CN118291421A - Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用，涉及生物技术领域。本发明具体公开了具有如SEQ ID No:2至SEQ ID No:7任一项中第10至841位所示的氨基酸序列的Taq DNA聚合酶突变体。相比于野生型Taq DNA聚合酶，本发明中的Taq DNA聚合酶突变体具有更高的比酶活力以及更高的热稳定性，在长片段扩增、DNA模板具有高级结构的PCR扩增反应等PCR反应领域中具有更好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及Taq DNA聚合酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术
PCR技术是应用最广泛的核酸检测方法之一。其要求DNA聚合酶具有较好的耐热性、热稳定性以及快的聚合速度，以保证能在PCR扩增过程中进行长时间的反应，从而得到准确的扩增结果。相关技术中，Taq DNA聚合酶虽可耐受相对较高的温度，但是在90℃以上时，其半衰期明显缩短。当需要长时间高温使具有二级结构和富含GC序列的DNA模板变性时，Taq DNA聚合酶的活性会变低，使得反应难以进行。同样，在扩增长片段模板时，需要添加更多的Taq DNA聚合酶，以供长时间孵育。因此，Taq DNA聚合酶难以满足科研、医疗诊断等方面的要求。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出Taq DNA聚合酶突变体，相比于野生型Taq DNA聚合酶，其具有更高的比酶活力以及更高的热稳定性。
本发明还提供与上述Taq DNA聚合酶突变体相关的生物材料。
本发明还提供一种酶制剂。
本发明还提供上述Taq DNA聚合酶突变体的制备方法。
本发明还提供一种扩增DNA分子的方法。
本发明还提供上述Taq DNA聚合酶突变体、生物材料或酶制剂相关的应用。
本发明还提供一种核酸扩增试剂盒。
根据本发明的第一方面实施例的一种Taq DNA聚合酶突变体，所述Taq DNA聚合酶突变体相比于野生型Taq DNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：R110K、A141G、V453T、F475H、R492K、E507H；所述野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
根据本发明实施例的Taq DNA聚合酶突变体，至少具有如下有益效果：
相比于野生型Taq DNA聚合酶，本发明中的Taq DNA聚合酶突变体具有更高的比酶活力，聚合速度更快；且其热稳定性比野生型Taq酶高5％～30％，在95℃下热处理1h后仍能保留至少40％的酶活力，在长片段扩增、DNA模板具有高级结构的PCR扩增反应等PCR反应领域中具有更好的应用前景。
根据本发明的一些实施例，所述Taq DNA聚合酶突变体具有A1)至A7)中的任一种：
A1)、如SEQ ID No:2第10至841位所示的氨基酸序列；
A2)、如SEQ ID No:3第10至841位所示的氨基酸序列；
A3)、如SEQ ID No:4第10至841位所示的氨基酸序列；
A4)、如SEQ ID No:5第10至841位所示的氨基酸序列；
A5)、如SEQ ID No:6第10至841位所示的氨基酸序列；
A6)、如SEQ ID No:7第10至841位所示的氨基酸序列；
A7)、在A1)至A6)任一项所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签序列得到的氨基酸序列。
根据本发明的一些实施例，A7)中，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列如SEQID No:2至SEQ ID No:7任一项所示。
根据本发明的一些实施例，所述Taq DNA聚合酶突变体还可以具有如A1)至A6)任一项所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个残基获得的氨基酸序列，且功能与具有A1)至A6)任一项所示的氨基酸序列的蛋白质功能(如热稳定性、PCR扩增性能等)相同或相似。其与A1)至A6)任一项所示的氨基酸序列具有至少90％同一性。例如：可以为90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。
根据本发明的一些实施例，所述标签序列包括利于Taq DNA聚合酶突变体的溶解、纯化和检测的标签序列中的至少一种。可以理解的是，本发明的Taq DNA聚合酶突变体可以包含一个或多个标签序列；多个标签序列可以包含多个相同标签序列的组合，也可以为多个不同标签序列的组合。例如：利于Taq DNA聚合酶突变体溶解的标签包括但不限于nus标签序列或麦芽糖结合蛋白标签序列；利于Taq DNA聚合酶突变体纯化的标签包括但不限于strep标签序列、His标签序列、GST标签序列、pelB信号标签序列或ompA信号标签序列；利于Taq DNA聚合酶突变体检测的标签包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)标签序列、β-半乳糖苷酶标签序列、萤光素酶标签序列、绿色荧光蛋白(GFP)标签序列、HcRed标签序列、DsRed标签序列或青色荧光蛋白(CFP)标签序列。所述标签具体可以为His标签序列。
根据本发明的一些实施例，所述Taq DNA聚合酶突变体的比酶活力相对于野生型Taq DNA聚合酶提高1～1.8倍。
根据本发明的一些实施例，所述Taq DNA聚合酶突变体在95℃热处理1h后酶的剩余活力不低于40％。
根据本发明的第二方面实施例的与本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体相关的生物材料，所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
根据本发明的一些实施例，所述核酸分子具有B11)至B18)中任一种：
B11)、如SEQ ID No:9所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID No:10所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID No:11所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、如SEQ ID No:12所示的核苷酸序列的DNA分子；
B15)、如SEQ ID No:13所示的核苷酸序列的DNA分子；
B16)、如SEQ ID No:14所示的核苷酸序列的DNA分子；
B17)、与SEQ ID No:9至SEQ ID No:14任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码上述Taq DNA聚合酶突变体的DNA分子；
B18)、在严格条件下与B11)至B17)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码上述TaqDNA聚合酶突变体的DNA分子。
根据本发明的一些实施例，所述严格条件可以为在2×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min；或在0.5×SSC，0.1％ SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
根据本发明的一些实施例，所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述Taq DNA聚合酶突变体的DNA。该DNA不但可包括启动所述Taq DNA聚合酶突变体基因转录的启动子，还可包括终止所述Taq DNA聚合酶突变体基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
根据本发明的一些实施例，载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
根据本发明的一些实施例，所述重组载体可以为在所述载体的多克隆位点插入编码所述Taq DNA聚合酶突变体的核酸分子得到的重组载体。
根据本发明的一些实施例，生物细胞包括原核细胞和真核细胞。所述原核细胞包括细菌或藻。所述真核细胞包括真菌、哺乳动物细胞或昆虫细胞。其中，所述细菌可以为大肠杆菌，如E.coli DH5α或E.coli JM109。所述重组生物不包含生殖材料。
根据本发明的一些实施例，所述重组生物细胞为向生物细胞中导入B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体，得到的重组生物细胞。具体可以为向E.coli DH5α或E.coli JM109中导入重组载体得到的重组大肠杆菌。
根据本发明的第三方面实施例的一种酶制剂，包括本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体。
根据本发明的一些实施例，所述酶制剂还包括PCR预混液。
根据本发明的一些实施例，所述PCR预混液包括Tris-HCl、NH4 +、K+、Mg2+、Triton X-100、dNTPs中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述NH4 +的来源为铵盐。所述铵盐包括有机铵盐(包括但不限于乙酸铵)、无机铵盐(包括但不限于(NH4)2SO4、NH4Cl或其组合)中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述K+的来源包括氯化钾、乙酸钾、硫酸钾中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述Mg2+的来源包括氯化镁、乙酸镁、硫酸镁中的至少一种。
根据本发明的一些实施例，所述PCR预混液包括100～150mmol/L Tris-HCl、15～25mmol/L K+、4～6mmol/L NH4 +、1.5～2.5mmol/L Mg2+、0.02～0.03％(v/v)Triton X-100、150～250μmol/L dNTPs。例如：所述PCR预混液可以包括120mmol/L Tris-HCl、20mmol/LKCl、5mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgCl2、0.025％(v/v)Triton X-100、200μmol/L dNTPs。
根据本发明的一些实施例，所述PCR预混液的pH为8.5～9.2。
可以理解的是，所述PCR预混液以不影响所述融合DNA聚合酶的活性为宜。
根据本发明的第四方面实施例的本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，包括：
将本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述Taq DNA聚合酶突变体。
根据本发明的一些实施例，所述生物细胞包括原核细胞和真核细胞。
根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括细菌或藻。其中，所述细菌可以为大肠杆菌(如：E.coli JM109)。
根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括真菌(如酵母)、哺乳动物细胞(如HEK293细胞)或昆虫细胞。
根据本发明的第五方面实施例的一种扩增DNA分子的方法，包括：以下步骤：
采用本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体对所述DNA分子进行扩增。
根据本发明的一些实施例，具体可以包括以下步骤：
将所述Taq DNA聚合酶突变体、所述DNA分子(模板DNA)、引物与反应预混液混合，反应。
根据本发明的第六方面实施例的应用。
根据本发明的一些实施例，所述应用为C1)至C3)任一项在制备核酸扩增产品中的应用；
C1)、本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体；
C2)、本发明第二方面实施例中所述的生物材料；
C3)、本发明第三方面实施例中所述的酶制剂。
根据本发明的一些实施例，所述应用为本发明第一方面实施例中所述的Taq DNA聚合酶突变体或本发明第三方面实施例中所述的酶制剂在核酸扩增中的应用。
根据本发明的一些实施例，所述核酸扩增具体可以为聚合酶链式反应。
根据本发明的第七方面实施例的一种核酸扩增产品，包括上述Taq DNA聚合酶突变体或上述酶制剂。
本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。
附图说明
图1为Taq DNA聚合酶突变体Taq-mt(A)、Taq-m1(B)、Taq-m2(C)、Taq-m3(D)、Taq-m4(E)、Taq-m5(F)和Taq-m6(G)的表达纯化结果图；M为蛋白marker，泳道1～11分别为样本1～11；
图2是野生型Taq DNA聚合酶(A)以及Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1(B)、Taq-m2(C)、Taq-m3(D)、Taq-m4(E)、Taq-m5(F)和Taq-m6(G)的相对酶活检测结果；
图3为野生型Taq DNA聚合酶(A)以及Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1(B)、Taq-m2(C)、Taq-m3(D)、Taq-m4(E)、Taq-m5(F)和Taq-m6(G)的热稳定性检测结果；
图4为野生型Taq DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1至Taq-m6的PCR扩增性能检测结果；其中，泳道M为DNA marker，泳道1-2为野生型Taq DNA聚合酶，泳道3-4为TaqDNA聚合酶突变体Taq-m1，泳道5-6为Taq DNA聚合酶突变体Taq-m2，泳道7-8为Taq DNA聚合酶突变体Taq-m3，泳道9-10为Taq DNA聚合酶突变体Taq-m4，泳道11-12为Taq DNA聚合酶突变体Taq-m5，泳道13-14为Taq DNA聚合酶突变体Taq-m6。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法或产品不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法或产品固有的其它步骤或单元。
除非特别定义，本专利所有的科学或技术专业词汇均与本领域大部分一般人员的普通理解一致。
术语“扩增”指的是目的核酸片段在核酸聚合酶的作用下数目变多的过程。
本发明中，氨基酸序列均是从N端到C端的顺序；核苷酸序列均是从5'端到3'端的顺序。
为获得热稳定性、扩增性能好的DNA聚合酶，对野生型Taq DNA聚合酶(氨基酸序列如SEQ ID No:1所示)进行突变，并进行大量筛选，得到Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1、Taq-m2、Taq-m3、Taq-m4、Taq-m5、Taq-m6。
Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1的氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。Taq DNA聚合酶突变体Taq-m2的氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。Taq DNA聚合酶突变体Taq-m3的氨基酸序列如SEQ ID No:4所示。Taq DNA聚合酶突变体Taq-m4的氨基酸序列如SEQ ID No:5所示。Taq DNA聚合酶突变体Taq-m5的氨基酸序列如SEQ ID No:6所示。Taq DNA聚合酶突变体Taq-m6的氨基酸序列如SEQ ID No:7所示。
编码野生型Taq DNA聚合酶的核苷酸序列如SEQ ID No:8所示。编码Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1的核苷酸序列如SEQ ID No:9所示。编码Taq DNA聚合酶突变体Taq-m2的核苷酸序列如SEQ ID No:10所示。编码Taq DNA聚合酶突变体Taq-m3的核苷酸序列如SEQ IDNo:11所示。编码Taq DNA聚合酶突变体Taq-m4的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示。编码TaqDNA聚合酶突变体Taq-m5的核苷酸序列如SEQ ID No:13所示。编码Taq DNA聚合酶突变体Taq-m6的核苷酸序列如SEQ ID No:14所示。
野生型Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶突变体的表达方法如下：
1、构建表达载体：
根据编码野生型Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1～Taq-m6的核苷酸序列，人工合成DNA分子，并将DNA分子分别通过重叠PCR与PET-32a载体连接，得到重组质粒。将重组质粒分别转化至E.coli DH5α感受态细胞中，通过抗性筛选挑取单菌落进行菌落PCR鉴定，并将鉴定为阳性的单克隆进行测序验证。培养测序验证正确的单克隆，并提取相应的质粒。
2、表达：
将步骤1获得的质粒分别转化至宿主细胞E.coli JM109中，挑取单菌落，分别接种至含50μg/mL氨苄西林的100mL LB培养基中，放置于30℃摇床中震荡培养过夜后，按体积比1:100接种至2L含有50μg/mL氨苄西林的LB培养基中，30℃摇床中震荡培养至0D600为0.6～0.8；加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，30℃继续震荡诱导10～12h；离心收集诱导后菌体并称重，记录菌体湿重，储存于-80℃。
3、纯化：
取诱导表达后-80℃冻存的菌体，按湿重每克菌体加入3mL裂解缓冲液(100mmol/LTris-HCl、0.2mM EDTA，pH7.5)重悬菌体，用高压破碎仪裂解菌体，高压破碎条件为800bar，循环破碎三轮。将裂解后菌体在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液A(样本1)至200mL灭菌烧杯中，弃沉淀A(样本2)。向上清液A中加入固体(NH4)2SO4至(NH4)2SO4终浓度为160mM，搅拌溶解；继续加入10％ PEI至PEI终浓度为0.1％，低速搅拌30min后，在4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液B(样本3)至新的200mL灭菌烧杯中，弃沉淀B(样本4)。将上清液B于75℃恒温水浴锅孵育20min，4℃、12000rpm条件下离心30min，取上清液C(样本5)，弃沉淀C(样本6)；将上清液C通过0.22μm微孔滤膜过滤，将滤液(样本7)转移至新的200mL灭菌烧杯中。
用缓冲液A(50mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、100mM KCl、0.2％ Tween-20，pH7.5)平衡层析柱Ni-NTA Purose 6Fast Flow 6mL(购自嘉兴千纯生物科技有限公司)后，将滤液上样至层析柱中，先用缓冲液A冲洗柱子，再用缓冲液B(50mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、100mMKCl、700mM咪唑、0.2％ Tween-20，pH7.5)进行0％～100％的梯度洗脱，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集洗脱液(样本8)，并将洗脱液透析至缓冲液A中，收集透析液A(样本9)备用。
用缓冲液A平衡层析柱Q Purose 6Fast Flow 6mL(购自嘉兴千纯生物科技有限公司)，将透析液A上样至层析柱中，先用缓冲液A冲洗柱子，再用缓冲液C(50mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、700mM KCl、0.2％ Tween-20，pH7.5)进行0％～100％的梯度洗脱，对洗脱组分进行SDS-PAGE蛋白电泳检测，根据检测结果收集洗脱液(样本10)，并将洗脱液透析至酶保存液(20mM Tris-HCl、0.1mM EDTA、100mM KCl、0.5％(v/v)Tween-20、1mM DTT，50％(v/v)甘油，pH7.5)中，收集透析液B(样本11)，即得纯化后的野生型Taq DNA聚合酶溶液/Taq DNA聚合酶突变体溶液。
样本1～样本11各取30μL，经SDS-PAGE电泳分析纯化结果。结果如图1所示。
纯化得到的野生型Taq DNA聚合酶、Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1～Taq-m6的纯度相近。
实施例1
取适量野生型Taq DNA聚合酶溶液、纯化后的Taq DNA聚合酶突变体溶液，使用Micro BCATM Protein Assay Kit(购自Thermo Fisher Scientific，货号23235)测定其蛋白质浓度。具体操作严格按照说明书进行。并按照以下方法测定其聚合酶活性。
聚合酶活性测定：设计发夹型寡核苷酸序列(Test 1：5'-tagcgaaggatgtgaacctaatcccTGCTCCCGCGGCC GatctgcCGGCCGCGGGAGCA-3')，对纯化后的野生型Taq DNA聚合酶溶液和Taq DNA聚合酶突变体溶液进行的酶活浓度预估，并使用酶保存液对商品DNA聚合酶(购自Thermo Fisher Scientific，货号18038018)、野生型Taq DNA聚合酶溶液和Taq DNA聚合酶突变体溶液分别进行适宜稀释，得到稀释后酶液。向20μL反应体系(25mmol/L Tris-HC1、50mmol/L KCl、5mmol/L(NH4)2SO4、2.5mmol/L MgC12、0.1％ TritonX-100、0.25mmol/LdNTPs、0.5μmol/L Test 1，pH 8.5)中加入5μL稀释后酶液，74℃反应5min，立即置于冰上冷却，并加入EDTA至终浓度为10mM，以终止反应；按体积比1:30加入1×SYBR染液，使用酶标仪进行检测。注意每个稀释倍数配制2个平行，以减少实验误差，同时每次反应配制2个空白对照，以扣除荧光背景。
在一定时间内，根据商品DNA聚合酶不同酶添加量下所得到的产物量建立对照曲线，同时建立待测DNA聚合酶的曲线，对两者斜率的比值进行计算，可用于确定待测DNA聚合酶的酶活。设计一段发夹型寡核苷酸序列，在DNA聚合酶的催化下，dNTPs逐渐渗入，发夹型寡核苷酸序列最终会形成双链DNA产物。SYBR Green I是一种与双链DNA结合的高灵敏度荧光染料，可与双链DNA结合产生荧光信号，其荧光信号强度与双链DNA的浓度呈正相关。通过测定一定时间内的荧光信号值，可计算出待测DNA聚合酶的酶活力值。
结果如图2和表1所示。
表1
与野生型Taq DNA聚合酶相比，Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1～Taq-m6均具有更高的比酶活力，即在相同的蛋白量下具有更高的酶活力值。
实施例2
依照实施例1中的聚合酶活性测定结果，用酶保存液将纯化后的野生型Taq DNA聚合酶溶液、Taq DNA聚合酶突变体溶液分别进行适宜的稀释，取相同体积酶溶液，于95℃下热处理1h，然后参考实施例1中的聚合酶活性测定方法测定各DNA聚合酶的酶活力。以对应未经热处理的野生型Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体作为未处理组。
结果如图3和表2所示。
表2
在95℃下热处理1h后，Taq DNA聚合酶突变体Taq-m1～Taq-m6剩余酶活力均显著高于野生型Taq DNA聚合酶，具有更高的热稳定性。
实施例3
以100ng的HL60 DNA作为模板，用适量野生型Taq DNA聚合酶或各Taq DNA聚合酶突变体扩增大小约1kb的DNA片段。PCR扩增体系(50μL)为：120mmol/L Tris-HC1、20mmol/LKC1、5mmol/L(NH4)2SO4、2mmol/L MgCl2、0.025％(v/v)Triton X-100、200μmol/L dNTPs、0.2μmol/L上游引物PCR-FP-1kb、0.2μmol/L下游引物PCR-RP-1kb、1.25U酶，pH 7.8；
PCR-FP-1kb：5'-TTTACCCTCTTCATCATCTTCC-3’；
PCR-RP-1kb：5'-CAAGCCAGAAGGAGGAACTG-3'。
反应程序为：94℃30s；98℃10s，55℃30s，72℃1min/cycles，共30个循环；72℃1min。
PCR反应结束后使用1％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳检测。
结果如图4所示。
在相同的反应体系下，各Taq DNA聚合酶突变体均可扩增得到大量1kb片段，且条带亮度比野生型Taq DNA聚合酶更强。这说明Taq DNA聚合酶突变体的扩增性能均显著高于野生型Taq DNA聚合酶。
综上可知，Taq DNA聚合酶突变体具有较高的比酶活力以及更高的热稳定性，在长片段扩增、DNA模板具有高级结构的PCR扩增反应等PCR反应领域中具有更好的应用前景。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。
Claims (10)
1.一种Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体相比于野生型Taq DNA聚合酶，包含以下突变位点中的至少一种：R110K、A141G、V453T、F475H、R492K、E507H；所述野生型Taq DNA聚合酶的氨基酸序列如SEQ ID No:1所示。
2.根据权利要求1所述的Taq DNA聚合酶突变体，其特征在于，所述Taq DNA聚合酶突变体具有A1)至A7)中的任一种：
A1)、如SEQ ID No:2第10至841位所示的氨基酸序列；
A2)、如SEQ ID No:3第10至841位所示的氨基酸序列；
A3)、如SEQ ID No:4第10至841位所示的氨基酸序列；
A4)、如SEQ ID No:5第10至841位所示的氨基酸序列；
A5)、如SEQ ID No:6第10至841位所示的氨基酸序列；
A6)、如SEQ ID No:7第10至841位所示的氨基酸序列；
A7)、在A1)至A6)任一项所示的氨基酸序列的中间和/或N端或/和C端连接标签序列得到的氨基酸序列。
3.与权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体相关的生物材料，其特征在于：所述生物材料为B1)至B4)中的任一种：
B1)、编码权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子或B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒或B3)所述重组载体的重组生物细胞。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述核酸分子具有B11)至B18)中任一种：
B11)、如SEQ ID No:9所示的核苷酸序列的DNA分子；
B12)、如SEQ ID No:10所示的核苷酸序列的DNA分子；
B13)、如SEQ ID No:11所示的核苷酸序列的DNA分子；
B14)、如SEQ ID No:12所示的核苷酸序列的DNA分子；
B15)、如SEQ ID No:13所示的核苷酸序列的DNA分子；
B16)、如SEQ ID No:14所示的核苷酸序列的DNA分子；
B17)、与SEQ ID No:9至SEQ ID No:14任一项所示的核苷酸序列具有80％、85％或90％以上的同源性，且编码所述Taq DNA聚合酶突变体的DNA分子；
B18)、在严格条件下与B11)至B17)任一项限定的核苷酸序列杂交，且编码所述Taq DNA聚合酶突变体的DNA分子。
5.一种酶制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体。
6.一种权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体的制备方法，其特征在于，包括：
将权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体的编码基因导入生物细胞中，使所述编码基因得到表达，得到所述Taq DNA聚合酶突变体。
7.一种扩增DNA分子的方法，其特征在于，包括：
采用权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂对所述DNA分子进行扩增。
8.C1)至C3)任一项在制备核酸扩增产品中的应用；
C1)、权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体；
C2)、权利要求3或4所述的生物材料；
C3)、权利要求5任一项所述的酶制剂。
9.权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂在核酸扩增中的应用。
10.一种核酸扩增试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的Taq DNA聚合酶突变体或权利要求5所述的酶制剂。
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN118291421A true CN118291421A (zh) | 2024-07-05 |
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication |