CN116042569A - Mmlv逆转录酶突变体及其应用 - Google Patents

Mmlv逆转录酶突变体及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN116042569A
CN116042569A CN202310093238.2A CN202310093238A CN116042569A CN 116042569 A CN116042569 A CN 116042569A CN 202310093238 A CN202310093238 A CN 202310093238A CN 116042569 A CN116042569 A CN 116042569A
Authority
CN
China
Prior art keywords
reverse transcriptase
mmlv reverse
kit
mutant
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202310093238.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN116042569B (zh
Inventor
谢海
黄远斌
覃雨棠
刘海莹
时彦祎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhuhai Baorui Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Zhuhai Baorui Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhuhai Baorui Biotechnology Co ltd filed Critical Zhuhai Baorui Biotechnology Co ltd
Priority to CN202310093238.2A priority Critical patent/CN116042569B/zh
Publication of CN116042569A publication Critical patent/CN116042569A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN116042569B publication Critical patent/CN116042569B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1276—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. reverse transcriptase or telomerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07049—RNA-directed DNA polymerase (2.7.7.49), i.e. telomerase or reverse-transcriptase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C12R2001/19—Escherichia coli
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本申请提供MMLV逆转录酶突变体及其应用，涉及生物技术领域，该MMLV逆转录酶突变体在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，通过实验证实E68G、L40Q和P126S三个突变体，相对野生型MMLV逆转录酶，活性分别提升了2.2倍、1.41倍和1.30倍，说明该三个MMLV逆转录酶突变体的逆转录活性相对于野生型MMLV逆转录酶大大提高。

Description

MMLV逆转录酶突变体及其应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，尤其涉及MMLV逆转录酶突变体及其应用。
背景技术
莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus，MMLV)逆转录酶是一种以RNA为模板的DNA聚合酶，具有RNase H活性，不具有3’-5’外切酶活性，可用于逆转录合成cDNA。
在分子检测中常遇到极低浓度的RNA样本，普通的逆转录酶对这种极低浓度的RNA无法进行有效逆转录，进而影响到了样本中RNA分子的检测，严重限制了微量RNA病毒检测、单细胞RNA分析等应用方面的技术开发。因此通过突变MMLV逆转录酶提高其逆转录活性，是MMLV逆转录酶的主要改造方向。
发明内容
本申请的目的在于提供MMLV逆转录酶突变体，旨在解决现有的MMLV逆转录酶活性不够高，不能检测极低浓度RNA的问题。
为实现以上目的，本申请第一方面提供MMLV逆转录酶突变体，在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，所述野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列为NCBI登陆号为NP_955591的氨基酸序列。
优选地，所述MMLV逆转录酶突变体的活性与所述野生型MMLV逆转录酶相比，至少提高了1倍。
本申请第二方面还提供核酸分子，编码上述的MMLV逆转录酶突变体。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(a)：在NCBI登陆号为NC_001501的第2337～4349位全长为2013bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸位点的突变，所述核苷酸突变位点选自：第203位的a突变为g，或第119位的t突变为a，或第376位的c突变为t；
(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述MMLV逆转录酶突变体的同义密码子序列。
本申请第三方面还提供重组表达载体，包括上述的核酸分子。
优选地，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。
本申请第四方面还提供一种宿主细胞，包括上述的核酸分子，或包括上述的重组表达载体。
本申请第五方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体的制备方法，包括：
培养上述的宿主细胞；
将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述MMLV逆转录酶突变体；
分离获得所述MMLV逆转录酶突变体。
本申请第六方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体在逆转录RNA合成cDNA的应用。
优选地，所述MMLV逆转录酶突变体合成cDNA之后，还包括以下应用：RT-PCR扩增cDNA、RT-qPCR实时定量分析mRNA水平、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增、制备基因表达芯片的cDNA靶标和RNA测序。
本申请第七方面还提供一种试剂盒，包括上述的MMLV逆转录酶突变体。
优选地，所述试剂盒选自：逆转录反应试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒、RT-qPCR试剂盒、cDNA文库构建试剂盒、cDNA末端快速扩增试剂盒或RNA测序试剂盒。
优选地，所述逆转录反应试剂盒还包括：逆转录反应缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂和逆转录反应引物中的至少一种；
所述RT-PCR扩增试剂盒还包括：PCR水、RT-PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和PCR扩增引物中的至少一种；
所述RT-qPCR试剂盒还包括：PCR水、RT-qPCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、PCR扩增引物和探针中的至少一种；
所述cDNA文库构建试剂盒还包括：接头。
本申请第八方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体在检测RNA样本中的应用。
优选地，所述RNA样本中的RNA的最低检测限相对于野生型MMLV逆转录酶，在同样条件下，提升了至少1000倍。
与现有技术相比，本申请的有益效果包括：
本申请提供的MMLV逆转录酶突变体，在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，通过实验证实E68G、L40Q和P126S三个突变体，相对野生型MMLV逆转录酶，活性分别提升了2.2倍、1.41倍和1.30倍，说明该三个MMLV逆转录酶突变体的逆转录活性相对于野生型MMLV逆转录酶大大提高。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。
图1为引物延伸电泳法检测突变体活性的原理示意图；
图2为引物延伸电泳法检测突变体活性的实验结果图；
图3为一步法RT-PCR测试MMLV逆转录酶突变体的灵敏度结果。
具体实施方式
如本文所用之术语：
“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。
当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。
“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。
本文术语“突变体”、“突变”或者“突变型”等，是指相比较于野生型DNA序列或者野生型的氨基酸序列，具有一个或者多个突变。当然这种突变可以发生在核酸水平上或者发生在氨基酸水平上。
在本文中，当表示突变位点时，依照本领域通常的表述方式，即为“突变前氨基酸缩写+位点+突变后氨基酸缩写”，例如“E68G”，其中“E”代表突变前氨基酸，“68”为相应的突变位点，“G”代表突变后的氨基酸。其中“E”和“G”均是采用本领域通用的单个字母缩写代表氨基酸。当表述组合突变时，两个突变之间用“/”连接，例如突变位点“E68G/L40Q”代表相较于野生型，在第68个氨基酸和第40个氨基酸同时发生了改变。
根据本发明的实施例，本申请第一方面提供MMLV逆转录酶突变体，在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，所述野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列为NCBI登陆号为NP_955591的氨基酸序列。
其中，MMLV逆转录酶即为莫洛尼氏鼠白血病病毒(Moloney murine leukemiaretrovirus，简称MMLV)逆转录酶，是一种以RNA为模板的DNA聚合酶，用于逆转录mRNA合成cDNA。
野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列为NCBI登陆号为NP_955591的氨基酸序列，全长为671个氨基酸，其氨基酸序列如下SEQ ID NO.1所示。MMLV逆转录酶的空间结构为典型的右手结构，分为拇指(Thumb)结构、手掌(Palm)结构和手指(Finger)结构。野生型MMLV逆转录酶具有RNase H活性，不具有3’-5’外切酶活性，且野生型MMLV逆转录酶的活性对于检测低浓度的RNA来说效果较差。
野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列：LNIEDEHRLHETSKEPDVSL GSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI(SEQ ID NO.1)。
本申请方案为了提高野生型MMLV逆转录酶的活性，在体外对野生型MMLV逆转录酶进行定向进化，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向筛选出逆转录活性提高的突变酶。
酶定向进化的方法例如可以为：易错PCR、盒式诱变、DNA改组法、体外随机重组法和交错延伸法等。筛选方法例如可以为：平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法或核糖体表面展示法。
例如可以在对野生型MMLV逆转录酶基因进行RCR扩增时采用易错PCR技术进行扩增，在野生型MMLV逆转录酶基因中引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出活性提升的突变酶。
易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。
本申请方案通过易错PCR构建野生型MMLV逆转录酶突变体库，筛选出三个活性提升的MMLV逆转录酶突变体，这三个MMLV逆转录酶突变体的氨基酸突变位点分别为E68G、L40Q和P126S，其中，E68G突变位点和L40Q突变位点位于MMLV逆转录酶的Fingers结构区域，P126S突变位点位于MMLV逆转录酶的Palm结构区域。即MMLV逆转录酶突变体可以为野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第68位的谷氨酸突变为甘氨酸，也可以为野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第40位的亮氨酸突变为谷氨酰胺，还可以为野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的第126位的脯氨酸突变为丝氨酸。
本申请提供的MMLV逆转录酶突变体，在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，通过实验证实E68G、L40Q和P126S三个突变体，相对野生型MMLV逆转录酶，活性分别提升了2.2倍、1.41倍和1.30倍，说明该三个MMLV逆转录酶突变体的逆转录活性相对于野生型MMLV逆转录酶大大提高。
优选地，所述MMLV逆转录酶突变体的活性与所述野生型MMLV逆转录酶相比，至少提高了1倍。氨基酸突变位点为E68G的MMLV逆转录酶突变体，相对野生型MMLV逆转录酶，活性提升了2.2倍，在三个MMLV逆转录酶突变体中的活性最好。
本申请第二方面还提供核酸分子，编码上述的MMLV逆转录酶突变体。
优选地，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(a)：在NCBI登陆号为NC_001501的第2337～4349位全长为2013bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸位点的突变，所述核苷酸突变位点选自：第203位的a突变为g，第119位的t突变为a，或第376位的c突变为t；
(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述MMLV逆转录酶突变体的同义密码子序列。
其中，NCBI登陆号为NC_001501的基因序列为莫洛尼氏鼠白血病病毒的全基因组序列，莫洛尼氏鼠白血病病毒的全基因组序列的第2337～4349位全长为2013bp的核苷酸序列为编码野生型MMLV逆转录酶的基因序列，其核苷酸序列如下SEQ ID NO.2所示。
野生型MMLV逆转录酶的基因序列：ctaaatatagaagatgagcatcggctacatgag acctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcata(SEQ ID NO.2)。
其中，编码氨基酸突变位点为E68G的MMLV逆转录酶突变体的核酸分子的核苷酸序列为在上述野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第203位的a突变为g。
编码氨基酸突变位点为L40Q的MMLV逆转录酶突变体的核酸分子的核苷酸序列为在上述野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第119位的t突变为a。
编码氨基酸突变位点为P126S的MMLV逆转录酶突变体的核酸分子的核苷酸序列为在上述野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第376位的c突变为t。
由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来进行编码，即同义密码子，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列，因此本申请的MMLV逆转录酶突变体不仅可以由上述(a)所述的核苷酸序列进行编码，还可以为与(a)所述的核苷酸序列进行1个或任意多个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。可以理解的是，同义密码子序列可以是对MML V逆转录酶突变体的突变氨基酸位点进行密码子同义突变，也可以是对其他非突变位点的氨基酸进行密码子同义突变。
本领域技术人员可以根据本申请公开的MMLV逆转录酶突变体的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其它适合的方法获得本申请的MMLV逆转录酶突变体，因此，编码上述MMLV逆转录酶突变体的核苷酸序列并不仅限于(a)所述的核苷酸序列，还可以为与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述MMLV逆转录酶突变体的同义密码子序列。只要编码得到的MMLV逆转录酶突变体没有明显的功能差异，均包括在本申请的范围内。
本申请第三方面还提供重组表达载体，包括上述的核酸分子，将上述的编码MMLV逆转录酶突变体的核酸分子克隆入表达载体中得到重组表达载体。其中，表达载体可以为原核表达载体，更优选为pET系列载体；更优选为pET-28a。
优选地，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。
本申请第四方面还提供一种宿主细胞，包括上述的核酸分子，或包括上述的重组表达载体。所述宿主细胞为将上述的重组表达载体转化入工程细胞得到。所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为BL21(DE3)细胞，该宿主细胞可快速、可溶表达上述的重组表达载体。
上述MMLV逆转录酶突变体可以通过化学合成方法得到，或是通过重组工程细胞株诱导表达制备得到，重组工程细胞株诱导表达得到的MMLV逆转录酶突变体可以为粗酶提取液形式，也可以为通过纯化得到的纯酶。从成本考虑，优选为通过重组工程细胞株诱导表达制备得到。
本申请第五方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体的制备方法，包括：
培养上述的宿主细胞。具体的，将宿主细胞株接种于LB培养基中培养，得到重组工程细胞种子液，将重组工程细胞种子液接种至LB培养基中，培养至菌液OD600达到0.6～0.8。
将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述MMLV逆转录酶突变体。向菌液中加入诱导剂IPTG，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀，所得菌体沉淀中包含所述的MMLV逆转录酶突变体。
分离获得所述MMLV逆转录酶突变体。具体的，在菌体沉淀中加入裂解缓冲液，震荡处理，得到均匀分散的菌体重悬液；取菌体重悬液超声处理，离心去除沉淀，过滤，得到上清液；先通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，再经阴离子交换层析，即纯化得到所述的MMLV逆转录酶突变体。
可以理解的是，在菌体沉淀中加入破胞液混匀后-80℃处理1h，再37℃处理1h，如此反复冻融3次。4000rpm条件下离心20min，上清即为粗酶液。其中破胞液包括：50mMTris7.5，0.3％溶菌酶。
本申请第六方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体在逆转录RNA合成cDNA的应用。上述的MMLV逆转录酶突变体相对于野生型MMLV逆转录酶活性提升，因此，MMLV逆转录酶突变体可以对更低浓度的RNA进行逆转录得到cDNA，从而可以检测低浓度的RNA。
优选地，所述MMLV逆转录酶突变体合成cDNA之后，还包括以下应用：RT-PCR扩增cDNA、RT-qPCR实时定量分析mRNA水平、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增、制备基因表达芯片的cDNA靶标和RNA测序。
本申请第七方面还提供一种试剂盒，包括上述的MMLV逆转录酶突变体。
优选地，所述试剂盒由用途决定选自：逆转录反应试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒、RT-qPCR试剂盒、cDNA文库构建试剂盒、cDNA末端快速扩增试剂盒、RNA测序试剂盒。
优选地，所述逆转录反应试剂盒还包括：逆转录反应缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂和逆转录反应引物中的至少一种；
所述RT-PCR扩增试剂盒还包括：PCR水、RT-PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和PCR扩增引物中的至少一种；
所述RT-qPCR试剂盒还包括：PCR水、RT-qPCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、PCR扩增引物和探针中的至少一种；
所述cDNA文库构建试剂盒还包括：接头。
本申请第八方面还提供上述的MMLV逆转录酶突变体在检测RNA样本中的应用。例如可以用于检测RNA病毒，用于病原体的检测分析，还可以用于单细胞RNA分析。
优选地，所述RNA样本中的RNA的最低检测限相对于野生型MMLV逆转录酶，在同样条件下，提升了至少1000倍。
下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1MMLV逆转录酶随机突变克隆文库的构建
1、MMLV逆转录酶随机突变克隆文库的生成
编码野生型MMLV逆转录酶的基因经过易错PCR构建在pET-28a常用质粒的NdeI和HindIII限制性内切酶位点之间，通过易错PCR以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得MMLV逆转录酶的随机突变体。
根据上述的野生型MMLV逆转录酶基因序列设计含有NdeI和HindIII酶切位点的MMLV-F和MMLV-R引物，其中MMLV-F序列为：GCAGCCATATGCTAAATATAGAAGATGAGCATCGGCT，其中下划线为NdeI酶切位点；MMLV-R序列为：CGCAAGCTTTTATATGAGGAGGGTAGA GGTGTCT，其中下划线为HindIII酶切位点。
根据表1配置易错PCR扩增体系，按照表2扩增程序进行扩增MMLV逆转录酶基因，形成含随机突变的MMLV逆转录酶基因片段文库。
表1易错PCR扩增体系
Figure BDA0004070966290000131
表2易错PCR扩增程序
Figure BDA0004070966290000132
使用NdeI和HindIII酶切线性化质粒载体pET-28a，经过纯化回收易错PCR得到的含随机突变的MMLV逆转录酶基因片段文库和酶切线性化质粒载体pET-28a，根据TAKARADNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒说明书，按照片段/载体＝0.03～0.3pmol：0.03pmol，16℃孵育2h进行连接，连接反应完成随后进行转化大肠杆菌感受态细胞BL21 DE3。
从-80℃冰箱取出BL21 DE3感受态，冰上融化。将10μL连接反应液加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置30min，随后在42℃水浴热激90s，立即冰水浴降温，3min后加入750μL LB液体培养基，在37℃摇床进行复苏50min。复苏结束后，4000rpm，离心2min。去掉上清，余100μL液体将菌体重悬，并均匀涂布于LB Kan固体平板上，37℃倒置培养12h左右，平板上单菌落集合即为MMLV逆转录酶随机突变克隆文库。
2、随机突变克隆文库的培养诱导及裂解
2.1随机突变克隆文库培养诱导
2.2.1一级深孔板培养
将步骤1得到的随机突变克隆文库平板的单菌落接种至96孔深孔板中(500μL LB培养基，50μg/mL Kan抗生素)，37℃，250rpm培养过夜，每个96深孔板设置2个野生型作为对照。
2.2.2二级深孔板诱导
从一级96孔深孔板中吸取10μL培养液转移至二级96孔深孔板板中(500μL LB培养基，50μg/mL Kan抗生素)，37℃，250rpm培养至OD600约0.6，加入一定量IPTG(终浓度为1mM)诱导酶表达，37℃，250rpm诱导过夜，至生长平台期，使各孔间的菌密度接近，同样设置2个野生型作为对照。
2.2破胞裂解
培养好的二级96孔深孔板加入100μL破胞液(50mM Tris7.5，0.3％溶菌酶)，混匀后-80℃处理1h，再37℃处理1h，如此反复冻融3次。4000rpm条件下离心20min，上清即为粗酶液，随后利用粗酶液进行活性测定。
实施例2突变型MMLV逆转录酶的鉴定
采用引物延伸电泳法对实施例1得到的突变型MMLV逆转录酶突变文库的粗酶液进行鉴定活性，引物延伸电泳法的原理如图1所示。带FAM荧光修饰的引物Primer，与互补单链RNA模板配对后，在含逆转录活性的MMLV聚合酶条件下，42℃反应，FAM荧光修饰的引物可以延伸至全长模板的长度，最后在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示长度变大的条带(FL)，活性越强，则显示全长条带FL含量越高；反之，活性越低或无活性，则显示全长条带FL含量越低或无。
1、测试体系准备
本实施例使用的带FAM荧光修饰的引物Primer的序列为S1-FAM：FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC；单链RNA模板的序列为R-Temp59：UCUAUUACAUUCUAAGAGUUAGAGUUAGGGUCUACUCUUGCUAU GCGUGGAGUGCUGAA。
R-Temp59寡核苷酸序列干粉按照合成单上的说明使用DEPC水稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒。
带荧光标记的寡核苷酸序列S1-FAM干粉按照合成单上的说明使用DEPC水稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒。
取稀释好的RNA模板R-Temp59和引物S1-FAM按1:1混合，在75℃下加热5min，然后以0.1℃/s的速率冷却至25℃，使得S1-FAM退火到R-Temp59上，得到检测模板50μmol/L。
2、测试体系反应
2.1聚合反应液的配制
按照表3的配制体系配置聚合反应液检测实施例1得到的突变型MMLV逆转录酶突变文库的粗酶液的反转录活性，在微量离心管中按照表3的比例配制聚合反应液(冰上配制)，聚合反应液配制完成后在漩涡混匀器涡旋混匀10s，微型离心机离心数秒。
表3反转录活性检测配制体系
Figure BDA0004070966290000161
2.2聚合反应液的反应
反应条件：42℃反应10分钟。
终止反应：反应完成后添加四倍体积的终止缓冲液(99％甲酰胺、0.1％SDS和20mMEDTA)终止反应。
3、聚合反应产物凝胶迁移实验
3.1配置12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。
3.2将终止反应的样品在95℃下煮沸5分钟。
3.3白电泳孔点上含溴酚蓝样品缓冲液，其余样品按顺序上样8μL。
3.4使用1×TBE电泳液，电压230V跑胶至样品跑到接近胶底结束。
3.5通过ChampGel 5000成像系统(赛智)上使用紫外条件对引物和全长产物进行拍照，并通过配套的凝胶成像系统分析全长产物的产量占比，采用灰度值分析。
4、实验结果
使用上述方案筛选约1000个MMLV突变体克隆，获得了3个活性相对于野生型MMLV逆转录酶提升的突变体克隆，命名为MM1、MM2和MM3，如图2所示，图2中泳道1为：Primer，泳道2-3为：野生型MMLV逆转录酶，泳道4-5为：MM1突变体克隆，泳道6-7为：MM2突变体克隆，泳道8-9为：MM3突变体克隆，根据图2可知，MM1、MM2和MM3三个突变体克隆均比野生型MMLV逆转录酶具有更高的逆转录酶活性。
图2的结果通过配套的凝胶成像系统分析全长产物的产量占比，结果如表4所示，MM1，MM2，MM3相对野生型MMLV，活性分别提升了2.2倍、1.41倍和1.30倍。
表4统计图2全长产物的产量占比结果
Figure BDA0004070966290000171
对MM1，MM2，MM3克隆进行DNA测序，通过确定MMLV逆转录酶突变体的DNA序列的突变情况来确定氨基酸的突变位点。测序结果显示，MM1，MM2，MM3的DNA序列分别为如下SEQID NO.3～SEQ IDNO.5所示。
MM1：ctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaaggagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcata(SEQ ID NO.3)。其中，加黑加下划线的碱基为发生氨基酸突变的密码子，发生氨基酸突变的密码子中的斜体碱基为突变后的碱基，在野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第203位的a突变为g。
MM2：ctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatggga
Figure BDA0004070966290000181
gcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcata(SEQ ID NO.4)。其中，加黑加下划线的碱基为发生氨基酸突变的密码子，发生氨基酸突变的密码子中的斜体碱基为突变后的碱基，在野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第119位的t突变为a。
MM3：ctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccactccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctcata(SEQ ID NO.5)。其中，加黑加下划线的碱基为发生氨基酸突变的密码子，发生氨基酸突变的密码子中的斜体碱基为突变后的碱基，在野生型MMLV逆转录酶的基因序列的基础上核苷酸突变位点为第376位的c突变为t。
根据MM1，MM2，MM3的DNA序列得到，此3个克隆MM1，MM2，MM3的氨基酸突变位点分别为：E68G，L40Q，P126S。MM1，MM2，MM3的氨基酸序列分别为如下SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.8所示，其中加黑加下划线且为斜体的为突变的氨基酸。
MM1：LNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKA TSTPVSIKQYPMSQGARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI(SEQ ID NO.6)。在野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的基础上第68位的谷氨酸E突变为甘氨酸G。
MM2：
LNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGQAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI(SEQID NO.7)。在野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的基础上第40位的亮氨酸L突变为谷氨酰胺Q。
MM3：
LNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHSTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLLI(SEQID NO.8)。在野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列的基础上第126位的脯氨酸P突变为丝氨酸S。
实施例3一步法RT-PCR测试MMLV逆转录酶突变体的灵敏度
1、测试体系准备
合成GAPDH引物做为检测引物，上下游引物序列分别为：
GAPDH-F：ACCACAGTCCATGCCATCAC；
GAPDH-R：TCCACCACCCTGTTGCTGTA。
产物大小452bp。
引物干粉按照合成单上的说明使用1×TE(10mmol/L Tris，1mmol/LEDTA，pH 8.5(25℃))稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，然后使用1×TE稀释至10μmol/L。
2、测试体系反应
2.1一步法RT-PCR反应液的配制
按照表5所示的一步法RT-PCR反应体系配制反应液，在微量离心管中按照表5的比例配制一步法RT-PCR反应液(冰上配制)，分别添加不同稀释倍数的RNA用量，以观察最低能够检测到的RNA用量，一步法RT-PCR反应液配制完成后在漩涡混匀器涡旋混匀10s，微型离心机离心数秒。
表5一步法RT-PCR反应体系
Figure BDA0004070966290000231
2.2一步法RT-PCR反应液的反应
反应条件：42℃逆转录30min，95℃预变性5min，进入循环扩增阶段：95℃30s→55℃30s→72℃30s，循环35次，最后在72℃保温7min。
3、一步法RT-PCR反应产物凝胶迁移实验
3.1配置2％琼脂糖凝胶。
3.2每个反应管中加入5μl 6×上样缓冲液，然后产物上样10μl。
3.3使用1×TAE电泳液，电压120V跑胶20min。
3.4通过ChampGel 5000成像系统(赛智)上使用紫外条件产物进行拍照。
4、实验结果
结果如图3所示，图3中M为：DL2000 DNA Marker，1为：野生型MMLV逆转录酶，2为：MM1，3为：MM2，4为：MM3。根据图3的结果统计得到如表6所示的结果。
表6图3扩增情况的统计表
模板用量 100ng/反应 10ng/反应 1ng/反应 0.1ng/反应 0.01ng/反应 0.001ng/反应
MMLV ++ + - - - -
MM1 +++ +++ +++ ++ + -
MM2 +++ +++ +++ ++ + -
MM3 +++ +++ ++ ++ + -
注释：+++：扩增很好；++：扩增一般；+：扩增较弱；-：无扩增。
根据图3和表6的结果可知，在相同的扩增体系下，野生型MMLV逆转录酶的RNA最低检测限为10ng/反应，而MM1、MM2和MM3的RNA最低检测限为0.01ng/反应，因此，MM1、MM2和MM3的灵敏度相对于野生型MMLV逆转录酶提升了1000倍。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。
此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (15)

1.MMLV逆转录酶突变体，其特征在于，在全长为671个氨基酸的野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：E68G、L40Q和P126S中的任一个，所述野生型MMLV逆转录酶的氨基酸序列为NCBI登陆号为NP_955591的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体，其特征在于，所述MMLV逆转录酶突变体的活性与所述野生型MMLV逆转录酶相比，至少提高了1倍。
3.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为：
(a)：在NCBI登陆号为NC_001501的第2337～4349位全长为2013bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸位点的突变，所述核苷酸突变位点选自：第203位的a突变为g，或第119位的t突变为a，或第376位的c突变为t；
(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述MMLV逆转录酶突变体的同义密码子序列。
5.重组表达载体，其特征在于，包括权利要求3至4任一项所述的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。
7.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3至4任一项所述的核酸分子，或包括权利要求5或6所述的重组表达载体。
8.权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：
培养权利要求7所述的宿主细胞；
将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述MMLV逆转录酶突变体；
分离获得所述MMLV逆转录酶突变体。
9.权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体在逆转录RNA合成cDNA的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述MMLV逆转录酶突变体合成cDNA之后，还包括以下应用：RT-PCR扩增cDNA、RT-qPCR实时定量分析mRNA水平、cDNA文库构建、cDNA末端快速扩增、制备基因表达芯片的cDNA靶标和RNA测序。
11.一种试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体。
12.根据权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒选自：逆转录反应试剂盒、RT-PCR扩增试剂盒、RT-qPCR试剂盒、cDNA文库构建试剂盒、cDNA末端快速扩增试剂盒或RNA测序试剂盒。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其特征在于，所述逆转录反应试剂盒还包括：逆转录反应缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂和逆转录反应引物中的至少一种；
所述RT-PCR扩增试剂盒还包括：PCR水、RT-PCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶和PCR扩增引物中的至少一种；
所述RT-qPCR试剂盒还包括：PCR水、RT-qPCR扩增缓冲液、dNTPs、DNA聚合酶、PCR扩增引物和探针中的至少一种；
所述cDNA文库构建试剂盒还包括：接头。
14.权利要求1所述的MMLV逆转录酶突变体在检测RNA样本中的应用。
15.根据权利要求14所述的应用，其特征在于，所述RNA样本中的RNA的最低检测限相对于野生型MMLV逆转录酶，在同样条件下，提升了至少1000倍。
CN202310093238.2A 2023-02-01 2023-02-01 Mmlv逆转录酶突变体及其应用 Active CN116042569B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310093238.2A CN116042569B (zh) 2023-02-01 2023-02-01 Mmlv逆转录酶突变体及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202310093238.2A CN116042569B (zh) 2023-02-01 2023-02-01 Mmlv逆转录酶突变体及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN116042569A true CN116042569A (zh) 2023-05-02
CN116042569B CN116042569B (zh) 2023-08-15

Family

ID=86113719

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202310093238.2A Active CN116042569B (zh) 2023-02-01 2023-02-01 Mmlv逆转录酶突变体及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN116042569B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694598A (zh) * 2023-06-30 2023-09-05 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1894403A (zh) * 2004-01-13 2007-01-10 中国科学院生物物理研究所 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法
US20080227661A1 (en) * 2005-08-10 2008-09-18 Stratagene California Mutant reverse transcriptase and methods of use
US20110081704A1 (en) * 2000-05-26 2011-04-07 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
CN106906237A (zh) * 2017-04-18 2017-06-30 淮海工学院 一种高性能m‑mlv逆转录酶的制备方法
CN107058258A (zh) * 2008-04-10 2017-08-18 赛默飞世尔科技波罗的海Uvb公司 一种逆转录酶和编码其的多核苷酸
CN110291196A (zh) * 2016-12-14 2019-09-27 宝生物工程株式会社 耐热逆转录酶突变体
CN113817707A (zh) * 2021-11-23 2021-12-21 中国医学科学院北京协和医院 一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用
WO2022020371A2 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Integrated Dna Technologies, Inc. Reverse transcriptase mutants with increased activity and thermostability
CN114480334A (zh) * 2020-11-13 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 用于新冠病毒检测的逆转录酶突变体
WO2022265965A1 (en) * 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20110081704A1 (en) * 2000-05-26 2011-04-07 Life Technologies Corporation Thermostable reverse transcriptases and uses thereof
CN1894403A (zh) * 2004-01-13 2007-01-10 中国科学院生物物理研究所 重组小鼠白血病病毒逆转录酶及其编码基因与表达方法
US20080227661A1 (en) * 2005-08-10 2008-09-18 Stratagene California Mutant reverse transcriptase and methods of use
CN107058258A (zh) * 2008-04-10 2017-08-18 赛默飞世尔科技波罗的海Uvb公司 一种逆转录酶和编码其的多核苷酸
CN110291196A (zh) * 2016-12-14 2019-09-27 宝生物工程株式会社 耐热逆转录酶突变体
CN106906237A (zh) * 2017-04-18 2017-06-30 淮海工学院 一种高性能m‑mlv逆转录酶的制备方法
WO2022020371A2 (en) * 2020-07-20 2022-01-27 Integrated Dna Technologies, Inc. Reverse transcriptase mutants with increased activity and thermostability
CN114480334A (zh) * 2020-11-13 2022-05-13 广州达安基因股份有限公司 用于新冠病毒检测的逆转录酶突变体
WO2022265965A1 (en) * 2021-06-14 2022-12-22 10X Genomics, Inc. Reverse transcriptase variants for improved performance
CN113817707A (zh) * 2021-11-23 2021-12-21 中国医学科学院北京协和医院 一种突变重组逆转录酶及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHAE-RYUN YI等: "Mutations Affecting the MA Portion of the v-Abl Protein Reveal a Conserved Role of Gag in Abelson Murine Leukemia Virus (MLV) and Moloney MLV", JOURNAL OF VIROLOGY, vol. 82, no. 11, pages 1 - 6 *
NCBI REFERENCE SEQUENCE: NP_955591.1: "NCBI Reference Sequence: NP_955591.1", NCBI, pages 1 - 4 *
唐成润等: "基于逆转录酶结构和耐药突变的新型非核苷类逆转录酶抑制剂研究进展", 国际药学研究杂志, vol. 45, no. 2, pages 81 - 87 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116694598A (zh) * 2023-06-30 2023-09-05 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN116042569B (zh) 2023-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110291196B (zh) 耐热逆转录酶突变体
CN107828755B (zh) 热启动TaqDNA聚合酶及其制备方法与应用
CN113583996B (zh) Bst DNA聚合酶重组突变体、其编码DNA及超快磁珠LAMP检测方法
CN117660400A (zh) 突变的具有高扩增活性的耐热dna聚合酶
CN116042569B (zh) Mmlv逆转录酶突变体及其应用
EP4182449A2 (en) Reverse transcriptase mutants with increased activity and thermostability
CN115975978B (zh) Bst DNA聚合酶大片段突变体及其应用
CN112175980B (zh) 通过定点突变提高聚合酶大片段活性的方法及应用
CN116286723A (zh) 一种基于蛋白定向进化的快速逆转录酶及其应用
CN114807085B (zh) 一种Taq酶突变体及其应用
CN116286721A (zh) 一种耐热型逆转录酶突变体及其制备方法和应用
CN115896063A (zh) 高保真Pfu DNA聚合酶突变体、其制备方法及应用
CN116064462A (zh) 一种Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法
CN109943549B (zh) 一种超高速扩增型Taq DNA聚合酶
CN116218814A (zh) 改造的Klenow片段及应用
CN112251423B (zh) 一种m-mlv逆转录酶体及其应用
CN115011578B (zh) 一种强化型m-mlv逆转录酶突变体及其应用
CN117925561A (zh) 一种m-mlv逆转录酶突变体及其制备方法与应用
CN114381442A (zh) 一种可快速延伸的高保真dna聚合酶及其制备方法和应用
CN118086243A (zh) 一种Taq DNA聚合酶突变体及其应用
WO2023164726A2 (en) C-terminal peptide extensions with increased activity
CN116515794A (zh) 一种基于蛋白定向进化的快速热启动酶及其应用
CN112592905A (zh) 用于新型冠状病毒检测的dna聚合酶混合物
CN112779238A (zh) 用于丙肝病毒检测的dna聚合酶混合物
CN115948364A (zh) Taq DNA聚合酶突变体Taq001及其编码基因、表达质粒、原核表达宿主

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant