WO2012043601A1 - アマドリアーゼ改変体 - Google Patents

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WO2012043601A1
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amino acid
amadoriase
seq
acid sequence
substituted
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PCT/JP2011/072136
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French (fr)
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浩三 廣川
康子 田鍋
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キッコーマン株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0012—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7)
    • C12N9/0026—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
    • C12N9/0032—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.6, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6893—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to diseases not provided for elsewhere
    • G—PHYSICS
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    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin
    • G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
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    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/04—Endocrine or metabolic disorders
    • G01N2800/042—Disorders of carbohydrate metabolism, e.g. diabetes, glucose metabolism

Definitions

  • the present invention relates to amadoriase with improved preservative resistance, its gene and recombinant DNA, and a method for producing amadoriase with improved preservative resistance.
  • Glycated proteins are produced by non-enzymatic covalent bond formation between the aldehyde group of aldoses (monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups) such as glucose, and Amadori transfer It is.
  • aldehyde group of aldoses monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups
  • Amadori transfer It is.
  • the amino group of the protein include an ⁇ -amino group at the amino terminus and an ⁇ -amino group on the side chain of a lysine residue in the protein.
  • Known glycated proteins generated in vivo include glycated hemoglobin in which hemoglobin in blood is glycated, glycated albumin in which albumin is glycated, and the like.
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • ⁇ -fructosylvalylhistidine (hereinafter referred to as ⁇ FVH)
  • ⁇ FVH amadoriase
  • ⁇ FV ⁇ -fructosylvalylhistidine
  • ⁇ FV ⁇ -fructosyl valine
  • Amadoriase catalyzes a reaction that oxidizes iminodiacetic acid or its derivative (also called “Amadori compound”) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ -ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide. To do.
  • Amadoriase has been found from bacteria, yeasts and fungi, and is particularly useful for the measurement of HbA1c.
  • Examples of amadoriase having enzyme activity against ⁇ FVH and / or ⁇ FV include, for example, the genus Coniochaeta, Eupenicillium ( The genus Eupeniclium, the genus Arthrinium, the genus Curvularia, the genus Leptosphaeria, the genus Neocosmospora, the genus Ophiobolus, the genus Ophiobolus (Cryptococcus) genus, Phaeosphaeria Amadoriases from the genera, Aspergillus, Ulocladium, Penicillium, Acremonium, Debaryomyces have been reported (eg, Patent 1, 5) To 11 and non-patent documents 1 to 5).
  • amadoriases with improved thermostability and / or protease resistance have also been reported (see, for example, Patent Document 12 and Non-Patent Document 6).
  • amadoriase may be described by expressions such as ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, and fructosylamine oxidase depending on the literature.
  • kits also referred to as test reagents, clinical test reagents, reagent kits, etc.
  • a reagent in powder or lyophilized state is provided and dissolved by the user at the time of use, while other types of products are more easily distributed in a solution state.
  • biochemical testing kits are mainly provided in the form of solutions.
  • the liquid kit has the advantage that it can be used for measurement as it is, and the advantage of avoiding blurring of the composition due to mistakes in the user's dissolution operation, while the growth of microorganisms (microbe contamination) during storage of the reagent. It has a problem that it is likely to occur. For this reason, generally, preservatives are often added to liquid kits for the purpose of suppressing the growth of microorganisms. For example, as the preservative used for such purposes, various isothiazoline-based preservatives are often used.
  • isothiazoline compounds include 2-methylisothiazone, 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazolin-3-one, and 5-chloro-2-methyl-4-isothiazoline-3.
  • preservatives of commercially available isothiazoline compounds containing these components include procrine (manufactured by Spellco, sold by Sigma Aldrich Japan), actiside (manufactured by Sor Japan), etc. Can be mentioned.
  • amadoriases have low resistance to preservatives of these isothiazoline compounds and are known to be destabilized by coexistence with these preservatives, these isothiazolines
  • amadoriase that can be suitably used in a reagent kit for clinical chemistry tests that contains a preservative of a compound of the type.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide an amadoriase excellent in preservative resistance, which can be suitably used in a reagent kit for clinical chemistry tests containing a preservative of an isothiazoline compound.
  • the present invention is as follows.
  • the cysteine residue at position 97 in the amino acid sequence constituting the parent protein having amadoriase activity represented by the following (g) or (h) is substituted with serine, asparagine, or alanine Amadoriase, a modified protein: (G) a protein comprising the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9 and having amadoriase activity; and (h) an amino acid other than the cysteine residue at position 97 in the amino acid sequence of (g) A protein consisting of amino acids in which one or several amino acids are deleted, substituted or added, and having amadoriase activity.
  • a host cell comprising the recombinant vector according to (6) above.
  • a method for producing amadoriase which comprises the following steps: (I) culturing the host cell according to (7) above; (Ii) expressing the amadoriase gene contained in the host cell; and (iii) isolating the amadoriase from the culture.
  • kits for use in the measurement of glycated hemoglobin comprising the amadoriase according to any one of (1) to (4) above.
  • a preservative that is hardly destabilized in a clinical chemistry test reagent kit containing a preservative of an isothiazoline-based compound can be advantageously used as a diagnostic enzyme for diabetes, and in a measurement kit for a diabetic marker. It is possible to provide an amadoriase having excellent resistance.
  • Amadoriase is also called ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, or fructosylamine oxidase, which oxidizes iminodiacetic acid or its derivative (Amadori compound) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ - It refers to an enzyme that catalyzes a reaction that produces ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide.
  • Amadoriase is widely distributed in nature and can be obtained by searching for microorganisms, enzymes of animal or plant origin. The microorganism can be obtained from, for example, filamentous fungi, yeast, or bacteria.
  • amadoriase of the present invention is a modified version of amadoriase with improved resistance to preservatives of isothiazoline compounds produced based on the amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9.
  • mutants include high sequence identity with SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9 (eg, 75% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, more preferably Amadoriase having an amino acid sequence having 90% or more, most preferably 95% or more), and in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9, one to several amino acids are altered or mutated, or Mention may be made of amadoriases having amino acid sequences which are deleted, substituted, added and / or inserted.
  • Eupenicillium genus may be produced based on amadoriase derived from other species.
  • FIG. 1 is a diagram showing alignments illustrating homology in amino acid sequences of various known amadoriases.
  • the abbreviation in a figure shows the microorganism name derived from various amadoriases, and is specifically as follows; “Co” Coniochaeta sp .; “Et” Eupenicillium terrenum; “Py” Pyrenochaeta sp .; “Ar” Arthrinium “Cc” Curvularia clavata; “Nv” Neocosmospora vasinfecta; “Cn” Cryptococcus neoformans; “Pn” Phaeosphaeria nodorum; “An” Aspergillus nidulans; “Ul” Ulocladium sp .; “Pj” Penicillium
  • amadoriase gene (Acquisition of gene encoding amadoriase)
  • amadoriase gene In order to obtain the gene of the present invention encoding these amadoriases (hereinafter also simply referred to as “amadoriase gene”), generally used gene cloning methods are used.
  • chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells having the ability to produce amadoriase and various cells by a conventional method, for example, a method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989).
  • cDNA can be synthesized using mRNA as a template.
  • a chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized, and using this, a method for selecting the amadoriase gene from a chromosomal DNA or cDNA library, or a suitable primer DNA based on the amino acid sequence. And amplifying DNA containing the gene fragment of interest encoding amadoriase by an appropriate polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR method) such as 5'RACE method or 3'RACE method. Can be ligated to obtain a DNA containing the full length of the target amadoriase gene.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • a preferred example of the gene encoding the amadoriase obtained in this way is the Amadoriase gene derived from the genus Coniocaeta (see Patent Document 7). Furthermore, as a preferable example, the Amadoriase gene derived from the genus Koniochaeta, which has been improved in heat resistance and / or protease resistance by introducing amino acid substitution (see Patent Document 12 and Non-Patent Document 6), and the like.
  • amadoriase genes are linked to various vectors as usual.
  • QIAGEN manufactured by Qiagen
  • pKK223-3-CFP-T7 a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 (see Patent Document 12 and Non-patent Document 6) containing a DNA encoding the amadoriase gene derived from Coniochaeta sp. NISL 9330.
  • DNA encoding an amadoriase gene can be obtained by extraction and purification.
  • plasmid pKK223-3-CFP-T7 is an independent administrative institution, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, located at 1st, 1st East, 1st Street, Tsukuba City, Ibaraki, Japan (Postal Code 305-8566) on March 31, 2006. Deposited at the Institute for Patent Biological Deposits and assigned the deposit number FERM BP-10593.
  • the vector that can be used in the present invention is not limited to the above plasmid, and any other vector known to those skilled in the art, such as bacteriophage and cosmid, can be used. Specifically, for example, pKK223-3 (Pharmacia) is preferable.
  • amadoriase gene mutation treatment The mutation process of the amadoriase gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a wide variety of methods such as a method of contacting and acting an amadoriase gene or a recombinant DNA incorporating the gene and a mutagen agent; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method. Can be used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for the contact and action are not particularly limited as long as it is possible to adopt conditions according to the type of drug used and the like and a desired mutation can be actually induced in the amadoriase gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • a reaction temperature 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • Even in the case of performing ultraviolet irradiation it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, 24-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985), Eckstein method (Nucleic Acid Res. 49 (Nucleic Acid Res. 49)). (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986), Kunkel method (Proc. Natl. Acid. Sci. US, 48, 1982). ): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • a technique known as a general PCR method can also be used (see Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified amadoriase gene can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • the amadoriase gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and a host corresponding to each vector is selected by a conventional method.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia as a host for example, using the obtained recombinant DNA, for example, Escherichia coli K-12 strain, preferably Escherichia coli JM109 strain, Escherichia coli DH5 ⁇ strain (both manufactured by Takara Bio Inc.), etc. Transform or transduce them to obtain the respective strain.
  • JM109 pKK223-3-CFP-T9-C97S
  • JM109 pKK223-3-CFP-T9-C97S
  • Amino acid sequence homology can be calculated using GENETYX-Mac (Software Development) 's maximum matching and search homology programs, or DNASIS Pro (Hitachi Software)' s maximum matching and multiple alignment programs. .
  • the “position corresponding to a specific amino acid of SEQ ID NO: 1” refers to a position in the amino acid sequence of an amadoriase derived from another species corresponding to the position of the specific amino acid of the amino acid sequence of Amadoriase shown in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid sequences are compared using a known algorithm such as the Lippman-Person method, and the maximum homology to conserved amino acid residues present in the amino acid sequences of each amadoriase It can be done by giving sex.
  • a known algorithm such as the Lippman-Person method
  • the maximum homology to conserved amino acid residues present in the amino acid sequences of each amadoriase It can be done by giving sex.
  • aligning and comparing the amino acid sequences of amadoriase in this way alignment can be performed to determine the position of homologous amino acid residues in each amadoriase sequence, regardless of insertion or deletion in the amino acid sequence. Is possible.
  • Corresponding homologous positions are considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be presumed that they have a similar effect on the specific function of the target amadoriase.
  • FIG. 1 shows an alignment of sequences of amadoriases from various species.
  • the position in the amino acid sequence of the amadoriase derived from another species corresponding to the amino acid at a specific position in the amino acid sequence of the amadoriase of a certain species such as amadoriase derived from the genus Coniochaeta can be known from FIG. Fig.
  • FIG. 1 shows an amadoriase derived from the genus Coniocaeta, an amadoriase derived from Eupenicillium terrenum, a ketoamine oxidase derived from Pyrenochaeta sp., A ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp., A ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, and a ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta Amino acid sequences of fructosyl amino acid oxidase from Cryptococcus neoformans, fructosyl peptide oxidase from Phaeosphaeria nodorum, fructosyl amino acid oxidase from Aspergillus nidulans, fructosyl amino acid oxidase from Ulocladium sp. And fructosyl amino acid oxidase from Penicillium jan
  • the amino acid at “position corresponding to cysteine at position 97 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9” is the determined amino acid sequence of amadoriase, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence of the amadoriase from the genus Coniochaeta shown in No. 3 or the cysteine at position 97 of the amadoriase of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 9 when compared with the amadoriase from the genus Eupenicillium shown in SEQ ID No. 9 Means an amino acid corresponding to
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-described method of specifying the “amino acid residue at the corresponding position”.
  • C97 indicated by an arrow in FIG. 1 is an amino acid “position corresponding to cysteine at position 97 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9” in the amadoriase derived from the organism shown in FIG. Indicates.
  • the amino acid “position corresponding to the methionine at position 302 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9” means the confirmed amino acid sequence of amadoriase, the amino acid of the amadoriase derived from the genus Eupenicillium shown in SEQ ID NO: 9 It means the amino acid corresponding to methionine at position 302 of the amadoriase of SEQ ID NO: 9 when compared with the sequence.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-described method of specifying the “amino acid residue at the corresponding position”.
  • M302 indicated by an arrow in FIG. 1 indicates an amino acid “position corresponding to methionine at position 302 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 9” in the amadoriase derived from the organism shown in FIG.
  • the amino acid “position corresponding to cysteine at position 360 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9” is the determined amino acid sequence of amadoriase, SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO:
  • the amino acid sequence of the amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in No. 3 or the cysteine at position 360 of the amadoriase of SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 3 or SEQ ID No. 9 when compared with the amadoriase derived from the genus Eupenicillium shown in SEQ ID No. 9 Means an amino acid corresponding to
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-described method of specifying the “amino acid residue at the corresponding position”.
  • C360 indicated by an arrow in FIG. 1 is an amino acid “position corresponding to cysteine at position 360 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9” in the amadoriase derived from the organism shown in FIG. Indicates.
  • one or several amino acids in the amino acid sequence of the amadoriase are altered or mutated, or deleted, substituted, added and / or inserted. It has an amino acid sequence.
  • “1 or several” means 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, or 1. Modification or mutation of the amino acid, or deletion, substitution, addition and / or insertion results in improved preservative resistance.
  • amadoriase with improved resistance to preservatives of isothiazoline compounds is, for example, an amino acid modified or mutated, deleted, or substituted in the amino acid sequence of the amadoriase shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9. , And / or by insertion.
  • substitution of the amino acid at the position corresponding to cysteine at position 97 of the amino acid sequence of Amadoriase shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9 with serine, asparagine or alanine, Amadoriase shown in SEQ ID NO: 9 Substitution of the amino acid at the position corresponding to methionine at position 302 of the amino acid sequence of the amino acid sequence of serine of amino acid at the position corresponding to cysteine at position 360 of the amino acid sequence of the amadoriase shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 9 The substitution to is mentioned.
  • the amino acid at the position corresponding to the specific amino acid of the specific amino acid sequence has the meaning as defined above, and in accordance with the definition, in the amino acid of the amadoriase derived from various organisms, each of the specific amino acids of the specific sequence
  • the amino acid at the corresponding position can be identified.
  • the amino acid at position 97 of the amino acid sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 and SEQ ID NO: 9 is cysteine
  • the amino acid at the position corresponding to the cysteine at position 97 is a fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans. Is the valine at position 96 (“C97” in FIG. 1).
  • valine at position 96 is serine, asparagine or alanine. Is replaced.
  • the amadoriase mutant with improved resistance to the preservative of the isothiazoline compound of the present invention has amino acid substitutions that result in improved resistance to the preservative of the above isothiazoline compound, and other than those substituted amino acids.
  • amino acid substitutions that result in improved resistance to the preservative of the above isothiazoline compound, and other than those substituted amino acids.
  • amino acids are deleted, inserted, added and / or substituted.
  • Amadoriase mutants that have an amino acid sequence have amadoriase activity, and have improved resistance to preservatives of isothiazoline compounds.
  • it is 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 97% or more, particularly preferably with respect to the amino acid sequence of the portion excluding the amino acid that brings about improvement in resistance to the preservative of the above isothiazoline-based compound.
  • It includes an amadoriase variant comprising an amino acid sequence having an amino acid sequence identity of 99% or more, having amadoriase activity, and having improved resistance to an antiseptic of an isothiazoline compound.
  • C97S a mutation in which the 97th cysteine (C) is substituted with serine (S) is represented as C97S.
  • this strain may be cultured by a normal solid culture method. It is preferable to employ the liquid culture method as much as possible.
  • Examples of the medium for culturing the above strain include, for example, yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor or one or more nitrogen sources such as soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, dihydrogen phosphate. Add one or more inorganic salts such as potassium, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • Culturing is carried out at a culture temperature of 20 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of around 37 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of around 37 ° C. for 4 to 8 hours, aeration / agitation deep culture, shaking culture, and stationary. It is preferably carried out by culturing or the like.
  • the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • a normal enzyme collecting means For example, the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone or the like is added thereto.
  • the fraction is collected and the precipitate is collected to obtain a crude enzyme of amadoriase.
  • an amadoriase purified enzyme preparation further from the above crude amadoriase enzyme, for example, gel filtration method using Sephadex, Superdex, Ultrogel, etc .; adsorption elution method using ion exchanger; electrophoresis using polyacrylamide gel, etc.
  • Method Adsorption elution method using hydroxyapatite; Precipitation method such as sucrose density gradient centrifugation; Affinity chromatography method; Fractionation method using molecular sieve membrane or hollow fiber membrane, etc.
  • amadoriase of the present invention obtained by the means as described above has improved resistance to preservatives of isothiazoline compounds as a result of mutations in the amino acid sequence due to genetic modification or the like, as compared to those before modification. It is characterized by that.
  • the degree of “resistance to the preservative of the isothiazoline compound” in the present invention is determined by the amadoriase of the present invention (that is, an amadoriase variant in which an amino acid at a position corresponding to a predetermined position is substituted) ) And the amadoriase before the amino acid substitution is introduced into a suitable buffer containing an isothiazoline-based compound preservative, respectively, and the residual activity ratio after treatment at a constant temperature for a certain time (%) ).
  • the residual activity rate (a) of the amadoriase of the present invention is a buffer solution containing a preservative of an isothiazoline compound with respect to an activity value after being treated at a constant temperature for a predetermined time in a buffer solution containing no preservative of the isothiazoline compound. It is the ratio of the activity value after processing at a constant temperature for a certain time.
  • the residual activity rate (b) of the amadoriase before introducing the characteristic substitution into the amadoriase of the present invention is the activity after treatment at a constant temperature for a certain time in a buffer solution containing no preservative of isothiazoline compounds.
  • the residual activity rate (a) of the amadoriase of the present invention under a predetermined condition is the residual activity rate obtained for the amadoriase before introducing a characteristic substitution to the amadoriase of the present invention under the same condition.
  • the relationship of (a)> (b) is satisfied, preferably (a) / (b) is 1.2 or more, more preferably 1.5 or more, still more preferably 2 or more, Most preferably, it is 3 or more.
  • the resistance of the isothiazoline-based compound to the preservative can be evaluated from the above-described numerical value (a).
  • (a) is preferably 50% or more, preferably 60% or more, more preferably 70% or more, still more preferably 80% or more, and most preferably 90% or more.
  • the types of preservatives of isothiazoline compounds targeted by the amadoriase of the present invention can include various preservatives used in a kit for measuring glycated hemoglobin.
  • preservatives of isothiazoline compounds often used in such applications 2-methylisothiazone, 2-methyl-4-isothiazolin-3-one, 1,2-benzisothiazoline-3-one, 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one and the like.
  • Examples of preservatives of isothiazoline compounds that are generally commercially available include Procrine 150 (manufactured by Spellco, sold by Sigma Aldrich Japan), Procrine 200 (manufactured by Spellco, sold by Sigma Aldrich Japan), Procrine 300 (manufactured by Spellco) Sigma (manufactured by Sigma-Aldrich Japan), MIT (manufactured by Roche, Sigma), Actiside MBS (manufactured by So Japan), Actiside B20 (N) (manufactured by So Japan) and the like.
  • the concentration of the preservative of the isothiazoline-based compound targeted by the amadoriase of the present invention can be various concentrations within the range that can be used in the kit for measuring glycated hemoglobin.
  • the optimal concentration of the preservative actually added may vary depending on the type of preservative, the type of enzyme used, the pH of the reagent, the type and concentration of other components, etc. Therefore, the concentration range practically used is preferably 0.001 to 1% (v / v), more preferably 0.01 to 0.1% (v / v), and still more preferably 0.02 to 0.05. % (V / v).
  • the length of time to be treated with the preservative and the treatment temperature may be arbitrarily set in consideration of the actual storage conditions and the like. For example, as an example of an accelerated (severe) test, 0.001 There is a method of determining the residual activity rate after storage at 37 ° C. for 60 minutes or at 50 ° C. for 10 minutes in the presence of a preservative having a concentration of ⁇ 1% (v / v). Alternatively, a method of obtaining the residual activity ratio by refrigeration or long-term storage at room temperature can be used.
  • the concentration of amadoriase used for the coexistence treatment with the preservative when measuring the antiseptic resistance is not particularly limited, but preferably 0.01 to 50 U / ml, assuming the concentration used for a normal diagnostic reagent, More preferably, it is 0.05 to 10 U / ml, and most preferably 0.1 to 1 U / ml.
  • An appropriate buffer used in the coexistence treatment with the preservative is not particularly limited as long as the type and concentration are selected so that it has sufficient buffering ability in the pH range in which amadoriase acts. For example, 50 mM Tris buffer (PH 8.0), 50 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) or the like can be selected.
  • surfactants, salts, chelating agents, and the like may be included assuming various components that will be blended in the diagnostic reagent.
  • amadoriase of the present invention is characterized in that the resistance to preservatives is improved by undergoing modification by substituting an amino acid at a specific site, as compared with the amadoriase before the modification (ie, “parent protein”). .
  • the above-mentioned various known amadoriases can be arbitrarily used. Furthermore, these parent proteins do not necessarily have to be naturally-occurring, and a separate enzyme can be used practically.
  • the mutation of the present invention may be additionally introduced to those in which some mutation has already been introduced. Even if it contains such a plurality of mutations, as long as the preservative resistance is improved as compared with the parent protein before introduction by introducing the amino acid substitution at the specific site of the present invention, the amadoriase of the present invention include.
  • amadoriase parent protein into which any mutation is separately introduced for the purpose of enhancing the practicality of the enzyme include CFP-T7 or CFP-T9, or EFP-T5 (International Publication No. 2007/125797). Appl.Microbiol.Biotechnol.78, 775-81, 2008 Table 1, 2). These parent proteins have improved heat resistance and / or protease resistance, and can be imparted with antiseptic resistance by further introducing the mutation of the present invention, thereby further enhancing the practicality of amadoriase. It becomes possible.
  • CFP-T7 has an amino acid substitution of N272D / H302R / H388Y (SEQ ID NO: 1) with respect to the amino acid sequence (SEQ ID NO: 29) of a natural Coniochaeta genus amadoriase
  • CFP-T9 is an amino acid of a natural Coniochaeta genus Amadoriase It has an amino acid substitution of G184D / F265L / N272D / H302R / H388Y with respect to the sequence (SEQ ID NO: 29) (SEQ ID NO: 3)
  • EFP-T5 has an amino acid sequence of a natural Eupenicillium-derived amadoriase (SEQ ID NO: 30).
  • CnFx has a sequence obtained by removing 34 amino acids from the C-terminus of the amino acid sequence of natural Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 35).
  • PcFPOX has the amino acid sequence (SEQ ID NO: 19) of Penicillium chrysogenum-derived fructosyl amino acid oxidase. The sequence is a sequence having a substitution of L69W / T142A with respect to the Penicillium yancineram sequence (SEQ ID NO: 39).
  • Method for measuring amadoriase activity Various methods can be used as a method for measuring the activity of amadoriase. As an example, a method for measuring amadoriase activity used in the present invention will be described below.
  • Examples of the method for measuring the enzyme activity of amadoriase in the present invention include a method for measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the reaction of the enzyme and a method for measuring the amount of oxygen consumed by the enzyme reaction.
  • a method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described.
  • ⁇ FVH or ⁇ FV is used as a substrate unless otherwise specified.
  • some types of amadoriase tend to act on ⁇ -fructosyl lysine ( ⁇ FK) as compared with their activity on these substrates.
  • ⁇ FK is used as a substrate.
  • the enzyme titer is defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute when measured using ⁇ FVH, ⁇ FK, or ⁇ FV as a substrate.
  • glycated amino acids such as ⁇ FK and ⁇ FV and glycated peptides such as ⁇ FVH
  • glycated amino acids such as ⁇ FK and ⁇ FV
  • glycated peptides such as ⁇ FVH
  • those synthesized and purified based on the method of Sakagami et al. Can be used (see JP 2001-95598 A).
  • Reagent preparation (1) Reagent 1: Peroxidase, 4-aminoantipyrine solution 5.0 kU peroxidase (manufactured by Kikkoman), 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Tokyo Chemical Industry), 0.1 M sodium phosphate Dissolve in buffer (pH 8.0) and make up to 1000 ml.
  • Reagent 1 Peroxidase, 4-aminoantipyrine solution 5.0 kU peroxidase (manufactured by Kikkoman), 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Tokyo Chemical Industry), 0.1 M sodium phosphate Dissolve in buffer (pH 8.0) and make up to 1000 ml.
  • Reagent 2 TOOS solution 500 mg of TOOS (manufactured by Dojindo Laboratories) is dissolved in ion-exchanged water, and the volume is adjusted to 100 ml.
  • Reagent 3 Substrate solution (150 mM; final concentration 5 mM) 625 mg of ⁇ FVH or 462 mg of ⁇ FK or 419 mg of ⁇ FV is dissolved in ion-exchanged water, and the volume is adjusted to 10 ml.
  • a standard solution of hydrogen peroxide prepared in advance is used in place of the reagent 3 and ion-exchanged water in place of the enzyme solution, and a graph is prepared in which the relationship with the amount of dye produced is examined. Using this graph, the number of micromoles of hydrogen peroxide produced per minute at 37 ° C. is calculated, and this value is used as the activity unit in the enzyme solution.
  • plasmid DNA for parent protein expression was prepared as follows.
  • Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain (see WO 2007/12579) having a recombinant plasmid of the Amadoriase gene (SEQ ID NO: 2) derived from the genus Coniochaeta was added to 3 ml of LB-amp medium [1% (W / v) bactotryptone, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin], and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. A culture was obtained.
  • SEQ ID NO: 2 Amadoriase gene
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 was extracted and purified using GenElute Plasmid Mini-Prep Kit (manufactured by Sigma Aldrich), and 2.5 ⁇ g of the recombinant plasmid pKK2233-3 was purified. CFP-T7 DNA was obtained.
  • the expression plasmid pKK223-3-CFP-T7 of the genus Coniochaeta-derived amadoriase is Appl. Microbiol. Biotechnol. 78, 775-81, 2008 Table 1.
  • the size of this expression plasmid is about 6.0 Kbp, and contains a DNA fragment encoding an amadoriase derived from the genus Coniochaeta having an amino acid substitution of N272D / H302R / H388Y at the EcoRI site of pKK223-3.
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of amadoriase deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), and the cysteine at position 360 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was substituted with serine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-C360S) encoding the modified amadoriase was obtained.
  • Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T9) strain (see International Publication No. 2007/1225779) having a recombinant plasmid of the Amadoriase gene derived from the genus Coniochaeta (SEQ ID NO: 4) was added to 3 ml of LB-amp medium [1% (W / v) bactotryptone, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin], and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. A culture was obtained.
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T9 was extracted and purified using GenElute Plasmid Mini-Prep Kit (manufactured by Sigma Aldrich), and 2.5 ⁇ g of the recombinant plasmid pKK223-3- CFP-T9 DNA was obtained.
  • the expression plasmid pKK223-3-CFP-T9 derived from Coniochaeta genus amadoriase is described in Non-Patent Document 6, Table 1.
  • the size of this expression plasmid is about 6.0 kbp, and contains a DNA fragment encoding an amadoriase derived from the genus Coniochaeta having an amino acid substitution of G184D / F265L / N272D / H302R / H388Y at the EcoRI site of pKK223-3.
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 4, and the amino acid sequence of amadoriase deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), and the 97th cysteine in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was substituted with serine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T9-C97S) encoding the modified amadoriase was obtained.
  • the prepared crude enzyme solution is adsorbed to 4 ml of Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.0), and then the resin is washed with 80 ml of the same buffer. Subsequently, the protein adsorbed on the resin was eluted with 20 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.0) containing 100 mM NaCl, and a fraction showing amadoriase activity was collected.
  • Q Sepharose Fast Flow resin GE Healthcare
  • the obtained fraction showing amadoriase activity was concentrated using Amicon Ultra-15, 30K NMWL (Millipore). Thereafter, it is applied to HiLoad 26/60 Superdex 200 pg (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 20 mM HEPES-NaOH buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, eluted with the same buffer, and fractions showing amadoriase activity. Were collected, and purified samples of wild type and modified amadoriase were obtained.
  • the ratio of the 18% increase and the residual activity ratio was improved by about 1.6 times, and it was confirmed that the preservative resistance in the amadoriase of the present invention was remarkably increased.
  • E. coli JM109 (pUTE100k′-EFP-T5) strain (see International Publication No. 2007/12579) having a recombinant plasmid of the Eupenicillium genus Amadoriase gene (SEQ ID NO: 10) was added to 3 ml of LB-amp medium [1% ( w / v) bactotryptone, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin], and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours. A culture was obtained.
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells.
  • the recombinant plasmid pUTE100k′-EFP-T5 was extracted from the cells using GenElute Plasmid Mini-Prep Kit (Sigma Aldrich) and purified, and 2.5 ⁇ g of the recombinant plasmid pUTE100k′-EFP- T5 DNA was obtained.
  • the expression plasmid pUTE100k'-EFP-T5 of Eupenicillium-derived amadoriase is described in Patent Document 12, Table 3.
  • the size of this expression plasmid is about 6.0 Kbp, and contains a DNA fragment encoding an auporicillium genus amadoriase having an amino acid substitution of G184D / N272D / H388Y at the HpaI site of pUTE100 k ′.
  • the base sequence is shown in SEQ ID NO: 10
  • the amino acid sequence of amadoriase deduced from this base sequence is shown in SEQ ID NO: 9.
  • the nucleotide sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), and methionine at position 302 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 9 was substituted with tryptophan.
  • a recombinant plasmid (pUTE100k′-EFP-T5-M302W) encoding the modified amadoriase was obtained.
  • the residual activity rate of the amadoriase (EFP-T5) before modification was 55.8%
  • the amadoriase (EFP-T5-M302W) of the present invention was 68.5%
  • the residual activity ratio increased by 12.7% and 33.4%, respectively, and the ratio of the residual activity ratio was improved by about 1.2 times and about 1.6 times. It was confirmed that the preservative resistance in Amadoriase increased significantly.
  • fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans was searched from the genome database (http://www.genome.jp/tools/blast/).
  • 3501A GENE ID: 4934641 CNBB5450 hypothetical protein
  • the 1332 bp gene (including the stop codon TGA) shown in SEQ ID NO: 16, which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 and has a codon optimized for E. coli expression, is a total synthesis by PCR of gene fragments that are conventional methods. Was obtained by total synthesis of cDNA. At this time, an NdeI site and a BamHI site were added to the 5 'end and 3' end of SEQ ID NO: 16, respectively.
  • amino acid sequence predicted from the cloned gene sequence is identical to the sequence obtained by removing 34 amino acids from the C-terminal of the amino acid sequence of Cryptococcus neoformans fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 35) in FIG. It was confirmed.
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-C97S) encoding a Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase gene in which the cysteine at position 97 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 was substituted with serine was obtained.
  • the ratio of the residual activity rate was improved by about 1.3 times, and it was confirmed that the preservative resistance in the amadoriase of the present invention was remarkably increased.
  • Plasmid DNA was prepared as follows.
  • Penicillium chrysogenum NBRC9251 strain was added to a liquid medium (0.4% yeast extract, 1.0% malt extract, 0.1% tryptone, 0.1% potassium dihydrogen phosphate, 0.05% magnesium sulfate, 2% The cells were cultured at 30 ° C. for 24 hours in 0.0% glucose, pH 6.5), and total RNA was prepared by the same procedure as described above.
  • RT-PCR was performed with PrimeScript PT-PCR kit (manufactured by Takara Bio Inc.) according to the attached protocol.
  • Oligo dT Primer attached to Kit was used in the reverse transcription reaction, and the synthetic oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 were used in the subsequent PCR reaction.
  • a cDNA fragment of about 1300 bp was specifically amplified.
  • the cloned cDNA fragment has the NdeI site and the BamHI site derived from the synthetic nucleotides shown in SEQ ID NOs: 21 and 22 at the 5 ′ end and 3 ′ end, respectively.
  • the recombinant plasmid pET22b-PcFPOX ′ was used as a template, and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 23 and 24, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.) was used under the same conditions as described above for PCR reaction, transformation of E. coli, and determination of the base sequence of DNA encoding fructosyl amino acid oxidase in plasmid DNA retained by the growing colonies.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PcFPOX) encoding a penicillium chrysogenum-derived fructosyl amino acid oxidase gene in which the serine at position 60 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 was substituted with glycine was obtained.
  • the resulting recombinant plasmid pET22b-PcFPOX was transformed into E. coli BL21 (DE3) to obtain E. coli that produces penicillium chrysogenum-derived fructosyl amino acid oxidase.
  • E. coli BL21 (DE3) that produces fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium chrysogenum obtained above was shaken at 30 ° C. for 18 hours in LB-amp medium supplemented with the reagent of Overnight Express Automation System 1 (manufactured by Novagen). Cultured. The obtained cultured cells were lysed using BugBuster Protein Extraction Reagent (manufactured by Novagen), and then centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes to obtain a crude enzyme solution of PcFPOX. Using this crude enzyme solution, the enzyme activity against ⁇ FV was measured by the above-mentioned B: activity measurement method, and found to be 0.090 U / ml. However, the reagent 1 for measuring the activity at this time was adjusted to pH 7.5.
  • a recombinant plasmid (pET22b) encoding a penicillium chrysogenum-derived fructosyl amino acid oxidase gene in which the serine at position 60 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 was replaced with glycine and the cysteine at position 97 was replaced with serine.
  • pET22b a recombinant plasmid encoding a penicillium chrysogenum-derived fructosyl amino acid oxidase gene in which the serine at position 60 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 19 was replaced with glycine and the cysteine at position 97 was replaced with serine.
  • -PcFPOX-C97S was obtained.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system CEQ2000 (manufactured by Beckman Coulter), and the cysteine at position 97 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 3 was substituted with asparagine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T9-C97N) encoding the modified amadoriase was obtained.
  • the residual activity rate of the amadoriase (CFP-T9) before modification was 77.8%
  • the amadoriase of the present invention (CFP-T9-C97N) was 97.5%
  • the amadoriase of the present invention In CFP-T9-C97A), the remaining activity rate increased by 19.7% and 5.3% respectively, and the ratio of the remaining activity rate was improved by about 1.3 and 1.1 times, respectively. It was confirmed that the preservative resistance in the amadoriase of the present invention was remarkably increased.

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Abstract

　本発明は防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼを提供し、本発明のアマドリアーゼはコニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属由来のアマドリアーゼの９７位、３０２位、および３６０位よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ。具体的には、９７位に対応する位置のアミノ酸がセリン、アスパラギン、アラニンに、３０２位に対応する位置のアミノ酸がトリプトファンに、３６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンに置換されている。

Description

アマドリアーゼ改変体
　本発明は、防腐剤耐性が向上したアマドリアーゼ、その遺伝子および組換え体ＤＮＡ、並びに防腐剤耐性が向上したアマドリアーゼの製造法に関する。
　糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のαアミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のεアミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
　これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は過去の一定期間の平均血糖値を反映しており、その測定値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
　このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、アマドリアーゼを用いる酵素的方法、すなわち、ＨｂＡ１ｃをプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端より遊離させたα－フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）、もしくはα－フルクトシルバリン（以降αＦＶと表す）を定量する方法が提案されている（例えば、特許文献１～６参照。）。実際には、ＨｂＡ１ｃからαＦＶを切り出す方法では、夾雑物等による影響が大きいと考えられ、特に現在ではαＦＶＨを測る方法が主流となっている。
　アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する。
　アマドリアーゼは、細菌、酵母、真菌から見出されているが、特にＨｂＡ１ｃの測定に有用である、αＦＶＨおよび／またはαＦＶに対する酵素活性を有するアマドリアーゼとしては、例えば、コニオカエタ（Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ）属、ユーペニシリウム（Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アルスリニウム（Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ）属、カーブラリア（Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ）属、レプトスフェリア（Ｌｅｐｔｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、ネオコスモスポラ（Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ）属、オフィオボラス（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｕｓ）属、プレオスポラ（Ｐｌｅｏｓｐｏｒａ）属、ピレノケータ（Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ）属、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、フェオスフェリア（Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ）属、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ウロクラディウム（Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属、デバリオマイセス（Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ）属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、５、７～１１、非特許文献１～５参照。）。さらに、熱安定性及び／またはプロテアーゼ耐性が向上した改変型アマドリアーゼも報告されている（例えば、特許文献１２、非特許文献６参照。）。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
　上述のような各種起源のアマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃ測定を行う際には、測定のために好ましい力価および濃度のアマドリアーゼと、その他に必要な各種成分（発色系の場合の発色剤や、ｐＨ調製剤、安定剤、前処理用の酵素剤、反応停止剤、等）を好ましい量で含む「キット」（検査薬、臨床検査試薬、試薬キット等ともいう）を調製し、それを使用するのが通常的である。そのようなキットには、粉末または凍結乾燥状態の試薬を提供して使用者が使用時に溶解して用いるタイプの製品もあれば、より簡便に、溶液状態で流通されるタイプの製品もあるが、近年の生化学検査用のキットにおいては、溶液状態で提供されるタイプのものが主流となっている。
　液状のキットは、そのまま直ちに測定に使える簡便性や、使用者の溶解操作ミスによる組成のブレ等を回避できるメリットを有する一方で、試薬を保存している間の微生物の増殖（微生物汚染）が起こりやすいという問題を有している。このため、一般に、液状のキットには、微生物の増殖を抑制する目的で防腐剤が添加される場合が多い。例えば、このような目的で用いられる防腐剤としては、各種のイソチアゾリン系化合物の防腐剤が用いられることが多い。これらのイソチアゾリン系化合物としては、２－メチルイソチアゾン、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オン、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン等が挙げられ、これらの成分を含有する市販のイソチアゾリン系化合物の防腐剤としては、例えば、プロクリン（スペルコ社製、シグマアルドリッチジャパン社販売）、アクチサイド（ソー・ジャパン社製）等が挙げられる。
　しかし、従来知られた各種のアマドリアーゼは、これらのイソチアゾリン系化合物の防腐剤に対する耐性が低く、これらの防腐剤と共存することにより不安定化されてしまうことが知られていることから、これらイソチアゾリン系化合物の防腐剤を含む臨床化学検査用試薬キットにおいて好適に使用できるアマドリアーゼが求められている。
国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１－９５５９８号公報 特公平０５－３３９９７号公報 特開平１１－１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２００３－２３５５８５号公報 特開２００４－２７５０１３号公報 特開２００４－２７５０６３号公報 特開２０１０－３５４６９号公報 特開２０１０－５７４７４号公報 国際公開第２００７／１２５７７９号
Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２４２，　４９９－５０５，　１９９６ Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　３１１，　１０４－１１，　２００３ Ａｒｃｈ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　１７８，　３４４－５０，　２００２ Ｊ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０２，　２４１－３，　２００６ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０６，　３５８－６６，　２０１０ Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７８，　７７５－８１，　２００８
　本発明が解決しようとする課題は、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含む臨床化学検査用試薬キットにおいて好適に使用できる、防腐剤耐性に優れたアマドリアーゼを提供することである。
　本発明者は、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼにおける特定のアミノ酸残基を特定のアミノ酸残基に置換することにより、上記課題を解決し得ることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
（１）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、それぞれ、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼ。
（２）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の以下（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上していることを特徴とするアマドリアーゼ：
（ａ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステイン；
（ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニン；および
（ｃ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステイン。
（３）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸の以下（ｄ）から（ｆ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下（ｄ）から（ｆ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されたアマドリアーゼ：
（ｄ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステインがセリンに置換されている；
（ｅ）配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニンがトリプトファンに置換されている；
（ｆ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステインがセリンに置換されている。
（４）以下の（ｇ）または（ｈ）で表されるアマドリアーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において９７位のシステイン残基がセリン、アスパラギン、アラニンのいずれかに置換されたことを特徴とする改変タンパク質であるアマドリアーゼ：
（ｇ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列からなり、かつアマドリアーゼ活性を有するタンパク質；および
（ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列において、９７位のシステイン残基以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、かつアマドリアーゼ活性を有するタンパク質。
（５）上記（１）から（４）のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
（６）上記（５）記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
（７）上記（６）記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
（８）アマドリアーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
（i）上記（７）記載の宿主細胞を培養する工程；
（ii）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；および
（iii）培養物からアマドリアーゼを単離する工程。
（９）上記（１）～（４）のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2010-218534号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含む臨床化学検査用試薬キットにおいても不安定化されにくく、糖尿病の診断用酵素として、また、糖尿病マーカーの測定キットに有利に利用できる、防腐剤耐性に優れたアマドリアーゼを提供することが可能である。
各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における相同性を例示する図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（アマドリアーゼ）
　アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
　本発明のアマドリアーゼは、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼに基づき作製された、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上したアマドリアーゼの改変体である。このような変異体の例としては、配列番号１、配列番号３または配列番号９と高い配列同一性（例えば、７５％以上、好ましくは、８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上）を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、および、配列番号１、配列番号３または配列番号９のアミノ酸配列において、１から数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼを挙げることができる。なお、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、アルスリニウム属、カーブラリア属、レプトスフェリア属、ネオコスモスポラ属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、ピレノケータ属、アスペルギルス属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、ウロクラディウム属、アクレモニウム属、デバリオマイセス属またはペニシリウム属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでも良い。
　図１は、各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における相同性を例示するアライメントを示す図である。なお、図中の略語は各種アマドリアーゼの由来微生物名を示し、具体的には以下の通りである；「Ｃｏ」Coniochaeta sp.；「Ｅｔ」Eupenicillium terrenum；「Ｐｙ」Pyrenochaeta sp.；「Ａｒ」Arthrinium sp.；「Ｃｃ」Curvularia clavata；「Ｎｖ」Neocosmospora vasinfecta；「Ｃｎ」Cryptococcus neoformans；「Ｐｎ」Phaeosphaeria nodorum；「Ａｎ」Aspergillus nidulans；「Ｕｌ」Ulocladium sp.；「Ｐｊ」Penicillium janthinellum。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
　これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特許文献７参照）が挙げられる。さらに、好ましい一例としては、アミノ酸置換を導入することにより耐熱性及び／またはプロテアーゼ耐性が向上したコニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特許文献１２、非特許文献６参照）なども挙げられる。
　これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７（特許文献１２，非特許文献６参照。）から、ＱＩＡＧＥＮ（キアゲン社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、抽出、精製して得ることができる。なお、プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７は、２００６年３月３１日付けで日本国茨城県つくば市東１丁目１番地１中央第６（郵便番号305-8566）所在の独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに寄託され、受託番号　ＦＥＲＭ　ＢＰ－１０５９３が付与されている。
（ベクター）
　本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＫＫ２２３－３（ファルマシア社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
　アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２，　９４４１　（１９８４）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３５０　（１９８７）：　Ｇｅｎｅ，　３７，　７３　（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７４９　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７６５　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１４，　９６７９　（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８２，　４８８　（１９８５）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３６７　（１９８７））等が挙げられる。
　また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，　１，　１１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
　上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
　上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
　例えば、このようにして得られた防腐剤に対して高い耐性を示すアマドリアーゼを生産する形質転換体の一例として、ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓ）株を挙げることができる。
（アミノ酸配列の相同性）
　アミノ酸配列の相同性は、ＧＥＮＥＴＹＸ－Ｍａｃ　（Ｓｏｆｔｗａｒｅ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソフト社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
　「配列番号１の特定のアミノ酸に対応する位置」とは、配列番号１に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の該特定のアミノ酸の位置に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
　「アミノ酸に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の相同性を与えることにより行うことができる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させアラインメントを行い比較することにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。対応する相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。図１に種々の生物種由来のアマドリアーゼの配列のアラインメントを示す。図１からコニオカエタ属由来のアマドリアーゼ等、ある生物種のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置を知ることができる。図１には、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼおよびPenicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列を示してある。
　なお、本発明において、「配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステインに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１もしくは配列番号３に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列、または配列番号９に示されるEupenicillium属由来のアマドリアーゼと比較した場合に、配列番号１、配列番号３または配列番号９のアマドリアーゼの９７位のシステインに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは９７位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９７位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは９７位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは９７位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは９７位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９７位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは９７位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９６位のバリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９７位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９７位のシステイン、Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは９７位のシステインである。図１中に矢印で示される「Ｃ９７」は図１に示す生物由来のアマドリアーゼにおける、「配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステインに対応する位置」のアミノ酸を示す。
なお、本発明において、「配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号９に示されるEupenicillium属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号９のアマドリアーゼの３０２位のメチオニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、Coniochaeta sp.由来のアマドリアーゼでは３０２位のヒスチジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３００位のアルギニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３０３位のアルギニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３００位のアルギニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３０２位のプロリン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０２位のヒスチジン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２９８位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０２位のプロリン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３００位のアルギニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０２位のロイシン、Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３０２位のロイシンである。図１中に矢印で示される「Ｍ３０２」は図１に示す生物由来のアマドリアーゼにおける、「配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニンに対応する位置」のアミノ酸を示す。
　なお、本発明において、「配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステインに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１もしくは配列番号３に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列、または配列番号９に示されるEupenicillium属由来のアマドリアーゼと比較した場合に、配列番号１、配列番号３または配列番号９のアマドリアーゼの３６０位のシステインに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「対応する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼでは３６０位のシステイン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３５８位のシステイン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼでは３６１位のシステイン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼでは３５８位のシステイン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼでは３６０位のシステイン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３６０位のシステイン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３５６位のシステイン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３６０位のシステイン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３５８位のシステイン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３６０位のシステイン、Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３６０位のシステインである。図１中に矢印で示される「Ｃ３６０」は図１に示す生物由来のアマドリアーゼにおける、「配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステインに対応する位置」のアミノ酸を示す。
　本発明のイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列において１または数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有する。ここで、「１または数個」とは、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個をいう。該アミノ酸の改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入により、防腐剤耐性向上がもたらされる。
　イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼは、例えば、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列において、アミノ酸を改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入することにより得られる。
　アミノ酸の改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入として、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の９７位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸、３０２位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸、および３６０位のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。具体的には、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の９７位のシステインに対応する位置のアミノ酸の置換、配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の３０２位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸の置換、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の３６０位のシステインに対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。さらに、具体的には配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の９７位のシステインに対応する位置のアミノ酸のセリン、アスパラギンまたはアラニンへの置換、配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の３０２位のメチオニンに対応する位置のアミノ酸のトリプトファンへの置換、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアマドリアーゼのアミノ酸配列の３６０位のシステインに対応する位置のアミノ酸のセリンへの置換が挙げられる。ここで、特定のアミノ酸配列の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸は上で定義したとおりの意味を有し、該定義に従い各種生物由来のアマドリアーゼのアミノ酸において、それぞれ特定の配列の特定のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸を同定することができる。例えば、配列番号１、配列番号３および配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のアミノ酸はいずれもシステインであるが、この９７位のシステインに対応する位置のアミノ酸はAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号３７）では９６位のバリンである（図１の「Ｃ９７」）。従って、本発明のイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼがAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを改変して得られるものである場合、９６位のバリンがセリン、アスパラギンまたはアラニンへ置換される。
　本発明のイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼ変異体は、上記のイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換を有し、それらの置換アミノ酸以外の位置で、さらに1または数個(例えば1～10個、好ましくは1～5個、さらに好ましくは1～3個、特に好ましくは１個)のアミノ酸が欠失、挿入、付加および／または置換されたアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼ変異体を包含する。さらに、上記のイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性の向上をもたらすアミノ酸を除いた部分のアミノ酸配列に対して、90％以上、さらに好ましくは95％以上、さらに好ましくは97％以上、特に好ましくは99％以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、アマドリアーゼ活性を有し、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上したアマドリアーゼ変異体を包含する。
　なお、本発明において、例えば、第９７位のシステイン（C)がセリン（S)へ置換された変異をC97Sと表す。
（本発明のアマドリアーゼの生産）
　上記のようにして得られた防腐剤耐性が向上したアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
　また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　なお、培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。
　培養は、２０～４２℃の培養温度、好ましくは３７℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは３７℃前後の培養温度で４～８時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
　培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
　上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法；イオン交換体を用いる吸着溶出法；ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法；ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法；蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法；アフィニティクロマトグラフィー法；分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望の防腐剤耐性が向上したアマドリアーゼを得ることができる。
（本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性の向上）
　上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較してイソチアゾリン系化合物の防腐剤に対する耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、本発明における「イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上している」度合は、本発明のアマドリアーゼ（すなわち、所定の位置に相当する位置のアミノ酸が置換されたアマドリアーゼ改変体）と、前記のアミノ酸の置換を導入する前のアマドリアーゼとを、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含有する適当な緩衝液中等にそれぞれ添加し、一定温度で一定時間処理した後の残存活性率（％）の比較により評価される。
　本発明のアマドリアーゼの残存活性率（ａ）は、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含有しない緩衝液中で一定温度、一定時間処理した後の活性値に対する、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含有する緩衝液中で一定温度、一定時間処理した後の活性値の割合である。同様に、本発明のアマドリアーゼに特徴的な置換を導入する前のアマドリアーゼの残存活性率（ｂ）は、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含有しない緩衝液中で一定温度、一定時間処理した後の活性値に対する、イソチアゾリン系化合物の防腐剤を含有する緩衝液中で一定温度、一定時間処理した後の活性値の割合である。両者が（ａ）＞（ｂ）を満たすアマドリアーゼの状態を、「イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上している」という。
　糖化ヘモグロビンの測定キットにおいて、測定試薬中での微生物の増殖を抑制する目的で添加される場合が多いイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が高いアマドリアーゼを用いれば、試薬中でアマドリアーゼが不安定化する度合が少なく、試薬の安定性を向上させ得ることが期待されるため、本発明のアマドリアーゼのイソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性は高いほど好ましい。具体的には、所定の条件下での本発明のアマドリアーゼの残存活性率（ａ）は、同条件下で、本発明のアマドリアーゼに特徴的な置換を導入する前のアマドリアーゼに関して得られる残存活性率（ｂ）に対して、（ａ）＞（ｂ）の関係を満たし、好ましくは、（ａ）／（ｂ）が１．２以上、より好ましくは、１．５以上、さらに好ましくは２以上、最も好ましくは３以上であることが好ましい。
　さらに、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性は、上述の（ａ）の数値自体から評価することもできる。例えば、（ａ）は、５０％以上、好ましくは、６０％以上、より好ましくは、７０％以上、さらに好ましくは８０％以上、最も好ましくは９０％以上であることが好ましい。このように高い残存活性率を有するアマドリアーゼを用いることにより、従来のアマドリアーゼを用いた場合と比較して、イソチアゾリン系化合物の防腐剤による不安定化の影響を良好に回避できる。
　本発明のアマドリアーゼが耐性を有する対象とするイソチアゾリン系化合物の防腐剤の種類には、糖化ヘモグロビンの測定キットに使用される各種の防腐剤を含み得る。例えば、このような用途に用いられることが多いイソチアゾリン系化合物の防腐剤としては、２－メチルイソチアゾン、２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン、１，２－ベンズイソチアゾリン－３－オン、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オン等が挙げられる。一般に市販されているイソチアゾリン系化合物の防腐剤の例としては、プロクリン１５０（スペルコ社製、シグマアルドリッチジャパン社販売）、プロクリン２００（スペルコ社製、シグマアルドリッチジャパン社販売）、プロクリン３００（スペルコ社製、シグマアルドリッチジャパン社販売）、ＭＩＴ（ロシュ社製、シグマ社製）、アクチサイドＭＢＳ（ソー・ジャパン社製）、アクチサイドＢ２０（Ｎ）（ソー・ジャパン社製）等が挙げられる。
　本発明のアマドリアーゼが耐性を有する対象とするイソチアゾリン系化合物の防腐剤の濃度は、糖化ヘモグロビンの測定キットに使用され得る範囲の各種濃度であり得る。防腐剤の種類や使用する酵素の種類や試薬のｐＨ、その他成分等の種類や濃度により、実際に配合される防腐剤の最適濃度は変化し得るが、一般的に診断薬等を長期保存するために実用される濃度範囲として、好ましくは０．００１～１％（ｖ／ｖ）、より好ましくは０．０１～０．１％（ｖ／ｖ）、さらに好ましくは０．０２～０．０５％（ｖ／ｖ）が挙げられる。
　防腐剤と共に一定時間処理する時間の長さおよび処理温度は、実際に保存する条件等を考慮して任意の条件を設定すれば良いが、例えば、加速（苛酷）試験の一例として、０．００１～１％（ｖ／ｖ）の濃度の防腐剤存在下で、３７℃、６０分間保存、または５０℃、１０分間保存後に、残存活性率を求める方法が挙げられる。あるいは、冷蔵もしくは室温にて長期保存し、残存活性率を求める方法等も挙げられる。
　防腐剤耐性を測定する際の、防腐剤との共存処理に供するアマドリアーゼの濃度は特に限定されないが、通常の診断試薬に使用される濃度を想定して、好ましくは０．０１～５０Ｕ／ｍｌ、より好ましくは０．０５～１０Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは０．１～１Ｕ／ｍｌである。防腐剤との共存処理の際に用いる適当な緩衝液としては、アマドリアーゼが作用するｐＨ範囲で十分な緩衝能を持つよう、その種類と濃度を選べば特に限定されないが、例えば、５０ｍＭ　トリス緩衝液（ｐＨ８．０）、または、５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）等を選択することができる。さらに、診断用試薬に配合されるであろう各種成分を想定して、界面活性剤、塩類、キレート剤などを含んでいてもよい。
（本発明のアマドリアーゼの親タンパク質）
　本発明のアマドリアーゼは、特定部位のアミノ酸を置換することによる改変を受けることにより、改変前のアマドリアーゼ（すなわち、「親タンパク質」）と比較して防腐剤耐性が向上していることを特徴とする。
　本発明のアマドリアーゼを得るために用いる「親タンパク質」としては、前述の各種公知のアマドリアーゼを任意に用いることができ、さらに、これらの親タンパク質は必ずしも天然型である必要はなく、別途酵素の実用性を高める目的で、何らかの変異が既に導入されたものに対し、付加的に本発明の変異を導入しても構わない。こうした複数の変異を含むものであっても、本発明の特定部位のアミノ酸の置換を導入することにより、導入前の親タンパク質と比較して防腐剤耐性が向上している限り、本発明のアマドリアーゼに含まれる。
　酵素の実用性を高める目的で、何らかの変異が別途導入されているアマドリアーゼ親タンパク質の好ましい例としては、ＣＦＰ－Ｔ７またはＣＦＰ－Ｔ９、あるいはＥＦＰ－Ｔ５等が挙げられる（国際公開第２００７／１２５７７９号、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７８，　７７５－８１，　２００８　Ｔａｂｌｅ　１、２参照）。これらの親タンパク質においては、耐熱性および／またはプロテアーゼ耐性が向上しており、ここにさらに本発明の変異を導入することによって、防腐剤耐性を付与することができ、一層アマドリアーゼの実用性を高めることが可能となる。また、ＣｎＦｘ(Cryptococcus neoformans B-3501A: GENE ID: 4934641 CNBB5450　hypothetical protein)やＰｃＦＰＯＸ等も挙げられる。ＣＦＰ－Ｔ７は天然のConiochaeta属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列（配列番号２９）に対してＮ２７２Ｄ／Ｈ３０２Ｒ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有し（配列番号１）、ＣＦＰ－Ｔ９は天然のConiochaeta属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列（配列番号２９）に対してＧ１８４Ｄ／Ｆ２６５Ｌ／Ｎ２７２Ｄ／Ｈ３０２Ｒ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有し（配列番号３）、ＥＦＰ－Ｔ５は天然のEupenicillium属由来アマドリアーゼのアミノ酸配列（配列番号３０）に対してＧ１８４Ｄ／Ｎ２７２Ｄ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有する（配列番号９）。また、ＣｎＦｘは天然のクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号３５）のＣ末端から３４アミノ酸を除いた配列を有する。さらに、ＰｃＦＰＯＸはペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１９）を有する。該配列はペニシリウム・ヤンシネラムの配列（配列番号３９）に対してＬ６９Ｗ／Ｔ１４２Ａの置換を有する配列である。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
　アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
　本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
　本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りのない限り、αＦＶＨまたはαＦＶを基質として用いる。また、アマドリアーゼの種類によっては、これらの基質への作用性に比較してε－フルクトシルリジン（εＦＫ）に作用しやすい傾向を有するものもあり、そのような酵素においては、εＦＫを基質として用いることもできる。なお、酵素力価は、αＦＶＨ、もしくはεＦＫ、またはαＦＶを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
　εＦＫ、αＦＶ等の糖化アミノ酸、およびαＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１－９５５９８号公報参照）。
Ａ．：試薬の調製
（１）試薬１：パーオキシダーゼ、４－アミノアンチピリン溶液
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４－アミノアンチピリン（東京化成社製）を０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．０）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（２）試薬２：ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（３）試薬３：基質溶液（１５０ｍＭ；　終濃度５ｍＭ）
αＦＶＨ　６２５ｍｇ、またはεＦＫ　４６２ｍｇまたはαＦＶ　４１９ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
Ｂ：活性測定法
　２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液（測定上好適な酵素濃度範囲となるよう、任意の緩衝液にて調製）を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混合した後、分光光度計（Ｕ－３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度を測定する。測定値は、５５５ｎｍにおける１分後から２分後の１分間あたりの吸光度変化とする。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にしたものである。これを予め作製しておいた過酸化水素の標準溶液を試薬３の代わりに、また酵素液の代わりにイオン交換水を用い、その生成色素量との関係を調べたグラフを用意する。このグラフを用いて、３７℃、１分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を計算し、この数値を酵素液中の活性単位とする。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの調製
　まず、本発明のアマドリアーゼ改変体を作製するための親タンパク質（ＣＦＰ－Ｔ７）を発現するために、親タンパク発現用のプラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを得た。
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼの発現プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７は、Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７８，　７７５－８１，　２００８　Ｔａｂｌｅ　１に記載されている。本発現プラスミドのサイズは、約６．０Ｋｂｐであり、ｐＫＫ２２３－３のＥｃｏＲＩサイトに、Ｎ２７２Ｄ／Ｈ３０２Ｒ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有するConiochaeta属由来アマドリアーゼをコードするＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列番号２に、また、この塩基配列から推定されるアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示す。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを鋳型として、配列番号５、６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、および、１ＵｎｉｔのＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の３６０位のシステインがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｃ３６０Ｓ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　上記の手順により得られた上記組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｃ３６０Ｓ）および、改変前のアマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）を保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、基質特異性確認のための酵素液０．６ｍｌを調製した。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｃ３６０Ｓ）および改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７）にそれぞれ、防腐剤として０．０１％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３７℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７）の残存活性率が１５．４％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｃ３６０Ｓ）では８２．４％と、残存活性率として６７％増加、残存活性率の比としては約５．４倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＣＦＰ－Ｔ７とＣＦＰ－Ｔ７－Ｃ３６０Ｓの間で、各基質に対するＫｍ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡの調製
　本発明のアマドリアーゼ改変体を作製するために、実施例１とは別の親タンパク質（ＣＦＰ－Ｔ９）を発現するために、親タンパク発現用のプラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号４）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを得た。
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼの発現プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９は、非特許文献６　Ｔａｂｌｅ　１に記載されている。本発現プラスミドのサイズは、約６．０ｋｂｐであり、ｐＫＫ２２３－３のＥｃｏＲＩサイトに、Ｇ１８４Ｄ／Ｆ２６５Ｌ／Ｎ２７２Ｄ／Ｈ３０２Ｒ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有するConiochaeta属由来アマドリアーゼをコードするＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列番号４に、また、この塩基配列から推定されるアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号３に示す。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを鋳型として、配列番号７、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の９７位のシステインがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　上記の手順により得られた上記組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓ）および、改変前のアマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９）を保持する大腸菌ＪＭ１０９株を、０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、３０℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、基質特異性確認のための酵素液８ｍｌを調製した。
　調製した粗酵素液を２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した４ｍｌのＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に８０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
　得られたアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ－１５，　３０Ｋ　ＮＭＷＬ（ミリポア社製）で濃縮した。その後、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００ｐｇ（ＧＥヘルスケア社製）にアプライし、同緩衝液で溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収し、野生型及び改変型アマドリアーゼの精製標品を得た。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓ）および改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９）にそれぞれ、防腐剤として０．００５％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３７℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９）の残存活性率が３２．７％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓ）では５０．９％と、残存活性率として１８％増加、残存活性率の比としては約１．６倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＣＦＰ－Ｔ９とＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｓの間で、各基質に対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
（１）組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡの調製
　本発明のアマドリアーゼ改変体を作製するために、実施例１、実施例２とは別の親タンパク質（ＥＦＰ－Ｔ５）を発現するために、親タンパク発現用のプラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
　Eupenicillium属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号１０）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　Ｍｉｎｉ－Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（シグマアルドリッチ社製）を用いて組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡを得た。
　Eupenicillium属由来アマドリアーゼの発現プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５は、特許文献１２　Ｔａｂｌｅ　３に記載されている。本発現プラスミドのサイズは、約６．０Ｋｂｐであり、ｐＵＴＥ１００ｋ’のＨｐａＩサイトに、Ｇ１８４Ｄ／Ｎ２７２Ｄ／Ｈ３８８Ｙのアミノ酸置換を有するEupenicillium属由来アマドリアーゼをコードするＤＮＡ断片を含む。その塩基配列を配列番号１０に、また、この塩基配列から推定されるアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号９に示す。
（２）組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１１、１２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号９記載のアミノ酸配列の３０２位のメチオニンがトリプトファンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－Ｍ３０２Ｗ）を得た。
　さらに、ｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３、１４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の操作を行うことにより、配列番号９記載のアミノ酸配列の９７位のシステインがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－Ｃ９７Ｓ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　実施例２（３）と同様の方法により、アマドリアーゼ改変体を生産、取得した。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＥＦＰ－Ｔ５－Ｍ３０２Ｗ、およびＥＦＰ－Ｔ５－Ｃ９７Ｓ）および改変前のアマドリアーゼ（ＥＦＰ－Ｔ５）にそれぞれ、防腐剤として０．００５％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３０℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＥＦＰ－Ｔ５）の残存活性率が５５．８％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＥＦＰ－Ｔ５－Ｍ３０２Ｗ）では６８．５％、（ＥＦＰ－Ｔ５－Ｃ９７Ｓ）では８９．２％と、残存活性率として、それぞれ１２．７％、３３．４％増加、残存活性率の比としては約１．２倍、約１．６倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＥＦＰ－Ｔ５とＥＦＰ－Ｔ５－Ｍ３０２Ｗ、及びＥＦＰ－Ｔ５－Ｃ９７Ｓの間で、各基質に対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
（１）組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ　ＤＮＡの調製
　本発明のアマドリアーゼ改変体を作製するために、実施例１、実施例２、実施例３とは別の親タンパク質（ＣｎＦＸ）を発現するために、親タンパク発現用のプラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
　既知のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列をもとに、ゲノムデータベース（http://www.genome.jp/tools/blast/）より検索したクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(Cryptococcus neoformans B-3501A: GENE ID: 4934641 CNBB5450　hypothetical protein)について、Ｃ末端から３４アミノ酸（配列番号３５のアミノ酸配列の４４４位以降のアミノ酸）を除いた、配列番号１５で示す４４３アミノ酸を大腸菌で発現させることを試みた。そこで、配列番号１５のアミノ酸配列をコードし、且つ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号１６で示す１３３２ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＧＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１６の５’末端、３’末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列は図１のクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号３５）のＣ末端から３４アミノ酸を除いた配列と一致していることを確認した。
（２）組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　続いて、取得した配列番号１６の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸを取得し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。次に、防腐剤耐性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸを鋳型にして、配列番号１７、１８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１５記載のアミノ酸配列の９７位のシステインがセリンに置換されたクリプトコッカス・ネオフォルマンス由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－Ｃ９７Ｓ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　上記で得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸおよびｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－Ｃ９７Ｓを保持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ－ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体を２０ｍＭのＨＥＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して酵素液０．６ｍｌを調製した。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＣｎＦＸ－Ｃ９７Ｓ）および改変前のアマドリアーゼ（ＣｎＦＸ）にそれぞれ、防腐剤として０．０１０％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３０℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＣｎＦＸ）の残存活性率が５３．０％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＣｎＦＸ－Ｃ９７Ｓ）では６７．１％と、残存活性率として、１４．１％増加、残存活性率の比としては約１．３倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＣｎＦＸとＣｎＦＸ－Ｃ９７Ｓの間で、各基質に対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
（１）組換え体プラスミドｐＥＴ２２－ＰｃＦＰＯＸ　ＤＮＡの調製
　本発明のアマドリアーゼ改変体を作製するために、実施例１～４とは別の親タンパク質（ＰｃＦＰＯＸ）を発現するために、親タンパク発現用のプラスミドＤＮＡを以下のように調製した。
（ペニシリウム・クリソゲナムＮＢＲＣ９２５１株からの全ＲＮＡの抽出）
　ペニシリウム・クリソゲナムＮＢＲＣ９２５１株を、液体培地（０．４％イーストエキストラクト、１．０％マルツエキストラクト、０．１％トリプトン、０．１％リン酸２水素１カリウム、０．０５％硫酸マグネシウム、２．０％グルコース、ｐＨ６．５）において、３０℃で２４時間培養し、上記と同様の手順で全ＲＮＡを調製した。
（ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼｃＤＮＡのクローニング）
　得られた全ＲＮＡ１μｇを用いて、ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＰＴ－ＰＣＲ　ｋｉｔ　（タカラバイオ社製）により、付属のプロトコールに従ってＲＴ－ＰＣＲを行った。このとき、逆転写反応ではＫｉｔ付属のＯｌｉｇｏ　ｄＴ　Ｐｒｉｍｅｒを用い、その後のＰＣＲ反応では配列番号２１、２２　に示した合成オリゴヌクレオチドを用いた。その結果、約１３００ｂｐのｃＤＮＡ断片が特異的に増幅した。次に、この増幅したｃＤＮＡ断片についてシーケンス解析を行った結果、配列番号２０に示した１３１７ｂｐからなる塩基配列であることがわかった。また、配列番号２０より予想されるアミノ酸配列（配列番号１９）は、図１で記載したペニシリウム・ヤンシネラムの配列（配列番号３９）の６９番目のロイシンがトリプトファンに、１４２番目のスレオニンがアラニンに置換されたものと一致していた。
（ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子の大腸菌での発現）
　続いて、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記でクローニングしてきたｃＤＮＡ断片は配列番号２１、２２に示した合成ヌクレオチド由来のＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトをそれぞれ５´末端と３´末端に有しているため、クローニングしてきたｃＤＮＡ断片をＮｄｅＩとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸ´を取得した。
　次に、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼにフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸ´を鋳型にして、配列番号２３、２４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９記載のアミノ酸配列の６０位のセリンがグリシンに置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸ）を取得した。そして、この得られた組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換することで、ペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌を取得した。
　上記で得られたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを産生する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　Ａｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　Ｓｙｓｔｅｍ　１（ノバジェン社製）の試薬を加えたＬＢ－ａｍｐ培地において３０℃で１８時間振とう培養した。得られた各培養菌体をＢｕｇＢｕｓｔｅｒ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（ノバジェン社製）を用いて溶菌した後、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離することでＰｃＦＰＯＸの粗酵素液を得た。この粗酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法により、αＦＶに対する酵素活性を測定したところ、０．０９０Ｕ／ｍｌであった。ただし、このときの活性測定の試薬１はｐＨ７．５に調整したものを使用した。
（２）組換え体プラスミドｐＥＴ２２－ＰｃＦＰＯＸ　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　続いて、防腐剤耐性を向上させるための点変異を導入することを目的として、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸ（６０位のセリンがグリシンに置換された変異を含む）を鋳型にして、配列番号２５、２６の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９記載のアミノ酸配列の６０位のセリンがグリシンに置換され、且つ９７位のシステインがセリンに置換されたペニシリウム・クリソゲナム由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｃＦＰＯＸ－Ｃ９７Ｓ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　実施例４（３）と同様の方法により、アマドリアーゼ改変体を生産、取得した。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＰｃＦＰＯＸ－Ｃ９７Ｓ）および改変前のアマドリアーゼ（ＰｃＦＰＯＸ）にそれぞれ、防腐剤として０．０１０％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３０℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＰｃＦＰＯＸ）の残存活性率が２２．３％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＰｃＦＰＯＸ－Ｃ９７Ｓ）では８８．８％と、残存活性率として、６６．５％増加、残存活性率の比としては約４．０倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＰｃＦＰＯＸとＰｃＦＰＯＸ－Ｃ９７Ｓの間で、各基質に対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡの調製
　実施例２（１）と同様の方法により、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを得た。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２７、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムＣＥＱ２０００（ベックマン・コールター社製）を用いて決定し、配列番号３記載のアミノ酸配列の９７位のシステインがアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｎ）を得た。
　さらに、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２８、８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、上記と同様の操作を行うことにより、配列番号３記載のアミノ酸配列の９７位のシステインがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ａ）を得た。
（３）アマドリアーゼ改変体の生産
　実施例２（３）と同様の方法により、アマドリアーゼ改変体を生産、取得した。
（４）アマドリアーゼ改変体の防腐剤耐性評価
　こうして得られたアマドリアーゼ改変体（ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｎ、およびＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ａ）および改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９）にそれぞれ、防腐剤として０．０２５％（ｖ／ｖ）のプロクリン３００（シグマアルドリッチ社製）を添加し、３０℃、１時間処理した後に、残存酵素活性率（％）を測定した。その結果、改変前のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９）の残存活性率が７７．８％であったのに対し、本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ｎ）では９７．５％、本発明のアマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ａ）では８３．１％と、残存活性率としてそれぞれ１９．７％、５．３％増加、残存活性率の比としては、それぞれ約１．３、１．１倍に向上し、本発明のアマドリアーゼにおける防腐剤耐性が顕著に増加していることが確認された。なお、ＣＦＰ－Ｔ９とＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７ＮおよびＣＦＰ－Ｔ９－Ｃ９７Ａの間で、各基質に対するＫｍ値、Ｋｃａｔ値にはほとんど差が見られず、防腐剤耐性を付与する変異による基質反応性への影響はほとんどみられないことがわかった。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (9)

  1. 　配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列に１または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および／または置換がなされたアミノ酸配列を有し、それぞれ、配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上しているアマドリアーゼ。
  2. 　配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の以下（ａ）から（ｃ）よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、前記置換を行う前のアマドリアーゼと比較して、イソチアゾリン系化合物の防腐剤への耐性が向上していることを特徴とするアマドリアーゼ：
    （ａ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステイン；
    （ｂ）配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニン；および
    （ｃ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステイン。
  3. 　配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸の以下（ｄ）から（ｆ）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸が、以下（ｄ）から（ｆ）の各々に記載される置換後のアミノ酸残基へと置換されたアマドリアーゼ：
    （ｄ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の９７位のシステインがセリン、アスパラギン、アラニンのいずれかに置換されている；
    （ｅ）配列番号９に示すアミノ酸配列の３０２位のメチオニンがトリプトファンに置換されている；および
    （ｆ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列の３６０位のシステインがセリンに置換されている。
  4. 　以下の（ｇ）または（ｈ）で表されるアマドリアーゼ活性を有する親タンパク質を構成するアミノ酸配列において９７位のシステイン残基がセリン、アスパラギン、アラニンのいずれかに置換されたことを特徴とする改変タンパク質であるアマドリアーゼ：
    （ｇ）配列番号１、配列番号３または配列番号９に示すアミノ酸配列からなり、かつアマドリアーゼ活性を有するタンパク質；および
    （ｈ）（ｇ）のアミノ酸配列において、９７位のシステイン残基以外のアミノ酸の１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸からなり、かつアマドリアーゼ活性を有するタンパク質。
  5. 　請求項１から請求項４のいずれかに記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
  6. 　請求項５記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
  7. 　請求項６記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
  8. 　アマドリアーゼを製造する方法であり、以下の工程を含む方法：
    （i）請求項７記載の宿主細胞を培養する工程；
    （ii）宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程；および
    （iii）培養物からアマドリアーゼを単離する工程。
  9. 　請求項１から請求項４のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるためのキット。
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