CN118222536A - phi29 DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了phi29DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。本发明具体公开了相对野生型phi29DNA聚合酶包含M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S、E515N、S527T中的至少一种突变的phi29DNA聚合酶突变体。相比于野生型phi29DNA聚合酶，其具有更高的DNA结合能力以及更高的热稳定性，在核酸扩增和测序等领域中具有很好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及phi29 DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术
Phi29 DNA聚合酶由感染枯草芽孢杆菌的噬菌体phi29编码，被广泛应用于核酸扩增和多种测序技术，包括多重置换扩增(MDA)、滚环扩增(RCA)、全基因组扩增(WGA)、SNP检测、单聚合酶分子实时DNA测序、DNA纳米球测序和采用合成测序方法的纳米孔测序等。然而野生型phi29 DNA聚合酶的DNA结合能力和热稳定性相对较差，实际的应用场景中常因此而影响其建库时的产量和测序的效果。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出phi29DNA聚合酶突变体，相比于野生型phi29 DNA聚合酶，其具有更高的DNA结合能力和热稳定性。
本发明还提供与上述phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料。
本发明还提供一种酶制剂。
本发明还提供上述phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法。
本发明还提供一种扩增DNA分子的方法。
本发明还提供上述phi29 DNA聚合酶突变体、生物材料或酶制剂相关的应用。
本发明还提供一种用于核酸扩增或测序的试剂盒。
根据本发明的第一方面实施例的一种phi29 DNA聚合酶突变体，所述phi29 DNA聚合酶突变体相比于野生型phi29 DNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S、E515N、S527T；所述野生型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQID NO:1所示。
根据本发明实施例的phi29 DNA聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：
相比于野生型phi29 DNA聚合酶，实施例的phi29 DNA聚合酶突变体具有更高的基因组扩增效率，通过MDA技术进行单细胞建库时，扩增后得到的条带亮度均高于野生型，扩增效率更高；并且具有更高的热稳定性。其在核酸扩增和测序领域中具有很好的应用前景。
根据本发明的一些实施例，所述phi29 DNA聚合酶突变体具有A1)至A3)中的任一种：
A1)、M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S；
A2)、M8K、M97E、Y224K、R496S、E515N、S527T；
A3)、M8K、M97E、Y224K、R496S、S527T。
根据本发明的一些实施例，所述phi29 DNA聚合酶突变体还包括标签。
根据本发明的一些实施例，所述标签连接在所述phi29 DNA聚合酶突变体的中间和/或N端或/和C端。
根据本发明的一些实施例，所述标签序列包括利于phi29 DNA聚合酶突变体的溶解、纯化和检测的标签序列中的至少一种。可以理解的是，本发明的phi29 DNA聚合酶突变体可以包含一个或多个标签序列；多个标签序列可以包含多个相同标签序列的组合，也可以为多个不同标签序列的组合。例如：利于phi29 DNA聚合酶突变体溶解的标签包括但不限于nus标签序列或麦芽糖结合蛋白标签序列；利于phi29 DNA聚合酶突变体纯化的标签包括但不限于strep标签序列、His标签序列、GST标签序列、pelB信号标签序列或ompA信号标签序列；利于phi29 DNA聚合酶突变体检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)标签序列、β-半乳糖苷酶标签序列、萤光素酶标签序列、绿色荧光蛋白(GFP)标签序列、HcRed标签序列、DsRed标签序列或青色荧光蛋白(CFP)标签序列。所述标签具体可以为His标签序列。
根据本发明的第二方面实施例的与本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子具有B11)至B15)中任一种：
B11)、如SEQ ID NO:6第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID NO:7第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID NO:8第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、与B11)至B13)任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述phi29 DNA聚合酶突变体的DNA分子；
B15)、在严格条件下与B11)至B14)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述phi29DNA聚合酶突变体的DNA分子。
根据本发明的一些实施例，所述严格条件可以为在2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述phi29DNA聚合酶突变体的DNA。该DNA不但可包括启动所述phi29 DNA聚合酶突变体基因转录的启动子，还可包括终止所述phi29 DNA聚合酶突变体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。例如：可以位PET-28a载体。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述phi29 DNA聚合酶突变体的DNA分子得到的重组载体。
根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如E.coli DH5α或E.coli BL21。所述重组生物不包含生殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向E.coli DH5α或E.coli BL21中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
根据本发明的第三方面实施例的一种酶制剂，包括本发明第一方面实施例中所述的phi29DNA聚合酶突变体。
根据本发明的一些实施例，所述酶制剂还包括反应预混液。
根据本发明的一些实施例，所述反应预混液包括Tris-HCl、Mg2+、NH4 +、DTT、dNTPs、BSA中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述NH4 +的来源为铵盐。所述铵盐包括有机铵盐(包括但不限于乙酸铵)、无机铵盐(包括但不限于(NH4)2SO4、NH4Cl或其组合)中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述Mg2+的来源包括氯化镁、乙酸镁、硫酸镁中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述反应预混液包括20～100mmol/L Tris-HCl、9～11mmol/LMg2+、9～11mmol/L NH4 +、4～5mmol/L DTT、120～130μmol/L dNTPs、100～110ng/μL BSA。例如：所述反应预混液可以包括50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L Mg2+、10mmol/L NH4 +、4mmol/L DTT、125μmol/L dNTPs、100ng/μL BSA。
根据本发明的一些实施例，所述反应预混液的pH为7.2～7.8。
可以理解的是，所述反应预混液以不影响所述phi29 DNA聚合酶突变体的活性为宜。
根据本发明的第四方面实施例的本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法，包括：
将本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述phi29 DNA聚合酶突变体。
根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌(如：E.coli BL21)。
根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括真菌(如酵母)、哺乳动物细胞(如HEK293细胞)或昆虫细胞。
根据本发明的第五方面实施例的一种扩增DNA分子的方法，包括：以下步骤：
采用本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体对所述DNA分子进行扩增。
根据本发明的一些实施例，具体可以包括以下步骤：
将所述phi29 DNA聚合酶突变体、所述DNA分子(模板DNA)、引物与反应预混液混合，反应。
根据本发明的第六方面实施例的应用。
根据本发明的一些实施例，所述应用为C1)至C3)任一项在制备核酸扩增或测序产品中的应用；
C1)、本发明第一方面实施例中所述的phi29 DNA聚合酶突变体；
C2)、本发明第二方面实施例中所述的生物材料；
C3)、本发明第三方面实施例中所述的酶制剂。
根据本发明的一些实施例，所述应用为本发明第一方面实施例中所述的phi29DNA聚合酶突变体或本发明第三方面实施例中所述的酶制剂在核酸扩增或测序中的应用。
根据本发明的一些实施例，所述核酸扩增包括但不限于滚环扩增或多重链置换扩增。
根据本发明的一些实施例，所述测序包括DNA测序。包括但不限于单细胞测序(如可作为DNA聚合酶用于单细胞建库)、单聚合酶分子实时DNA测序、DNA纳米球测序或纳米孔测序。
根据本发明的第七方面实施例的一种用于核酸扩增或测序的试剂盒，包括上述phi29DNA聚合酶突变体或上述酶制剂。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1为包含各突变位点的phi29 DNA聚合酶突变体的三维建模结构图；
图2为phi29 DNA聚合酶突变体phi29-mt(A)、phi29-m1(B)、phi29-m2(C)、phi29-m3(D)的表达纯化结果图；M为蛋白marker，泳道1～12分别为样本1～12；
图3为野生型phi29 DNA聚合酶(A)以及phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1(B)、phi29-m2(C)、phi29-m3(D)的相对酶活检测结果；
图4为37℃热处理6h后，野生型phi29 DNA聚合酶(A)以及phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1(B)、phi29-m2(C)、phi29-m3(D)的相对酶活检测结果；
图5为野生型phi29 DNA聚合酶和phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1至phi29-m3的基因组扩增性能检测结果图；其中，M为DNAmarker(GL DNA Marker 10000)，1～2为模板量为10ng的实验组，3～4为模板量为0.1ng的实验组，5为不添加酶的阴性对照组；
图6为热处理后，野生型phi29 DNA聚合酶和phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1的基因组扩增性能检测结果图；其中，M为DNAmarker(GL DNA Marker 10000)，1～2是未处理组，3～4是30℃加热30min，5～6为37℃加热30min，7～8为42℃加热30min；
图7为热处理后，phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m2和phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m3的基因组扩增性能检测结果图；其中，M为DNAmarker(GL DNA Marker 10000)，1～2是未处理组，3～4是30℃加热30min，5～6为37℃加热30min，7～8为42℃加热30min。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法或产品不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法或产品固有的其它步骤或单元。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
以下氨基酸序列均是从N端到C端的顺序；核苷酸序列均是从5'端到3'端的顺序。
术语“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程。
为获得热稳定性、扩增性能好的phi29 DNA聚合酶，对野生型phi29 DNA聚合酶进行突变，并进行大量筛选，得到phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3。
野生型phi29 DNA聚合酶phi29-mt的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。MKHMPRKMYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISRMGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRYAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLRQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK(SEQ ID NO:1)。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸进行突变形成，具体氨基酸突变方式为M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S。氨基酸序列具体如SEQ IDNO:2所示。
MKHMPRKKYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKCQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISREGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIIDTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRKAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLSQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFSVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK(SEQ ID NO:2)。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m2基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸进行突变形成，具体氨基酸突变方式为M8K、M97E、Y224K、R496S、E515N、S527T。氨基酸序列具体如SEQ IDNO:3所示。
MKHMPRKKYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISREGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRKAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLSQKTYIQDIYMKEVDGKLVNGSPDDYTDIKFTVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK(SEQ ID NO:3)。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m3基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸进行突变形成，具体氨基酸突变方式为M8K、M97E、Y224K、R496S、S527T。氨基酸序列具体如SEQ ID NO:4所示。
MKHMPRKKYSCDFETTTKVEDCRVWAYGYMNIEDHSEYKIGNSLDEFMAWVLKVQADLYFHNLKFDGAFIINWLERNGFKWSADGLPNTYNTIISREGQWYMIDICLGYKGKRKIHTVIYDSLKKLPFPVKKIAKDFKLTVLKGDIDYHKERPVGYKITPEEYAYIKNDIQIIAEALLIQFKQGLDRMTAGSDSLKGFKDIITTKKFKKVFPTLSLGLDKEVRKAYRGGFTWLNDRFKEKEIGEGMVFDVNSLYPAQMYSRLLPYGEPIVFEGKYVWDEDYPLHIQHIRCEFELKEGYIPTIQIKRSRFYKGNEYLKSSGGEIADLWLSNVDLELMKEHYDLYNVEYISGLKFKATTGLFKDFIDKWTYIKTTSEGAIKQLAKLMLNSLYGKFASNPDVTGKVPYLKENGALGFRLGEEETKDPVYTPMGVFITAWARYTTITAAQACYDRIIYCDTDSIHLTGTEIPDVIKDIVDPKKLGYWAHESTFKRAKYLSQKTYIQDIYMKEVDGKLVEGSPDDYTDIKFTVKCAGMTDKIKKEVTFENFKVGFSRKMKPKPVQVPGGVVLVDDTFTIK(SEQ ID NO:4)。
实施例1
1、表达载体的构建：
在野生型phi29 DNA聚合酶的N端设计连接肽(氨基酸序列为GS)连接8×组氨酸标签，合成相应DNA分子(核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)。将DNA分子与PET-28a载体连接，得到表达载体PET-28a/phi29-mt。
ATGCATCACCACCATCACCATCACCACGGTAGCATGAAACATATGCCGCGCAAAATGTATAGCTGCGATTTCGAAACCACCACCAAAGTGGAAGATTGCCGCGTGTGGGCCTACGGCTATATGAATATTGAAGACCACAGCGAATACAAAATTGGCAATAGCCTGGACGAATTTATGGCGTGGGTGCTGAAAGTGCAGGCGGATCTGTATTTCCATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTATTAACTGGCTGGAACGCAACGGCTTCAAATGGAGCGCGGACGGCCTGCCGAATACCTACAACACCATTATTTCACGCATGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGTCTGGGTTACAAAGGCAAACGCAAAATTCATACCGTGATTTACGATAGTCTGAAAAAACTGCCGTTCCCGGTTAAGAAAATCGCGAAGGATTTTAAACTGACCGTTCTGAAAGGCGATATTGACTATCACAAAGAACGCCCGGTGGGCTATAAAATTACCCCCGAAGAGTATGCGTATATTAAAAACGATATTCAGATCATTGCGGAAGCGCTCCTGATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTCAAAGATATTATTACCACCAAAAAATTTAAAAAAGTTTTTCCGACTCTGAGCCTGGGCCTGGATAAAGAAGTGCGCTATGCGTATCGTGGCGGCTTTACCTGGTTAAACGATCGTTTTAAAGAAAAAGAAATTGGTGAAGGCATGGTTTTTGATGTGAATTCGCTGTACCCGGCGCAGATGTACAGCCGTCTGCTGCCGTACGGCGAACCGATTGTGTTCGAGGGCAAATACGTATGGGACGAAGATTACCCGCTGCACATTCAGCATATTCGCTGCGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAACGCTCGCGCTTTTACAAAGGTAACGAATATCTGAAAAGCTCAGGTGGTGAAATTGCGGATCTGTGGCTGAGCAACGTGGATCTGGAACTGATGAAAGAACATTATGATCTGTACAATGTGGAATACATTAGCGGCCTGAAATTTAAAGCGACCACCGGTCTGTTCAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATATTAAAACCACCAGCGAAGGCGCGATTAAACAGCTGGCCAAACTGATGCTGAATAGCCTGTACGGCAAATTTGCGAGCAATCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTACCTGAAAGAAAACGGCGCGCTGGGTTTCCGTCTGGGCGAAGAAGAAACCAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTCATTACGGCCTGGGCGCGCTATACCACCATCACCGCGGCGCAGGCGTGTTATGATCGCATTATTTACTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAATTCCGGATGTGATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGTTATTGGGCGCATGAGAGCACCTTCAAACGTGCGAAATATCTGCGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATATGAAAGAAGTAGATGGCAAACTGGTGGAAGGCAGCCCGGATGATTACACCGATATTAAATTTAGCGTGAAATGCGCCGGCATGACCGATAAAATCAAAAAAGAAGTGACCTTTGAAAATTTTAAAGTTGGTTTCTCGCGCAAAATGAAACCGAAACCGGTGCAGGTGCCGGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATGATACCTTTACCATTAAATAA(SEQ ID NO:5)。
采用点突变的方法设计引物，分别对野生型phi29 DNA聚合酶的核苷酸序列(SEQID NO:5)进行点突变。具体引物序列如下：
phi29-FP1：5'-GCCGCGCAAAAAGTATAGCTGCGATT-3'；
phi29-RP1：5'-TCGAAATCGCAGCTATACTTTTTGCGC-3'；
phi29-FP2：5'-TGCTGAAATGCCAGGCGGATCTGTAT-3'；
phi29-RP2：5'-TCCGCCTGGCATTTCAGCACCCAC-3'；
phi29-FP3：5'-TTTCACGCGAGGGCCAGTGGTATAT-3'；
phi29-RP3：5'-ACTGGCCCTCGCGTGAAATAATGG-3'；
phi29-FP4：5'-CAAAGATATTATTGACACCAAAAAATTTAA-3'；
phi29-RP4：5'-GCTTCAAAGATATTATTGACACCAAAAAA-3'；
phi29-FP5：5'-AGTGCGCAAAGCGTATCGTGGCGG-3'；
phi29-RP5：5'-CACGATACGCTTTGCGCACTTCTTTAT-3'；
phi29-FP6：5'-CGAAATATCTGAGCCAGAAAACCTATA-3'；
phi29-RP6：5'-GTTTTCTGGCTCAGATATTTCGCACG-3'；
phi29-FP7：5'-ACTGGTGAACGGCAGCCCGGATGA-3'；
phi29-RP7：5'-GGGCTGCCGTTCACCAGTTTGCCAT-3'；
phi29-FP8：5'-TTAAATTTACCGTGAAATGCGCCGGC-3'；
phi29-RP8：5'-CATTTCACGGTAAATTTAATATCGGTG-3'。
以野生型phi29 DNA聚合酶的表达载体PET-28a/phi29-mt为模板(200ng)，加入25μL2×ApexHF HS PCR Master Mix(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号AG12209)、1μL上游引物(10μmol/L)、1μL下游引物(10μmol/L)，以水补足至50μL，进行PCR扩增。PCR扩增程序为：94℃30s；98℃10s、55℃15s、72℃1min，共25个循环。使用SteadyPure PCR反应液纯化试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司，货号AG21003)纯化回收得到的PCR产物，并将回收产物转化至DH5α感受态细胞中。挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将阳性单克隆进行测序验证，培养验证正确的感受态细胞，并提取质粒，得到能够分别表达phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3的重组表达载体。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
ATGCATCACCACCATCACCATCACCACGGTAGCATGAAACATATGCCGCGCAAAAAGTATAGCTGCGATTTCGAAACCACCACCAAAGTGGAAGATTGCCGCGTGTGGGCCTACGGCTATATGAATATTGAAGACCACAGCGAATACAAAATTGGCAATAGCCTGGACGAATTTATGGCGTGGGTGCTGAAATGCCAGGCGGATCTGTATTTCCATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTATTAACTGGCTGGAACGCAACGGCTTCAAATGGAGCGCGGACGGCCTGCCGAATACCTACAACACCATTATTTCACGCGAGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGTCTGGGTTACAAAGGCAAACGCAAAATTCATACCGTGATTTACGATAGTCTGAAAAAACTGCCGTTCCCGGTTAAGAAAATCGCGAAGGATTTTAAACTGACCGTTCTGAAAGGCGATATTGACTATCACAAAGAACGCCCGGTGGGCTATAAAATTACCCCCGAAGAGTATGCGTATATTAAAAACGATATTCAGATCATTGCGGAAGCGCTCCTGATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTCAAAGATATTATTGACACCAAAAAATTTAAAAAAGTTTTTCCGACTCTGAGCCTGGGCCTGGATAAAGAAGTGCGCAAAGCGTATCGTGGCGGCTTTACCTGGTTAAACGATCGTTTTAAAGAAAAAGAAATTGGTGAAGGCATGGTTTTTGATGTGAATTCGCTGTACCCGGCGCAGATGTACAGCCGTCTGCTGCCGTACGGCGAACCGATTGTGTTCGAGGGCAAATACGTATGGGACGAAGATTACCCGCTGCACATTCAGCATATTCGCTGCGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAACGCTCGCGCTTTTACAAAGGTAACGAATATCTGAAAAGCTCAGGTGGTGAAATTGCGGATCTGTGGCTGAGCAACGTGGATCTGGAACTGATGAAAGAACATTATGATCTGTACAATGTGGAATACATTAGCGGCCTGAAATTTAAAGCGACCACCGGTCTGTTCAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATATTAAAACCACCAGCGAAGGCGCGATTAAACAGCTGGCCAAACTGATGCTGAATAGCCTGTACGGCAAATTTGCGAGCAATCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTACCTGAAAGAAAACGGCGCGCTGGGTTTCCGTCTGGGCGAAGAAGAAACCAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTCATTACGGCCTGGGCGCGCTATACCACCATCACCGCGGCGCAGGCGTGTTATGATCGCATTATTTACTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAATTCCGGATGTGATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGTTATTGGGCGCATGAGAGCACCTTCAAACGTGCGAAATATCTGAGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATATGAAAGAAGTAGATGGCAAACTGGTGGAAGGCAGCCCGGATGATTACACCGATATTAAATTTAGCGTGAAATGCGCCGGCATGACCGATAAAATCAAAAAAGAAGTGACCTTTGAAAATTTTAAAGTTGGTTTCTCGCGCAAAATGAAACCGAAACCGGTGCAGGTGCCGGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATGATACCTTTACCATTAAATAA(SEQ ID NO:6)。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m2的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。
ATGCATCACCACCATCACCATCACCACGGTAGCATGAAACATATGCCGCGCAAAAAGTATAGCTGCGATTTCGAAACCACCACCAAAGTGGAAGATTGCCGCGTGTGGGCCTACGGCTATATGAATATTGAAGACCACAGCGAATACAAAATTGGCAATAGCCTGGACGAATTTATGGCGTGGGTGCTGAAAGTGCAGGCGGATCTGTATTTCCATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTATTAACTGGCTGGAACGCAACGGCTTCAAATGGAGCGCGGACGGCCTGCCGAATACCTACAACACCATTATTTCACGCGAGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGTCTGGGTTACAAAGGCAAACGCAAAATTCATACCGTGATTTACGATAGTCTGAAAAAACTGCCGTTCCCGGTTAAGAAAATCGCGAAGGATTTTAAACTGACCGTTCTGAAAGGCGATATTGACTATCACAAAGAACGCCCGGTGGGCTATAAAATTACCCCCGAAGAGTATGCGTATATTAAAAACGATATTCAGATCATTGCGGAAGCGCTCCTGATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTCAAAGATATTATTACCACCAAAAAATTTAAAAAAGTTTTTCCGACTCTGAGCCTGGGCCTGGATAAAGAAGTGCGCAAAGCGTATCGTGGCGGCTTTACCTGGTTAAACGATCGTTTTAAAGAAAAAGAAATTGGTGAAGGCATGGTTTTTGATGTGAATTCGCTGTACCCGGCGCAGATGTACAGCCGTCTGCTGCCGTACGGCGAACCGATTGTGTTCGAGGGCAAATACGTATGGGACGAAGATTACCCGCTGCACATTCAGCATATTCGCTGCGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAACGCTCGCGCTTTTACAAAGGTAACGAATATCTGAAAAGCTCAGGTGGTGAAATTGCGGATCTGTGGCTGAGCAACGTGGATCTGGAACTGATGAAAGAACATTATGATCTGTACAATGTGGAATACATTAGCGGCCTGAAATTTAAAGCGACCACCGGTCTGTTCAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATATTAAAACCACCAGCGAAGGCGCGATTAAACAGCTGGCCAAACTGATGCTGAATAGCCTGTACGGCAAATTTGCGAGCAATCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTACCTGAAAGAAAACGGCGCGCTGGGTTTCCGTCTGGGCGAAGAAGAAACCAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTCATTACGGCCTGGGCGCGCTATACCACCATCACCGCGGCGCAGGCGTGTTATGATCGCATTATTTACTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAATTCCGGATGTGATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGTTATTGGGCGCATGAGAGCACCTTCAAACGTGCGAAATATCTGAGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATATGAAAGAAGTAGATGGCAAACTGGTGAACGGCAGCCCGGATGATTACACCGATATTAAATTTACCGTGAAATGCGCCGGCATGACCGATAAAATCAAAAAAGAAGTGACCTTTGAAAATTTTAAAGTTGGTTTCTCGCGCAAAATGAAACCGAAACCGGTGCAGGTGCCGGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATGATACCTTTACCATTAAATAA(SEQ ID NO:7)。
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m3的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。
ATGCATCACCACCATCACCATCACCACGGTAGCATGAAACATATGCCGCGCAAAAAGTATAGCTGCGATTTCGAAACCACCACCAAAGTGGAAGATTGCCGCGTGTGGGCCTACGGCTATATGAATATTGAAGACCACAGCGAATACAAAATTGGCAATAGCCTGGACGAATTTATGGCGTGGGTGCTGAAAGTGCAGGCGGATCTGTATTTCCATAACCTGAAATTTGATGGCGCGTTTATTATTAACTGGCTGGAACGCAACGGCTTCAAATGGAGCGCGGACGGCCTGCCGAATACCTACAACACCATTATTTCACGCGAGGGCCAGTGGTATATGATTGATATTTGTCTGGGTTACAAAGGCAAACGCAAAATTCATACCGTGATTTACGATAGTCTGAAAAAACTGCCGTTCCCGGTTAAGAAAATCGCGAAGGATTTTAAACTGACCGTTCTGAAAGGCGATATTGACTATCACAAAGAACGCCCGGTGGGCTATAAAATTACCCCCGAAGAGTATGCGTATATTAAAAACGATATTCAGATCATTGCGGAAGCGCTCCTGATTCAGTTTAAACAGGGCCTGGATCGCATGACCGCGGGCAGCGATAGCCTGAAAGGCTTCAAAGATATTATTACCACCAAAAAATTTAAAAAAGTTTTTCCGACTCTGAGCCTGGGCCTGGATAAAGAAGTGCGCAAAGCGTATCGTGGCGGCTTTACCTGGTTAAACGATCGTTTTAAAGAAAAAGAAATTGGTGAAGGCATGGTTTTTGATGTGAATTCGCTGTACCCGGCGCAGATGTACAGCCGTCTGCTGCCGTACGGCGAACCGATTGTGTTCGAGGGCAAATACGTATGGGACGAAGATTACCCGCTGCACATTCAGCATATTCGCTGCGAATTTGAACTGAAAGAAGGCTATATTCCGACCATTCAGATTAAACGCTCGCGCTTTTACAAAGGTAACGAATATCTGAAAAGCTCAGGTGGTGAAATTGCGGATCTGTGGCTGAGCAACGTGGATCTGGAACTGATGAAAGAACATTATGATCTGTACAATGTGGAATACATTAGCGGCCTGAAATTTAAAGCGACCACCGGTCTGTTCAAAGATTTTATTGATAAATGGACCTATATTAAAACCACCAGCGAAGGCGCGATTAAACAGCTGGCCAAACTGATGCTGAATAGCCTGTACGGCAAATTTGCGAGCAATCCGGATGTGACCGGCAAAGTGCCGTACCTGAAAGAAAACGGCGCGCTGGGTTTCCGTCTGGGCGAAGAAGAAACCAAAGATCCGGTGTATACCCCGATGGGCGTGTTCATTACGGCCTGGGCGCGCTATACCACCATCACCGCGGCGCAGGCGTGTTATGATCGCATTATTTACTGCGATACCGATAGCATTCATCTGACCGGCACCGAAATTCCGGATGTGATTAAAGATATTGTGGATCCGAAAAAACTGGGTTATTGGGCGCATGAGAGCACCTTCAAACGTGCGAAATATCTGAGCCAGAAAACCTATATTCAGGATATTTATATGAAAGAAGTAGATGGCAAACTGGTGGAAGGCAGCCCGGATGATTACACCGATATTAAATTTACCGTGAAATGCGCCGGCATGACCGATAAAATCAAAAAAGAAGTGACCTTTGAAAATTTTAAAGTTGGTTTCTCGCGCAAAATGAAACCGAAACCGGTGCAGGTGCCGGGCGGCGTGGTGCTGGTGGATGATACCTTTACCATTAAATAA(SEQ ID NO:8)。
2、表达：
将步骤1获得的重组质粒分别转化至宿主细胞E.coli BL21中，挑取单菌落，分别接种至含50μg/mL氨苄西林的100mL LB培养基中，放置于30℃摇床中震荡培养过夜后，按体积比1:100接种至2L含有50μg/mL氨苄西林的LB培养基中，30℃摇床中震荡培养至0D600为0.6～0.8；加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，降低温度至16℃继续震荡诱导16h～18h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于-80℃。
3、纯化：
取诱导表达后-80℃冻存的菌体，按湿重每克菌体加入5mL裂解缓冲液(50mMTris-HCl、1mM EDTA、300mM NaCl、1mM DTT，pH 7.5)重悬菌体，得到菌体悬液(样本1)，用高压破碎仪裂解菌体，高压破碎条件为750bar，循环破碎三轮，得到菌体破碎液(样本2)。将裂解后菌体在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液A(样本3)至200mL灭菌烧杯中，弃沉淀A(样本4)。向上清液A中加入10％ PEI至PEI终浓度为0.6％，低速搅拌30min～60min后，在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液B(样本5)至新的200mL灭菌烧杯中，弃沉淀B(样本6)。向上清液B中加入(NH4)2SO4至(NH4)2SO4终浓度为65％后，在4℃、12000rpm条件下离心30min，取沉淀C(样本7)，弃上清液C。将沉淀C溶于缓冲液A(50mM Tris-HCl、1mM EDTA、300mM NaCl、1mM DTT、20mM咪唑，pH7.5)中，得到待纯化蛋白溶液(样本8)。
用缓冲液A平衡层析柱Ni-NTA Purose 6Fast Flow(购自嘉兴千纯生物科技有限公司)后，将待纯化蛋白溶液上样至层析柱中，先用缓冲液A冲洗柱子，再用缓冲液B(50mMTris-HCl、1mM EDTA、300mM NaCl、1mM DTT、700mM imidazole，pH7.5)进行0％～100％的梯度洗脱，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集含目的蛋白的洗脱液A(样本9)，并将洗脱液A透析至缓冲液A中，收集透析液A(样本10)。并对透析液A进行二次镍离子亲和层析纯化，步骤同上，收集得到含目的蛋白的洗脱液B(样本11)，并将洗脱液B透析至缓冲液A中，收集透析液B(样本12)备用。
样本1～样本12各取30μL，经SDS-PAGE电泳分析纯化结果。结果如图2所示。
检测例1
在一定时间内，根据商品DNA聚合酶不同酶添加量下所得到的产物量建立对照曲线，同时建立待测DNA聚合酶的曲线，对两者斜率的比值进行计算，可用于确定待测DNA聚合酶的酶活。设计一段发夹型寡核苷酸序列，在DNA聚合酶的催化下，dNTPs逐渐渗入，发夹型寡核苷酸序列最终会形成双链DNA产物。SYBR Green I是一种与双链DNA结合的高灵敏度荧光染料，可与双链DNA结合产生荧光信号，其荧光信号强度与双链DNA的浓度呈正相关。通过测定一定时间内的荧光信号值，可计算出待测DNA聚合酶的酶活力值。
酶活力测定：设计发夹型寡核苷酸序列(Test 1：5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCC GCGGCCGatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3')，根据纯化后蛋白SDS-PAGE电泳胶图中最终所得到的蛋白液条带亮度，预先对纯化得到的野生型和突变体phi29 DNA聚合酶按照一定的比例进行酶活计算，得到预估酶活值，使用酶保存液稀释至酶活值预估为10U/μL，然后再使用酶保存液对商品DNA聚合酶(购自近岸蛋白，货号E013-02A，作为control组)、野生型phi29 DNA聚合酶溶液和phi29 DNA聚合酶突变体溶液分别进行不同倍数的稀释，得到稀释后酶液。向20μL反应体系(25mmol/L Tris-HC1、50mmol/L KCl、5mmol/L(NH4)2SO4、2.5mmol/L MgC12、0.1％ TritonX-100、0.25mmol/L dNTPs、0.5μmol/L Test 1，pH 8.5)中加入5μL稀释后酶液，30℃反应5min，立即置于冰上冷却，并加入EDTA至终浓度为10mM，以终止反应；按体积比1:30加入1×SYBR染液，使用酶标仪进行检测。注意每个稀释倍数配制2个平行，以减少实验误差，同时每次反应配制2个空白对照，以扣除荧光背景。导出检测原始荧光信号值数据，扣除荧光背景信号值，计算荧光信号值与酶量的斜率值。
将野生型phi29 DNA聚合酶、各phi29 DNA聚合酶突变体分别于37℃下热处理6h，然后参照上述方法测定酶活力，并对其剩余酶活力进行计算。以对应未经热处理的野生型ph i29 DNA聚合酶或phi29 DNA聚合酶突变体作为未处理组。
结果如图3～4和表1所示。其中，野生型phi29 DNA聚合酶经热处理后，酶活已经消失，数值无法形成线性关系。如图4中A图所示。
表1
phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3具有很好的热稳定性，经37℃下热处理6h后，还具有很高的酶活力。而野生型phi29 DNA聚合酶失去酶活，热稳定性差。
检测例2
本检测例对phi29 DNA聚合酶突变体进行单细胞建库的扩增性能进行检测。以人类基因组(Human Genomic)DNA作为模板，用野生型phi29 DNA聚合酶或phi29 DNA聚合酶突变体通过MDA技术对其进行单细胞建库扩增反应，通过扩增反应后得到的整体电泳条带亮度确定其扩增效率。步骤如下：
将20μL含10ng或0.1ng模板的反应体系(50mmol/L Tris-HCl、10mmol/L MgCl2、10mmol/L(NH4)2SO4、4mmol/L DTT、125μmol/L dNTPs、25μmol/L Random Primer 6(购自NEB，货号S1230S)、100ng/μL BSA、10U酶，pH 7.5)置于30℃孵育2h后，65℃热孵育10min，使用1％的琼脂糖凝胶对产物进行电泳检测。
结果如图5所示。
在相同的反应体系和反应条件下，phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3扩增得到的条带亮度均远亮于野生型phi29 DNA聚合酶。这说明phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3进行单细胞建库的扩增效率均优于野生型phi29 DNA聚合酶。
检测例3
本检测例对phi29 DNA聚合酶突变体热处理后的单细胞建库扩增性能进行检测。将野生型phi29 DNA聚合酶、各phi29 DNA聚合酶突变体分别于30℃、37℃、42℃下热处理30min，然后检测其进行单细胞建库的扩增性能变化。方法同检测例2(模板添加量为10ng)。
实验结果如图6～7所示。
在相同的反应体系下，野生型phi29 DNA聚合酶整体条带亮度较弱，且只在30℃处理30min后有条带，37℃或42℃热处理后均无扩增条带。phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1在30℃、37℃、42℃热处理后均具有很亮的扩增条带，强于野生型phi29 DNA聚合酶。phi29DNA聚合酶突变体phi29-m2能够耐受30℃、37℃热处理，在30℃、37℃热处理后均具有很亮的扩增条带，强于野生型phi29 DNA聚合酶。phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m3能够耐受30℃热处理，且整体条带亮度仍强于野生型phi29 DNA聚合酶。这说明phi29 DNA聚合酶突变体phi29-m1、phi29-m2、phi29-m3的热稳定性均相对野生型phi29 DNA聚合酶有所提高。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述phi29 DNA聚合酶突变体相比于野生型phi29 DNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S、E515N、S527T；所述野生型phi29 DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.根据权利要求1所述的phi29 DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述phi29 DNA聚合酶突变体相比于野生型phi29 DNA聚合酶，具有A1)至A3)中任一组突变位点：
A1)、M8K、V54C、M97E、T203D、Y224K、R496S；
A2)、M8K、M97E、Y224K、R496S、E515N、S527T；
A3)、M8K、M97E、Y224K、R496S、S527T；
优选地，所述phi29 DNA聚合酶突变体还包括标签。
3.与权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子具有B11)至B15)中任一种：
B11)、如SEQ ID NO:6第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID NO:7第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID NO:8第34至1761位所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、与B11)至B13)任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述phi29 DNA聚合酶突变体的DNA分子；
B15)、在严格条件下与B11)至B14)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述phi29DNA聚合酶突变体的DNA分子。
5.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体。
6.一种权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述phi29 DNA聚合酶突变体。
7.一种扩增DNA分子的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂对所述DNA分子进行扩增。
8.C1)至C3)任一项在制备核酸扩增或测序产品中的应用；
C1)、权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体；
C2)、权利要求3或4所述的生物材料；
C3)、权利要求5任一项所述的酶制剂。
9.权利要求1或2所述的phi29 DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂在核酸扩增或测序中的应用。
10.一种用于核酸扩增或测序的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的phi29DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂。
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