CN115975978B - Bst DNA聚合酶大片段突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请提供Bst DNA聚合酶大片段突变体及其应用，涉及酶技术领域，该Bst DNA聚合酶大片段突变体在野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸位点的突变，采用随机突变高通量筛选的方法，筛选得到两个新的突变位点Q115R和E444G，获得DNA聚合酶活性提升的突变体，突变位点分别为Q115R和E444G的Bst DNA聚合酶大片段突变体的活性与野生型相比，分别提升了2.67倍、2.18倍。

Description

Bst DNA聚合酶大片段突变体及其应用

技术领域

本申请涉及酶技术领域，尤其涉及Bst DNA聚合酶大片段突变体及其应用。

背景技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是2000年开发的一种新颖的恒温核酸扩增方法，其特点是针对靶基因的6个区域设计4 -6种特异引物，利用链置换DNA聚合酶在等温条件(63℃左右)保温30-60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。LAMP具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR，能够同时检测大批量的病理样本，非常适合基层快速诊断，具有巨大的未来市场价值。

目前常用的链置换DNA聚合酶为嗜热脂肪地芽孢杆菌DNA聚合酶(Bacillusstearothermophilus，Bst DNA聚合酶)的大片段，但是，目前用于LAMP方法的链置换功能的Bst DNA聚合酶大片段仍然存在产物得率低、延伸能力差等问题，因此通过突变使Bst DNA聚合酶大片段提高DNA聚合酶活性，是Bst DNA聚合酶大片段的主要改造方向之一。

发明内容

本申请的目的在于提供一种聚合酶活性更高的Bst DNA聚合酶大片段突变体，旨在解决现有的Bst DNA聚合酶大片段活性不够高存在产物得率低、延伸能力差的问题。

为实现以上目的，本申请提供一种Bst DNA聚合酶大片段突变体，在全长为586个氨基酸的野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：Q115R和E444G中的任一个，所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列为NCBI登录号为AAB52611的全长为876个氨基酸的氨基酸序列的第291～876位氨基酸。

优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的活性与所述野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，至少提高了2倍。

本申请还提供一种核酸分子，编码上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列为：

(a)：在NCBI登陆号为U33536.1的碱基序列的第871～2631位全长为1761bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸位点的突变，所述核苷酸突变位点选自：第344位的a突变为g，或第1331位的a突变为g；

(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的同义密码子序列。

本申请还提供一种重组表达载体，包括上述的核酸分子。

优选地，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。

本申请还提供一种宿主细胞，包括上述的核酸分子，或包括上述的重组表达载体。

本申请还提供上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体的制备方法，包括：

培养上述的宿主细胞；

将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述Bst DNA聚合酶大片段突变体；

分离获得所述Bst DNA聚合酶大片段突变体。

本申请还提供上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体在制备环介导等温扩增产品的应用。

本申请还提供一种环介导等温扩增试剂盒，包括上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

优选地，还包括：环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板DNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

优选地，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。

本申请还提供一种环介导等温扩增方法，使用上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体，或上述的环介导等温扩增试剂盒检测样本DNA。

本申请还提供一种混合酶，包括上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体与反转录酶。

本申请还提供一种逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述的混合酶。

优选地，还包括：逆转录反应引物、环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板RNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

本申请还提供一种逆转录环介导等温扩增方法，使用上述的混合酶，或上述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测样本RNA。

与现有技术相比，本申请的有益效果包括：

本申请提供的Bst DNA聚合酶大片段突变体在野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸位点的突变，采用随机突变高通量筛选的方法，筛选得到两个新的突变位点Q115R和E444G，获得DNA聚合酶活性提升的突变体，突变位点分别为Q115R和E444G的Bst DNA聚合酶大片段突变体的活性与野生型相比，分别提升了2.67倍、2.18倍。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对本申请范围的限定。

图1为引物延伸电泳法原理示意图；

图2为引物延伸电泳法筛选到活性提升的突变体的结果图；

图3为筛选到的Bst DNA聚合酶大片段突变体粗酶在LAMP体系的扩增结果图。

具体实施方式

如本文所用之术语：

“由……制备”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

连接词“由……组成”排除任何未指出的要素、步骤或组分。如果用于权利要求中，此短语将使权利要求为封闭式，使其不包含除那些描述的材料以外的材料，但与其相关的常规杂质除外。当短语“由……组成”出现在权利要求主体的子句中而不是紧接在主题之后时，其仅限定在该子句中描述的要素；其它要素并不被排除在作为整体的所述权利要求之外。

当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

在这些实施例中，除非另有指明，所述的份和百分比均按质量计。

“质量份”指表示多个组分的质量比例关系的基本计量单位，1份可表示任意的单位质量，如可以表示为1g，也可表示2.689g等。假如我们说A组分的质量份为a份，B组分的质量份为b份，则表示A组分的质量和B组分的质量之比a：b。或者，表示A组分的质量为aK，B组分的质量为bK(K为任意数，表示倍数因子)。不可误解的是，与质量份数不同的是，所有组分的质量份之和并不受限于100份之限制。

“和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括(A和B)和(A或B)。

本文术语“突变体”、“突变”或者“突变型”等，是指相比较于野生型DNA序列或者野生型的氨基酸序列，具有一个或者多个突变。当然这种突变可以发生在核酸水平上或者发生在氨基酸水平上。

在本文中，当表示突变位点时，依照本领域通常的表述方式，即为“突变前氨基酸缩写+位点+突变后氨基酸缩写”，例如“Q115R”，其中“Q”代表突变前氨基酸，“115”为相应的突变位点，“R”代表突变后的氨基酸。其中“Q”和“R”均是采用本领域通用的单个字母缩写代表氨基酸。当表述组合突变时，两个突变之间用“/”连接，例如突变位点“Q115R/E444G”代表相较于野生型，在第115个氨基酸和第444个氨基酸同时发生了改变。

本申请提供一种Bst DNA聚合酶大片段突变体，在全长为586个氨基酸的野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：Q115R和E444G中的任一个，所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列为NCBI登录号为AAB52611的全长为876个氨基酸的氨基酸序列的第291～876位氨基酸。

其中，Bst DNA聚合酶是来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌的DNA聚合酶，具有5'→3'DNA聚合酶活性，也具有5'→3'外切核酸酶活性，可以用于聚合酶链式反应(Polymerase ChainReaction，PCR)。Bst DNA聚合酶为单链肽蛋白，其氨基酸序列为NCBI登录号为AAB52611的全长为876个氨基酸的氨基酸序列，如SEQ ID NO.1所示，Bst DNA聚合酶的氨基酸序列为：

其中，野生型Bst DNA聚合酶大片段为Bst DNA聚合酶的C端586个氨基酸，即上述Bst DNA聚合酶的氨基酸序列的第291～876位氨基酸(Bst DNA聚合酶的氨基酸序列中的加黑字体并加下划线的氨基酸序列)。Bst DNA聚合酶大片段具有5'→3'DNA聚合酶活性，但不具有5'→3'外切核酸酶活性，还具有较强的热稳定性、链置换活性，用于环介导等温扩增技术。

本申请方案为了提高野生型Bst DNA聚合酶大片段的活性，在体外对野生型BstDNA聚合酶大片段进行定向进化，通过人为地创造特殊的条件，模拟自然进化机制，在体外改造酶基因，并定向筛选出聚合酶活性提高的突变酶。

酶定向进化的方法例如可以为：易错PCR、盒式诱变、DNA改组法、体外随机重组法和交错延伸法等。筛选方法例如可以为：平板筛选法，荧光筛选法，噬菌体表面展示法，细胞表面展示法或核糖体表面展示法。

例如可以在对野生型Bst DNA聚合酶大片段基因进行RCR扩增时采用易错PCR技术进行扩增，在野生型Bst DNA聚合酶大片段基因中引入突变，构建突变库，凭借定向的选择方法，选出活性提升的突变酶。

易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。

本申请方案通过易错PCR构建野生型Bst DNA聚合酶大片段突变体库，筛选出两个活性提升的Bst DNA聚合酶大片段突变体，这两个Bst DNA聚合酶大片段突变体的氨基酸突变位点分别为Q115R和E444G。即Bst DNA聚合酶大片段突变体可以为野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列的第115位的谷氨酰胺突变为精氨酸，也可以为野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列的第444位的谷氨酸突变为甘氨酸。

优选地，所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的活性与所述野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，至少提高了2倍。

本申请提供的Bst DNA聚合酶大片段突变体，在全长为586个氨基酸的野生型BstDNA聚合酶大片段的氨基酸序列基础上进行氨基酸位点的突变，所述氨基酸突变位点包括：Q115R和E444G中的任一个，通过实验证实Q115R和E444G两个突变体，相对野生型Bst DNA聚合酶大片段，活性分别提升了2.67倍和2.18倍，说明该两个Bst DNA聚合酶大片段突变体的聚合酶活性相对于野生型Bst DNA聚合酶大片段大大提高。

本申请还提供一种核酸分子，编码上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

优选地，所述核酸分子的核苷酸序列为：

(a)：在NCBI登陆号为U33536.1的碱基序列的第871～2631位全长为1761bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸位点的突变，所述核苷酸突变位点选自：第344位的a突变为g，或第1331位的a突变为g；

(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的同义密码子序列。

其中，NCBI登陆号为U33536.1的碱基序列即为野生型Bst DNA聚合酶的基因序列，全长为2631个bp。野生型Bst DNA聚合酶的基因序列的第871～2631位全长为1761bp的核苷酸序列即为野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列，野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列如SEQ ID NO.2所示，为：

gaaggggagaaaccgcttgaggagatggagtttgccatcgttgacgtcattaccgaagagatgcttgccgacaaggcagcgcttgtcgttgaggtgatggaagaaaactaccacgatgccccgattgtcggaatcgcactagtgaacgagcatgggcgattttttatgcgcccggagaccgcgctggctgattcgcaatttttagcatggcttgccgatgaaacgaagaaaaaaagcatgtttgacgccaagcgggcagtcgttgccttaaagtggaaaggaattgagcttcgcggcgtcgcctttgatttattgctcgctgcctatttgctcaatccggctcaagatgccggcgatatcgctgcggtggcgaaaatgaaacaatatgaagcggtgcggtcggatgaagcggtctatggcaaaggcgtcaagcggtcgctgccggacgaacagacgcttgctgagcatctcgttcgcaaagcggcagccatttgggcgcttgagcagccgtttatggacgatttgcggaacaacgaacaagatcaattattaacgaagcttgagcagccgctggcggcgattttggctgaaatggaattcactggggtgaacgtggatacaaagcggcttgaacagatgggttcggagctcgccgaacaactgcgtgccatcgagcagcgcatttacgagctagccggccaagagttcaacattaactcaccaaaacagctcggagtcattttatttgaaaagctgcagctaccggtgctgaagaagacgaaaacaggctattcgacttcggctgatgtgcttgagaagcttgcgccgcatcatgaaatcgtcgaaaacattttgcattaccgccagcttggcaaactgcaatcaacgtatattgaaggattgttgaaagttgtgcgccctgataccggcaaagtgcatacgatgttcaaccaagcgctgacgcaaactgggcggctcagctcggccgagccgaacttgcaaaacattccgattcggctcgaagaggggcggaaaatccgccaagcgttcgtcccgtcagagccggactggctcattttcgccgccgattactcacaaattgaattgcgcgtcctcgcccatatcgccgatgacgacaatctaattgaagcgttccaacgcgatttggatattcacacaaaaacggcgatggacattttccatgtgagcgaagaggaagtcacggccaacatgcgccgccaggcaaaggccgttaacttcggtatcgtttacggaattagcgattacggattggcgcaaaacttgaacattacgcgcaaagaagctgccgaatttatcgaacgttacttcgccagctttccgggcgtaaagcagtatatggaaaacattgtgcaagaagcgaaacagaaaggatatgtgacaacgctgttgcatcggcgccgctatttgcctgatattacaagccgcaatttcaacgtccgcagttttgcagagcggacggccatgaacacgccaattcaaggaagcgccgctgacattattaaaaaagcgatgattgatttagcggcacggctgaaagaagagcagcttcaggctcgtcttttgctgcaagtgcatgacgagctcattttggaagcgccaaaagaggaaattgagcgattatgtgagcttgttccggaagtgatggagcaggccgttacgctccgcgtgccgctgaaagtcgactaccattacggcccaacatggtatgatgccaaataa(SEQ ID NO.2)。

其中，编码突变位点为Q115R的Bst DNA聚合酶大片段突变体的核酸分子的核苷酸序列在野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列的基础上核苷酸突变位点为第344位的a突变为g。

编码突变位点为E444G的Bst DNA聚合酶大片段突变体的核酸分子的核苷酸序列在野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列的基础上核苷酸突变位点为第1331位的a突变为g。

由于同一氨基酸可由几种不同的密码子来进行编码，即同义密码子，故同一氨基酸可对应不同的核苷酸序列，因此本申请的Bst DNA聚合酶大片段突变体不仅可以由上述(a)所述的核苷酸序列进行编码，还可以为与(a)所述的核苷酸序列进行1个或任意多个核苷酸取代而得到的密码子同义突变的核苷酸序列所编码得到。可以理解的是，同义密码子序列可以是对Bst DNA聚合酶大片段突变体的突变氨基酸位点进行密码子同义突变，也可以是对其他非突变位点的氨基酸进行密码子同义突变。

本领域技术人员可以根据本申请公开的Bst DNA聚合酶大片段突变体的氨基酸序列，根据现有分子生物学技术，采用cDNA克隆和定点突变的方法或其它适合的方法获得本申请的Bst DNA聚合酶大片段突变体，因此，编码上述Bst DNA聚合酶大片段突变体的核苷酸序列并不仅限于(a)所述的核苷酸序列，还可以为与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的同义密码子序列。只要编码得到的Bst DNA聚合酶大片段突变体没有明显的功能差异，均包括在本申请的范围内。

本申请还提供一种重组表达载体，包括上述的核酸分子。将上述的编码Bst DNA聚合酶大片段突变体的核酸分子克隆入表达载体中得到重组表达载体。其中，表达载体可以为原核表达载体，更优选为pET系列载体；更优选为pET-28a。

优选地，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。

本申请还提供一种宿主细胞，包括上述的核酸分子，或包括上述的重组表达载体。所述宿主细胞为将上述的重组表达载体转化入工程细胞得到。所述的工程细胞优选为大肠杆菌细胞；更优选为BL21(DE3)细胞，该宿主细胞可快速、可溶表达上述的重组表达载体。

本申请还提供上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体的制备方法，包括：

培养上述的宿主细胞。具体的，将宿主细胞株接种于LB培养基中培养，得到重组工程细胞种子液，将重组工程细胞种子液接种至LB培养基中，培养至菌液OD600达到0.6～0.8。

将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述Bst DNA聚合酶大片段突变体。向菌液中加入诱导剂IPTG，诱导细胞表达蛋白，离心收集菌体沉淀，所得菌体沉淀中包含所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体蛋白。

分离获得所述Bst DNA聚合酶大片段突变体。具体的，在菌体沉淀中加入裂解缓冲液，震荡处理，得到均匀分散的菌体重悬液；取菌体重悬液超声处理，离心去除沉淀，过滤，得到上清液；先通过镍离子亲和层析收集含有目的蛋白的样品洗脱液，再经阴离子交换层析，即纯化得到所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体蛋白。

可以理解的是，在菌体沉淀中加入破胞液混匀后-80℃处理1h，再37℃处理1h，如此反复冻融3次。4000rpm条件下离心20min，上清即为粗酶液。其中破胞液包括：50mMTris7.5，0.3％溶菌酶。

本申请还提供上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体在制备环介导等温扩增产品的应用。

本申请还提供一种环介导等温扩增试剂盒，包括上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

优选地，还包括：环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板DNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

优选地，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。

本申请还提供一种环介导等温扩增方法，使用上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体，或上述的环介导等温扩增试剂盒检测样本DNA。

本申请还提供一种混合酶，包括上述的Bst DNA聚合酶大片段突变体与反转录酶。

本申请还提供一种逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括上述的混合酶。

优选地，还包括：逆转录反应引物、环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板RNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

本申请还提供一种逆转录环介导等温扩增方法，使用上述的混合酶，或上述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测样本RNA。

下面将结合具体实施例对本申请的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本申请，而不应视为限制本申请的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

1、随机突变克隆文库的生成

编码野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因经过易错PCR构建在pET28a常用质粒的NdeI和XhoI限制性内切酶位点之间，诱导突变形成突变克隆文库。

根据上述的野生型Bst DNA聚合酶大片段的基因序列设计含有pET28a的NdeI和XhoI酶切位点的Bst-F和Bst-R引物用于扩增Bst DNA聚合酶大片段基因，Bst-F:GCAGCCAT ATGGCCGAAGGGGAGAAACCGCTTGA GGA，其中，下划线为NdeI酶切位点；Bst-R:CGCCTCGAGTTATTTGGC ATCATACCATGTTGGGCCGT，其中，下划线为XhoI酶切位点。根据表1配置易错PCR扩增体系，按照表2扩增程序进行扩增Bst DNA聚合酶大片段基因，形成含随机突变的Bst DNA聚合酶大片段基因片段文库。

表1易错PCR扩增体系

表2易错PCR扩增程序

NdeI和XhoI酶切线性化质粒载体pET28a。经过纯化回收Bst DNA聚合酶大片段基因片段文库和酶切线性化质粒载体pET28a，根据TAKARA DNA Ligation Kit Ver.2.1试剂盒说明书，按照片段/载体＝0.03-0.3pmol：0.03pmol，16℃孵育2h进行连接，连接反应体系随后进行转化大肠杆菌感受态细胞BL21 DE3。

从-80℃冰箱取出BL21 DE3感受态100μl，冰上融化。将每份5μL连接反应液加入感受态细胞中，轻轻吹打混匀，冰上静置30min，随后在42℃水浴热激90s，立即冰水浴降温，3min后加入750μL LB液体培养基，在37℃摇床进行复苏50min。复苏结束后，4000rpm，离心2min。去掉上清，余100μL液体将菌体重悬，并均匀涂布于LB Kan固体平板上，37℃倒置培养12h左右，平板上单菌落集合即为Bst DNA聚合酶大片段随机突变克隆文库。

2、随机突变克隆文库的培养诱导及裂解

2.1随机突变克隆文库培养诱导

2.2.1一级深孔板培养

将随机突变克隆文库平板的单菌落接种至96孔深孔板中(500μL LB培养基，50μg/mL Kan抗生素)，37℃，250rpm培养过夜，每个96深孔板设置2个野生型作为对照。

2.2.2二级深孔板诱导

从一级96孔深孔板中吸取10μL培养液转移至二级96孔深孔板板中(500μL LB培养基，50μg/mL Kan抗生素)，37℃，250rpm培养至OD600约0.6，加入一定量IPTG(终浓度为1mM)诱导酶表达，37℃，250rpm诱导过夜，至生长平台期，使各孔间的菌密度接近，同样设置2个野生型作为对照。

2.2破胞裂解

培养好的二级96孔深孔板加入100μL破胞液(50mM Tris7.5，0.3％溶菌酶)，混匀后-80℃1h，在37℃处理1h，如此反复冻融3次。4000rpm条件下离心20min，上清即为粗酶液。随后利用粗酶液进行测活。

实施例2

实施例1得到的Bst DNA聚合酶大片段随机突变克隆文库的粗酶液进行聚合酶活性的鉴定，鉴定方法为引物延伸电泳法，其原理如图1所示，带FAM荧光修饰的引物Primer，与互补DNA单链模板配对后，在含DNA聚合酶活性的酶(如Bst DNA聚合酶大片段)的条件下，FAM荧光修饰的引物可以延伸至全长模板的长度，最后在尿素变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中显示长度变大的条带(FL)，活性越强，则显示全长条带FL含量越高；反之，活性越低或无活性，则显示全长条带FL含量越低或无。

1、测试体系准备

做为DNA模板的寡核苷酸序列S-Temp59(核苷酸序列为：TCTATT ACATTCTAAGAGTTAGAGTTAGGGTCTACTCTTGCTATGCGTGGAGT GCTGAA)干粉按照合成单上的说明使用TE稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒。

做为ssDNA引物的带荧光标记寡核苷酸序列S1-FAM(核苷酸序列为：FAM-TTCAGCACTCCACGCATAGC)干粉按照合成单上的说明使用TE稀释到100μmol/L，储存于-20℃，使用时从-20℃取出平衡至室温，于漩涡混匀器上混匀10s，在微型离心机上离心数秒。

取稀释好的DNA模板S-Temp59和引物S1-FAM按1:1混合，在75℃下加热5min，然后以0.1℃/s的速率冷却至25℃，使得S1-FAM退火到S-Temp59上，得到检测模板50μmol/L。

2、测试体系反应

2.1聚合反应液的配制

聚合反应液按照表3所示进行配制，在微量离心管中按照表3的比例配制聚合反应液(冰上配制)，聚合反应液配制完成后在漩涡混匀器涡旋混匀10s，微型离心机离心数秒，其中，10×Bst反应缓冲液包括：200mmol/L Tris，100mmol/L硫酸铵，10mmol/L KCl，20mmol/L MgSO₄，1％(体积分数)TritonX-100，pH 8.8(25℃)。

表3Bst粗酶活性检测配制体系

2.2聚合反应液的反应

反应条件：65℃反应5分钟。

终止反应：反应完成后添加四倍体积的终止缓冲液(99％甲酰胺、0.1％SDS和20mMEDTA)终止反应。

3、聚合反应产物凝胶迁移实验

3.1配置12％尿素变性聚丙烯酰胺凝胶。

3.2将终止反应的样品在95℃下煮沸5分钟。

3.3白电泳孔点上含溴酚蓝样品缓冲液，其余样品按顺序上样8μL。

3.4使用1×TBE电泳液，电压230V跑胶至样品跑到接近胶底结束。

3.5通过ChampGel 5000成像系统(赛智)上使用紫外条件对引物和全长产物进行拍照，并通过配套的凝胶成像系统分析全长产物的产量占比(灰度值分析)。

4、实验结果

使用上述方案筛选约1000个Bst DNA聚合酶大片段突变体克隆，获得了2个活性提升的突变体克隆，命名为BM1和BM2，如图2的电泳结果所示，其中，1-2泳道为：Primer，3-4泳道为：野生型Bst，5-6泳道为：BM1克隆，7-8泳道为：BM2克隆，突变体克隆BM1和BM2均比野生型Bst DNA聚合酶大片段具有更高的聚合酶活性。

根据图2上部分的电泳结果通过配套的凝胶成像系统分析计算得到全长产物的量占比，得到图2下部分和表4所示的结果，BM1，BM2相对野生型Bst DNA聚合酶大片段，活性分别提升了2.18倍和2.67倍。

表4统计引物延伸电泳法筛选到活性提升的2个克隆

对BM1，BM2克隆进行DNA测序，通过确定Bst DNA聚合酶大片段突变体的DNA序列的变化情况来确定氨基酸的突变位点。测序结果显示，BM1的DNA序列如SEQ ID NO.3所示，为：

gaaggggagaaaccgcttgaggagatggagtttgccatcgttgacgtcattaccgaagagatgcttgccgacaaggcagcgcttgtcgttgaggtgatggaagaaaactaccacgatgccccgattgtcggaatcgcactagtgaacgagcatgggcgattttttatgcgcccggagaccgcgctggctgattcgcaatttttagcatggcttgccgatgaaacgaagaaaaaaagcatgtttgacgccaagcgggcagtcgttgccttaaagtggaaaggaattgagcttcgcggcgtcgcctttgatttattgctcgctgcctatttgctcaatccggctcaagatgccggcgatatcgctgcggtggcgaaaatgaaacaatatgaagcggtgcggtcggatgaagcggtctatggcaaaggcgtcaagcggtcgctgccggacgaacagacgcttgctgagcatctcgttcgcaaagcggcagccatttgggcgcttgagcagccgtttatggacgatttgcggaacaacgaacaagatcaattattaacgaagcttgagcagccgctggcggcgattttggctgaaatggaattcactggggtgaacgtggatacaaagcggcttgaacagatgggttcggagctcgccgaacaactgcgtgccatcgagcagcgcatttacgagctagccggccaagagttcaacattaactcaccaaaacagctcggagtcattttatttgaaaagctgcagctaccggtgctgaagaagacgaaaacaggctattcgacttcggctgatgtgcttgagaagcttgcgccgcatcatgaaatcgtcgaaaacattttgcattaccgccagcttggcaaactgcaatcaacgtatattgaaggattgttgaaagttgtgcgccctgataccggcaaagtgcatacgatgttcaaccaagcgctgacgcaaactgggcggctcagctcggccgagccgaacttgcaaaacattccgattcggctcgaagaggggcggaaaatccgccaagcgttcgtcccgtcagagccggactggctcattttcgccgccgattactcacaaattgaattgcgcgtcctcgcccatatcgccgatgacgacaatctaattgaagcgttccaacgcgatttggatattcacacaaaaacggcgatggacattttccatgtgagcgaagaggaagtcacggccaacatgcgccgccaggcaaaggccgttaacttcggtatcgtttacggaattagcgattacggattggcgcaaaacttgaacattacgcgcaaagaagctgccggatttatcgaacgttacttcgccagctttccgggcgtaaagcagtatatggaaaacattgtgcaagaagcgaaacagaaaggatatgtgacaacgctgttgcatcggcgccgctatttgcctgatattacaagccgcaatttcaacgtccgcagttttgcagagcggacggccatgaacacgccaattcaaggaagcgccgctgacattattaaaaaagcgatgattgatttagcggcacggctgaaagaagagcagcttcaggctcgtcttttgctgcaagtgcatgacgagctcattttggaagcgccaaaagaggaaattgagcgattatgtgagcttgttccggaagtgatggagcaggccgttacgctccgcgtgccgctgaaagtcgactaccattacggcccaacatggtatgatgccaaataa(SEQ ID NO.3)。其中，加黑加下划线的碱基为发生氨基酸突变的密码子，发生氨基酸突变的密码子中的斜体碱基为突变后的碱基，相对于野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列，其第1331位的a突变为g。

BM2的DNA序列如SEQ ID NO.4所示，为：

gaaggggagaaaccgcttgaggagatggagtttgccatcgttgacgtcattaccgaagagatgcttgccgacaaggcagcgcttgtcgttgaggtgatggaagaaaactaccacgatgccccgattgtcggaatcgcactagtgaacgagcatgggcgattttttatgcgcccggagaccgcgctggctgattcgcaatttttagcatggcttgccgatgaaacgaagaaaaaaagcatgtttgacgccaagcgggcagtcgttgccttaaagtggaaaggaattgagcttcgcggcgtcgcctttgatttattgctcgctgcctatttgctcaatccggctcgagatgccggcgatatcgctgcggtggcgaaaatgaaacaatatgaagcggtgcggtcggatgaagcggtctatggcaaaggcgtcaagcggtcgctgccggacgaacagacgcttgctgagcatctcgttcgcaaagcggcagccatttgggcgcttgagcagccgtttatggacgatttgcggaacaacgaacaagatcaattattaacgaagcttgagcagccgctggcggcgattttggctgaaatggaattcactggggtgaacgtggatacaaagcggcttgaacagatgggttcggagctcgccgaacaactgcgtgccatcgagcagcgcatttacgagctagccggccaagagttcaacattaactcaccaaaacagctcggagtcattttatttgaaaagctgcagctaccggtgctgaagaagacgaaaacaggctattcgacttcggctgatgtgcttgagaagcttgcgccgcatcatgaaatcgtcgaaaacattttgcattaccgccagcttggcaaactgcaatcaacgtatattgaaggattgttgaaagttgtgcgccctgataccggcaaagtgcatacgatgttcaaccaagcgctgacgcaaactgggcggctcagctcggccgagccgaacttgcaaaacattccgattcggctcgaagaggggcggaaaatccgccaagcgttcgtcccgtcagagccggactggctcattttcgccgccgattactcacaaattgaattgcgcgtcctcgcccatatcgccgatgacgacaatctaattgaagcgttccaacgcgatttggatattcacacaaaaacggcgatggacattttccatgtgagcgaagaggaagtcacggccaacatgcgccgccaggcaaaggccgttaacttcggtatcgtttacggaattagcgattacggattggcgcaaaacttgaacattacgcgcaaagaagctgccgaatttatcgaacgttacttcgccagctttccgggcgtaaagcagtatatggaaaacattgtgcaagaagcgaaacagaaaggatatgtgacaacgctgttgcatcggcgccgctatttgcctgatattacaagccgcaatttcaacgtccgcagttttgcagagcggacggccatgaacacgccaattcaaggaagcgccgctgacattattaaaaaagcgatgattgatttagcggcacggctgaaagaagagcagcttcaggctcgtcttttgctgcaagtgcatgacgagctcattttggaagcgccaaaagaggaaattgagcgattatgtgagcttgttccggaagtgatggagcaggccgttacgctccgcgtgccgctgaaagtcgactaccattacggcccaacatggtatgatgccaaataa(SEQ ID NO.4)。其中，加黑加下划线的碱基为发生氨基酸突变的密码子，发生氨基酸突变的密码子中的斜体碱基为突变后的碱基，相对于野生型Bst DNA聚合酶大片段基因序列，其第344位的a突变为了g。

从而根据BM1的DNA序列可以得到突变体克隆BM1的氨基酸突变位点为E444G，BM1的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，为：EGEKPL EEMEFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPAQDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLTKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELAEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTGKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAGFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCELVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAK(SEQ ID NO.5)。其中加黑加下划线且为斜体的为突变的氨基酸，相对于野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列，其第444位氨基酸由谷氨酸E突变为了甘氨酸G。

根据BM2的DNA序列可以得到突变体克隆BM2的氨基酸突变位点为Q115R，BM2的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示，为：EGEKPLEEM EFAIVDVITEEMLADKAALVVEVMEENYHDAPIVGIALVNEHGRFFMRPETALADSQFLAWLADETKKKSMFDAKRAVVALKWKGIELRGVAFDLLLAAYLLNPARDAGDIAAVAKMKQYEAVRSDEAVYGKGVKRSLPDEQTLAEHLVRKAAAIWALEQPFMDDLRNNEQDQLLTKLEQPLAAILAEMEFTGVNVDTKRLEQMGSELAEQLRAIEQRIYELAGQEFNINSPKQLGVILFEKLQLPVLKKTKTGYSTSADVLEKLAPHHEIVENILHYRQLGKLQSTYIEGLLKVVRPDTGKVHTMFNQALTQTGRLSSAEPNLQNIPIRLEEGRKIRQAFVPSEPDWLIFAADYSQIELRVLAHIADDDNLIEAFQRDLDIHTKTAMDIFHVSEEEVTANMRRQAKAVNFGIVYGISDYGLAQNLNITRKEAAEFIERYFASFPGVKQYMENIVQEAKQKGYVTTLLHRRRYLPDITSRNFNVRSFAERTAMNTPIQGSAADIIKKAMIDLAARLKEEQLQARLLLQVHDELILEAPKEEIERLCELVPEVMEQAVTLRVPLKVDYHYGPTWYDAK(SEQ ID NO.6)。其中加黑加下划线且为斜体的为突变的氨基酸，相对于野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列，其第115位氨基酸由谷氨酰胺Q突变为了精氨酸R。

实施例3

使用宝锐生物科技有限公司的LAMP检测试剂盒(染料法)检测实施例2筛选得到的Bst DNA聚合酶大片段突变体BM1和BM2的扩增性能，反应体系如表5所示，按照表5的体系配置扩增反应液。

表5LAMP扩增检测体系

试剂	25μl体系	终浓度
			2×LAMP Premix Buffer	12.5μl	1×
10×Primer mix*	2.5μl	1×
			实施例2的突变体粗酶液	2μl	-
50×Eva Green	0.5μl	1×
			λDNA	70pg	-
ddH2O	-	-
			Total volume	25μl

*10×Primer Mix(λDNA):16μM FIP，16μM BIP，2μM F3，2μM B3，4μM LoopF，4μMLoopB in TE。

其中λDNA LAMP引物包括：

F3：GGCTTGGCTCTGCTAACACGTT；

B3：GGACGTTTGTAATGTCCGCTCC；

FIP：CAGCCAGCCGCAGCACGTTCGCTCATAGGAGATATGGTAG AGCCGC；

BIP：GAGAGAATTTGTACCACCTCCCACCGGGCACATAGCAGTC CTAGGGACAG；

LooF：CTGCATACGACGTGTCT；

LooB：ACCATCTATGACTGTACGCC。

反应条件：65℃孵育30min，每隔1min作为1个循环，每个循环检测一次荧光。

结果如图3所示，野生型Bst DNA聚合酶大片段(野生型Bst组)、突变体BM1(BM1组)和突变体BM2(BM2组)达到阈值Rn＝300时，所需的时间分别为：10.2min、8.5min和7.3min。相对野生型Bst，BM1和BM2在LAMP应用的检测速度分别提升了1.7min和2.9min。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本申请的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本申请进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请各实施例技术方案的范围。

此外，本领域的技术人员能够理解，尽管在此的一些实施例包括其它实施例中所包括的某些特征而不是其它特征，但是不同实施例的特征的组合意味着处于本申请的范围之内并且形成不同的实施例。例如，在上面的权利要求书中，所要求保护的实施例的任意之一都可以以任意的组合方式来使用。公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在加深对本申请的总体背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域技术人员所公知的现有技术。

Claims (17)

1.Bst DNA聚合酶大片段突变体，其特征在于，在全长为586个氨基酸的野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列上进行氨基酸的突变，所述氨基酸突变为：Q115R和E444G中的任一个，所述野生型Bst DNA聚合酶大片段的氨基酸序列为NCBI登录号为AAB52611的全长为876个氨基酸的氨基酸序列的第291～876位氨基酸。

2.根据权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体，其特征在于，所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的活性与所述野生型Bst DNA聚合酶大片段相比，至少提高了2倍。

3.核酸分子，其特征在于，编码权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列为：

(a)：在NCBI登陆号为U33536.1的碱基序列的第871～2631位全长为1761bp的核苷酸序列的基础上进行核苷酸的突变，所述核苷酸突变选自：第344位的a突变为g，或第1331位的a突变为g；

(b)：与(a)所述的核苷酸序列编码相同的所述Bst DNA聚合酶大片段突变体的同义密码子序列。

5.重组表达载体，其特征在于，包括权利要求3至4任一项所述的核酸分子。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述核酸分子可操作地连接启动子，所述启动子选自下列中的任一种：T7启动子、A-PL启动子、tac启动子、trp启动子、araBAD启动子和trc启动子。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包括权利要求3至4任一项所述的核酸分子，或包括权利要求5或6所述的重组表达载体。

8.权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体的制备方法，其特征在于，包括：

培养权利要求7所述的宿主细胞；

将所述宿主细胞进行诱导处理，使得所述宿主细胞表达所述Bst DNA聚合酶大片段突变体；

分离获得所述Bst DNA聚合酶大片段突变体。

9.权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体在制备环介导等温扩增产品的应用。

10.一种环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体。

11.根据权利要求10所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，还包括：环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板DNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

12.根据权利要求10所述的环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，所述试剂盒用于病原体检测、临床疾病诊断、肿瘤基因检测、原位扩增、动物胚胎鉴定、转基因食品检测或环境监测。

13.一种环介导等温扩增方法，其特征在于，使用权利要求10或11所述的环介导等温扩增试剂盒检测样本DNA。

14.一种混合酶，其特征在于，包括权利要求1所述的Bst DNA聚合酶大片段突变体与反转录酶。

15.一种逆转录环介导等温扩增试剂盒，包括权利要求14所述的混合酶。

16.根据权利要15所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒，其特征在于，还包括：逆转录反应引物、环介导等温扩增引物、PCR反应液、对照引物、对照模板RNA、MgCl₂和无核酸酶ddH₂O中的至少一种。

17.一种逆转录环介导等温扩增方法，其特征在于，使用权利要求15或16所述的逆转录环介导等温扩增试剂盒检测样本RNA。