CN116694598A - 一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用 - Google Patents

一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：A46、S60、V88、S92、P100、V101、R121、P127、H143、K152、P166、R211、D216、A229、D339、Q341、T420、L452、M457、T467、A500、G504、A539、L563、A589、L604、T605、S606、G608、E616、Q639或A646中的任意一个或至少两个的组合。本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，获得的突变型逆转录酶展示出提高的热稳定性、更高温度下的反应活性和/或额外的有益特性(提高的存储稳定性、提高的运输稳定性、改进的复杂结构RNA模板的cDNA合成能力或提高的特异性)。

Description

一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用。
背景技术
逆转录酶是使用RNA为模板合成DNA的酶，被广泛应用于科学研究以及从病原体检测到转录组分析各种场景，涉及RT-PCR、RT-qPCR、RT-LAMP、cDNA文库构建等多种技术。在已知的逆转录酶中，来自Moloney鼠白血病病毒的逆转录酶(MMLV RT)是使用最广泛也是最知名的一种。相较于其他逆转录酶，MMLV逆转录酶具有更强的逆转录活性，并且表达纯化工艺更适于商业化。但MMLV逆转录酶野生型存在明显的缺陷，其最适反应温度是37-42℃，高温下极易失活。
而作为模板的RNA容易形成二级结构，这对于逆转录过程来说是极不利的，二级结构可能会导致逆转录过程提前终止，或者合成的cDNA不完整、产量少及存在偏好性等问题。提高逆转录的反应温度则有助于打开RNA的二级结构，改善cDNA产物的质量，但能打开RNA二级结构的温度往往也让逆转录酶失活，因此提高MMLV逆转录酶的热稳定性势在必行。另外，MMLV逆转录酶热稳定性的提升，往往也伴随着在高温下反应活性的提高和存储稳定性的提高，从而使技术更优越、使运输存储更便利。
综上所述，目前现有野生型MMLV逆转录酶存在热稳定性差、无法耐高温，难以适用于多种技术(如高温逆转录反应，高温RT-qPCR及高温RT-LAMP)应用场景等问题。如何提供一种热稳定性优异，高温下催化活性高的鼠白血病病毒逆转录酶突变体已成为目前生物技术领域亟待解决的问题之一。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体及其应用，解决了现有野生型MMLV逆转录酶存在的热稳定性差、无法耐高温，难以适用于高温逆转录反应，高温RT-qPCR及高温RT-LAMP等问题，获得的突变型逆转录酶展示出提高的热稳定性、更高温度下的反应活性和/或额外的有益特性(提高的存储稳定性、提高的运输稳定性、改进的复杂结构RNA模板的cDNA合成能力或提高的特异性)。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A46、S60、V88、S92、P100、V101、R121、P127、H143、K152、P166、R211、D216、A229、D339、Q341、T420、L452、M457、T467、A500、G504、A539、L563、A589、L604、T605、S606、G608、E616、Q639或A646中的任意一个或至少两个的组合。
优选地，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A46P、S60K或S60R或S60H、V88K或V88R或V88H、S92C、P100V或P100G或P100S或P100A或P100Y、V101G或V101I或V101C或V101N或V101F或V101K或V101R或V101Y、R121C、P127S、H143C、K152I或K152Q或K152E或K152D、P166C、R211S、D216Q、A229C、D339E、Q341E或Q341D、T420V、L452C或L452K或L452R或L452H、M457C、T467N、A500P、G504P或G504S、A539C、L563C、A589K或A589R或A589H、L604N或L604D或L604E或L604Y或L604G、T605I或T605S或T605P或T605V或T605D或T605E或T605R或T605K、S606F或S606V或S606H或S606G或S606R或S606K、G608M或G608S、E616C、Q639C或A646C中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下突变：
S60、P100、V101、K152、R211、D216、D339、T420、L452、M457、L563、L604、T605、S606、G608、E616中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
S60K或S60R或S60H、P100V或P100G或P100S或P100A或P100Y、V101G或V101I或V101C或V101N或V101F或V101K或V101R或V101Y、K152I或K152Q或K152E或K152D、R211S、D216Q、D339E、T420V、L452C或L452K或L452R或l452H、M457C、L563C、L604N或L604D或L604E或L604Y或L604G、T605I或T605S或T605P或T605V或T605D或T605E或T605R或T605K、S606F或S606V或S606H或S606G或S606R或S606K、G608M或G608S或E616C中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上还发生包括如下突变：
M39、S56、M66、L99、D108、P111、L139、D200、T287、T330、P448、D449、S453、N479、A502、D524、H594、L603、I611、L630、H634、D653、L671中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上还发生包括如下位点突变：
M39V、S56C、M66L、L99F或L99V或L99Y或L99N或L99G或L99C、D108I或D108L或D108C或D108H、P111L、L139P、D200H或D200Q、T287A、T330P、P448C、D449G、S453K、N479D、A502V、D524A、H594K、L603W、I611K或I611R或I611H、L630P、H634Y、D653T或L671P中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
(1)L563C、G608S、E616C、H634Y和D653T；
(2)S60R、D200Q、A229C、S453K、D524A、L604N、T605D、G608M和I611R；
(3)D200Q、A229C、T467N和L671P；
(4)S60R、P127S、D200H、Q341E、S453K和L671P；
(5)K152I、T382A、G504S和L604D；
(6)V101F、K152I、R211S、D216Q、T420V、A502V、D524A、T605I、S606K、I611H和A646C；
(7)M39V、D200H、N479D、L563C和L671P；
(8)P100A和D339E；
(9)A46P、P100I、V101G、D200N和G608S；
(10)K152E、G504S、A539C和S606K；
(11)S60K、V129R、D200H和A500P；
(12)S60R、G608S和I611R；
(13)K152Q、T420V和G608S。
在本发明的一些实施例中，突变前的氨基酸序列不限定于与SEQ ID NO.1完全相同，例如，与SEQ ID NO.1氨基酸序列一致性为90％以上、优选的95％以上、进一步优选的98％以上的氨基酸序列均是可行的。
本发明中，所述SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列如下：
TLNIEDEHRLHETSKEPDVSLGSTWLSDFPQAWAETGGMGLAVRQAPLIIPLKATSTPVSIKQYPMSQEARLGIKPHIQRLLDQGILVPCQSPWNTPLLPVKKPGTNDYRPVQDLREVNKRVEDIHPTVPNPYNLLSGLPPSHQWYTVLDLKDAFFCLRLHPTSQPLFAFEWRDPEMGISGQLTWTRLPQGFKNSPTLFDEALHRDLADFRIQHPDLILLQYVDDLLLAATSELDCQQGTRALLQTLGNLGYRASAKKAQICQKQVKYLGYLLKEGQRWLTEARKETVMGQPTPKTPRQLREFLGTAGFCRLWIPGFAEMAAPLYPLTKTGTLFNWGPDQQKAYQEIKQALLTAPALGLPDLTKPFELFVDEKQGYAKGVLTQKLGPWRRPVAYLSKKLDPVAAGWPPCLRMVAAIAVLTKDAGKLTMGQPLVILAPHAVEALVKQPPDRWLSNARMTHYQALLLDTDRVQFGPVVALNPATLLPLPEEGLQHNCLDILAEAHGTRPDLTDQPLPDADHTWYTDGSSLLQEGQRKAGAAVTTETEVIWAKALPAGTSAQRAELIALTQALKMAEGKKLNVYTDSRYAFATAHIHGEIYRRRGLLTSEGKEIKNKDEILALLKALFLPKRLSIIHCPGHQKGHSAEARGNRMADQAARKAAITETPDTSTLL。
第二方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子含有第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。
第三方面，本发明提供了一种重组载体，所述重组载体含有第二方面所述的核酸分子。
第四方面，本发明提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有第二方面所述的核酸分子和/或第三方面所述的重组载体。
第五方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒含有第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体。
优选地，所述试剂盒用于以RNA为模板合成cDNA。
第六方面，本发明提供了第一方面所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用。
优选地，所述逆转录反应包括RT-PCR、RT-qPCR或RT-LAMP中的任意一种。
优选地，所述突变体保留逆转录酶活性。
优选地，所述突变体还包括以下一个或至少两个的特性的提高：热稳定性、最适反应温度、逆转录酶活性、存储稳定性、运输稳定性、持续合成能力、复杂结构RNA模板的cDNA合成能力、产物特异性、逆转录速度。
优选地，所述突变体缺失RNase H活性。
本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶由理性设计得到。所用理性设计的策略是生成二硫键、提高底物结合能力、改善局部区域的结构柔性、优化局部区域电荷分布和降低吉布斯自由能等的一种或多种。
本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶由半理性设计得到。所用半理性设计的策略是根据理性设计分析，选择重要的氨基酸位点进行饱和突变。
本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶由定向进化得到。所用策略是构建MMLV逆转录酶的全长随机突变库，并通过高通量定向进化的方法筛选热稳定性优异的突变体。
本发明通过理性设计、半理性设计和定向进化的方法获得了对MMLV逆转录酶热稳定性有益的突变体，经过分析，突变位点主要通过以下一种或多种途径影响MMLV逆转录酶的热稳定性。
本发明的一些实施例中，热稳定优异的突变型MMLV逆转录酶在相对于野生型第56位、第92位、第121位、第143位、第166位、第229位、第448位、第457位、第563位、第616位、第639位、第646位的一个或者多个位置用半胱氨酸替换，通过生成二硫键来提高逆转录酶的热稳定性。二硫键是常用的提升蛋白质热稳定性的方法，此方法在MMLV逆转录酶中同样有效。在本发明的一些实施例中，一对或者多对二硫键的生成表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，一对或者多对二硫键与其他一个或者多个于热稳定性提高有益的氨基酸替换组合也表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶在相对于野生型第127位、第452位、第453位、第603位、第604位、第605位、第606位、第608位、第611位的一个或者多个位置用其他氨基酸替换，可以提高底物结合能力，提高底物结合能力有助于蛋白质在催化反应过程中更稳定。
在本发明的一些实施例中，一个或者多个有助于提高底物结合能力的氨基酸替换与其他一个或者多个于热稳定性提高有益的氨基酸替换组合也表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶在相对于野生型第46位、第139位、第330位、第500位、第504位、第605位、第671位的一个或者多个位置用脯氨酸替换，可以改善局部区域的结构柔性，提高酶的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，一个或者多个有助于提升结构刚性的脯氨酸替换与其他一个或者多个于热稳定性提高有益的氨基酸替换组合也表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶在相对于野生型第60位、第88位、第152位、第341位、第449位、第452位、第453位、第479位、第589位、第604位、第605位、第606位、第608位、第611位的一个或者多个位置用其他氨基酸替换，可以改善局部区域电荷分布，提高酶在溶液中的稳定性。例如，第60位氨基酸位于蛋白质表面，将其突变为K、R和H碱性氨基酸后能改善表面电荷分布，有利于提高在盐溶液中的稳定性。
在本发明的一些实施例中，一个或者多个优化局部电荷的氨基酸替换与其他一个或者多个于热稳定性提高有益的氨基酸替换组合也表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型MMLV逆转录酶在相对于野生型第39位、第66位、第99位、第100位、第101位、第108位、第111位、第152位、第211位、第216位、第287位、第420位、第467位、第502位、第634位、第653位的一个或者多个位置用其他氨基酸替换，可以降低蛋白质的吉布斯自由能，蛋白质从正常折叠状态向紊乱的失活状态转变需要消耗更多的能量，从而提高酶的稳定性。
在本发明的一些实施例中，一个或者多个降低吉布斯自由能的氨基酸替换与其他一个或者多个于热稳定性提高有益的氨基酸替换组合也表现出比野生型具有更优异的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，上述生成二硫键、提高底物结合能力、刚化柔性区域、优化局部电荷、降低吉布斯自由能等策略每种策略不限于一个或多个位点同时进行替换，也不限于各种策略独立实施或者组合实施，于提高逆转录酶热稳定有益的策略均适用。
在本发明的一些实施例中，本发明公开的有益于热稳定性提高的氨基酸替换与已报道的突变体组合，同样有助于提升突变体的热稳定性。例如，MMLV的第524位的天冬氨酸突变为A后，MMLV的RNase H活性失活，同时热稳定性提高。本发明的一些实施例在D524A突变体上进行了新的多位点突变，进一步提高了逆转录酶的热稳定性。同样的，第200位的氨基酸发生替换也有助于热稳定性的提高，本发明的一些实施例在此基础上进行了新的多位点突变，结果同样表明热稳定性可以得到进一步提升。因此，在已知的突变型MMLV上叠加一个或者多个本发明公开的突变位点，可以进一步提升逆转录酶的热稳定性。
在本发明的一些实施例中，突变型逆转录酶所用载体为pET21b，所用表达宿主为大肠杆菌Rosetta。但本发明所述热稳定性优异突变型逆转录酶不限定于上述载体和宿主。
在本发明的一些实施例中，热稳定性优异的突变型逆转录酶通过熔解温度(Tm)来反映。蛋白肽链在水中发生折叠，其亲水基团会将疏水基团包裹在内，在外界压力(高温)下，蛋白会因变性解折叠而逐渐暴露出疏水基团，此时体系中的疏水荧光染料会与蛋白疏水基团结合发出荧光，通过荧光曲线的变化即可计算出不同蛋白的Tm，从而实现对突变体的热稳定性进行筛选和比较。
本发明所述突变型逆转录酶Tm测定不限定于上述方法，其他适用于蛋白质Tm测定的方法均可能适用于本发明所述突变型逆转录酶。
野生型MMLV逆转录酶的最适反应温度为37-42℃，本发明公开的突变型逆转录酶具有更好热稳定性，能在50℃进行逆转录反应，因此在比较突变型逆转录酶不同温度下的残余产量时，使用50℃的逆转录温度。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高MMLV逆转录酶的热稳定性，具体与野生型相比提高0.1℃以上、0.2℃以上、0.5℃以上、1℃以上、2℃以上、3℃以上、4℃以上、5℃以上；效果更好的MMLV逆转录酶的Tm可提高6℃以上。60℃孵育15min后残余产量仍能达到50％以上，65℃孵育15min后残余产量仍能达到15％以上，可进行高温RT-LAMP反应；
(2)本发明的突变型逆转录酶保留了逆转录酶活性，同时具有以下一个或者多个特性的提高：a.热稳定性；b.最适反应温度；c.逆转录酶活性；d.存储稳定性；e.运输稳定性；f.持续合成能力；g.cDNA合成能力；h.产物特异性；i.逆转录速度。
附图说明
图1为突变型MMLV逆转录酶的ΔTm(ΔTm＝Tm(Mutation)-Tm(WT))图；
图2为突变型MMLV逆转录酶在60℃孵育15min后的残余产量图；
图3为突变型MMLV逆转录酶在65℃孵育15min后的残余产量图；
图4A为野生型MMLV逆转录酶在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4B为突变型MMLV逆转录酶356在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4C为突变型MMLV逆转录酶215在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4D为突变型MMLV逆转录酶306在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4E为突变型MMLV逆转录酶347在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4F为突变型MMLV逆转录酶334在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4G为突变型MMLV逆转录酶209在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4H为突变型MMLV逆转录酶335在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4I为突变型MMLV逆转录酶329在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4J为突变型MMLV逆转录酶188在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4K为突变型MMLV逆转录酶330在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图4L为突变型MMLV逆转录酶179在65℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5A为野生型MMLV逆转录酶在68℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5B为突变型MMLV逆转录酶215在68℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5C为突变型MMLV逆转录酶209在68℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5D为突变型MMLV逆转录酶306在68℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5E为突变型MMLV逆转录酶188在68℃下的RT-LAMP反应结果图；
图5F为突变型MMLV逆转录酶329在68℃下的RT-LAMP反应结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
通过理性设计、半理性设计和定向进化方法多种方式结合进行MMLV逆转录酶热稳定性的改造。其中理性设计定点突变或定点组合突变160个突变体，半理性设计定点饱和突变库或定点组合饱和突变库20个，定向进化筛选随机突变库10000个以上，最终获得得了对热稳定性提高有益的MMLV逆转录酶突变体数据库，如表1所示。表1所示氨基酸突变为在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生的突变。
表1
上述突变型MMLV逆转录酶的具体制备方法如下：将编码以上突变型MMLV逆转录酶氨基酸序列的核苷酸序列(对应的编码野生型MMLV逆转录酶氨基酸序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2)连接至载体pET21b(+)中获得重组载体，将重组载体转化到表达宿主大肠杆菌Rosetta中，获得重组菌株。培养重组菌株，诱导MMLV逆转录酶的表达，纯化后即获得MMLV逆转录酶突变体。
SEQ ID NO.2：
accctaaatatagaagatgagcatcggctacatgagacctcaaaagagccagatgtttctctagggtccacatggctgtctgattttcctcaggcctgggcggaaaccgggggcatgggactggcagttcgccaagctcctctgatcatacctctgaaagcaacctctacccccgtgtccataaaacaataccccatgtcacaagaagccagactggggatcaagccccacatacagagactgttggaccagggaatactggtaccctgccagtccccctggaacacgcccctgctacccgttaagaaaccagggactaatgattataggcctgtccaggatctgagagaagtcaacaagcgggtggaagacatccaccccaccgtgcccaacccttacaacctcttgagcgggctcccaccgtcccaccagtggtacactgtgcttgatttaaaggatgcctttttctgcctgagactccaccccaccagtcagcctctcttcgcctttgagtggagagatccagagatgggaatctcaggacaattgacctggaccagactcccacagggtttcaaaaacagtcccaccctgtttgatgaggcactgcacagagacctagcagacttccggatccagcacccagacttgatcctgctacagtacgtggatgacttactgctggccgccacttctgagctagactgccaacaaggtactcgggccctgttacaaaccctagggaacctcgggtatcgggcctcggccaagaaagcccaaatttgccagaaacaggtcaagtatctggggtatcttctaaaagagggtcagagatggctgactgaggccagaaaagagactgtgatggggcagcctactccgaagacccctcgacaactaagggagttcctagggacggcaggcttctgtcgcctctggatccctgggtttgcagaaatggcagcccccttgtaccctctcaccaaaacggggactctgtttaattggggcccagaccaacaaaaggcctatcaagaaatcaagcaagctcttctaactgccccagccctggggttgccagatttgactaagccctttgaactctttgtcgacgagaagcagggctacgccaaaggtgtcctaacgcaaaaactgggaccttggcgtcggccggtggcctacctgtccaaaaagctagacccagtagcagctgggtggcccccttgcctacggatggtagcagccattgccgtactgacaaaggatgcaggcaagctaaccatgggacagccactagtcattctggccccccatgcagtagaggcactagtcaaacaaccccccgaccgctggctttccaacgcccggatgactcactatcaggccttgcttttggacacggaccgggtccagttcggaccggtggtagccctgaacccggctacgctgctcccactgcctgaggaagggctgcaacacaactgccttgatatcctggccgaagcccacggaacccgacccgacctaacggaccagccgctcccagacgccgaccacacctggtacacggatggaagcagtctcttacaagagggacagcgtaaggcgggagctgcggtgaccaccgagaccgaggtaatctgggctaaagccctgccagccgggacatccgctcagcgggctgaactgatagcactcacccaggccctaaagatggcagaaggtaagaagctaaatgtttatactgatagccgttatgcttttgctactgcccatatccatggagaaatatacagaaggcgtgggttgctcacatcagaaggcaaagagatcaaaaataaagacgagatcttggccctactaaaagccctctttctgcccaaaagacttagcataatccattgtccaggacatcaaaagggacacagcgccgaggctagaggcaaccggatggctgaccaagcggcccgaaaggcagccatcacagagactccagacacctctaccctcctctag。
实施例2
检测实施例1获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的Tm值。
方法：纯化实施例1获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，得到逆转录酶纯酶液，与疏水荧光染料混合，在实时荧光定量PCR仪中，以恒定速度升温至30℃并恒温20s，后逐渐提高至70℃并恒温1s，升温过程中每0.5s采集一次荧光信号，根据采集的信号分析计算Tm。
结果：本发明获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体与野生型鼠白血病病毒逆转录酶相比，熔解温度(Tm)显著提高(图1)。具体而言，可以与野生型相比提高0.1℃以上、0.2℃以上、0.5℃以上、1℃以上、2℃以上、3℃以上、4℃以上、5℃以上，效果更好的提高6℃以上，效果最好的提高7℃以上。熔解温度(Tm)反映了MMLV逆转录酶的热稳定性，熔解温度(Tm)越高热稳定性越好。
实施例3
检测实施例1获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体60℃和65℃下的残余产量。野生型MMLV逆转录酶的最适反应温度为37-42℃，经实验证明，本发明提供的MMLV逆转录酶突变体能在50℃进行逆转录反应，因此在比较突变型逆转录酶不同温度下的残余产量时，使用50℃的逆转录温度。
方法：将突变型逆转录酶稀释至同一体积活力，分别在60℃下孵育15min后进行50℃ 15min的逆转录反应。其中以不进行60℃ 15min孵育处理、直接进行50℃ 15min逆转录反应的突变型逆转录酶作为对照组。筛选出性能较佳的MMLV逆转录酶突变体进行更高温度的残余产量测试。
筛选60℃残余产量较高的突变体，分别在65℃下孵育15min后进行50℃ 15min的逆转录反应。其中分别以不进行65℃ 15min孵育处理、直接进行50℃ 15min逆转录反应的突变型逆转录酶作为对照组。
逆转录体系配置如表2所示。
表2
组分 用量
Oligo dT(50μM) 1μL
dNTPs(10mM each) 0.5μL
mRNA 2μg
5×Reaction Buffer 4μL
Enzyme 1μL
DEPC-H2O To 20μL
结果：本发明获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在60℃孵育15min后再进行逆转录反应残余产量与野生型相比明显提高(图2)。具体而言，突变编号188、329、330、331、334、335、356的突变体的残余产量可以达到50％以上，突变编号302、306、327、341的突变体的残余产量可以达到80％以上，突变编号342的突变体可以达到90％以上。
本发明获得的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在65℃孵育15min后再进行逆转录反应残余产量与野生型相比明显提高(图3)。具体而言，突变编号209、215的突变体的残余产量可以达到5％以上，突变编号188、306的突变体的残余产量可以达到15％以上，突变编号327的突变体的残余产量可以达到20％以上，突变体330的残余产量可以达到40％以上。
实施例4
利用实施例1获得的突变体进行RT-LAMP反应。检测实施例1获得的MMLV逆转录酶突变体60℃、65℃和68℃下的RT-LAMP反应的有效性，经实验证明，本发明提供的MMLV逆转录酶突变体能在60℃的RT-LAMP反应中能有效起峰且具有可重复性。筛选出性能较佳的MMLV逆转录酶突变体进行更高温度下的RT-LAMP。
RT-LAMP反应体系如表3所示。
表3
其中，以不添加模板的体系为阴性对照。
65℃的RT-LAMP反应程序如表4所示。
表4
结果：突变编号356、215、306、347、334、209、335、329、188、330、179的突变型逆转录酶在RT-LAMP测试中热稳定性比野生型MMLV逆转录酶显著提高，其中突变体209、215、188和306在65℃的RT-LAMP反应中能有效起峰且在8次平行实验中具有至少7次的可重复性(图4)。
68℃的RT-LAMP反应程序如表5所示。
表5
温度 时间 循环次数
68℃ 1min(读取荧光) 60×
95℃ 2min 1×
结果：突变编号215、209、306、188、329的突变型逆转录酶在RT-LAMP测试中热稳定性显著提高，其中突变体209、306、188和329在68℃的RT-LAMP反应中能有效起峰且在8次平行实验中具有至少4次的可重复性(图5)。
综上所述，本发明通过设计氨基酸的一个或多个不同位点的突变，能够显著提高MMLV逆转录酶的热稳定性，MMLV逆转录酶Tm可提高6℃以上，60℃孵育15min后残余产量仍能达到90％以上，65℃孵育15min后残余产量仍能达到40％以上，可进行68℃的RT-LAMP反应。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ IDNO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A46、S60、V88、S92、P100、V101、R121、P127、H143、K152、P166、R211、D216、A229、D339、Q341、T420、L452、M457、T467、A500、G504、A539、L563、A589、L604、T605、S606、G608、E616、Q639或A646中的任意一个或至少两个的组合。
2.根据权利要求1所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
A46P、S60K或S60R或S60H、V88K或V88R或V88H、S92C、P100V或P100G或P100S或P100A或P100Y、V101G或V101I或V101C或V101N或V101F或V101K或V101R或V101Y、R121C、P127S、H143C、K152I或K152Q或K152E或K152D、P166C、R211S、D216Q、A229C、D339E、Q341E或Q341D、T420V、L452C或L452K或L452R或L452H、M457C、T467N、A500P、G504P或G504S、A539C、L563C、A589K或A589R或A589H、L604N或L604D或L604E或L604Y或L604G、T605I或T605S或T605P或T605V或T605D或T605E或T605R或T605K、S606F或S606V或S606H或S606G或S606R或S606K、G608M或G608S、E616C、Q639C或A646C中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下突变：
S60、P100、V101、K152、R211、D216、D339、T420、L452、M457、L563、L604、T605、S606、G608、E616中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述突变体与SEQ ID NO.1具有大于90％的氨基酸序列同一性；所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括如下位点突变：
S60K或S60R或S60H、P100V或P100G或P100S或P100A或P100Y、V101G或V101I或V101C或V101N或V101F或V101K或V101R或V101Y、K152I或K152Q或K152E或K152D、R211S、D216Q、D339E、T420V、L452C或L452K或L452R或L452H、M457C、L563C、L604N或L604D或L604E或L604Y或L604G、T605I或T605S或T605P或T605V或T605D或T605E或T605R或T605K、S606F或S606V或S606H或S606G或S606R或S606K、G608M或G608S或E616C中任意一种或至少两种的组合。
3.根据权利要求1或2所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上还发生包括如下突变：
M39、S56、M66、L99、D108、P111、L139、D200、T287、T330、P448、D449、S453、N479、A502、D524、H594、L603、I611、L630、H634、D653、L671中任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述突变体在氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上还发生包括如下位点突变：
M39V、S56C、M66L、L99F或L99V或L99Y或L99N或L99G或L99C、D108I或D108L或D108C或D108H、P111L、L139P、D200H或D200Q、T287A、T330P、P448C、D449G、S453K、N479D、A502V、D524A、H594K、L603W、I611K或I611R或I611H、L630P、H634Y、D653T或L671P中任意一种或至少两种的组合。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体氨基酸序列SEQ ID NO.1的基础上发生包括以下任意一种组合位点突变：
(1)L563C、G608S、E616C、H634Y和D653T；
(2)S60R、D200Q、A229C、S453K、D524A、L604N、T605D、G608M和I611R；
(3)D200Q、A229C、T467N和L671P；
(4)S60R、P127S、D200H、Q341E、S453K和L671P；
(5)K152I、T382A、G504S和L604D；
(6)V101F、K152I、R211S、D216Q、T420V、A502V、D524A、T605I、S606K、I611H和A646C；
(7)M39V、D200H、N479D、L563C和L671P；
(8)P100A和D339E；
(9)A46P、P100I、V101G、D200N和G608S；
(10)K152E、G504S、A539C和S606K；
(11)S60K、V129R、D200H和A500P；
(12)S60R、G608S和I611R；
(13)K152Q、T420V和G608S。
5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子含有权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体的编码序列。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求5所述的核酸分子。
7.一种重组细胞，其特征在于，所述重组细胞含有权利要求5所述的核酸分子和/或权利要求6所述的重组载体。
8.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1-4中任一项中所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体；
优选地，所述试剂盒用于以RNA为模板合成cDNA。
9.权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体在逆转录反应中的应用；
优选地，所述逆转录反应包括RT-PCR、RT-qPCR或RT-LAMP中的任意一种。
10.根据权利要求1-4中任一项所述的鼠白血病病毒逆转录酶突变体，其特征在于，所述突变体保留逆转录酶活性；
优选地，所述突变体还包括以下一个或至少两个的特性的提高：热稳定性、最适反应温度、逆转录酶活性、存储稳定性、运输稳定性、持续合成能力、复杂结构RNA模板的cDNA合成能力、产物特异性、逆转录速度；
优选地，所述突变体缺失RNaseH活性。
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