CN117660399A - 具有高扩增活性的耐热dna聚合酶突变体 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体，具体地，本发明应用蛋白质定向进化技术，对针对Taq酶的聚合酶活性结构域构建随机突变库，通过逐步添加筛选压力，使不适合的突变自然淘汰，具有优势性状的突变逐步积累，最终筛选出一系列对Taq酶扩增性能、聚合性能有关键作用的氨基酸位点及其突变，并得到高扩增性能的Taq酶突变体。

Description

具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体

本申请是申请日为2019年01月29日，申请号为201910083410.X，发明创造名称为“一种具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体”的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体地说，本发明涉及一种具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体。

背景技术

Taq酶是一种来源于耐热性细菌Thermus aquaticus的耐热性DNA聚合酶，分子量94KDa，在镁离子存在的条件下，其最适反应温度为75-80℃，在95℃下的活性半衰期为40分钟，具有5’-3’核酸外切酶活性。由于其具有耐高温的特性，因此广泛用于聚合酶链式反应(PCR)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。商品化Taq酶使用大肠杆菌原核表达系统进行克隆及表达。现代分子生物检测技术对PCR反应的灵敏度、精确度、耐用性要求越来越高，野生型Taq酶无法完全满足实际应用的需求。为使其更加适应特定技术的使用，对Taq酶序列的突变改造进行了很多的尝试，如添加DNA结合结构域使其具有更强的延伸活性(Wang Y(2004).A novel strategy to engineer DNA polymerases for enhanced processivityand improved performance in vitro.Nucleic Acids Res 32,1197–1207))；通过定点突变、删除结构域使其具有更高的保真性(Suzuki M,Yoshida S,Adman ET,Blank A,Loeb LA(2000)Thermus Aquaticus DNA polymerase I mutants with alteredfidelity.Interacting mutations in the O-Helix.J Biol Chem 275:32728–32735)、更高的DNA聚合活性(Mutant Taq DNA polymerases with improved elongation abilityas a useful reagent for genetic engineering.Front Microbiol 5:461.doi:10.3389/fmicb.2014.00461)、耐受高浓度抑制剂(Zhang Z,Kermekchiev MB,Barnes WM(2010)Direct DNA amplification from crude clinical samples using a PCRenhancer cocktail and novel mutants of Taq.J Mol Diagn 12:152–161)、降低5’-3’核酸外切酶活性(Vainshtein I,Atrazhev A,Eom SH,Elliott JF,Wishart DS,MalcolmBA(1996)Peptide rescue of an N-Terminal truncation of the Stoffel fragment ofTaq DNA polymerase.Protein Sci 5:51785–51792)。

对Taq酶的改造主要有以下几种途径。1：增加结构域，使其具有新的性能。如加入单链结合结构域(SSB)或DNA结合蛋白Sso7，增强Taq酶对引物及模板DNA的结合能力，使其具有更强的延伸能力和持续合成能力，适合用于长片段DNA的扩增反应。但增加结构域会直接增大Taq酶的分子量，有可能使Taq酶的溶解性和稳定性降低。降低原核表达生产的产量。2：去除Taq酶上非必要的结构域。如将5’-3’核酸外切酶结构域(Taq酶N端前280个氨基酸)删除，使Taq酶只保留核酸聚合酶活性区域，降低高浓度Taq酶对引物及模板DNA造成降解的可能性，达到提高Taq酶聚合活性的目的。但此方法得到的Taq酶突变体没有了5’-3’核酸外切酶活性，不适合用于基于Taq man探针法的定量PCR反应，可使用范围有限。3：定点突变法。对活性位点、镁离子结合位点、DNA结合位点的氨基酸进行定点突变，提高各位点对底物、模板及引物的亲和力，从而提高对各种抑制剂的耐受性。由于蛋白质结构的复杂性，一些远离活性位点的氨基酸也有可能对酶的整体结构产生影响，因此只对特定几个活性中心位点的氨基酸进行突变，难以从整体上对酶进行改造。而且现有的计算机模拟技术难以预测各个位点突变对整体结构会产生什么影响，用定点突变法制备突变体以及进行突变体筛选的工作量非常大，而且效率低下，一些可能对活性有重大影响的位点无法被识别。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体。

在本发明的第一方面，提供了一种突变的DNA聚合酶，所述突变的DNA聚合酶在选自下组的一个或多个位点发生突变：V453、F495、E507、K508、T509、A518、S624、Y672、E734、R737、F749、T757、L764、H785，其中，氨基酸残基编号采用SEQ ID NO.2所示的编号。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶的活性是野生型DNA聚合酶(SEQ ID NO.:2)的至少1.5倍；优选地至少2倍；更优选地至少3倍。

在另一优选例中，所述野生型DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶的氨基选序列与SEQ ID NO.2相比具有至少80％的同源性；更优选地，具有至少90％的同源性；最优选地，具有至少95％的同源性；如具有至少96％、97％、98％、99％的同源性。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶选自下组的突变体1-20：

突变体编号	突变氨基酸
		1	E507A，K508L，E734E，F749K
2	K508L、V453A、R737K
		3	E734G
4	F749G K508L L764K
		5	E507Q、T757S
6	H785G
		7	S624T F749V
8	E734F F749V
		9	K508L R737W Y672R
10	E507H H785L
		11	A518Q E734M
12	F495R F749T
		13	K508L F749T E734F
14	R737P S624K
		15	T757W V453G E507M
16	F749E H785G F495G
		17	E734F Y672P
18	T509L H785K
		19	E734G T757S L764Q
20	K508L V453A A518Q。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶中突变位点的数量为1-4个，优选为2或3个。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶选自表2中的各具体突变体酶。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶包括表2中的各具体突变体酶的突变位点。

在另一优选例中，所述突变的DNA聚合酶在SEQ ID NO.:2所示的野生型DNA聚合酶基础上进行突变，并且所述突变的DNA聚合酶包括选自下组的突变位点：

(1)E507A、K508L、E734E、F749K；

(2)K508L、V453A、R737K

(3)E734G

(4)F749G、K508L、L764K

(5)E507Q、T757S

(6)H785G

(7)S624T、F749V

(8)E734F、F749V

(9)K508L、R737W、Y672R

(10)E507H、H785L

(11)A518Q、E734M

(12)F495R、F749T

(13)K508L、F749T、E734F

(14)R737P、S624K

(15)T757W、V453G、E507M

(16)F749E、H785G、F495G

(17)E734F、Y672P

(18)T509L、H785K

(19)E734G、T757S、L764Q；和

(20)K508L、V453A、A518Q。

本发明的第二方面，提供了一种多核苷酸分子，所述多核苷酸分子编码本发明第一方面所述的突变的DNA聚合酶。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核酸分子。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第一方面所述的载体或染色体整合有本发明第二方面所述的核酸分子。

在另一优选例中，所述宿主细胞为原核细胞、或真核细胞。

在另一优选例中，所述原核细胞为大肠杆菌。

在另一优选例中，所述真核细胞为酵母细胞。

本发明的第五方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的突变的DNA聚合酶的方法，包括步骤：

(i)在适合的条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而表达出所述的突变的DNA聚合酶；和

(ii)分离所述的突变的DNA聚合酶。

在另一优选例中，所述步骤(i)中培养所述宿主细胞的温度为20℃-40℃；优选为25℃-37℃，如35℃。

本发明的第六方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含本发明第一方面所述的突变的DNA聚合酶。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，应用蛋白质定向进化技术，对针对Taq酶的聚合酶活性结构域构建随机突变库，通过逐步添加筛选压力，使不适合的突变自然淘汰，具有优势性状的突变逐步积累，最终筛选出一系列对Taq酶扩增性能、聚合性能有关键作用的氨基酸位点及其突变，并得到高扩增性能的Taq酶突变体。在此基础上，完成了本发明。

在描述本发明之前，应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。

除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

虽然在本发明的实施或测试中可以使用与本发明中所述相似或等价的任何方法和材料，本文在此处例举优选的方法和材料。

Taq酶

Taq酶广泛用于聚合酶链式反应(PCR)，是核酸扩增、检测等反应的首选用酶。商品化Taq酶使用大肠杆菌原核表达系统进行克隆及表达。

野生型Taq酶DNA序列如下：

ATGCGTGGCATGCTGCCGCTTTTCGAGCCTAAGGGACGCGTTCTTCTTGTGGATGGACATCATCTGGCGTACCGTACCTTTCATGCCCTGAAGGGCCTGACCACTTCGCGTGGGGAACCCGTGCAAGCAGTTTATGGATTCGCCAAATCGTTACTTAAGGCTCTGAAGGAGGATGGTGATGCGGTCATTGTTGTGTTCGACGCAAAAGCTCCCTCGTTCCGTCACGAGGCCTACGGCGGCTATAAAGCTGGGCGTGCACCCACACCTGAGGATTTTCCCCGGCAACTTGCTTTGATAAAGGAATTAGTAGACCTGTTAGGCCTGGCGCGGTTAGAAGTGCCGGGTTACGAAGCAGATGACGTCTTGGCTAGTTTAGCGAAAAAGGCTGAAAAAGAGGGATATGAAGTGCGGATCCTGACCGCGGATAAAGATCTGTATCAACTGTTGTCCGACCGTATTCACGTGCTTCATCCGGAGGGCTACTTGATAACCCCGGCTTGGCTGTGGGAGAAATATGGGCTGCGTCCAGATCAGTGGGCTGATTATCGTGCACTTACAGGCGATGAATCTGATAATCTTCCCGGCGTCAAGGGGATTGGTGAGAAAACCGCCCGTAAACTTTTGGAGGAGTGGGGCAGCTTGGAGGCGCTGTTGAAGAATCTGGATCGTTTGAAACCCGCTATACGGGAAAAAATCTTGGCGCACATGGACGACTTAAAACTGTCTTGGGACCTGGCGAAAGTTCGTACTGATTTGCCGCTGGAGGTCGACTTTGCGAAGCGTCGCGAGCCCGATCGTGAACGTCTTCGCGCATTTCTGGAGCGTTTAGAATTTGGCTCCCTGTTGCATGAGTTTGGTTTGCTTGAAAGCCCGAAGGCACTTGAGGAAGCTCCTTGGCCTCCGCCTGAGGGCGCTTTTGTCGGATTTGTCTTGAGCCGTAAAGAACCGATGTGGGCGGACTTACTGGCCCTTGCTGCTGCTCGTGGGGGTCGCGTGCATCGCGCACCGGAGCCATACAAAGCACTTCGTGACCTTAAAGAAGCCCGTGGCTTGTTGGCAAAAGATTTAAGTGTCCTGGCTTTACGCGAGGGCTTGGGCTTACCACCGGGAGATGATCCGATGCTTTTGGCCTATCTGCTGGACCCGAGCAACACGACTCCAGAGGGCGTTGCCCGTCGTTATGGCGGAGAATGGACGGAGGAGGCGGGAGAGCGCGCAGCGTTAAGCGAGCGTCTGTTTGCTAATCTGTGGGGACGCTTAGAGGGAGAGGAGCGCCTGTTGTGGTTGTACCGTGAAGTGGAACGGCCGCTGAGTGCAGTGTTAGCTCACATGGAAGCAACCGGGGTGCGGCTGGACGTTGCGTATTTGCGTGCGCTGTCGTTAGAGGTCGCGGAGGAAATAGCCCGTCTGGAGGCCGAAGTATTCCGTTTGGCTGGCCATCCTTTCAACCTGAACAGTCGGGATCAGCTGGAACGTGTACTTTTTGATGAACTGGGGCTGCCCGCCATCGGCAAAACCGAAAAAACCGGCAAACGTAGCACCTCTGCGGCAGTGCTGGAAGCGTTACGTGAAGCTCATCCGATTGTGGAGAAAATTCTGCAATATCGCGAATTGACGAAACTGAAGAGCACCTATATTGATCCGCTGCCAGACTTAATTCACCCCCGTACCGGACGGTTGCATACCCGCTTCAACCAGACCGCGACGGCGACAGGGCGGCTGAGTAGCAGCGATCCGAACCTGCAAAACATTCCCGTGCGTACCCCGCTGGGTCAGCGTATTCGCCGTGCTTTCATTGCCGAGGAAGGCTGGCTGCTGGTCGCGCTGGACTACTCGCAAATCGAATTGCGTGTGTTGGCCCACCTGTCGGGCGACGAAAACTTAATACGCGTGTTTCAAGAAGGTCGTGACATACATACTGAAACCGCGTCCTGGATGTTTGGAGTCCCACGGGAGGCTGTCGATCCTCTTATGCGTCGTGCCGCCAAAACAATTAACTTCGGAGTTCTGTACGGCATGTCGGCACATCGTTTATCACAGGAACTGGCGATTCCGTATGAAGAAGCGCAGGCCTTCATAGAACGTTATTTCCAATCATTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAAGAGGGCCGTCGTCGTGGCTATGTAGAGACTCTGTTCGGACGTCGGCGGTATGTACCCGATCTTGAGGCCCGTGTGAAGTCCGTTCGTGAGGCAGCAGAACGTATGGCGTTTAACATGCCAGTCCAGGGCACAGCGGCGGACCTGATGAAATTAGCTATGGTTAAGCTGTTTCCGCGTTTGGAAGAAATGGGCGCTCGTATGCTGTTACAGGTTCATGACGAGTTAGTATTAGAAGCACCGAAGGAGCGTGCCGAAGCCGTGGCCCGGTTAGCCAAAGAGGTAATGGAAGGCGTCTACCCCCTTGCAGTCCCGCTTGAAGTCGAAGTTGGCATAGGGGAAGACTGGTTATCTGCGAAGGAA(SEQID NO.:1)

野生型Taq酶氨基酸序列如下：

MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVVFDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEGYEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGEKTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERLRAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPEPYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGERAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAEVFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKSTYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIELRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLSQELAIPYEEAQAFIERYFQSFPKVRAWIEKTLEEGRRRGYVETLFGRRRYVPDLEARVKSVREAAERMAFNMPVQGTAADLMKLAMVKLFPRLEEMGARMLLQVHDELVLEAPKERAEAVARLAKEVMEGVYPLAVPLEVEVGIGEDWLSAKE(SEQ ID NO.:2)

本发明通过定向进化的方式，筛选出与Taq酶扩增活性高度相关的氨基酸位点及其突变方式。相关突变氨基酸位点包括：V453、F495、E507、K508、T509、A518、S624、Y672、E734、R737、F749、T757、L764、和H785，氨基酸残基编号依据SEQ ID NO.:2。将上述氨基酸位点突变成任意的其他氨基酸可以获得更高活性的Taq酶突变体，优选的突变形式包括：E507A/Q/H/M、K508L、E734G/F/M、F749K/G/V/T/E、L764K/Q、V453A/G、R737K/W/P、T757S/W、H785G/L/K、S624T/K、Y672R/P、A518Q、F495G/R、T509L。

本发明通过定向进化技术，从随机突变库中筛选出对Taq酶活性具有高度相关性的氨基酸位点及其突变方式，突变体数量是定点突变的10⁵倍，更有利于筛选出具有协同效应的突变位点，而这些位点是无法通过现有的计算机模拟技术预测出来的。而且基于定向进化的原理，积累的优势性状是最适应所添加的筛选条件的，因此得到的突变体也肯定是所有突变体中的最优个体。

本领域的普通技术人员可以使用的常规方法获得本发明的Taq酶基因序列，例如全人工合成或PCR法合成。一种优选的合成法为不对称PCR法。不对称PCR法是用不等量的一对引物，PCR扩增后产生大量的单链DNA(ssDNA)。这对引物分别称为非限制引物与限制性引物，其比例一般为50-100∶1。在PCR反应的最初10-15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA，但当限制性引物(低浓度引物)消耗完后，非限制性引物(高浓度引物)引导的PCR就会产生大量的单链DNA。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明的Taq酶可以通过常规的重组DNA技术进行表达或生产，包括步骤：

(1)用编码本发明蛋白的多核苷酸，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2)在合适的培养基中培养宿主细胞；

(3)从培养基或细胞中分离、纯化目的蛋白质，从而获得Taq酶。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明Taq酶的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体，优选市售的载体：pET28。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

所述重组载体在5'到3'方向上包括：启动子，目的基因和终止子。如果需要，所述重组载体还可以包括以下元件：蛋白纯化标签；3'多聚核苷酸化信号；非翻译核酸序列；转运和靶向核酸序列；选择标记(抗生素抗性基因、荧光蛋白等)；增强子；或操作子。

用于制备重组载体的方法是本领域普通技术人员所熟知的。表达载体可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以被采用。

本领域普通技术人员可以采用熟知的方法构建含有本发明启动子和/或目的基因序列的载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。

本发明的表达载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使宿主转录目的RNA或表达目的蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌、黄色短杆菌、链霉菌属、农杆菌：或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物(如大肠杆菌)时，可以用CaCl₂法处理，也可用电穿孔法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法(如显微注射、电穿孔、脂质体包装等)。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。

术语“可操作连接”是指将准备转录表达的目的基因以一种本领域的常规方式连接到它的控制序列以被表达。

工程菌的培养和目的蛋白发酵生产

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞，表达本发明的基因序列所编码的蛋白。根据宿主细胞的不同，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在本发明中，可采用常规的发酵条件。代表性的条件包括(但并不限于)：

(a)就温度而言，Taq酶的发酵及诱导温度保持在25-37℃；

(b)就诱导期的pH值而言，诱导期pH控制在3-9；

(c)就溶氧(DO)而言，DO控制在10-90％，溶氧的维持可以用氧气/空气混合气体的通入来解决；

(d)就补料而言，补料种类宜包括甘油、甲醇、葡萄糖等碳源，可单独补料或混合补料；

(e)就诱导期IPTG浓度而言，常规诱导浓度都可用于本发明，通常IPTG浓度控制在0.1-1.5mM；

(f)就诱导时间而言，没有特别限制，通常为2-20小时，较佳地为5-15小时。

本发明的目的蛋白Taq酶存在大肠杆菌细胞胞内，通过离心机收集宿主细胞，然后通过高压、机器力、酶解细胞被或其他细胞破碎方法破碎宿主细胞，释放重组蛋白，优选的是高压法。宿主细胞裂解液可通过絮凝、盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析、超滤等纯化，也可直接进行层析纯化。

层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析等技术。常用的层析方法包括：

1.阴离子交换层析：

阴离子交换层析介质包括(但不限于)：Q-Sepharose、DEAE-Sepharose。如果发酵样品的盐浓度较高，影响与离子交换介质的结合，则在进行离子交换层析前需降低盐浓度。样品可以用稀释、超滤、透析、凝胶过滤层析等手段进行平衡缓冲液的更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，然后上样，进行盐浓度或pH的梯度洗脱。

2.疏水层析：

疏水层析介质包括(但不限于)：Phenyl-Sepharose、Butyl-Sepharose、Octyle-Sepharose。样品通过添加NaCl、(NH₄)₂SO₄等方式提高盐浓度，然后上样，通过降低盐浓度方法洗脱。通过疏水层析除去疏水性有较大差异的杂蛋白。

3.凝胶过滤层析

疏水层析介质包括(但不限于)：Sephacryl、Superdex、Sephadex类。通过凝胶过滤层析更换缓冲体系，或进一步精纯。

4.亲和层析

亲和层析介质包括(但不限于)：HiTrap^TMHeparinHPColumns。

5.膜过滤

超滤介质包括：有机膜如聚砜膜、无机膜如陶瓷膜、金属膜类。通过膜过滤可以达到纯化和浓缩的目的。

本发明的主要优点在于：

(1)本发明的具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体在同等PCR循环次数下扩增得到的产物量比野生型Taq酶有显著的提高。

(2)本发明的具有高扩增活性的耐热DNA聚合酶突变体在同等条件下扩增产生同等量的产物所需的时间比野生型Taq酶有显著的缩短，因此，能够显著提高检测效率。

下面结合具体实施例，进一步详陈本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

实施例1：Taq酶随机突变质粒的构建

用低保真度PCR(Error-PCR)扩增Taq酶的聚合酶活性结构域DNA序列(423－831位氨基酸编码序列)，突变发生率为0.3％，然后与Taq酶的其余编码序列(1－423位氨基酸序列)连接，克隆至pET28a原核表达载体中，得到Taq酶随机突变质粒。具体步骤如下：

1)以Taq-pET28a质粒为模板，设计引物T(1－423)扩增Taq(1－423)片段。

Taq(1-423)DNA Seq

ATGCGTGGCATGCTGCCGCTTTTCGAGCCTAAGGGACGCGTTCTTCTTGTGGATGGACATCATCTGGCGTACCGTACCTTTCATGCCCTGAAGGGCCTGACCACTTCGCGTGGGGAACCCGTGCAAGCAGTTTATGGATTCGCCAAATCGTTACTTAAGGCTCTGAAGGAGGATGGTGATGCGGTCATTGTTGTGTTCGACGCAAAAGCTCCCTCGTTCCGTCACGAGGCCTACGGCGGCTATAAAGCTGGGCGTGCACCCACACCTGAGGATTTTCCCCGGCAACTTGCTTTGATAAAGGAATTAGTAGACCTGTTAGGCCTGGCGCGGTTAGAAGTGCCGGGTTACGAAGCAGATGACGTCTTGGCTAGTTTAGCGAAAAAGGCTGAAAAAGAGGGATATGAAGTGCGGATCCTGACCGCGGATAAAGATCTGTATCAACTGTTGTCCGACCGTATTCACGTGCTTCATCCGGAGGGCTACTTGATAACCCCGGCTTGGCTGTGGGAGAAATATGGGCTGCGTCCAGATCAGTGGGCTGATTATCGTGCACTTACAGGCGATGAATCTGATAATCTTCCCGGCGTCAAGGGGATTGGTGAGAAAACCGCCCGTAAACTTTTGGAGGAGTGGGGCAGCTTGGAGGCGCTGTTGAAGAATCTGGATCGTTTGAAACCCGCTATACGGGAAAAAATCTTGGCGCACATGGACGACTTAAAACTGTCTTGGGACCTGGCGAAAGTTCGTACTGATTTGCCGCTGGAGGTCGACTTTGCGAAGCGTCGCGAGCCCGATCGTGAACGTCTTCGCGCATTTCTGGAGCGTTTAGAATTTGGCTCCCTGTTGCATGAGTTTGGTTTGCTTGAAAGCCCGAAGGCACTTGAGGAAGCTCCTTGGCCTCCGCCTGAGGGCGCTTTTGTCGGATTTGTCTTGAGCCGTAAAGAACCGATGTGGGCGGACTTACTGGCCCTTGCTGCTGCTCGTGGGGGTCGCGTGCATCGCGCACCGGAGCCATACAAAGCACTTCGTGACCTTAAAGAAGCCCGTGGCTTGTTGGCAAAAGATTTAAGTGTCCTGGCTTTACGCGAGGGCTTGGGCTTACCACCGGGAGATGATCCGATGCTTTTGGCCTATCTGCTGGACCCGAGCAACACGACTCCAGAGGGCGTTGCCCGTCGTTATGGCGGAGAATGGACGGAGGAGGCGGGAGAGCGCGCAGCGTTAAGCGAGCGTCTGTTTGCTAATCTGTGGGGACGCTTAGAGGGAGAG(SEQ ID NO.:3)

T1-423_PF：5'ATATCATATGCGTGGCATGCTGCCGCTTTT 3'(SEQ ID NO.:4)

T1-423_PR：5'GCATGAATTCCGTCTCCTCTCCCTCTAAGC 3'(SEQ ID NO.:5)

PCR反应体系及程序：

PCR程序：95℃3分钟，(95℃30秒，60℃30秒，72℃1分钟)×25个循环，72℃3分钟，4℃保存

PCR产物用DNA胶回收试剂盒纯化回收，用NdeI及XhoI酶切，连接到pET28a载体，测序确认序列正确，得到的质粒命名为Taq(1-423)-pET28

2)以Taq-pET28a质粒为模板，使用Clontech PCR RandomMutagenesis Kit(大连宝生物PT3393-2)，设计引物(TMu_F/R)扩增Taq(423-822)片段

Taq(423-832)DNA Seq

GGAGAGGAGCGCCTGTTGTGGTTGTACCGTGAAGTGGAACGGCCGCTGAGTGCAGTGTTAGCTCACATGGAAGCAACCGGGGTGCGGCTGGACGTTGCGTATTTGCGTGCGCTGTCGTTAGAGGTCGCGGAGGAAATAGCCCGTCTGGAGGCCGAAGTATTCCGTTTGGCTGGCCATCCTTTCAACCTGAACAGTCGGGATCAGCTGGAACGTGTACTTTTTGATGAACTGGGGCTGCCCGCCATCGGCAAAACCGAAAAAACCGGCAAACGTAGCACCTCTGCGGCAGTGCTGGAAGCGTTACGTGAAGCTCATCCGATTGTGGAGAAAATTCTGCAATATCGCGAATTGACGAAACTGAAGAGCACCTATATTGATCCGCTGCCAGACTTAATTCACCCCCGTACCGGACGGTTGCATACCCGCTTCAACCAGACCGCGACGGCGACAGGGCGGCTGAGTAGCAGCGATCCGAACCTGCAAAACATTCCCGTGCGTACCCCGCTGGGTCAGCGTATTCGCCGTGCTTTCATTGCCGAGGAAGGCTGGCTGCTGGTCGCGCTGGACTACTCGCAAATCGAATTGCGTGTGTTGGCCCACCTGTCGGGCGACGAAAACTTAATACGCGTGTTTCAAGAAGGTCGTGACATACATACTGAAACCGCGTCCTGGATGTTTGGAGTCCCACGGGAGGCTGTCGATCCTCTTATGCGTCGTGCCGCCAAAACAATTAACTTCGGAGTTCTGTACGGCATGTCGGCACATCGTTTATCACAGGAACTGGCGATTCCGTATGAAGAAGCGCAGGCCTTCATAGAACGTTATTTCCAATCATTCCCCAAGGTGCGGGCCTGGATTGAGAAGACCCTGGAAGAGGGCCGTCGTCGTGGCTATGTAGAGACTCTGTTCGGACGTCGGCGGTATGTACCCGATCTTGAGGCCCGTGTGAAGTCCGTTCGTGAGGCAGCAGAACGTATGGCGTTTAACATGCCAGTCCAGGGCACAGCGGCGGACCTGATGAAATTAGCTATGGTTAAGCTGTTTCCGCGTTTGGAAGAAATGGGCGCTCGTATGCTGTTACAGGTTCATGACGAGTTAGTATTAGAAGCACCGAAGGAGCGTGCCGAAGCCGTGGCCCGGTTAGCCAAAGAGGTAATGGAAGGCGTCTACCCCCTTGCAGTCCCGCTTGAAGTCGAAGTTGGCATAGGGGAAGACTGGTTATCTGCGAAGGAATAA(SEQ ID NO.:6)

TMu_F：5'GGAGAGGAGCGCCTGTTGTGGTTGT 3'(SEQ ID NO.:7)

TMu_R：5'TTATTCCTTCGCAGATAACCAGTCT 3'(SEQ ID NO.:8)

PCR反应体系及程序：

95℃3分钟,(95℃30秒,60℃30秒，68℃2分钟)X25次循环，68℃5分钟，4℃保存

PCR产物用BsmBI及XhoI酶切，然后连接经BsmBI及XhoI酶切的Taq(1-423)-pET28质粒，连接产物转化BL21(DE3)表达宿主菌，统计转化子数量。

实施例2：Taq酶突变体的表达及定向进化筛选

Taq酶突变质粒转化BL21(DE3)表达菌株，诱导表达出Taq酶突变库。将含有Taq酶突变库的BL21(DE3)诱导表达菌用乳液PCR体系分散包裹，进行PCR反应，扩增出含有Taq酶突变片段的DNA。然后把乳液PCR扩增出来的DNA片段用Taq酶特异引物进行高保真PCR二次扩增，将扩增的DNA产物重新克隆至pET28a表达载体中，完成一次筛选过程。之后重复进行乳液PCR-二次高保真PCR-克隆至pET28a表达载体的筛选过程，同时逐步缩短每次筛选中乳液PCR的延伸时间，使具有高延伸活性和高扩增活性的突变体群体得到累积。具体步骤如下：

1)取实施例1转化得到的转化子，接种至LB培养基中，37℃震荡培养6小时，加入终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导培养3小时。离心收集菌体，用ddH₂O洗涤菌体两次，最后用ddH₂O重悬菌体，测定菌体溶液在600nm处的光吸收值(OD600值)，用ddH2O将终浓度稀释至OD600＝1.0

2)配制油相溶液

Tween-80 200ul

Triton X-100 25ul

Mineral oil 10ml

以上3种试剂合并，混合均匀

3)水相反应液的配制

将步骤1)配制好的OD600＝1.0的菌体重悬液，用ddH2O稀释100倍，配制以下反应液

/>

pET28_F引物：TACGGTTAACCCTTTGAATCA(SEQ ID NO.:9)

pET28_R引物：GTTACCTGGTTAAACTGTACT(SEQ ID NO.:10)

4)乳液体系的制备

取200ul水相+400ul油相在2ml管中混合，在漩涡振荡器上高速振荡10分钟，取5个PCR管，每个分装100ul混合液，P℃R程序：95℃5分钟，(95℃30秒、55℃30秒、72℃2分钟)X25次循环、72℃5分钟，4℃∞

5)将乳液PCR产物转移至1.5ml管，加入166ul水饱和乙醚，漩涡振荡30秒，12000rpm离心10分钟，转移走下层液相，室温静置10分钟待乙醚挥发，采用酚氯仿法抽提纯化液相产物，然后乙醇沉淀过夜回收产物。

6)高保真PCR二次扩增产物

以步骤4)产物为模板，进行PCR二次扩增

PCR程序如下：95℃5分钟，20次循环X(95℃30秒、62℃30秒、72℃2分钟)72℃5分钟、4℃∞

Taq_F引物：ATGCGTGGCATGCTGCCGCTTTTCGAGCCTAAGGGACG(SEQ ID NO.:11)

Taq_R引物：TTCCTTCGCAGATAACCAGTCTTCCCCTATGCCAACTTCGAC(SEQ ID NO.:12)

7)PCR产物用DNA产物纯化回收试剂盒纯化，然后重新连接pET28a表达载体。至此完成一轮筛选

8)将重新连接pET28a载体的转化子重复步骤(1)-(6)，按下表的程序改变乳液PCR的条件，对突变库逐步添加选择压力

第二轮筛选：95℃5分钟，(95℃30秒、55℃30秒、72℃1.5分钟)X 25次循环、72℃5分钟，4℃∞

第三轮筛选：95℃5分钟，(95℃30秒、55℃30秒、72℃1分钟)X 20次循环、72℃5分钟，4℃∞

第四轮筛选：95℃5分钟，(95℃30秒、55℃30秒、72℃30秒)X 15次循环、72℃5分钟，4℃∞

经4轮筛选后，所得的Taq酶突变体转化子进入实施例3的高通量筛选

实施例3：Taq酶突变体的高通量筛选

从实施例2得到的突变库中随机挑取384个单克隆，经培养及诱导表达后，用高通量PCR反应测试其扩增活性，从中挑选出20个具有高扩增活性的突变体。具体步骤如下：

1)挑取384个单克隆，接种到LB培养基中，37℃培养6小时，加入终浓度0.1mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃诱导培养3小时

2)离心收集诱导培养后菌体，加入含0.1mg/ml溶菌酶的裂解液(50Mm Tris，50MmNaCl，5％甘油pH8.5)，重悬菌体，37℃孵育10分钟，75℃加热30分钟。然后12000rpm离心10分钟，取上清液。

3)取96孔PCR板，每孔加入以下反应组分

PCR程序：95℃5分钟，20次循环X(95℃30秒、62℃30秒、72℃60秒)、4C∞

PCR产物取5ul进行琼脂糖凝胶电泳，对比各单克隆制备的上清液的PCR产物的产量，选出产量最高20个单克隆。各突变体的扩增产量是野生型扩增产量的1.2倍制2倍。

实施例4：优势Taq酶突变体突变位点的确认

对实施例3选出的Taq酶突变体进行的DNA序列测序，确定其氨基酸序列的突变情况，统计高频突变位点及其突变的形式。

表1

/>

对扩增活性较好的20个突变体进行测序，统计其氨基酸突变情况如上表，可见：V453、F495、E507、K508、T509、A518、S624、Y672、E734、R737、F749、T757、L764、H785在20个突变体高频重复出现，证明其突变对Taq酶的扩增活性有显著的影响。

实施例5经突变改造后的Taq酶与野生型Taq酶的对比

取Taq酶突变体1，经表达纯化后，与野生型Taq酶进行以下扩增能力测试：

/>

PCR程序：95℃5分钟，n次循环X(95℃15秒、55℃15秒、72℃10秒)、4C∞

配制以上反应液，PCR扩增15、20、25、30个循环，乙醇沉淀纯化PCR产物，测定产物在260nm处的光吸收值，计算各循环次数所对应的PCR产物的总量(ng)。结果如下：

表2

/>

从以上结果可见，Taq酶突变体1至20在同等PCR循环次数下扩增得到的产物量比野生型Taq酶有显著的提高。其中，突变体1扩增20个循环时得到的产物量已经跟野生型Taq酶扩增30个循环所得的产物量相当；在同为30个扩增循环的条件下，突变体1获得产物量达到了野生型Taq酶产物量的2.5倍多。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种突变的DNA聚合酶，其特征在于，所述突变的DNA聚合酶在SEQ ID NO.2所示的野生型DNA聚合酶基础上进行突变，所述突变是：第508位氨基酸残基突变为L、第453位氨基酸残基突变为A和第737位氨基酸残基突变为K。

2.如权利要求1所述的DNA聚合酶，其特征在于，所述突变的DNA聚合酶的活性是野生型DNA聚合酶的至少1.2倍；优选地至少1.5倍。

3.一种多核苷酸分子，其特征在于，所述多核苷酸分子编码权利要求1所述的突变的DNA聚合酶。

4.一种载体，其特征在于，所述载体含有权利要求3所述的多核苷酸分子。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的载体或染色体整合有权利要求3所述的多核苷酸分子。

6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

7.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞为大肠杆菌细胞。

8.如权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母细胞。

9.一种制备权利要求1所述的突变的DNA聚合酶的方法，其特征在于，包括步骤：

(i)在适合的条件下，培养权利要求5的宿主细胞，从而表达出所述的突变的DNA聚合酶；和

(ii)分离所述的突变的DNA聚合酶。

10.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的突变的DNA聚合酶。