序列

SEQ ID NO: 18：逆转录酶突变体O1+K3 (T55G+D524A)核酸序列

SEQ ID NO: 19：逆转录酶突变体O1+K2 (T55G+D524N)核酸序列

SEQ ID NO: 20：逆转录酶突变体O1+LT (T55G+H204R+M289L+T306K+F309N)核酸序列

SEQ ID NO: 21：逆转录酶突变体O2(T55A)氨基酸序列

SEQ ID NO: 22：逆转录酶突变体O3(T55S)氨基酸序列

SEQ ID NO: 23：逆转录酶突变体P13(T55K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 24：逆转录酶突变体O2(T55A)核酸序列

SEQ ID NO: 25：逆转录酶突变体O3(T55S)核酸序列

SEQ ID NO: 26：逆转录酶突变体P13(T55K)核酸序列

SEQ ID NO: 27：逆转录酶突变体D1(T287K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 28：逆转录酶突变体K1(Q291K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 29：逆转录酶突变体K4(T306K)氨基酸序列

SEQ ID NO: 30：逆转录酶突变体K3(D524A)氨基酸序列

SEQ ID NO: 31：逆转录酶突变体K2(D524N)氨基酸序列

SEQ ID NO: 32：逆转录酶突变体LT(H204R+M289L+T306K+F309N)氨基酸序列

SEQ ID NO: 33：逆转录酶突变体D1(T287K)核酸序列

SEQ ID NO: 34：逆转录酶突变体K1(Q291K)核酸序列

SEQ ID NO: 35：逆转录酶突变体K4(T306K)核酸序列

SEQ ID NO: 36：逆转录酶突变体K3(D524A)核酸序列

SEQ ID NO: 37：逆转录酶突变体K2(D524N)核酸序列

SEQ ID NO: 38：逆转录酶突变体LT(H204R+M289L+T306K+F309N)核酸序列

SEQ ID NO: 39：逆转录酶突变体C3+D1氨基酸序列

SEQ ID NO: 40：逆转录酶突变体C3+K1氨基酸序列

SEQ ID NO: 41：逆转录酶突变体C3+K4氨基酸序列

SEQ ID NO: 42：逆转录酶突变体C3+K3氨基酸序列

SEQ ID NO: 43：逆转录酶突变体C3+K2氨基酸序列

SEQ ID NO: 44：逆转录酶突变体C3+LT氨基酸序列

SEQ ID NO: 45：逆转录酶突变体C3+D1核酸序列

SEQ ID NO: 46：逆转录酶突变体C3+K1核酸序列

SEQ ID NO: 47：逆转录酶突变体C3+K4核酸序列

SEQ ID NO: 48：逆转录酶突变体C3+K3核酸序列

SEQ ID NO: 49：逆转录酶突变体C3+K2核酸序列

SEQ ID NO: 50：逆转录酶突变体C3+LT核酸序列

SEQ ID NO: 51：逆转录酶突变体C5 (D209P+I212A)氨基酸序列

SEQ ID NO: 52：逆转录酶突变体C3+C5氨基酸序列

SEQ ID NO: 53：逆转录酶突变体C5核酸序列

SEQ ID NO: 54：逆转录酶突变体C3+C5核酸序列

SEQ ID NO: 55：逆转录酶突变体P12+D1氨基酸序列

SEQ ID NO: 56：逆转录酶突变体P12+LT氨基酸序列

SEQ ID NO: 57：逆转录酶突变体P12+K1氨基酸序列

SEQ ID NO: 58：逆转录酶突变体P12+K2氨基酸序列

SEQ ID NO: 59：逆转录酶突变体P12+K3氨基酸序列

SEQ ID NO: 60：逆转录酶突变体P12+K4氨基酸序列

SEQ ID NO: 61：逆转录酶突变体O1+C5氨基酸序列

SEQ ID NO: 62：逆转录酶突变体P12+C5氨基酸序列

SEQ ID NO: 63：逆转录酶突变体P12+D1核酸序列

SEQ ID NO: 64：逆转录酶突变体P12+LT核酸序列

SEQ ID NO: 65：逆转录酶突变体P12+K1核酸序列

SEQ ID NO: 66：逆转录酶突变体P12+K2核酸序列

SEQ ID NO: 67：逆转录酶突变体P12+K3核酸序列

SEQ ID NO: 68：逆转录酶突变体P12+K4核酸序列

SEQ ID NO: 69：逆转录酶突变体O1+C5核酸序列

SEQ ID NO: 70：逆转录酶突变体P12+C5核酸序列

Claims

1.一种逆转录酶突变体，其在对应于野生型莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置包含氨基酸突变，其中所述氨基酸突变为用不同的氨基酸置换苏氨酸，并且所述不同的氨基酸选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸。

2.权利要求1的逆转录酶突变体，其中所述不同的氨基酸为甘氨酸或天冬氨酸。

3.权利要求1或2的逆转录酶突变体，其进一步包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

4.权利要求1-3中任何一项的逆转录酶突变体，其缺少核糖核酸酶H活性。

5.一种编码权利要求1-4中任何一项的逆转录酶突变体的核酸。

6.一种表达载体，其包含权利要求5的核酸和表达调控序列。

7.一种用权利要求6的表达载体转化的细胞，其表达逆转录酶突变体。

8.一种用于产生编码逆转录酶突变体的核酸的方法，所述方法包括以下步骤：在编码MMLV逆转录酶的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子。

9.权利要求8的方法，其中编码MMLV逆转录酶的核酸为编码野生型MMLV逆转录酶或其突变体的核酸。

10.权利要求9的方法，其中编码MMLV逆转录酶的核酸为编码包含一个或多个选自以下(1)-(8)的氨基酸置换的逆转录酶突变体的核酸：

(1) A54P，

(2) T287K，

(3) Q291K，

(4) T306K，

(5) D524A，

(6) D524N，

(7) H204R、M289L、T306K和F309N，和

(8) D209P和I212A。

11.一种用于产生耐热逆转录酶突变体的方法，所述方法包括以下步骤：在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸置换苏氨酸。

12.一种用于合成cDNA的方法，所述方法包括使用权利要求1-4中任何一项的逆转录酶突变体合成与模板RNA互补的DNA的步骤。

13.权利要求12的方法，其进一步包括扩增所述cDNA的步骤。

14.权利要求13的方法，其中所述cDNA的扩增通过等温扩增反应或PCR进行。

15.一种组合物，其含有权利要求1-4中任何一项的逆转录酶突变体。

16.一种试剂盒，其包含权利要求1-4中任何一项的逆转录酶突变体。

17.一种用于增加逆转录酶的耐热性的方法，所述方法包括以下步骤：在编码MMLV逆转录酶的核酸中，在对应于野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第55位的位置，用编码选自具有非极性脂肪族侧链的氨基酸和具有极性酸性官能团侧链的氨基酸的氨基酸的密码子置换编码苏氨酸的密码子。