JPWO2015020200A1 - 改変型アマドリアーゼ及びその製造法、並びにアマドリアーゼの界面活性剤耐性向上剤及びこれを用いたHbA1c測定用組成物 - Google Patents
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- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
- G01N2333/906—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7)
- G01N2333/9065—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5)
- G01N2333/90672—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on CH-NH groups of donors (1.5) with oxygen as acceptor (1.5.3) in general
Abstract
Description
(i)配列番号1、3、または37に示すアミノ酸配列に1または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および/または置換がなされたアミノ酸配列を有し、かつ/又は
(ii)配列番号1、3、または37に示すアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
前記アマドリアーゼ。
(i)262位のアスパラギン、
(ii)257位のバリン、
(iii)249位のグルタミン酸
(iv)253位のグルタミン酸、
(v)337位のグルタミン、
(vi)340位のグルタミン酸、
(vii)232位のアスパラギン酸、
(viii)129位のアスパラギン酸、
(ix)132位のアスパラギン酸、
(x)133位のグルタミン酸、
(xi)44位のグルタミン酸、
(xii)256位のグリシン、
(xiii)231位のグルタミン酸、及び
(xiv)81位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、[1]又は[2]記載のアマドリアーゼ。
以下の(i)から(xiv)の置換:
(i)262位のアスパラギンがヒスチジンに置換されている;
(ii)257位のバリンがシステイン、セリン、トレオニンに置換されている;
(iii)249位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(iv)253位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(v)337位のグルタミンがリジン、アルギニンに置換されている;
(vi)340位のグルタミン酸がプロリンに置換されている;
(vii)232位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(viii)129位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(ix)132位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(x)133位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている;
(xi)44位のグルタミン酸がプロリンに置換されている;
(xii)256位のグリシンがリジン、アルギニンに置換されている;
(xiii)231位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;及び
(xiv)81位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
のいずれか1以上を有する、[1]〜[3]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
(i)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(ii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(iii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(iv)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(v)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(vi)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(vii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(viii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;並びに
(ix)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、[1]〜[4]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
以下の(i)から(ix)の置換:
(i)247位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(ii)251位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(iii)335位のトレオニンがリジン、アルギニンに置換されている;
(iv)230位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(v)129位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(vi)132位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(vii)133位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている;
(viii)254位のアスパラギンがリジン、アルギニンに置換されている;及び
(ix)229位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
のいずれか1以上を有する、[1]〜[3]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
(i)251位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換;
(ii)132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(iii)133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;並びに
(iv)229位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、[1]〜[3]および[6]のいずれかに記載のアマドリアーゼ。
(i)[10]記載の宿主細胞を培養する工程;
(ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
(iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。
(i)界面活性剤を添加してから5分後の残存活性(%)が、添加しない場合と比較して、15%以上残存し、かつ/又は
(ii)終濃度0.04%の界面活性剤の存在下において、発色基質N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64)を添加し5分間反応させた後の751nmにおける吸光度と、糖化アミノ酸溶液または糖化ペプチド溶液の代わりにイオン交換水を用いた対照液添加から5分後の751nmにおける吸光度との差が0.006以上となるアマドリアーゼである、
[13]に記載の組成物。
以下の一般式(II)で表されるピリジニウム塩、
以下の一般式(III)で表されるホスホニウム塩、
並びにドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される1以上のイオン性界面活性剤である、[13]〜[16]のいずれかに記載の組成物。
1−デシルピリジニウムクロリド、1−デシルピリジニウムブロミド、1−ドデシルピリジニウムクロリド、1−ドデシルピリジニウムブロミド、1−テトラデシルピリジニウムクロリド、1−テトラデシルピリジニウムブロミド、1−ヘキサデシルピリジニウムクロリド、1−ヘキサデシルピリジニウムブロミド、N−セチル−2−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−2−メチルピリジニウムブロミド、N−セチル−3−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−3−メチルピリジニウムブロミド、N−セチル−4−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−4−メチルピリジニウムブロミド、1−オクタデシルピリジニウムクロリド、1−オクタデシルピリジニウムブロミド、1−エイコシルピリジニウムクロリド及び1−エイコシルピリジニウムブロミド、
テトラエチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、トリブチルメチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド、テトラ−n−オクチルホスホニウムクロリド、テトラ−n−オクチルホスホニウムブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、並びにテトラフェニルホスホニウムブロミド、
からなる群より選択される1以上のイオン性界面活性剤である、[17]に記載の組成物。
硫酸アンモニウム及びこれらの組合せからなる群より選択される1以上の安定化剤をさらに含む、[13]に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。
アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等とも称され、酸素の存在下で、イミノ2酢酸またはその誘導体(アマドリ化合物)を酸化して、グリオキシル酸またはα−ケトアルデヒド、アミノ酸またはペプチドおよび過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物または植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母または細菌等から得ることができる。
(2)257位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、トレオニンへの置換。
(3)249位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(4)253位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(5)337位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(6)340位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。
(7)232位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(8)129位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(9)132位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(10)133位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。
(11)44位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。
(12)256位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(13)231位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(14)81位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
(11)-(6) 44位のグルタミン酸の置換および340位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。
(11)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、262位のアスパラギンの置換および340位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。
(11)-(2)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換および340位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。
(11)-(7)-(2)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換、340位のグルタミン酸の置換、および232位のアスパラギン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。
(11)-(3)-(2)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換、340位のグルタミン酸の置換、および249位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。
(11)-(8)-(4)-(2)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、253位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換、340位のグルタミン酸の置換、および129位のアスパラギン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、および129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換を有する変異体。
(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、133位のグルタミン酸の置換、253位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換および340位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。
(11)-(10)-(4)-(2)-(1)-(5)-(6) 44位のグルタミン酸の置換、133位のグルタミン酸の置換、253位のグルタミン酸の置換、257位のバリンの置換、262位のアスパラギンの置換、337位のグルタミンのリジンへの置換および340位のグルタミン酸の置換、例えば、44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンまたはアルギニンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換を有する変異体。
(i)247位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(ii)251位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(iii)335位のトレオニンの置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(iv)230位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(v)129位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(vi)132位のアスパラギン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;
(vii)133位のグルタミン酸の置換、例えばアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換;
(viii)254位のアスパラギンの置換、例えばリジン、アルギニンへの置換;及び
(ix)229位のグルタミン酸の置換、例えばリジン、アルギニンへの置換。
配列番号37に示すアミノ酸配列において、以下の(i)から(iv):
(i)251位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換を有する変異体;
(ii)132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体;
(iii)133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体;並びに
(iv)229位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換を有する変異体。
これらのアマドリアーゼをコードする本発明の遺伝子(以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう。)を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience,1989)記載の方法により、染色体DNAまたはmRNAを抽出することができる。さらにmRNAを鋳型としてcDNAを合成することができる。このようにして得られた染色体DNAまたはcDNAを用いて、染色体DNAまたはcDNAのライブラリーを作製することができる。
本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなくそれ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、pBluescriptII SK+(STRATAGENE社製)等が好ましい。
アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体DNAと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法;紫外線照射法;遺伝子工学的手法;またはタンパク質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
上述の如くして得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞もしくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、得られた組換え体DNAを用いて、任意の宿主、例えば、エッシェリシア属に属する微生物、具体例としては大腸菌K−12株、好ましくは大腸菌JM109株、大腸菌DH5α株(ともにタカラバイオ社製)や大腸菌B株、好ましくは大腸菌BL21株(ニッポンジーン社製)等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得ることができる。
アミノ酸配列の同一性は、GENETYX Ver.11(ゼネティックス社製)のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラムまたはDNASIS Pro(日立ソフト社製)のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。
「アミノ酸に対応する位置」とは、配列番号1に示すConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列の特定の位置のアミノ酸に対応する他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における位置をいう。
なお、本発明において、「配列番号1記載のアミノ酸配列の44位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号1に示されるConiochaeta属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号1のアマドリアーゼの44位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図1−1により特定することができる。
上記のようにして得られた界面活性剤耐性の優れたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、可能な限り液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
本発明における界面活性剤としては、本発明のHbA1cの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられるが、特にカチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤が好ましい。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は1以上の界面活性剤を包含するものとする。
本発明はアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む糖化ヘモグロビン測定用キットを提供する。界面活性剤は非イオン性又はイオン性界面活性剤とすることができる。また、アマドリアーゼと界面活性剤とは、キット中に同一又は別個の成分として含まれ得る。一般に、同一の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤はアマドリアーゼを失活させない濃度で含まれるのが好ましい。別個の成分としてアマドリアーゼと界面活性剤とがキット中に含まれる場合、界面活性剤は測定時における終濃度よりも高濃度のストック溶液を用いてもよい。このストック溶液を適宜希釈して、測定に用いる溶液を調製する。
本発明のキット又は組成物には、アマドリアーゼの活性が失活しない範囲であるpH5.0〜pH10.0、好ましくはpH6.0〜pH8.0の範囲で緩衝能を有する緩衝剤または緩衝液を適宜加えて良い。本明細書において緩衝剤というとき、特に断らない限り、この用語は1以上の緩衝剤を包含するものとする。緩衝液とは溶液のpHを一定範囲に保つ緩衝作用(緩衝能)のある溶液のことをいい、緩衝剤とは溶液に緩衝作用を付与する物質をいう。緩衝剤は、弱酸を例にとると、弱酸とその塩から構成され、この場合、当該塩を共役塩と呼ぶ。例えば緩衝剤がリン酸とそのカリウム塩から構成される場合、本明細書ではベースとなる化合物がリン酸であることからこれを便宜上、リン酸緩衝剤と呼ぶことがある。またある緩衝剤についての濃度は、当該緩衝剤のベースとなる化合物の単独形態とその共役塩の形態とを合計したベース化合物についての濃度をいう。例えば100mMのリン酸緩衝剤というとき、これは終濃度として溶液に含まれるリン酸及びその共役塩(例えばリン酸カリウム塩)を合計したリン酸濃度が100mMであることをいう。
本発明のキット又は組成物には、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する安定化剤を適宜加えてもよい。本明細書において安定化剤とは、界面活性剤存在下でのアマドリアーゼの残存活性を維持する又は残存活性の低下を軽減する物質を言う。本明細書において安定化剤というとき、特に断らない限り、この表現は1以上の安定化剤を包含するものとする。本発明のキット又は組成物に含まれる安定化剤(安定剤)としては、例えば、リン酸、トリカルボン酸(例えば、クエン酸)、ジカルボン酸(例えば、リンゴ酸、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸)、モノカルボン酸(例えば、酢酸)、式(IV)で表される化合物(例えばMES、MOPS、MOPSO)、硫酸アンモニウム、これらの塩及びこれらの任意の組合せが挙げられる。
上記のような手段で得られる本発明のアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、改変前のものと比較して界面活性剤耐性が向上していることを特徴とする。具体的には、改変前のアマドリアーゼの活性と比較して、改変アマドリアーゼは、本明細書中に記載の活性測定方法および界面活性剤耐性評価方法に記載した反応条件下で、所定の界面活性剤処理、例えば、0.01%(w/v)のヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド(以下、「CTAC」と表す)を添加してから、30℃、5分後の残存活性(%)が、向上していることを特徴とする。ここで、残存活性(%)とは、界面活性剤処理前の活性を100とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合をパーセンテージ(%)で表したものである。なお、本明細書において界面活性剤の濃度をパーセンテージで記載する場合、特に断らない限りこれは%(w/v)を意味するものとする。
アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
(1)試薬1:POD−4−AA溶液
4.0kUのパーオキシダーゼ(キッコーマン社製)、100mgの4−アミノアンチピリン(東京化成工業社製)を0.1Mのリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)に溶解し、1Lに定容する。
500mgのTOOS(N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学社製)をイオン交換水に溶解し、100mlに定容する。
フルクトシルバリン417mgをイオン交換水に溶解して10mlに定容する。
2.7mlの試薬1,100μlの試薬2、および100μlの試薬3を混和し、37℃で5分間予備加温する。その後、酵素液を100μl加えてよく混ぜた後、分光光度計(U−3010、日立ハイテクノロジーズ社製)により、555nmにおける吸光度を測定する。測定値は、555nmにおける1分後から3分後の1分間あたりの吸光度変化とする。なお対照液は、100μlの試薬3の代わりに100μlのイオン交換水を加える以外は前記と同様に調製する。37℃、1分当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(U)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)= {(ΔAs−ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs : 反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0 : 対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2: 反応により生成されるキノンイミン色素の
ミリモル吸光係数(mM−1・cm−1)
0.5 : 1molの過酸化水素による生成されるキノンイミン色素のmol数
df : 希釈係数
アマドリアーゼ粗酵素液、またはアマドリアーゼ精製標品を約1.0U/mlとなるように、30mM MES/21mM Tris緩衝液(pH6.5)で希釈し、CTAC(例えば、東京化成工業社製)を終濃度0.01%(w/v)または0.04%となるように添加後、30℃にて5分間加温する。加温後、0.15%のBSAを含む10mM リン酸緩衝液(pH7.0)で2倍希釈し、上述のB.の方法を用いて界面活性剤処理前と界面活性剤処理後のサンプルの酵素活性を測定し、界面活性剤処理前の活性を100とした場合の界面活性剤処理後の活性の割合、すなわち、残存活性(%)を求めることにより、界面活性剤耐性を評価する。
上記の界面活性剤耐性測定方法において、30mM MES/21mM Tris緩衝液の代わりに種々の緩衝剤を用いてアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、緩衝剤によるアマドリアーゼ活性残存への寄与を評価することができる。例えば30mM MES/21mM Tris緩衝液(pH 6.5)の代わりに、リン酸緩衝液(pH 7.0)、クエン酸緩衝液(pH 6.0)、HEPES緩衝液(pH 7.0)、ACES緩衝液(pH 7.0)等を用いることができる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
上記の界面活性剤耐性測定方法において、種々の安定化剤をさらに添加してアマドリアーゼの残存活性の測定を行うことで、当該安定化剤の作用を評価することができる。評価対象である安定化剤が緩衝作用をも有する化合物である場合、当該化合物の緩衝作用によるアマドリアーゼ活性残存への寄与によらないアマドリアーゼ安定化作用を評価するためには、アマドリアーゼ安定化作用を有しない緩衝剤を溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度で使用しつつ(例えばHEPES(pH 7.0)を500mMにて使用)、安定化剤を低濃度で、すなわち溶液に緩衝能を付与するには十分でない低濃度で用いることができる。溶液に緩衝能を付与するのに十分な濃度とは、当該溶液に添加する他の試薬に起因するpH変動が生じずpHが一定の範囲(例えばpH5〜10、pH6〜8)に保たれる濃度をいう。溶液に緩衝能を付与するには十分でない濃度とは、当該溶液に他の試薬を添加するとpH変動が生じpHが一定範囲から逸脱する濃度をいう。これらの濃度は溶液に添加される他の試薬の種類及び量に応じて変化するが、当業者であれば慣用法により該濃度を適宜決定することができる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
本発明の緩衝剤と、本発明の安定化剤とを併用した場合のアマドリアーゼ安定作用を評価するために、本発明のアマドリアーゼ及び界面活性剤を含む溶液に、安定化剤及び緩衝剤を適宜濃度調整しつつ添加し、アマドリアーゼの残存活性を測定することもできる。他の条件及び手順は上記の界面活性剤耐性測定方法と同様としうる。
(界面活性剤耐性向上型変異について)
(1)組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAの調製
CFP−T7遺伝子(配列番号2)を含む組換え体プラスミドを有する大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株(国際公開2007/125779号参照)を、LB−amp培地[1%(W/V) バクトトリプトン、0.5%(W/V) ペプトン、0.5%(W/V) NaCl、50μg/ml Ampicilin]2.5mlに接種して、37℃で20時間振とう培養し、培養物を得た。
得られた組換え体プラスミドpKK223−3−CFP−T7 DNAを鋳型として、配列番号5、6の合成オリゴヌクレオチド、KOD−Plus−(東洋紡績社製)を用い、以下の条件でPCR反応を行った。
上記の手順により得られた上記組換え体プラスミドを保持するそれぞれの大腸菌JM109株を、0.1mMのIPTGを添加したLB−amp培地3mlにおいて、30℃で16時間培養した。その後、各菌体をpH7.0の0.01Mリン酸緩衝液で洗浄、超音波破砕、15,000rpmで10分間遠心分離し、各粗酵素液1.5mlを調製した。
このようにして調製した各粗酵素液をサンプルとし、CTACの終濃度を0.01%として、上記の界面活性剤耐性測定法に従って、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表1−1に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。表1−1において、CFP−T7は、大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株由来のアマドリアーゼを示す。なお、本実施例では大腸菌JM109(pKK223−3−CFP−T7)株由来のアマドリアーゼであるCFP−T7を変異元酵素としたため、表中に記載の「アミノ酸変異」の記載には、CFP−T7に既に導入済みの各種変異点は含めていない。
配列番号37はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼ(以降CcFXと称する)のアミノ酸配列である(国際公開第2004/104203号)。配列番号37のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号55)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した(終止コドンTAAを含む)。このとき、配列番号55の5´末端、3´末端にはそれぞれEcoRIサイトとHindIIIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図1のCcFXの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号55の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をEcoRIサイトとHindIIIサイト(タカラバイオ社製)の2種類の制限酵素で処理し、pKK−223−3 Vector(GEヘルスケア社製)のEcoRI−HindIIIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドpKK223−3−CcFXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌JM109株を形質転換し、大腸菌JM109(pKK223−3−CcFX)株を得た。
(界面活性剤耐性向上型変異の蓄積)
実施例1で見出された界面活性剤耐性向上変異の知見に基づき、これらを組み合わせて変異を蓄積させることにより、さらに界面活性剤耐性を高めたアマドリアーゼを取得することを目的として、多重変異体(2重変異体、3重変異体、4重変異体、5重変異体、6重変異体、7重変異体)の作製による界面活性剤耐性向上型変異の蓄積を試みた。
(界面活性剤TTACに対する評価)
実施例2で用いた界面活性剤CTACに変わり、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド(以下、「TTAC」と表記。)を用いて、CFP−Dの安定性を評価した。実施例1に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で希釈し、0.04%のTTACの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表3−1に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
(CFP−T7、CFP−D2、CFP−D7の精製)
実施例1,2で得たCFP―T7、CFP−D2およびCFP−D7の粗酵素を用いて、調製した粗酵素液を20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で平衡化した4mlのQ Sepharose Fast Flow樹脂(GEヘルスケア社製)に吸着させ、次に80mlの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて100mM NaClを含む20mM リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)で樹脂に吸着していた蛋白質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
種々の界面活性剤を用い、上記のようにして得た精製酵素CFP−T7、CFP−D2およびCFP−D7の安定性を評価した。実施例1に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)で希釈し、各種濃度の界面活性剤の混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表3−2に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
(界面活性剤SDSに対する評価)
実施例2で用いた界面活性剤CTACに変わり、ドデシル硫酸ナトリウム(以下、「SDS」と表記。)を用いて、CFP−Dの安定性を評価した。実施例1に準じた界面活性剤耐性測定方法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、アマドリアーゼを30mM MES/21mM Tris緩衝液(pH6.5)で希釈し、0.04%のSDSの混合を行うことで、各種改変型アマドリアーゼの界面活性剤耐性評価を行った。結果を表4に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
実施例3−2で得たCFP−T7、およびCFP−D7の精製酵素を用いて、下記に示した試料の測定を実施した。なお、CFP−T7、およびCFP−D7の活性値はアマドリアーゼ活性の測定方法に記載の方法に従い、終濃度5mMのαFVHを基質として、pH7.0に調整した(試薬1)を用いて決定した。
(試薬4)αFVH 125mgをイオン交換水に溶解し、10mlに定容することにより、基質溶液30mMを得た。さらに、CTAC溶液で714倍希釈することにより、42μMのαFVH/0%〜0.2%のCTAC溶液を得た。
(試薬5)
0.21mM DA−64(N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム、和光純薬工業社製)
20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
(試薬6)
6.7U/ml CFP−T7、あるいはCFP−D7
19U/ml パーオキシダーゼ(キッコーマン社製)
20mM リン酸カリウム緩衝液(pH7.0)
予め37℃で5分間加温しておいた135μlの(試薬5)と上記(11)で調製した25μlの試料の混合溶液に対し、50μlの(試薬6)を添加して反応を開始し、37℃で5分間反応後の波長751nmにおける吸光度を自動分析装置Bio Majesty JCA‐BM1650(日本電子)で測定した。基質溶液の代わりにイオン交換水を用いて作製した(試薬4)に対しても、同様に操作して測定した波長751nmにおける吸光度(試薬ブランク)を対照として、下記の式により、それぞれの試料を測定した場合の吸光度変化量(差)を算出した。発色基質DA−64の終濃度は0.15mMであり、基質ありの場合はαFVHの終濃度は5μMであり、吸光度測定に用いたセルの長さ(光路)は1cmであった。
吸光度変化量=ΔAes−Ae0
ΔAes:反応開始から5分経過後の吸光度
ΔAe0:対照液を添加した場合の反応開始から5分経過後の吸光度
(界面活性剤混合下におけるフルクトシルペプチド試料の定量)
CFP−T7、およびCFP−D7の精製酵素を用いて、CTAC混合下において、0.5〜3μMの範囲でαFVH測定値の直線性を比較した。CFP−T7は、0.01%または0.02%のCTAC混合をし、さらに4.2μM、8.4μM、13μM、17μM、21μMまたは25μMのαFVH、つまり終濃度では、0.5μM、1.0μM、1.5μM、2.0μM、2.5μMまたは3.0μMのαFVHを用いる条件で、実施例5と同様に吸光度変化量を測定し、相関係数を算出した。同様に、CFP−D7は、0.02%または0.2%のCTAC混合をし、上記と同様のαFVHを用いる条件で、実施例5と同様に吸光度変化量を測定し、相関係数を算出した。その結果を表6に示し、各相関データを図2、3、4、5に示す。図2は、0.01%のCTACの混合下でCFP−T7を用いて、αFVHを測定した結果であり、図3は、0.02%のCTACの混合下でCFP−T7を用いて、αFVHを測定した結果であり、図4は、0.02%のCTACの混合下でCFP−D7を用いて、αFVHを測定した結果であり、図5は、0.2%のCTACの混合下でCFP−D7を用いて、αFVHを測定した結果である。
(各種アマドリアーゼの界面活性剤耐性の評価)
界面活性剤、好ましくはイオン性界面活性剤の存在下においても活性が残存するアマドリアーゼを含む糖化ヘモグロビン測定用組成物を提供するために、上述のようにConiochaeta属由来アマドリアーゼを改変して界面活性剤耐性を向上させた。また、Coniochaeta属由来アマドリアーゼ以外のアマドリアーゼにおいては、イオン性界面活性剤存在下においてのHbA1c測定が可能か知られていない。そこで、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼおよびNeocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼとイオン性界面活性剤を組み合わせて、αFVHの測定を試みた。
配列番号40はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ(以降PnFXと称する)のアミノ酸配列である(Biotechnology and Bioengineering, 106, 358−366, 2010参照)。配列番号40のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号44)を定法である遺伝子断片のPCRによる全合成によりcDNAを全合成することで取得した。このとき、配列番号40の5´末端、3´末端にはそれぞれNdeIサイトとBamHIサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図1のPnFXの配列と一致していることを確認した。続いて、取得した配列番号44の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をNdeIサイトとBamHI(タカラバイオ社製)の2種類の制限酵素で処理し、pET−22b(+) Vector(ノバジェン社製)のNdeI−BamHIサイトに挿入することで、組換え体プラスミドpET22b−PnFXを取得し、上記と同様の条件で大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、大腸菌BL21(DE3)(pET22b−PnFX)株を得た。
配列番号38はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ(NvFX)のアミノ酸配列であり、配列番号38のアミノ酸配列をコードする遺伝子(配列番号45)を挿入した組換え体プラスミドpET22b―NvFXを大腸菌で発現させることにより、NvFXの活性が確認されている(国際公開第2012/18094号参照)。実施例1と同様に大腸菌BL21(DE3)株を形質転換し、得られた大腸菌BL21(DE3)(pET22b―NvFX)株を用いて上記の方法で培養して、NvFXの粗酵素液を調製した。
(各種緩衝剤存在下におけるアマドリアーゼの界面活性剤耐性評価)
30mM MES/21mM Tris緩衝剤(pH6.5)以外の緩衝剤を用いた場合に、アマドリアーゼの界面活性剤耐性が向上するか検討した。上記のように精製したCFP−T7をサンプルとし、CTACの終濃度を0.01%として、30mM MES/21mM Tris緩衝剤(pH6.5)の代わりに各種緩衝剤、具体的にはリン酸とリン酸カリウムとを含むリン酸緩衝剤(pH7.0)、クエン酸とクエン酸ナトリウムとを含むクエン酸緩衝剤(pH6.0)、MESとそのナトリウム塩とを含むMES緩衝剤(pH7.0)、HEPESとそのナトリウム塩とを含むHEPES緩衝剤(pH7.0)、ACESとそのナトリウム塩とを含むACES緩衝剤(pH7.0)の存在下において、実施例1の界面活性剤耐性測定法に従って、CFP−T7の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表8に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
(各安定化剤添加時におけるアマドリアーゼの界面活性剤耐性評価)
種々の安定化剤を添加した際に、アマドリアーゼの界面活性剤耐性が向上するか検討した。安定化剤として、リン酸、トリカルボン酸(例えば、クエン酸)、ジカルボン酸(例えば、リンゴ酸、マレイン酸、シトラコン酸、マロン酸、グルタル酸、酒石酸)、モノカルボン酸(例えば、酢酸)、MES、MOPS、MOPSO、硫酸アンモニウムを用いた。また比較例としてCHESを用いた。安定化剤を添加した際に、pHの変化を防ぐようにするために、緩衝液は500mM HEPES(pH7.0)を用い、上記のように精製したCFP−T7をサンプルとし、CTACの終濃度を0.01%として、さらに、種々の安定化剤を添加し、実施例1の界面活性剤耐性測定法に従って、CFP−T7の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表9−1、9−2に示す。また、500mM HEPES(pH7.0)緩衝剤を用い、上記のように精製したCFP−D2をサンプルとし、さらに、種々の安定化剤を添加し、実施例1の界面活性剤耐性測定法に従って、ただし、界面活性剤処理条件に関しては、CTACの終濃度を0.08%、処理温度を37℃とより過酷な条件を設定し、CFP−D2の界面活性剤耐性評価を行った。結果を表9−3に示す。実際に、安定化剤を添加した際に、pHは実際に7.0を示すことを確認した。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
に包含されるMES(n=1, R10はH)、MOPS(n=2, R10はいずれもH)、MOPSO(n=2, R10はOHおよびH)はいずれもアマドリアーゼ安定化作用を示した。以上のことから、リン酸、トリカルボン酸、ジカルボン酸、モノカルボン酸、MES、MOPS、MOPSO等の式(IV)で表される化合物、硫酸アンモニウムには、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる効果があることを示している。また、本発明の変異を導入していないアマドリアーゼCFP−T7についても、本発明の変異を導入したアマドリアーゼCFP−D2についても界面活性剤耐性の向上が観察された。
Coniochaeta属由来アマドリアーゼ以外のアマドリアーゼとして、例えば、PnFXに対し、上記の安定化剤は界面活性剤耐性向上効果があるか検討した。安定化剤は上記と同様のものを用い、安定化剤を添加した際に、pHの変化を防ぐようにするために、緩衝液は300mM HEPES(pH7.0)を用い、上記のように精製したPnFXをサンプルとし、CTACの終濃度を0.04%として、上記と同様に、PnFXの界面活性剤耐性評価を行った。実際に、安定化剤を添加した際に、pHは実際に7.0を示すことを確認した。結果を表10に示す。なお加温後のサンプルをBSA溶液で2倍希釈してから30分後に再度活性測定を行っても、活性値に変化がないことを確認した。
配列番号2. CFP−T7の遺伝子配列
配列番号3. CFP−Dのアミノ酸配列
配列番号4. CFP−Dの遺伝子配列
配列番号5. N262H導入プライマーFw
配列番号6. N262X導入プライマーRv
配列番号7. V257C導入プライマーFw
配列番号8. V257X導入プライマーRv
配列番号9. V257S導入プライマーFw
配列番号10. V257T導入プライマーFw
配列番号11. E253K導入プライマーFw
配列番号12. E253X導入プライマーRv
配列番号13. E253R導入プライマーFw
配列番号14. Q337K導入プライマーFw
配列番号15. Q337X導入プライマーRv
配列番号16. E340P導入プライマーFw
配列番号17. E340X導入プライマーRv
配列番号18. E133A導入プライマーFw
配列番号19. E133X導入プライマーRv
配列番号20. E133M導入プライマーFw
配列番号21. E133K導入プライマーFw
配列番号22. E44P導入プライマーFw
配列番号23. E44X導入プライマーRv
配列番号24. G256K導入プライマーFw
配列番号25. G256R導入プライマーFw
配列番号26. E81K導入プライマーFw
配列番号27. E81X導入プライマーRv
配列番号28. F43Y/E44P導入プライマーFw
配列番号29. V257X/N262H導入プライマーRv
配列番号30. E253K/V257C導入プライマーFw
配列番号31. E253X/V257C/N262H導入プライマーRv
配列番号32. Q337K/E340P導入プライマーFw
配列番号33. Q337X/E340P導入プライマーRv
配列番号34. Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ
配列番号35. Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号36. Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号37. Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号38. Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ
配列番号39. Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号40. Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ
配列番号41. Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号42. Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号43. Penicillium crysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ
配列番号44. Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼの遺伝子
配列番号45. Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
配列番号46. D129K導入プライマーFw
配列番号47. D129K導入プライマーRv
配列番号48. D132K導入プライマーFw
配列番号49. E231K導入プライマーFw
配列番号50. E231X導入プライマーRv
配列番号51. D232K導入プライマーFw
配列番号52. E249K導入プライマーFw
配列番号53. E249K導入プライマーRv
配列番号54. E249K/V257C導入プライマーRv
配列番号55. Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼの遺伝子
配列番号56. CcFXのD129K導入プライマーFw
配列番号57. CcFXのD129K導入プライマーRv
配列番号58. CcFXのD132K導入プライマーFw
配列番号59. CcFXのE133K導入プライマーFw
配列番号60. CcFXのE133A導入プライマーFw
配列番号61. CcFXのE133X導入プライマーRv
配列番号62. CcFXのE229K導入プライマーFw
配列番号63. CcFXのD230K導入プライマーFw
配列番号64. CcFXのD230X導入プライマーRv
配列番号65. CcFXのE247K導入プライマーFw
配列番号66. CcFXのE247K導入プライマーRv
配列番号67. CcFXのE251K導入プライマーFw
配列番号68. CcFXのE251X導入プライマーRv
配列番号69. CcFXのE251R導入プライマーFw
配列番号70. CcFXのN254K導入プライマーFw
配列番号71. CcFXのN254K導入プライマーRv
配列番号72. CcFXのT335K導入プライマーFw
配列番号73. CcFXのT335X導入プライマーRv
配列番号74. CcFXのT335R導入プライマーFw
Claims (26)
- 界面活性剤を添加してから5分後の残存活性(%)が、配列番号1、3、または37に示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼと比較して向上しているアマドリアーゼであって、
(i)配列番号1、3、または37に示すアミノ酸配列に1または数個のアミノ酸の欠失、挿入、付加、および/または置換がなされたアミノ酸配列を有し、かつ/又は
(ii)配列番号1、3、または37に示すアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有する、
前記アマドリアーゼ。 - 界面活性剤がイオン性界面活性剤である、請求項1記載のアマドリアーゼ。
- 配列番号1または3に示すアミノ酸配列における以下の(i)から(xiv):
(i)262位のアスパラギン、
(ii)257位のバリン、
(iii)249位のグルタミン酸
(iv)253位のグルタミン酸、
(v)337位のグルタミン、
(vi)340位のグルタミン酸、
(vii)232位のアスパラギン酸、
(viii)129位のアスパラギン酸、
(ix)132位のアスパラギン酸、
(x)133位のグルタミン酸、
(xi)44位のグルタミン酸、
(xii)256位のグリシン、
(xiii)231位のグルタミン酸、及び
(xiv)81位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で1つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する、請求項1又は2記載のアマドリアーゼ。 - 配列番号1または3に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の(i)から(xiv)の置換:
(i)262位のアスパラギンがヒスチジンに置換されている;
(ii)257位のバリンがシステイン、セリン、トレオニンに置換されている;
(iii)249位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(iv)253位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(v)337位のグルタミンがリジン、アルギニンに置換されている;
(vi)340位のグルタミン酸がプロリンに置換されている;
(vii)232位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(viii)129位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(ix)132位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(x)133位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている;
(xi)44位のグルタミン酸がプロリンに置換されている;
(xii)256位のグリシンがリジン、アルギニンに置換されている;
(xiii)231位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;及び
(xiv)81位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
のいずれか1以上を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - 配列番号1または3に示すアミノ酸配列において、以下の(i)から(ix):
(i)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(ii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(iii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(iv)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および232位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(v)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および249位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(vi)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;
(vii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換および129位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(viii)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換;並びに
(ix)44位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換、133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換、253位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換、257位のバリンに対応する位置のアミノ酸のシステインへの置換、262位のアスパラギンに対応する位置のアミノ酸のヒスチジンへの置換、337位のグルタミンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および340位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のプロリンへの置換
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、請求項1〜4のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - 配列番号37に示すアミノ酸配列のアミノ酸が、
以下の(i)から(ix)の置換:
(i)247位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(ii)251位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(iii)335位のトレオニンがリジン、アルギニンに置換されている;
(iv)230位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(v)129位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(vi)132位のアスパラギン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
(vii)133位のグルタミン酸がアラニン、メチオニン、リジン、アルギニンに置換されている;
(viii)254位のアスパラギンがリジン、アルギニンに置換されている;及び
(ix)229位のグルタミン酸がリジン、アルギニンに置換されている;
のいずれか1以上を有する、請求項1〜3のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - 配列番号37に示すアミノ酸配列において、以下の(i)から(iv):
(i)251位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンの置換;
(ii)132位のアスパラギン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
(iii)133位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のアラニンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;並びに
(iv)229位のグルタミン酸に対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換および335位のトレオニンに対応する位置のアミノ酸のリジンへの置換;
よりなる群から選択されるアミノ酸残基の置換を有する、請求項1〜3および6のいずれか1項に記載のアマドリアーゼ。 - 請求項1〜7のいずれか1項に記載のアミノ酸配列をコードするアマドリアーゼ遺伝子。
- 請求項8記載のアマドリアーゼ遺伝子を含む組換えベクター。
- 請求項9記載の組換えベクターを含む宿主細胞。
- 以下の工程:
(i)請求項10記載の宿主細胞を培養する工程;
(ii)宿主細胞に含まれるアマドリアーゼ遺伝子を発現させる工程;及び
(iii)培養物からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼを製造する方法。 - 請求項1〜7のいずれかに記載のアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビンの測定に用いるための組成物。
- 1以上の界面活性剤及びアマドリアーゼを含む、糖化ヘモグロビン測定用組成物。
- アマドリアーゼが、
(i)界面活性剤を添加してから5分後の残存活性(%)が、添加しない場合と比較して、15%以上残存し、かつ/又は
(ii)終濃度0.04%の界面活性剤の存在下において、発色基質N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4′−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム(DA−64)を添加し5分間反応させた後の751nmにおける吸光度と、糖化アミノ酸溶液または糖化ペプチド溶液の代わりにイオン交換水を用いた対照液添加から5分後の751nmにおける吸光度との差が0.006以上となるアマドリアーゼである、
請求項13に記載の組成物。 - アマドリアーゼが配列番号1、3、37または40に示すアミノ酸配列と少なくとも70%の同一性を有するアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである、請求項13又は14に記載の組成物。
- 界面活性剤が、70mM以下の臨界ミセル濃度を有するものである、請求項13〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 界面活性剤が、以下の一般式(I)で表される第四級アンモニウム塩、
以下の一般式(II)で表されるピリジニウム塩、
以下の一般式(III)で表されるホスホニウム塩、
並びにドデシル硫酸ナトリウムからなる群より選択される1以上のイオン性界面活性剤である、請求項13〜16のいずれか1項に記載の組成物。 - 界面活性剤が、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド、オクチルトリメチルアンモニウムブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド、ジオクチルジメチルアンモニウムブロミド、デシルトリメチルアンモニウムクロリド、デシルトリメチルアンモニウムブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ドデシルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロミド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド、オクタデシルトリメチルアンモニウムブロミド、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びエイコシルトリメチルアンモニウムブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド、およびベンジルセチルジメチルアンモニウムブロミド、
1−デシルピリジニウムクロリド、1−デシルピリジニウムブロミド、1−ドデシルピリジニウムクロリド、1−ドデシルピリジニウムブロミド、1−テトラデシルピリジニウムクロリド、1−テトラデシルピリジニウムブロミド、1−ヘキサデシルピリジニウムクロリド、1−ヘキサデシルピリジニウムブロミド、N−セチル−2−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−2−メチルピリジニウムブロミド、N−セチル−3−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−3−メチルピリジニウムブロミド、N−セチル−4−メチルピリジニウムクロリド、N−セチル−4−メチルピリジニウムブロミド、1−オクタデシルピリジニウムクロリド、1−オクタデシルピリジニウムブロミド、1−エイコシルピリジニウムクロリド及び1−エイコシルピリジニウムブロミド、
テトラエチルホスホニウムクロリド、テトラエチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド、トリブチルメチルホスホニウムブロミド、トリブチルメチルホスホニウムヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド、テトラブチルホスホニウムブロミド、テトラ−n−オクチルホスホニウムクロリド、テトラ−n−オクチルホスホニウムブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド、トリブチルドデシルホスホニウムブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド、メチルトリフェニルホスホニウムブロミド、メチルトリフェニルホスホニウムヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、並びにテトラフェニルホスホニウムブロミド、
からなる群より選択される1以上のイオン性界面活性剤である、請求項17に記載の組成物。 - 含まれる界面活性剤が、測定時における終濃度として、0.01%(w/v)以上である、請求項13〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- ホウ酸緩衝剤、トリス塩酸緩衝剤、リン酸緩衝剤、クエン酸緩衝剤、フマル酸緩衝剤、グルタル酸緩衝剤、シトラコン酸緩衝剤、メサコン酸緩衝剤、マロン酸緩衝剤、酒石酸緩衝剤、コハク酸緩衝剤、アジピン酸緩衝剤、ACES(N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝剤、BES(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝剤、Bicin(N,N-ビス(2-ヒドロキシエチル)グリシン)緩衝剤、Bis−Tris(ビス(2-ヒドロキシエチル)イミノトリス(ヒドロキシメチル)メタン)緩衝剤、EPPS(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンプロパンスルホン酸)緩衝剤、HEPPSO(N-(ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝剤、MES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)緩衝剤、MOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)緩衝剤、MOPSO(2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤、PIPES(ピペラジン-N,N'-ビス(2-エタンスルホン酸))緩衝剤、POPSO(ピペラジン-1,4-ビス(2-ヒドロキシプロパンスルホン酸))緩衝剤、TAPS(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-3-アミノプロパンスルホン酸)緩衝剤、TAPSO(3-[N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]-2-ヒドロキシプロパンスルホン酸)緩衝剤、TES(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチル-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝剤、トリシン(N-トリス(ヒドロキシメチル)メチルグリシン)緩衝剤及びこれらの組合せからなる群より選択される1以上の緩衝剤をさらに含む、請求項13に記載の糖化ヘモグロビン測定用組成物。
- 測定溶液における終濃度が100mM以上となるリン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が10mM以上となるクエン酸緩衝剤、測定溶液における終濃度が150mM以上となるMES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるMOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)緩衝剤、測定溶液における終濃度が100mM以上となるMOPSO(2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸)緩衝剤、及び測定溶液における終濃度が200mM以上となるACES(N-(2-アセトアミド)-2-アミノエタンスルホン酸)緩衝剤からなる群より選択される1以上の緩衝剤を含む、請求項20に記載の組成物。
- トリカルボン酸がクエン酸であるか、または、ジカルボン酸がフマル酸、グルタル酸、シトラコン酸、メサコン酸、マロン酸、酒石酸、コハク酸、アジピン酸、マレイン酸、リンゴ酸及びこれらの組合せからなる群より選択されるものであるか、モノカルボン酸が酢酸であるか、または、式(IV)の化合物がMES、MOPS、MOPSO及びこれらの組合せからなる群より選択されるものである、請求項22に記載の組成物。
- 前記安定化剤が、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリン酸、測定溶液における終濃度が0.2mM以上となるクエン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるリンゴ酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマレイン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるシトラコン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるマロン酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となるグルタル酸、測定溶液における終濃度が2mM以上となる酒石酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となる酢酸、測定溶液における終濃度が10mM以上となるMES(2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸)、測定溶液における終濃度が10mM以上となるMOPS(3-(N-モルホリノ)プロパンスルホン酸)、測定溶液における終濃度が10mM以上となるMOPSO(2-ヒドロキシ-3-モルホリノプロパンスルホン酸)、測定溶液における終濃度が2mM以上となる硫酸アンモニウム、及びこれらの組合せからなる群より選択される1以上の安定化剤である、請求項22または23に記載の組成物。
- 請求項20又は21に記載の緩衝剤、及び、請求項22、23又は24に記載の安定化剤を含む糖化ヘモグロビン測定用組成物。
- アマドリアーゼが、配列番号1、配列番号37もしくは配列番号40のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または請求項1〜7のいずれか1項に記載のアマドリアーゼである、請求項20〜25のいずれか1項に記載の組成物。
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