WO2007010950A1 - 糖化蛋白質の測定方法および測定キット - Google Patents

糖化蛋白質の測定方法および測定キット Download PDF

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WO2007010950A1
WO2007010950A1 PCT/JP2006/314299 JP2006314299W WO2007010950A1 WO 2007010950 A1 WO2007010950 A1 WO 2007010950A1 JP 2006314299 W JP2006314299 W JP 2006314299W WO 2007010950 A1 WO2007010950 A1 WO 2007010950A1
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WO
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amino acid
oxidase
sugar
glycated
peptide
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PCT/JP2006/314299
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kozo Hirokawa
Kazuhiko Shimoji
Original Assignee
Kikkoman Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring glycoprotein, which reduces measurement errors in measurement of glycoproteins such as glycohemoglobin and obtains accurate measurement values, and a reagent for eliminating the cause of measurement errors And a kit for measuring glycoprotein.
  • Glycoprotein is a protein in which a protein is non-enzymatically saccharified, and is a sugar, that is, an aldehyde group on the side of aldose (a monosaccharide and a derivative having a potential aldehyde group) and a protein side.
  • the amino group of is produced by a non-enzymatic covalent bond.
  • Examples of the amino group on the protein side include an N-terminal ⁇ -amino group, a side chain ⁇ -amino group of an internal lysine residue, and the like.
  • ⁇ -Glycoprotein is produced.
  • These glycoproteins are also called so-called Amadori compounds because the Schiff base generated as a reaction intermediate undergoes Amadori transfer.
  • Glycoprotein is contained, for example, in body fluids such as blood in a living body and biological samples such as hair.
  • body fluids such as blood in a living body
  • glycoproteins present in the blood include glycoprotein hemoglobin, glycated albumin, etc., and the production of these glycoproteins is caused by sugars such as darcos dissolved in serum. Strongly depends on the concentration of.
  • Glycoprotein production is known to increase in diabetic conditions, and glycated albumin and glycated hemoglobin are used for diagnosis and symptom management of diabetes as indicators that reflect blood glucose levels.
  • glycated hemoglobin contained in red blood cells reflects the average blood glucose level over a certain period in the past, making it an important measurement index for diagnosing and managing symptoms of diabetes!
  • the glycoproteins to be measured are digested with protease or the like to release glycopeptides or glycoamino acids, and these
  • a method of measuring using an enzyme that specifically acts on the enzyme For example, there is known a method for measuring saccharide amino acids derived from saccharide hemoglobin or saccharide albumin using an oxidase that acts on glycated amino acid (see Patent Documents 1 to 5). See).
  • hemoglobin Ale hemoglobin “j8 chain” of the N-terminal Val (palin), a glycated protein in which glucose is bound to the X-amino group
  • the present applicant discloses a method using an enzyme (fructosyl peptide oxidase) that acts on a glycated peptide (see Patent Document 6).
  • glycosyamino acids or glycopeptides that can be released from glycated proteins and can be measured, a sugar glycoamino acid, ex glycopeptide, ⁇ sugar glycoamino acid And ⁇ -glycopeptides.
  • the ⁇ -glycoamino acid and ⁇ -glycopeptide are generated by being released from the glycated end of the glycated protein.
  • ⁇ -glycosylated amino acids and ⁇ -glycosyl peptides are those where the ⁇ -position side chain of the amino acid is glycated (for example, lysine residues or arginine residues in proteins can cause glycosylation). ) Force is also released.
  • glycated albumin is measured by measuring the sum of ⁇ -glycosylated amino acid and ⁇ -glycated peptide, and HbAlc is measured by measuring ⁇ -glycated peptide.
  • different saccharide amino acids and / or saccharide peptides are measured using enzymes that are highly specific to each other.
  • the true measurement object that is, the saccharide protein to be measured is measured.
  • Measurement of a sugar amino acid and / or a sugar peptide other than a specific sugar amino acid or a sugar peptide cut by a protease can cause a measurement value higher than the actual value, that is, a measurement error. Therefore, as measures against these, two methods for eradicating glycated amino acids or glycated peptides other than the substance to be measured have been disclosed for measurement of glycated hemoglobin (see Patent Documents 7 and 8).
  • the sample subjected to the protease treatment contains hemoglobin, blood proteins other than hemoglobin that are contaminated in the sample, and a plurality of proteins including the protease itself, and a plurality of ⁇ -sugar moieties are contained therein.
  • Patent Document 1 Japanese Patent Publication No. 5-33997
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 6-65300
  • Patent Document 3 JP-A-5-192193
  • Patent Document 4 JP-A-6-46846
  • Patent Document 5 Pamphlet of International Publication No. 97Z13872
  • Patent Document 6 Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598
  • Patent Document 7 Pamphlet of International Publication No. 02Z061119
  • Patent Document 8 Japanese Unexamined Patent Application Publication No. 2004-113014
  • An object of the present invention is to reduce a measurement error in measurement of a glycoprotein such as glycohemoglobin and to obtain an accurate measurement value, and a reagent for eliminating the measurement error causative substance And a kit for measuring glycoproteins. More specifically, after erasing the ex-glyco-amino acid, ⁇ -glyco-amino acid, ⁇ -glyco-peptide, or a combination thereof in the measurement sample, a a enzyme that acts on the glycated peptide is used.
  • the present inventors have intensively studied a method for eliminating sugar amino acids and / or peptides that cause measurement errors in the measurement of sugar hemoglobin.
  • an erasing reagent containing one or more ketamine oxidases is allowed to act on: a glycated amino acid, ⁇ sugar ⁇ amino acid, ⁇ sugar
  • measurement of the glycoprotein was performed by measuring the OC glycated peptide in the sample using an oxidase that acts on the OC glycopeptide. We found that errors were reduced and accurate measurements were obtained.
  • the elimination reagent acts on ex sugar ⁇ amino acid, ⁇ sugar ⁇ amino acid, ⁇ sugar ⁇ peptide, or a combination thereof, and does not act on ⁇ saccharide peptide. It contains ketamine oxidase and is characterized by eliminating ⁇ -sugar amino acid, ⁇ -sugar amino acid, ⁇ -sugar peptide, or a combination thereof in the sample.
  • the kit containing this elimination reagent, a reagent containing a protease, and a reagent containing an oxidase that acts on ex glycopeptides reduces the measurement error and provides an accurate measurement value. It is useful for the measurement of glycoproteins such as hemoglobin The present invention was completed.
  • the present invention relates to the following.
  • Protease is allowed to act on whole blood and / or blood cell samples, and then an elimination reagent containing one or more ketoamine oxidases is allowed to act on a-sugar amino acid, ⁇ -sugar
  • a glycated protein characterized by measuring a glycated peptide in the sample using an oxidase that acts on an ⁇ -glycated peptide after erasing the amino acid, ⁇ -glycated peptide, or a combination thereof. Measuring method.
  • ketoaminoxidase eliminates ⁇ -glycoamino acid, ⁇ -glycated amino acid, and ⁇ -glycated peptide.
  • Ketoamine oxidase acts on an enzyme that does not act on a glycated amino acid and does not act on a glycated peptide, ⁇ -glycosylated amino acid and / or ⁇ -glycosylated peptide, and ⁇ — Enzymes that do not act on glycopeptides, ⁇ -glycosylamino acids and / or ⁇ -glycated peptides, and enzymes that act on ⁇ -glycosylamino acids and do not act on ex-glycosylpeptides, or those enzymes
  • the saccharide protein is saccharide hemoglobin The method described.
  • (9) a.
  • One or more ketamine oxidases that act on a glycan amino acid, ⁇ glycan amino acid, ⁇ glycan peptide, or a combination thereof, and do not act on an ⁇ glycan peptide.
  • An erasing reagent containing and erasing sucrose ⁇ amino acid, ⁇ saccharide ⁇ amino acid, ⁇ glycated peptide or a combination thereof in a sample.
  • Ketoamine oxidase power Fructosyl amino acid oxidase derived from Corynebacterium, Arthrobacter, Agrobacterium, Fusarium or Guipellera
  • the elimination reagent according to (8) which is a ketamine oxidase derived from the genus, Acremum, Devaryomyces, Pichia, Trichosporon or Bacillus, or a combination thereof .
  • Glycoprotein measurement kit comprising a protease-containing reagent, the elimination reagent according to (9) or (10), and a reagent containing an oxidase that acts on an ⁇ -glycated peptide
  • kits according to (11) which is a fructosyl peptide oxidase that acts on a glycopeptide.
  • the glycated protein in the present invention is a protein in which the protein is non-enzymatically glycated.
  • the glycated protein that is, the aldehyde group on the aldose (monosaccharide and its derivative having a potential aldehyde group) side and the protein side
  • the amino group is produced by non-enzymatic covalent bonding.
  • the oc-saccharification site produced by saccharification of the ⁇ -terminal ⁇ -amino group in the polypeptide constituting the protein molecule, and the interior of the protein molecule
  • Glycoprotein is contained in body fluids such as blood in living bodies and biological samples such as hair, and various glycoproteins are produced by sugars such as glucose in the environment where the protein is localized. It strongly depends on the concentration. For example, the production of glycoprotein in the blood correlates with the blood concentration of Darcos, that is, the blood sugar level. Examples of glycoproteins present in the blood include glycoprotein hemoglobin, glycoprotein albumin, etc., which are used as indicators to reflect blood glucose levels in the diagnosis and management of symptoms of diabetes. Used.
  • Glycohemoglobin is further classified into several types depending on how it is defined or defined, but glycated hemoglobin, which is particularly important in the diagnosis and management of symptoms of diabetes, is HbAlc. It is. HbAlc is a hemoglobin with a tetrameric structure of ⁇ ⁇
  • valin glycated valin at least in the ⁇ -chain of the bin molecule
  • HbAlc is particularly important as an indicator that well reflects the average blood glucose level over a period of time .
  • glycated hemoglobin glycation at all the glycated sites is measured, that is, glycated amino acids and / or glycated peptides derived from all glycated sites are measured. taking measurement.
  • HbAlc only the sugar chain at Val at the heel end of sugar hemoglobin “ ⁇ chain” is measured, that is, a glycated amino acid derived from the heel end of “ ⁇ chain” and / or Or a Only glycopeptides are measured.
  • a method for measuring HbAlc there are a method for measuring a glycated amino acid or a method for measuring a glycated peptide. More preferred is a method for measuring conjugated peptides.
  • proteases that can efficiently release the ⁇ -glycopeptide of N-terminal ⁇ -glycopeptide, whereas the release of oc-glycosylated amino acid at the N-terminus. No protease has been found that can. In other words, the substance that liberates the a-glycoprotein at the terminus of the glycated protein reflecting the amount of glycated protein (in fact, only the X-glycated peptide).
  • Glycohemoglobin is localized in erythrocytes. That is, when glycated hemoglobin is used as a measurement target, it is preferable to measure a sample containing red blood cells.
  • whole blood and / or blood cell samples can be preferably used.
  • Whole blood and / or blood cell samples described in this specification include blood for collection or storage, and commercially available standard blood (for example, HbAlc measurement standard substance: welfare, medical technology promotion association, Tokyo, Japan ) Etc., and those treated by various methods, and those added with anticoagulants and other additive substances.
  • Whole blood includes all components of blood and contains red blood cells, white blood cells, blood platelets, plasma and the like as main components.
  • a blood cell sample is a fraction obtained by separating and removing plasma components from whole blood, and contains red blood cells, white blood cells, platelets and the like as main components.
  • the method for separating the blood cell sample from the whole blood is not particularly limited, and can be separated by, for example, centrifugation or using a serum separation sheet (blood cell separation membrane).
  • whole blood and / or blood cell samples are used for measurement after hemolysis.
  • whole blood is hemolyzed as it is, or plasma is removed from whole blood by centrifugation or the like, and a blood cell fraction is separated and hemolyzed.
  • the hemolysis method is not particularly limited, for example, a method using a surfactant, by ultrasonic A method, a method using a difference in osmotic pressure, a method by freezing and thawing, and the like can be used.
  • the sample thus obtained is subjected to each treatment for measurement including protease treatment and the like.
  • sugar albumin may be used as an indicator of glycemic control in a shorter period than HbAlc. It is known that albumin, which is a protein mainly contained in serum, receives sugars from four Lys residues inside. As in the case of measuring HbAlc, when measuring sugar albumin, the sugar substances contaminated in the sample are efficiently erased, and the sugar particles derived from the lysed Lys residue inside the albumin. It is necessary to measure only food.
  • oxidases fructosyl amino acid oxidase, glycosyl amino acid oxidase, fructosamine oxidase, amadoriase, etc.
  • ketoamine oxidase or “erase enzyme” for convenience.
  • the enzyme used to measure a-glycopeptide used as a measurement enzyme in the present invention can also be included in ketoamine oxidase. It is described as “oxidase acting on saccharide peptide” or “measuring enzyme”.
  • oxidase acting on saccharide peptide or “measuring enzyme”.
  • the "measuring enzyme" of the present invention is preferably an aoxidase that acts on a glycoside peptide, such as fructosyl peptide oxidase.
  • a glycoside peptide such as fructosyl peptide oxidase.
  • examples of such enzymes include the genus Achaetomiella, the genus Achaetomium, the genus Thielavia, the genus Chaetomium, the genus Kelasinospora, the genus Microascus, Enzymes from the genus Coniochaeta, Eupenicillium, Curvularia, Pyrenochaeta or Arthrinium (Arch Microbiol. 180: 227-) 31, 2003 and JP 2004-275063).
  • Examples of commercially available enzymes include FP OX-EE and FPOX-CE (both manufactured by Kikkoman Corporation, Japan). Further, a genetically engineered sugar amino acid oxidase (Japanese Patent Laid-Open No. 2001-95598) is also known. The activity of fructosyl peptide oxidase in the present invention is disclosed in JP 2003-235585 A. The amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute at 37 ° C was defined as 1 U, as measured by the method described in the publication (new fructosyl peptide oxidase).
  • the degree of the influence of the error-causing substance on the measurement value in the method of the present invention also depends on the substrate specificity of fructosyl peptide oxidase, which is the measurement enzyme.
  • the higher the substrate specificity of the fructosyl peptide oxidase used the more accurate measurement values can be obtained without the need for complete erasure.
  • fructosyl peptide oxidase having it is necessary to erase various contaminants more completely. For example, when using fructosyl peptide oxidase, which is easy to measure oc sugar amino acid, elimination of a sugar amino acid is essential to obtain an accurate measurement.
  • protease that can be used in the present invention, it can be used for clinical examinations, and at least ⁇ -glycopeptide is effectively used from a glycated protein to be measured in a sample to be processed, for example, glycohemoglobin.
  • Any protease can be used as long as it can be excised.
  • proteases include proteinase 1: pronase, thermolysin, subtilisin (subtilisin), carboxypeptidase ⁇ , pancreatin, cathebcin, carboxypeptidase, endoproteinase Glu-C, papain, ficin, Examples include bromelain, aminopeptidase and other proteases or peptidases.
  • proteases that efficiently release oc glycopeptides include Aspergillus-derived proteases such as “IP Enzyme TM “, “AO Protease”, “Peptidase”, “Morcin TM “ Isman Co., Japan), “Protease A5" (Kyowa Kasei Co., Japan), “Ummamizyme”, “Protease A”, “Protease M”, “Protease P”, “Peptidase R” (above Amano Enzyme) Company, Ltd., Japan), “sumizyme MP TM", “Sumi team LP- 20 TM”, “sumizyme LPL TM", “sumizyme AP TM” (more than new Japan Chemical Industry Co., Ltd., Japan), “proteinase 6” (Manufactured by Full Power Co., USA), Rhizobus-derived enzymes include “peptidase R” (manufactured by Amano Enzyme, Japan), and Bacillus-derived proteases such as “IP
  • proteases may be used alone or in combination of two or more.
  • glycated hemoglobin can be synthesized by endoproteinase Glu-C using a glycated hexapeptide (fructosyl & 1 13 ⁇ 45 0111) is known to form (Kobold U., et al, Clin. Chem. 1997, 43: 1944–1951). That Therefore, combining Glu-C with the above protease is an extremely effective method for producing a saccharide peptide from saccharide hemoglobin.
  • the above protease group is only a specific example, and is not limited thereto.
  • a protease in the present invention the viewpoint of efficiently cutting out a glycopeptide from the glycoprotein to be measured and at the same time suppressing the production of contaminants as much as possible.
  • proteases can be selected based on this information.
  • the protease treatment condition of the sample is that the protease used acts on glycated hemoglobin.
  • a Any conditions can be used as long as the glycopeptide can be efficiently released in a short time.
  • the amount of the protease to be used is appropriately selected depending on the content of glycated hemoglobin contained in the sample or the processing conditions.
  • a protease derived from the genus Aspergillus for example, protease p, Amano ( Co., Ltd., Japan)
  • final concentration is 0.1 ⁇
  • the pH at the time of treatment with the protease may be adjusted to a pH suitable for the action of the protease to be used, even if it is not adjusted, for example, a suitable pH adjusting agent such as hydrochloric acid, acetic acid, sulfuric acid, hydroxide.
  • the pH may be adjusted to 2 to 9, preferably 3 to 8, with sodium hydroxide, potassium hydroxide or the like.
  • the treatment temperature may be 20 to 50 ° C, for example, depending on the enzyme used, and may be 45 to 70 ° C in a higher temperature range.
  • the treatment time at this time may be 30 seconds to 180 minutes, preferably 1 to 60 minutes, as long as it is sufficient to decompose the glycated protein.
  • the obtained treatment solution may be heated, centrifuged, concentrated, diluted, or the like as it is or as necessary.
  • the activity of the protease that can be used in the present invention was measured by the caseinfoline method, and the color development corresponding to 1 ⁇ g of tyrosine at 37 ° C for 1 minute was defined as 1U.
  • the glycated amino acid and / or glycated peptide to be erased in the present invention is contained in blood, plasma, serum, etc., and is free glycated amino acid and / or glycated peptide. Not only peptides, but also glycoproteins derived from glycoproteins other than hemoglobin and hemoglobin, which are produced at the same time as the glycoproteins and / or glycopeptides are produced by protease treatment.
  • glycopeptides when measuring glycated hemoglobin, only the ⁇ -glycopeptide cut out by protease treatment of glycated hemoglobin is the measurement object, but glycated amino acids and / or glycated peptides derived from glycated proteins other than hemoglobin. Furthermore, ⁇ -sugar amino acids, ⁇ -glycated peptides, and a-sugar amino acids derived from glycated hemoglobin can cause errors.
  • the substance to be measured in this system is only ⁇ -glycopeptide derived from glycated hemoglobin.
  • the contaminants to be erased are free OC glycoside amino acids, ex glycoside peptides, ⁇ glycoside amino acids, and ⁇ glycoside peptides, and derived from glycated proteins other than hemoglobin.
  • ⁇ -glycopeptide derived from hemoglobin which is the measurement target substance.
  • hemoglobin molecule is composed of heterogeneous subunits of “ ⁇ chain” and “j8 chain”, and the N-terminal amino acid sequence of both is different, and is released from either subunit in the hemoglobin molecule.
  • the oc glycopeptide derived from the other subunit is also considered a contaminant.
  • HbAlc measurement measures a glycopeptide released from hemoglobin “
  • ⁇ -glycated peptide derived from “chain” can in principle be an error-causing contaminant.
  • fructosyl peptide oxidase for example, the substrate specificity of fructosyl peptide oxidase is extremely high.
  • a Glyco-amino acid, ⁇ -glyco-amino acid, or ⁇ -glyco-peptide Of course, these erasures are not required if they do not substantially affect other contaminants.
  • fructosyl peptides are used to eliminate various ketoamine oxidases.
  • the ⁇ -sugar amino acid and / or the ⁇ -sugar peptide can be deleted in an overlapping manner.
  • the substrate specificity of the erasing enzyme multiple substances can be erased simultaneously with the same enzyme. It may be erased. For example, ⁇ -glycosyl amino acids and ⁇ -glycated peptides tend to be erased together by certain enzymes.
  • this contaminant is an OC glycated peptide. Specifically, it is derived from free OC glycated peptide and a glycoprotein derived from glycoprotein other than hemoglobin, and also derived from the hemoglobin “chain” at the time of HbAlc measurement. A refers to a glycopeptide. These cannot be eliminated by ketamine oxidase, an erasing enzyme, and may remain in the measurement system. However, in the glycosylation protein measurement system of the present invention, particularly in the glycosylation hemoglobin measurement system, these have little influence on the measurement value. The following can be considered as the basis.
  • glycoprotein released by protease treatment of glycoprotein is theoretically one at most from each N-terminus of each polypeptide constituting the glycoprotein. Therefore, the absolute amount that can be contaminated is small compared to the ⁇ -glycopeptide which has a possibility of liberating in a large amount by including a plurality of ⁇ -glycoyl sites inside the glycated protein.
  • ⁇ -glycopeptide elimination by fructosyl peptide oxidase should be performed before protease treatment.
  • the production of ⁇ -glycopeptide as a contaminant can also be achieved by selecting a protease having a substrate specificity that suppresses the generation of contaminants as much as possible. Can be sufficiently suppressed.
  • fructosyl peptide oxidase for example, Fru— Val— Leu (fructosylva, which is an ⁇ -sugar peptide that can be released from the “chain” side of glycohemoglobin.
  • Fru— Val— Leu fructosyl peptide oxidase that does not act on Fru-Val-His (fructosylnorylhistidine)
  • an glycated OC glycated peptide that does not act on the “ ⁇ -chain” side Do not measure impurities by It is possible to obtain accurate measurements.
  • any enzyme can be used as long as it is a ketamine oxidase that works well on sugar amino acids and / or peptides and generates peracid hydrogen. May be used. “Ketoamine oxidase acting on ⁇ -glyco-amino acid and / or ⁇ -glyco-peptide”, “Ketoamine oxidase acting on sucrose-amino acid” and / or glycated amino acid and / or ⁇ -glyco-peptide And ketoamine oxidase that acts on ⁇ -amino acids!
  • Examples of "ketoamine oxidase having high specificity for ⁇ -glycoamino acid and / or ⁇ -glycopeptide” include enzymes from the genus Gibberella and Fusarium. Are known. Specifically, fructosyl lysine oxidase (from Fusarium genus, Guipellera genus, see JP-A-11-243950), ketoamine oxidase (from Fusarium genus, marketed by Genzyme (USA)), fructosamine oxidase (Asahi Kasei) (Japan), PCT ZJP02Z00721). These enzymes are characteristic in that they do not act substantially on a-sugar amino acids.
  • Examples of “a ketoamine oxidase having high specificity for a sugar amino acid” include those derived from the genus Corynebacterium, Agrobacterium, Arthrobacter. Enzymes are known.
  • FAOX—C derived from Corynebacterium, Bisci Biotechnol Biochem. 66: 1256—61, 2002
  • FAO X—TE derived from Corynebacterium, manufactured by Kikkoman (Japan)
  • fructosyl amino acid oxidase coryne Bacterium genus, Sigma-Aldrich (USA), AgaE- li ke Protein (Agrono kuterium genus, Biosci Biotechnol Biochem.
  • Examples of “ketoamine oxidase acting on ⁇ -glycoamino acid and / or ⁇ -glyco-peptide, and a-glyco-amino acid” include Gibberella genus, Fusarium genus ), Penicillium genus, Aspergillus genus, Candida genus, Acremonium genus, Debarymyces (Debary) Enzymes derived from the genus omyces, the genus Pichia, the genus Trichosporon and the genus Bacillus are known.
  • fructosyl amino acid oxidase derived from the genus Fusarium, see JP-A-8-154672
  • fructosyl amino acid oxidase derived from the genus Persium, derived from Aspergillus tereus, Eur J Biochem. 242: 499-505
  • fructosylamine oxidase from the genus Aspergillus, Agric biol chem 55: 333-8, 1991
  • amadoriase I, ⁇ from Aspergillus-Fumigas, J Biol Chem.
  • ketoamine oxidase from genus Acremoum, genus Devariomyces, see US Pat. No. 5,370,990
  • fructosyl aminoxidase from Pichia genus
  • fructosyl amino acid oxidase from Trichosporon genus, see JP 2000-245454
  • fructosylamic acid zyme from Bacillus genus, JP 2002-125663
  • ketoamine oxidase manufactured by Asahi Kasei Corporation (Japan), see JP 2004-222570
  • FAOD-E manufactured by Kikkoman (Japan)
  • ketamine oxidase The activity of ketamine oxidase was measured by the method described in JP-A-11-155579 (manufacturing method of fructosyl amino acid oxidase gene, novel recombinant DNA and fructosyl amino acid oxidase). The amount of enzyme that produces 1 mol of hydrogen peroxide per minute was defined as 1U.
  • the "eliminating enzyme" of the present invention is a glycated amino acid and / or glycated peptide contained in a processing solution.
  • the final concentration may be 0.1 to 50 UZmL, preferably 1 to LOUZm L.
  • the pH at the time of action is, for example, pH 3 to ll, particularly preferably pH 5 to 9, and the buffer is used so that the pH is suitable for the reaction in consideration of the optimum pH of ketamine oxidase. Although it is preferable to adjust, it is not limited to this as long as the pH is operable.
  • the pH adjustment method is not particularly limited, and examples of the buffer include N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate. , Citrate, dimethyl glutamate, tricine, HEP ES, and the like. If necessary, the pH of the reaction solution may be adjusted to the above pH using a buffer.
  • the action time is, for example, 1 to 120 minutes, preferably 1 to 30 minutes, and the force depending on the amount of the sugar ⁇ amino acid and / or saccharide peptide serving as the substrate ketamine oxidase force It is sufficient that the time is sufficient to act.
  • the working temperature is, for example, 20 to 45 ° C., and the temperature used for ordinary enzyme reaction can be appropriately selected.
  • Peroxyhydrogen generated by the action of ketamine oxidase may be decomposed by catalase or the like.
  • the buffer used in the present invention include N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, citrate, Examples thereof include dimethyl glutamate, tricine, HEPES and the like.
  • various additives such as a solubilizer, stabilizer, etc. may be used as a surfactant (Triton X-100, Bridge 35, Twin 80, Cholic acid, etc. within the range not impairing the object of the present invention. Salt), reducing agents (dithiothreitol, mercaptoethanol, L-cystine, etc.), bovine serum albumin, saccharides (glycerin, lactose, sucrose, etc.), etc.
  • the “causing enzyme” of the present invention is used to eliminate the error-causing substance. It is important to perform this elimination after protease treatment.
  • the present invention is characterized in that this erasing is performed by causing one or more types of ketamine oxidase to act on the sample after the protease treatment.
  • the erasing enzyme may be an enzyme that eliminates oc-glycated amino acids, an enzyme that eliminates ⁇ -glycosylamino acids and / or ⁇ -glycated peptides, or may be used in any combination of these!
  • it is desirable that the free ex-glyco-amino acid, ⁇ -glyco-amino acid, and ⁇ -glyco-peptide in the sample are erased and a-glyco-peptide remains after the treatment.
  • “Ketoamine oxidase acting on sugar amino acid and / or peptide having ⁇ -amino group acting on sugar amino acid and / or peptide” It is desirable to use.
  • ketamine oxidase does not act on ⁇ -saccharide peptides. If it is clear that there is a particularly large amount of the substance to be erased before the protease treatment, a separate elimination step may be further introduced before the protease treatment.
  • reaction conditions can be devised so that the protease does not rapidly decompose the erasing enzyme.
  • the protease considering the optimal reaction between the protease and the erasing enzyme, the difference in the optimal temperature, and the effects of salts, metals, chelating agents, and protease inhibitors on the activity of each enzyme, the protease
  • the protease can be physically removed by methods such as membrane filtration, chromatography, and salting out.
  • the protease can be inactivated by heat treatment, acid / alkali treatment, dilution, or the like. If the degradation of the erasing enzyme by the protease does not adversely affect the measured value, it can be performed without setting special conditions.
  • the method of the present invention further includes, after the elimination of the substance to be erased, measuring the amount of a glycopeptide using an oxidase that acts on the oc-glycated peptide. For example, after erasing, the amount of OC-glycopeptide can be accurately measured by using a “measuring enzyme” fructosyl peptide oxidase such as FPOX.
  • a “measuring enzyme” fructosyl peptide oxidase such as FPOX.
  • the fructosyl peptide oxidase to be used depends on the amount of a-glycated peptide contained in the treatment solution.
  • the final concentration is 0.1 to 50 UZmL, preferably 1 to: LOUZmL. do it.
  • the pH during the action is, for example, pH 3 to ll, particularly preferably The pH is 5-9, and it is preferable to adjust with a buffering agent so that the optimum pH of fructosyl peptide oxidase is taken into consideration, but if it is a working pH, It is not limited to this.
  • the pH adjustment method is not particularly limited, and examples of buffers include N— [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) aminomethane, boric acid. Salt, citrate, dimethyl glutamate, tricine, HEPES, and the like.
  • the pH of the treatment solution after protease treatment may be adjusted to the above pH using a buffer.
  • the duration of action is, for example, 1 to 120 minutes, preferably 1 to 30 minutes.
  • the force depends on the amount of glycopeptide as a substrate. Fructosylpeptide oxidase force Sufficient time to act on these peptides If it is.
  • the working temperature is, for example, 20 to 45 ° C., and a temperature used for a normal enzyme reaction can be appropriately selected.
  • Hydrogen peroxide produced by the action of fructosyl peptide oxidase may be measured by any method, for example, an electrical method using an oxygen electrode, preferably a peroxidase and a suitable chromogenic substrate.
  • an electrical method using an oxygen electrode preferably a peroxidase and a suitable chromogenic substrate.
  • oxygen electrode preferably a peroxidase and a suitable chromogenic substrate.
  • a peroxidase and a suitable chromogenic substrate examples include the enzymatic method used.
  • a buffer pH 4 to 10 dynamics
  • 5 to 500 mM preferably 50 to: LOOmM
  • 4 aminoantipyrine as a chromogenic substrate
  • examples thereof include reagents having a composition of 0.01 to 50 mM, preferably 0.1 to 20 mM, peroxidase 0.1 to 50 UZmL, preferably 1 to 20 UZml.
  • the buffer used in the measurement system include N— [Tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, and citrate. Salts, dimethyl glutamate, tricine, HEPES, and the like.
  • chromogenic substrate in addition to 4-aminoantipyrine, for example, ADOS (N
  • additives such as solubilizers, stabilizers, surfactants (Triton X-100, Bridge 35, Tween 80, cholate, etc.), reducing agents (dithiothreitol). , Mercaptoethanol, L-cysteine, etc.), bovine serum albumin, saccharides (glycerin, lactose, sucrose, etc.) may be added as appropriate.
  • the above-mentioned reagent for measuring hydrogen peroxide is used. It is preferable to add fructosyl peptide oxidase, for example, 0.1 to 50 UZmL, preferably 1 to: LOUZmL. These reagents for measurement may be used by immersing them in a dry substance or a carrier on a thin film which may be used in a dissolved state, for example, a sheet-impregnated paper.
  • the enzymes used in the measurement reagent can be immobilized by a conventional method and used repeatedly.
  • the measurement temperature is, for example, 20 to 45 ° C., and the temperature used for normal enzyme reaction can be appropriately selected.
  • the time required for the measurement is a force that can be appropriately selected according to various measurement conditions. For example, 0.1 to 60 minutes, particularly 1 to LO minutes are preferable.
  • the degree of color development (absorbance change) of the measurement reagent can be measured with a spectrophotometer, and the glycopeptide or glycoprotein contained in the sample can be measured by comparison with the standard absorbance.
  • a normal automatic analyzer can also be used for the measurement.
  • the present invention further includes one or more saccharides that act on monosaccharide amino acids, ⁇ -glycoamino acids, ⁇ -glycated peptides, or combinations thereof, and that do not act on ⁇ -glycopeptides.
  • An erasing reagent containing ketamine oxidase and erasing ⁇ -sugar amino acid, ⁇ sugar amino acid, ⁇ sugar amino peptide or a combination thereof in a sample is provided.
  • An erasing reagent can be prepared by combining ketamine oxidase used for erasing in the present invention. By using this erasing reagent, a plurality of target substances to be erased can be efficiently erased simultaneously.
  • This elimination reagent has different substrate specificities and contains one or more of the ketamine oxidases described above, and further improves the efficiency of elimination and various stabilizers and buffers that contribute to the stability of the enzyme. Agents and other ingredients may be included.
  • ketamine oxidase include the enzymes listed in the specific examples of the “eliminating enzyme” above, ie, fructosyl lysoxidase (derived from the genus Fusarium or Guipellera), ketamine oxidase (derived from the genus Fusarium, Genzyme (US sales), fructosamine oxidase (Asahi Kasei (Japan)), FAOX-C (derived from Corynebacterium), FAOX-TE (derived from Corynebacterium, sold by Kikkoman Corporation (Japan)), Fructosyl amino acid oxidase (derived from Corynebataterum, sold by Sigma-Aldrich (USA)), AgaE—like Prote in (derived from Agrobataterum), ArFAOD (derived from Arthrobacter i), fructosylamino acid oxidase (Pet -From Iran, from Aspergill
  • the present invention provides a glycoprotein, such as glycohemoglobin, comprising the above-described elimination reagent, a protease-containing reagent for protease treatment, and a reagent containing an oxidase that acts on a glycopeptide for measurement.
  • a kit for measurement is provided.
  • the kit for measuring glycoproteins such as glycated hemoglobin of the present invention may be prepared by containing each of the above-mentioned reagents in different containers, for example, a liquid product, a frozen liquid product, or a freeze-dried product. And offer.
  • the oxidase acting on a glycopeptide is a fructosyl peptide oxidase.
  • the enzyme reaction reagent for quantifying glycated hemoglobin according to the present invention includes various known components.
  • the measurement method, the elimination reagent and the kit of the present invention may be applied to a system for quantifying hydrogen peroxide using an electrode or the like.
  • the titer of fructosyl peptide oxidase acting on a glycoside dipeptide can be measured, for example, by the following method, and can also be measured by other methods.
  • Reagent 1 (R1): 1. OkU peroxidase (hereinafter abbreviated as POD; manufactured by Kikkoman Corporation (Japan)), lOOmg of 4-aminoantipyrine (hereinafter abbreviated as 4AA; Tokyo Kasei Co., Ltd.) (Manufactured by Japan) is dissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 8.0) to a constant volume of 1 L.
  • POD lOOmg of 4-aminoantipyrine
  • 4AA Tokyo Kasei Co., Ltd.
  • Reagent 2 500 mg of TOOS (N ethyl N— (2 hydroxy-3-sulfopropyl) —m-toluidine, manufactured by Dojin Kaisha (Japan)) was dissolved in ion-exchanged water, Adjust to a volume of lOOmL.
  • TOOS N ethyl N— (2 hydroxy-3-sulfopropyl) —m-toluidine, manufactured by Dojin Kaisha (Japan)
  • Reagent 3 Fructosyl Val-His (MW416, see JP2003-235585 for production method) 1. Dissolve 25 g in ion-exchanged water, and make up to a volume of lOmL.
  • HbAlc hemoglobin Ale
  • Glycoprotein to be measured Common reference material for HbAlc measurement (manufactured by the Japan Society for the Promotion of Health and Welfare Technology, Standard Reference Center (Japan)) 130gZL (HbAlc value: 5.8%)
  • HbAlc is subdivided into 6 sections, Fru—Val in the 1st section, Fru—Gly in the 2nd section, ⁇ —Fru—Lys in the 3rd section, and Fru—Val—Leu in the 4th section.
  • all contaminants were added so that the concentration in the sample would be 250 M each.
  • These added impurities were regarded as free substances and contaminants that caused measurement errors caused by the protease treatment, and were subjected to measurement including the following elimination process.
  • physiological saline was added instead of contaminants, and samples without additives were used.
  • Reagents used for measurement were prepared with the composition shown in Table 1.
  • the elimination reagent 1 for B contains two types of ketamine oxidases having different substrate specificities.
  • FAOX-TE is a type of ketamine oxidase with high specificity for ex-glycosylamino acids
  • FAOD-E is a type of ketamine oxidase with high specificity for ⁇ -glycosylated amino acids and ⁇ -glycosyl peptides.
  • a ketamine oxidase containing only FAOX (erasing reagent 2) and one containing only FAOD (erasing reagent 3) were prepared.
  • Each sample 20 ⁇ 1 prepared in (3) was mixed with 40 ⁇ 1 of a hemolyzing agent (Sulfolizer: manufactured by Sysmetas Co., Ltd., Japan) and 40 ⁇ 1 of purified water to prepare a hemolyzed sample.
  • a hemolyzing agent Sulfolizer: manufactured by Sysmetas Co., Ltd., Japan
  • 10 ⁇ l of each hemolyzed sample was mixed with 30 ⁇ l of a reagent reagent containing a sputum protease and subjected to protease treatment at 37 ° C. for 90 minutes.
  • Sample after treatment 40 1 ⁇ B B elimination reagent 220 1 is mixed, 37 ° C, 5 minutes It was made to react between. Measure the absorbance at 750 nm (A) and add C measuring reagent 100 / zl.
  • the concentration of sugar hemoglobin was calculated, and the sugar hemoglobin value (HbAlc value (%)) was calculated by dividing the sugar hemoglobin concentration by the hemoglobin concentration.
  • Measurements were performed on systems using each of the erasing reagents 1, 2, and 3. As a comparative example, the same measurement was performed on a system that did not use the erasing reagent B and did not perform the erasing process. Table 2 shows the above results.
  • Erase 1, Erase 2, and Erase 3 show the results when using erasing reagents 1, 2, and 3, respectively, as erasing reagents.
  • the elimination reagent 1 of the present invention comprises two types of ketoamines, a type having high specificity for a-sugar amino acids and a type having high specificity for ⁇ -sugar amino acids and ⁇ -sugar peptides. Complete elimination of various contaminants, including xidase, was achieved. As an example using an erasing reagent with a different composition, the forces shown as erasing 2 and erasing 3 also show that the accuracy of the measured values is remarkably improved compared to the comparative example. In Erasing 2 and Erasing 3, some impurities remained that could not be erased due to the substrate specificity of the erasing enzyme.
  • HbAlc hemoglycerin Ale
  • FPOX hemoglycerin Ale
  • Example 1 Using a hemoglycerin Ale (HbAlc) in a human blood sample as a glycated protein to be measured, a glycine peptide produced by protease treatment was measured by FPOX, and the effect of eliminating free substances and contaminants produced by protease treatment was verified. Furthermore, as in Example 1, it was also confirmed whether or not the erasing effect was observed when a contaminant was added after the protease treatment. An experiment similar to the method shown in Example 1 was performed, except that a human blood sample was used as the HbAlc to be measured. Table 3 shows 750nm The absorbance change power of the specimen was measured, and the value obtained by subtracting the absorbance change of the blank was shown.

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Abstract

　本発明は、全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、１種類又は複数のケトアミンオキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、α－糖化アミノ酸、ε－糖化アミノ酸、ε－糖化ペプチド、またはそれらの組合わせ物を消去した後に、α－糖化ペプチドに作用するオキシダーゼを用いて前記試料中のα－糖化ペプチドを測定する方法、ならびにそのための消去試薬およびキットに関する。 　本発明により、糖化ヘモグロビンなどの糖化蛋白質の測定における測定誤差を低減させ、正確な測定値を得ることを可能にする。

Description

明 細 書
糖化蛋白質の測定方法および測定キット
技術分野
[0001] 本発明は、糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕蛋白質の測定における測定誤差を低減さ せ、正確な測定値を得るための糖ィ匕蛋白質の測定方法、測定誤差原因物質の消去 試薬、及び糖ィ匕蛋白質測定用キットに関する。
背景技術
[0002] 糖ィ匕蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質であり、糖、すなわちアル ドース (アルデヒド基を潜在的に有する単糖及びその誘導体)側のアルデヒド基と、蛋 白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合することにより生成する。蛋白質側のアミノ 基としては、 N末端の α—アミノ基、内部リジン残基の側鎖 εーァミノ基などがあげら れ、これらが糖化されること〖こより、 ひ 一糖ィ匕蛋白質及び/又は ε—糖ィ匕蛋白質が生 成する。これらの糖ィ匕蛋白質は、反応中間体として生じたシッフ塩基がアマドリ転移 を受けて形成されることから、いわゆるアマドリ化合物とも呼ばれる。
[0003] 糖ィ匕蛋白質は、例えば生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含 有される。血液中に存在する糖ィ匕蛋白質の例としては、糖ィ匕ヘモグロビン、糖化アル ブミンなどが含まれ、これらの糖ィ匕蛋白質の生成は、血清中に溶解しているダルコ一 スなどの糖類の濃度に強く依存する。糖尿病状態では糖ィヒ蛋白質の生成が亢進し ていることが知られており、糖ィ匕アルブミンや糖ィ匕ヘモグロビンは、血糖値を反映する 指標として糖尿病の症状の診断や症状管理に利用され、中でも赤血球に含まれる糖 化ヘモグロビンは過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、糖尿病の症状 の診断や症状管理にお!、て重要な測定指標となって!/、る。
[0004] 従来、糖尿病の診断を目的とした糖化蛋白質の酵素法測定として、測定対象とす る糖ィ匕蛋白質をプロテアーゼ等により消化して糖ィ匕ペプチド又は糖ィ匕アミノ酸を遊離 させ、それらに特異的に作用する酵素を用いて測定する方法が知られている。例え ば、糖ィ匕ヘモグロビンもしくは糖ィ匕アルブミンに由来する糖ィ匕アミノ酸を、糖化アミノ 酸に作用するォキシダーゼを用いて測定する方法が知られている（特許文献 1〜5参 照）。さらに、これらの方法では正確な測定が困難であったヘモグロビン Ale (へモグ ロビン「 j8鎖」 N末端の Val (パリン）の、 (X—位のァミノ基にグルコースが結合した糖 化蛋白質、以下 HbAlcとする）の測定に関し、本出願人により、 a 糖化ペプチド に作用する酵素（フルクトシルペプチドォキシダーゼ)を用いた方法が開示されて ヽ る (特許文献 6参照)。
[0005] 上記の各種測定において、糖化蛋白質から遊離し、測定対象となり得る糖ィ匕ァミノ 酸又は糖ィ匕ペプチドとしては、 a 糖ィ匕アミノ酸、 ex 糖ィ匕ペプチド、 ε 糖ィ匕ァミノ 酸及び ε 糖ィ匕ペプチドの 4種がある。 α 糖ィ匕アミノ酸及び α 糖ィ匕ペプチドは、 糖化蛋白質の糖化された Ν末端から遊離して生じる。一方、 ε 糖化アミノ酸及び ε —糖ィ匕ペプチドは、アミノ酸の ε—位の側鎖が糖化された箇所 (例えば蛋白質内のリ ジン残基やアルギニン残基にぉ 、て糖ィ匕が起こり得る）力も遊離して生じる。
[0006] 例えば、糖ィ匕アルブミンの測定には ε 糖化アミノ酸及び ε 糖化ペプチドの和 を測定し、 HbAlcの測定には α 糖ィ匕ペプチドを測定する等、測定対象とする糖 化蛋白質の種類により、異なる糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドを、それぞれに 特異性の高い酵素を用いて測定するが、この時に、真の測定対象物、すなわち、測 定対象とする糖ィ匕蛋白質力 プロテアーゼによって切り出される特定の糖ィ匕アミノ酸 又は糖ィ匕ペプチド以外の糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドを測り込んでしまうこと は、実際より高い測定値、すなわち測定誤差を生じ得る。そこでこれらへの対策とし て、糖ィ匕ヘモグロビン測定に関し、測定対象物質以外の糖化アミノ酸又は糖化ぺプ チドを消去する 2つの方法が開示されている (特許文献 7、 8参照)。
[0007] 第 1の方法は、予め ε 糖ィ匕アミノ酸に特異性の高い酵素を用いて試料内の遊離 の ε 糖ィ匕アミノ酸を消去した後、 ex 糖ィ匕アミノ酸と ε 糖化アミノ酸の両方に作 用する測定酵素を使用することによって、 a 糖ィ匕アミノ酸のみを測定するものであ る（特許文献 7参照)。この方法は試料中の遊離の ε 糖化アミノ酸や ε 糖化ぺプ チドの一部の測り込みを回避できる力 例えば高カロリーのアミノ酸輸液を受けている 患者等において、輸液中であるいは輸液を受けた後に血中で生成し得る遊離の oc —糖ィ匕アミノ酸を消去することができないという問題を有している。すなわち、消去用 酵素では α 糖ィ匕アミノ酸夾雑物を消去できず、さらに測定用酵素では、同じ α— 糖化アミノ酸を遊離のものかプロテアーゼで切り出されたものかで区別できな 、ため
、この方法では遊離の OC 糖ィ匕アミノ酸が消去されることなく測り込まれ、誤差原因と なり得る。
[0008] 第 2の方法では、 oc 糖ィ匕アミノ酸もしくは ex 糖化ペプチドに作用する酵素を、 消去用と測定用に共に使用する (特許文献 8参照)。すなわち、測定用酵素が作用し 得る基質を、プロテアーゼ処理前の試料から予め消去しておき、プロテアーゼ処理に より新たに生じる測定基質のみを測定することにより、測定対象糖ィ匕蛋白質のみに由 来する ex 糖ィ匕アミノ酸もしくは α 糖ィ匕ペプチドを測定する。この方法によれば、 測定用酵素（=消去用酵素)の基質であって、かつプロテアーゼ処理前に遊離状態 である夾雑物に由来する測定誤差を回避することができるが、依然として測定用酵素 (=消去用酵素)の基質特異性に起因する問題が残る。この方法では、 ε—糖ィ匕アミ ノ酸を模したモデル夾雑物が良好に消去される。すなわちこの方法の測定用酵素（ =消去用酵素）は測定対象の OC 糖ィ匕アミノ酸もしくは OC 糖ィ匕ペプチドにも、消去 対象の ε—糖ィ匕アミノ酸にも良好に作用する。ところで、プロテアーゼ処理に供され る試料中にはヘモグロビン、さらに試料中に夾雑するヘモグロビン以外の血液蛋白 質、及びプロテアーゼ自身を含む複数の蛋白質が混在し、それらの内部に複数の ε 糖ィ匕部分を含むため、これらもまたプロテアーゼ処理により遊離して ε 糖ィ匕アミ ノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチドを生じるが、この方法においては測定酵素によるこ れらの測り込みが避けられない。従って、 a 糖ィ匕アミノ酸又は糖ィ匕ペプチドのみを 正確に測定する方法としては十分とは言えな 、。
[0009] したがって、糖ィ匕蛋白質の酵素法測定において、測定誤差の原因となる物質を消 去するための糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドの消去方法及び消去試薬に関す る技術は、さらなる向上が望まれていた。
特許文献 1：特公平 5— 33997号公報
特許文献 2：特公平 6— 65300号公報
特許文献 3 :特開平 5-192193号公報
特許文献 4：特開平 6—46846号公報
特許文献 5 :国際公開第 97Z13872号パンフレット 特許文献 6 :特開 2001— 95598号公報
特許文献 7：国際公開第 02Z061119号パンフレット
特許文献 8：特開 2004 - 113014号公報
発明の開示
[0010] 本発明の目的は、糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕蛋白質の測定における測定誤差を 低減させ、正確な測定値を得るための糖化蛋白質の測定方法及び測定誤差原因物 質の消去試薬、並びに糖ィ匕蛋白質測定用キットを提供することである。より具体的に は、測定試料中の ex 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド、又はそ れらの組合わせ物を消去した後に、 a 糖化ペプチドに作用する酵素を用いて前記 試料中の (X 糖化ペプチドを測定することを特徴とする糖化蛋白質の測定方法、及 びこの測定に使用する消去試薬、並びに糖ィ匕蛋白質測定用キットを提供することを 課題とする。
[0011] 発明の概要
上記の目的を達成するために、本発明者らは、糖ィ匕ヘモグロビンの測定において 測定誤差の原因となる糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドの消去法について鋭意 検討を行った。その結果、全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、 1種類又は複数のケトァミンォキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、 a 糖 化アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去 した後に、 OC 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼを用いて前記試料中の OC 糖 化ペプチドを測定することにより、糖ィヒ蛋白質の測定方法における測定誤差が低減 され、正確な測定値が得られることを見出した。
[0012] 前記消去試薬は、 ex 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド、又は それらの組合わせ物に作用し、かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない 1種類又は複数 のケトァミンォキシダーゼを含有し、試料中の α—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖ィ匕ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする。
[0013] さらにこの消去試薬と、プロテアーゼを含有する試薬、及び ex 糖ィ匕ペプチドに作 用するォキシダーゼを含有する試薬を含むキットは、測定誤差が低減され、正確な 測定値が得られる糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕蛋白質の測定のために有用であるこ とを見出し、本発明を完成した。
[0014] すなわち、本発明は、以下に関する。
[0015] ( 1)全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、 1種類又は複数のケト アミンォキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、 a—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖ィ匕 アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去した後に、 α—糖化べ プチドに作用するォキシダーゼを用いて前記試料中の a 糖ィヒペプチドを測定する ことを特徴とする糖化蛋白質の測定方法。
[0016] (2)ケトァミンォキシダーゼが、 α—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖化アミノ酸及び ε—糖化べ プチドを消去することを特徴とする、 ( 1)に記載の方法。
[0017] (3)ケトアミンォキシダーゼが、 a 糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ a 糖化ペプチドに 作用しない酵素、 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチドに作用し、かつ α— 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素、 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖化ペプチド、及 び α 糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ ex 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素、あるいはそ れらの酵素の組合わせであることを特徴とする、 ( 1)に記載の方法。
[0018] (4) a 糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ ex 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素力 コリネ バクテリウム属、アースロバクター属又はァグロバタテリゥム属由来のフルクトシルアミ ノ酸ォキシダーゼであることを特徴とする、 (3)に記載の方法。
[0019] (5) ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチドに作用し、かつ a 糖ィ匕ペプチド に作用しない酵素力 フサリウム属又はギペレラ属由来のフルクトシルアミノ酸ォキシ ダーゼであることを特徴とする、 (3)に記載の方法。
[0020] (6) ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチド、及び α—糖化アミノ酸に作用し 、かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素力 ギべレラ属、フサリウム属、ぺ-シリウ ム属、ァスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニゥム属、デバリオマイセス属、ピキア 属、トリコスポロン属又はバチノレス属由来のケトァミンォキシダーゼであることを特徴と する、 (3)に記載の方法。
[0021] (7) a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ力 フルクトシルペプチドォキシダー ゼであることを特徴とする、 ( 1)〜（6)のいずれかに記載の方法。
[0022] (8)糖ィ匕蛋白質が糖ィ匕ヘモグロビンであることを特徴とする（1)〜（7)のいずれかに 記載の方法。
[0023] (9) a 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド又はそれらの組合わせ 物に作用し、かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない 1種類又は複数のケトァミンォキシ ダーゼを含有し、試料中のひ 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖化ペプチド 又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする消去試薬。
[0024] ( 10)ケトァミンォキシダーゼ力 コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ァグロバ クテリウム属、フサリウム属又はギペレラ属由来のフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ、 ギべレラ属、ぺニシリウム属、ァスペルギルス属、カンジダ属、アクレモ-ゥム属、デバ リオマイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトアミンォキシダ ーゼ、またはそれらの組合わせであることを特徴とする、 (8)に記載の消去試薬。
[0025] ( 11)プロテアーゼを含有する試薬、（9)又は（10)に記載の消去試薬、及び α—糖 化ペプチドに作用するォキシダーゼを含有する試薬を含む糖ィ匕蛋白質測定用キット
[0026] ( 12) a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ力 フルクトシルペプチドォキシダ ーゼであることを特徴とする、 ( 11)に記載のキット。
[0027] 本発明によれば、糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕蛋白質の測定における測定誤差が 低減され、正確な測定値が得られるようになる。また、この測定に使用する消去試薬 、及び、測定誤差が低減され正確な測定値が得られる糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕 蛋白質測定用キットを提供でき、臨床診断分野において有用である。
[0028] 本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願 2005-208737号の明細書 及び/又は図面に記載される内容を包含する。
[0029] 詳糸田な Ρ月
以下、この発明の構成及び好ましい形態について更に詳しく説明する。
[0030] 本発明における糖化蛋白質は、蛋白質が非酵素的に糖化された蛋白質であり、糖 、すなわちアルドース (アルデヒド基を潜在的に有する単糖及びその誘導体)側のァ ルデヒド基と、蛋白質側のアミノ基が非酵素的に共有結合することにより生成したもの である。糖ィ匕蛋白質における糖ィ匕部位には、蛋白質分子を構成するポリペプチドに おける Ν末端 α アミノ基が糖化されて生成する oc 糖化部位と、蛋白質分子内部 のアミノ酸残基の側鎖における ε ーァミノ基が糖化されて生成する ε 糖ィ匕部位が ある。
[0031] 糖ィ匕蛋白質は、生体内の血液などの体液や、毛髪などの生体試料中に含有され、 各種糖ィ匕蛋白質の生成は、その蛋白質が局在する環境中のグルコースなどの糖濃 度に強く依存している。例えば、血液中の糖ィ匕蛋白質の生成は、血液中のダルコ一 ス濃度、すなわち血糖値と相関している。血液中に存在する糖ィ匕蛋白質の例として は、糖ィ匕ヘモグロビン、糖ィ匕アルブミンなどがあり、これらは血糖値を反映する指標と して、糖尿病の症状の診断や症状管理にぉ 、て用いられて 、る。
[0032] 糖ィ匕ヘモグロビンはさらに、糖ィ匕のされ方、あるいは定義のされ方により数種類に 区別されるが、糖尿病の症状の診断や症状管理において特に重要視されている糖 化ヘモグロビンが HbAlcである。 HbAlcは、 α β の 4量体構造を有するへモグロ
2 2
ビン分子の、少なくとも「 β鎖」における Ν末端の Val (パリン)が糖化されたものと定義 され、 HbAlcは過去の一定期間の平均血糖値を良好に反映する指標として、特に 重要視されている。
[0033] Delpierre、 J. Biol. Chem. , 279:27613— 20 (2004)に、糖ィ匕ヘモグロビンに おいて糖ィ匕を受けている残基が示されており、該文献中の Table IIにおいて、糖ィ匕 ヘモグロビンは「 鎖」の N末端の Val以外には、「α鎖」では 16番目、 61番目及び 1 39番目の: Lys (リジン）、「j8鎖」では 17番目、 59番目、 66番目、 132番目及び 144 番目の Lys残基が糖ィ匕を受けて 、ることが記載されて 、る。「 a鎖」の N末端の Valは ほとんど糖化されておらず、これはヘモグロビン分子の立体構造特性によるものと考 えられる。
[0034] 通常、糖ィ匕ヘモグロビンを測定する場合には、上記の全ての糖ィ匕部位における糖 化を測定する、すなわち、全ての糖化部位に由来する糖化アミノ酸及び/又は糖ィ匕 ペプチドを測定する。これに対し、 HbAlcを測定する場合には、糖ィ匕ヘモグロビン「 β鎖」の Ν末端の Valにおける糖ィ匕のみを測定する、すなわち、「 β鎖」の Ν末端由来 の a 糖化アミノ酸及び/又は a 糖ィ匕ペプチドのみを測定する。
[0035] なお、上記のように、 HbAlcを測定する方法としては、 a 糖化アミノ酸を測定す る方法又は a 糖ィ匕ペプチドを測定する方法がある力 以下の理由により、 a 糖 化ペプチドを測定する方法がより好ま 、。
[0036] 第 1に、糖ィ匕蛋白質力 N末端の α 糖ィ匕ペプチドを効率よく遊離させることがで きるプロテアーゼが数多く知られているのに対し、 Ν末端の oc 糖化アミノ酸を遊離 させることができるプロテアーゼは見出されていない。すなわち、糖ィ匕蛋白質の量を 反映して糖化蛋白質の Ν末端の a—糖ィ匕部位力 遊離してくる物質は、事実上 (X - 糖化ペプチドのみである。
[0037] 第 2に、たとえ糖化蛋白質の Ν末端の oc 糖化部位から a 糖化アミノ酸を効率よ く遊離させることのできるプロテアーゼが見出された場合でも、これを用いて糖ィ匕へモ グロビンから oc—糖ィ匕アミノ酸を遊離させる際には、糖ィ匕ヘモグロビンの「 oc鎖」及び 「 β鎖」の糖ィ匕 Ν末端力も共に oc—糖ィ匕アミノ酸が遊離して、これらを区別することが できない。すなわち、糖ィ匕ヘモグロビンの「α鎖」及び「j8鎖」の Ν末端の 1残基目の アミノ酸配列はいずれも Valであり、遊離する α 糖ィ匕アミノ酸は共にフルクトシルバ リンであることから、「 β鎖」の糖ィ匕のみを測定することができない。
[0038] 糖ィ匕ヘモグロビンは赤血球中に局在する。すなわち、糖ィ匕ヘモグロビンを測定対象 とする場合は、赤血球を含む試料を測定することが好ましぐ具体的には、全血及び /又は血球試料が好適に使用できる。本明細書中に記載の全血及び/又は血球試料 には、採血、又は保存用血液、市販の標準血液 (例えば、 HbAlc測定用常用標準 物質:福祉，医療技術振興会製、東京、日本国)等を含み、各種方法により処理した ものや、抗凝固剤その他の各種添加物質を添加したものを含む。
[0039] 全血とは、血液の全成分を含むものであり、主要成分として赤血球、白血球、血小 板、血漿等を含有する。血球試料とは、全血から血漿成分を分離除去した画分であ り、主要成分として赤血球、白血球、血小板等を含有する。全血からの血球試料の分 離方法は特に制限されず、例えば遠心分離操作や、血清分離シート (血球分離膜） の使用等により分離を行うことができる。
[0040] 糖ィ匕ヘモグロビン測定の場合、全血及び/又は血球試料は、溶血させたものを測定 に使用する。一般的な糖ィ匕ヘモグロビン測定においては、全血をそのまま溶血させ、 又は全血から遠心分離等により血漿を除去し、血球画分を分離してこれを溶血させ る。溶血方法は特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による 方法、浸透圧の差を利用する方法、凍結融解による方法等が使用できる。このように して得られた試料を、プロテアーゼ処理等を含む測定用の各処理に供する。
[0041] 一方、 HbAlcと比べてより短期の血糖コントロールの指標として、糖ィ匕アルブミンが 用いられる場合がある。血清中に主に含まれるタンパク質であるアルブミンは、内部 の 4箇所の Lys残基にぉ 、て糖ィ匕を受けることが知られて 、る。 HbAlcを測定する 場合と同様、糖ィ匕アルブミンを測定する際も、サンプル中に夾雑する糖ィ匕物を効率 的に消去し、アルブミン内部の糖ィ匕された Lys残基に由来する糖ィ匕物のみを測定す る必要がある。
[0042] 本明細書中にお!ヽて、糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドに作用する各種ォキシ ダーゼ（フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ、糖ィ匕アミノ酸ォキシダーゼ、フルクトサミン ォキシダーゼ、アマドリアーゼ、などの様々な名称で呼ばれる）を便宜上まとめて「ケト アミンォキシダーゼ」もしくは「消去用酵素」と称する。この定義によれば、本発明にお いて測定用酵素として用いる、 a—糖ィ匕ペプチドを測定するための酵素もケトァミン ォキシダーゼに含まれ得る力 説明上の混乱を避ける目的で、この酵素のみ「ひ 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ」もしくは「測定用酵素」と記載する。なお実際 に、既知の上記ケトァミンォキシダーゼの中で α 糖ィヒペプチドに特異性の高い酵 素は存在しないので、そのような観点力もも両者は明確に区別できる。
[0043] 本発明の「測定用酵素」としては、 a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ、例 えばフルクトシルペプチドォキシダーゼが好ましい。そのような酵素の例としては、ァ カェトミエラ (Achaetomiella)属、ァカエトミゥム (Achaetomium)属、シェラビア (T hielavia)属、力エトミゥム (Chaetomium)属、ケフシノスホフ J¾ (Gelasinospora)、 ミクロァスカス（Microascus)属、コ-ォ力エタ（Coniochaeta)属、ユウぺ-シリウム（ Eupenicillium)属、カーブラリア (Curvularia)属、ピレノケータ (Pyrenochaeta) 属又はアルスリニゥム（Arthrinium)属由来の酵素等が挙げられる（Arch Microbi ol. 180 : 227- 31, 2003及び特開 2004— 275063号）。市販の酵素としては、 FP OX-EE, FPOX— CE (いずれもキッコ一マン社製、日本国）が挙げられる。また、 遺伝子操作糖ィ匕アミノ酸ォキシダーゼ（特開 2001— 95598号)も知られている。本 発明におけるフルクトシルペプチドォキシダーゼの活性は、特開 2003— 235585号 公報 (新規なフルクトシルペプチドォキシダーゼ)記載の方法にて測定し、 37°C、 1分 間に 1 μ molの過酸ィ匕水素を生成する酵素量を 1Uと定義した。
[0044] 本発明の方法における測定値に及ぼす誤差原因物質の影響の程度は、測定用酵 素であるフルクトシルペプチドォキシダーゼの基質特異性にも依存する。すなわち、 使用するフルクトシルペプチドォキシダーゼの基質特異性が高 、ほど、必ずしも完全 な消去操作を要さなくても正確な測定値が得られやすぐ逆に、夾雑物質を測り込み やすい基質特異性を有するフルクトシルペプチドォキシダーゼを使用する場合には 、より完全に各種夾雑物質を消去する必要が生じる。例えば、 oc 糖ィ匕アミノ酸を測 り込みやすいフルクトシルペプチドォキシダーゼを用いる場合、 a 糖ィ匕アミノ酸の 消去は、正確な測定値を得るために必須である。
[0045] また、同じ a 糖ィ匕ペプチドであっても、その配列を識別して、特定の a 糖化べ プチドのみを測定できる基質特異性の高 、フルクトシルペプチドォキシダーゼを用い れば、さらに特定的な測定が可能である。例えば、糖ィ匕ヘモグロビンの「α鎖」側から 遊離し得る (X—糖ィ匕ペプチドである Fru—Val— Leu (フルクトシルノ リルロイシン）に は作用せず、「 β鎖」側から遊離し得る ex—糖ィ匕ペプチドである Fru— Val— His (フ ルクトシルノ リルヒスチジン）には作用するフルクトシルペプチドォキシダーゼを用い ることにより、「ひ鎖」側力 遊離し得る α—糖ィ匕ペプチドを消去することなぐ「|8鎖」 側から遊離し得る OC 糖ィ匕ペプチドのみを測定することもできる。そのような酵素とし ては、 FPOX— EE、 FPOX— CE (いずれもキッコ一マン社製、 日本国）が知られて いる。
[0046] 本発明に使用し得るプロテアーゼとしては、臨床検査に使用が可能で、かつ処理 に供する試料中の測定対象糖化蛋白質、例えば糖ィ匕ヘモグロビンから、少なくとも α —糖ィ匕ペプチドを有効に切り出し得るものであれば、いかなるプロテアーゼを用いて も良い。そのようなプロテアーゼの例としては、プロティナ一ゼ1：、プロナーゼ、サー モリシン、サチライシン（ズブチリシン）、カルボキシぺプチダーゼ Β、パンクレアチン、 カテブシン、カルボキシぺプチダーゼ、エンドプロティナーゼ Glu— C、パパイン、フィ シン、ブロメライン、アミノぺプチダーゼ等のプロテアーゼあるいはぺプチダーゼが挙 げられる。 [0047] 特に oc 糖ィ匕ペプチドを効率よく遊離するプロテアーゼとしては、ァスペルギルス 由来プロテアーゼでは、例えば、「IP酵素 TM」、「AOプロテア一ゼ」、「ぺプチダーゼ」 、 「モルシン TM」（以上キッコ一マン社製、 日本国）、「プロテアーゼ A5」（協和化成社 製、 日本国）、「ゥマミザィム」、「プロテアーゼ A」、「プロテアーゼ M」、「プロテアーゼ P」「ぺプチダーゼ R」（以上天野ェンザィム社製、 日本国）、「スミチーム MPTM」、 「スミ チーム LP— 20™」、 「スミチーム LPL™」、 「スミチーム APTM」（以上新日本化学工業 社製、 日本国）、「プロティナーゼ 6」（フル力社製、米国）、リゾブス由来酵素では、「 ぺプチダーゼ R」（天野ェンザィム社製、 日本国）、バチルス由来プロテアーゼから、「 デイスパーゼ」（ロシュ社製、スイス）、 「サチライシン」（ベーリンガー社製、ドイツ）、 「プ 口ティナ一ゼ^^」（フル力社製、米国）、「プロティナーゼ TypeVII」（シグマ社製、米国 )、「プロティナーゼ, Bacterial」（フル力社製、米国）、「プロテアーゼ N」、「プロレザ 一 FG— F™」、「プロテア一ゼ3」（以上天野ェンザィム社製、 日本国）、「プロティナ ーゼ TypeX」（シグマ社製、米国）、「サーモリシン」（大和化成社製、 日本国）、「プロ ナーゼ E」（科研ィ匕学社製、 日本国）、「中性プロテアーゼ」（東洋紡績社製、 日本国） 、ストレプトマイセス由来プロテアーゼでは、「プロナーゼ」（ベーリンガー社製、ドイツ )、「プロティナーゼ TypeXIV」（シグマ社製、米国）、「ァノレカリプロテアーゼ」（東洋 紡績社製、 日本国）、トリチラチウム由来プロテアーゼから、「プロティナ一ゼ 」（ロシ ュ社 (スイス)、和光純薬社製（日本国））、スタフイロコッカス由来プロテアーゼでは、「 Glu - Cj (ベーリンガー社製、ドイツ）、植物由来プロテアーゼでは、パパイン（ロシュ 社 (スイス）、和光純薬社（日本国）、シグマ社、天野ェンザィム社（日本国）、アサヒ社 製（日本国)）、フイシン (シグマ社製、米国）、ブロメライン (天野ェンザィム社（日本国 )、シグマ社 (米国)製、）、動物由来プロテアーゼでは、「パンクレアチン」（和光純薬 社製、 日本国）、カテブシン B (シグマ社製、米国）等のプロテアーゼを含むものが特 に好適に用いられる。
[0048] 上記プロテアーゼは、単独で用いても、また 2種以上を組み合わせて用いてもょ ヽ 。例えば、糖ィ匕ヘモグロビンは、エンドプロティナーゼ Glu— Cにより、 a 糖化へキ サぺプチド（フルクトシル &1 1¾5
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0111)が生成することが知ら れて ヽる（Kobold U. , et al, Clin. Chem. 1997, 43 : 1944— 1951)。その ため、 Glu—Cと上記プロテアーゼを組み合わせることは、糖ィ匕ヘモグロビンからひ 糖ィ匕ペプチドを製造するのに極めて有効な方法である。なお、上記のプロテアーゼ 群は具体的な一例に過ぎず、これらに限定されるものではない。
[0049] 本発明においてプロテアーゼを選択する際には、測定対象とする糖ィ匕蛋白質から 、 a 糖ィ匕ペプチドを効率よく切り出してくることと同時に、夾雑物質の生成をできる 限り抑制するという観点力もの酵素の選択を行うこともできる。すなわち、測定試料中 に含まれる、測定対象糖化蛋白質以外の糖化蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/又は ペプチドを夾雑物質として予測し、それらを生成しにく 、タイプのプロテアーゼを選択 することにより、夾雑物質の生成を抑制できる。既知の各種プロテアーゼがどのような アミノ酸残基間の結合を切断しやすいかに関しては非常に多くの知見があり、この情 報などに基づいてプロテアーゼを選択することができる。
[0050] 試料のプロテアーゼ処理条件は、用いるプロテアーゼが糖ィ匕ヘモグロビンに作用し
、 a 糖ィ匕ペプチドを短時間に効率よく遊離する条件であれば、いかなる条件でもよ い。使用するプロテア一ゼの量は、試料中に含まれる糖ィ匕ヘモグロビンの含量あるい は処理条件等により適宜選択され、例えば、一例として、ァスペルギルス属菌由来の プロテアーゼ (例えば、プロテアーゼ p、天野 (株)販売、日本国）を、終濃度が 0. 1〜
50UZmL、好ましくは 1〜： LOUZmLとなるように加える。さらに必要により適宜他の プロテアーゼをカ卩えてもよ ヽ。
[0051] プロテアーゼで処理する際の pHは、無調整でもよぐ使用するプロテアーゼの作用 に好適な pHとなるように、例えば、適当な pH調整剤、例えば、塩酸、酢酸、硫酸、水 酸ィ匕ナトリウム、水酸ィ匕カリウム等により、 pH2〜9、好ましくは pH3〜8に調整しても よい。処理温度は、例えば、 20〜50°Cで行ってもよぐ用いる酵素によっては、より高 温域の 45〜70°Cで行ってもよい。この際の処理時間は、糖化蛋白質を分解するの に充分な時間であればよぐ 30秒〜 180分間、好ましくは 1〜60分間で行うことがで きる。得られる処理液は、そのまま、あるいは必要により適宜、加熱、遠心分離、濃縮 、希釈等をしてもよい。
[0052] 本発明に使用可能なプロテアーゼの活性はカゼインフォリン法により測定し、 37°C 、 1分間において 1 μ gのチロシンに相当する発色を 1Uと定義した。 [0053] 本発明で消去の対象となる糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドは、血液、血漿、 血清等の中に含まれて 、る遊離の糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドのみならず、 プロテアーゼ処理により測定対象物である糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドが生 成するのと同時に生成する、ヘモグロビン及びヘモグロビン以外の糖ィ匕蛋白質由来 の糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドを含む。すなわち、糖化ヘモグロビン測定の 際には、糖ィ匕ヘモグロビンのプロテアーゼ処理で切り出された α 糖ィ匕ペプチドの みが測定対象物となるが、ヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来の糖化アミノ酸及び/ 又は糖化ペプチド、さらには糖化ヘモグロビン由来の ε—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖化べ プチド、 a—糖ィ匕アミノ酸が誤差原因となり得る。
[0054] すなわち、この系において測定対象とすべき物質とは、糖化ヘモグロビン由来の α 糖ィ匕ペプチドのみである。一方、消去の対象とすべき夾雑物質とは、遊離の OC 糖ィ匕アミノ酸、 ex 糖ィ匕ペプチド、 ε 糖ィ匕アミノ酸、及び ε 糖ィ匕ペプチドであり、 さらに、ヘモグロビン以外の糖化蛋白質由来の oc 糖ィ匕アミノ酸、 OC 糖化ペプチド 、 ε 糖ィ匕アミノ酸、及び ε 糖化ペプチドであり、さらに、糖化ヘモグロビン由来の ε—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖ィ匕ペプチド、及び α—糖ィ匕アミノ酸である。
[0055] さらに、上記測定対象物質であるヘモグロビン由来の α 糖ィ匕ペプチドには、 2種 類がある。これはヘモグロビン分子が「 α鎖」及び「 j8鎖」という異種のサブユニットか らなり、両者の N末端アミノ酸配列が異なることに起因し、ヘモグロビン分子内のどち らのサブユニットから遊離してくるかの違いによって、構造の異なる a—糖ィ匕ペプチド 力 S生じることによる。「ひ鎖」「 鎖」のいずれに由来するかによらず、 α 糖化べプチ ドの和を測定する場合には、両者を区別する必要はない。一方、特定のサブユニット に由来する OC 糖ィ匕ペプチドの量のみを測定する意図がある場合には、他方のサブ ユニット〖こ由来する oc 糖ィ匕ペプチドもまた、夾雑物質とみなされる。例えば、 HbAl c測定は、ヘモグロビン「 |8鎖」から遊離する a 糖ィ匕ペプチドを測定するものである から、「ひ鎖」由来の α 糖化ペプチドは、原理上、誤差原因夾雑物質となり得る。以 下、各種夾雑物質の消去について、又は消去が行えない夾雑物質が本発明の測定 値に及ぼす影響に関し、順に説明する。
[0056] まず、ケトァミンォキシダーゼで消去可能な各種夾雑物質に関して述べる。測定用 酵素であるフルクトシルペプチドォキシダーゼにより α 糖ィヒペプチドを測定する際 に、例えばフルクトシルペプチドォキシダーゼの基質特異性が極めて高ぐ a 糖ィ匕 アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、あるいは ε 糖ィ匕ペプチドなどの夾雑物質に実質的に 作用しないのであれば、これらの消去はあえて必要とされないことは当然である。しか し、これまでに知られている各種フルクトシルペプチドォキシダーゼはいずれも、程度 の差はあれ多少夾雑物質に作用し、中でも、構造類似性の高い α 糖ィ匕アミノ酸に 対しては作用しやすい傾向を有している。従って、本発明においては、正確な測定を 実現するために、特に α 糖ィ匕アミノ酸の消去が重要である。従来のケトアミンォキ シダーゼによる測定系では oc 糖ィ匕ペプチドと oc 糖ィ匕アミノ酸との区別に着目し た測定ができな力つた力 本発明では各種ケトァミンォキシダーゼを消去用に、フル クトシルペプチドォキシダーゼを測定用に使うことにより、 a 糖ィ匕アミノ酸を消去し a 糖ィ匕ペプチドのみを測定できるようになり、効率的な消去が実現される。
[0057] さらに測定誤差を低減するために、本発明では、 ε—糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε - 糖ィ匕ペプチドを重ねて消去することができる。当然ながら、試料の性質上あるいは測 定用酵素の基質特異性上、あえて消去を必要としない場合には、追加的な消去を行 わなくてもよい。また、消去用酵素の基質特異性を利用して、同一の酵素で同時に複 数の物質を消去することもでき、ある!/、は複数の酵素を組み合わせて各酵素の作用 により複数の物質を消去してもよい。例えば、 ε 糖ィ匕アミノ酸と ε 糖化ペプチド は、ある種の酵素により共に消去される傾向がある。
[0058] 次に、ケトァミンォキシダーゼで消去不可能な夾雑物質について述べる。すなわち この夾雑物質とは OC 糖化ペプチドであり、具体的には、遊離の OC 糖化ペプチド 及びヘモグロビン以外の糖ィ匕蛋白質由来の a 糖ィ匕ペプチド、さらに、 HbAlc測 定時におけるヘモグロビン「ひ鎖」由来の a 糖ィ匕ペプチドを指す。これらは消去用 酵素であるケトァミンォキシダーゼでは消去できず、測定系内に残る可能性を有する 。しかし、本発明の目的とする糖ィ匕蛋白質の測定系、特に糖ィ匕ヘモグロビンの測定 系において、これらが測定値に与える影響は少ない。その根拠としては以下が考えら れる。
[0059] まず 1点目に、輸液等の影響を受けて増加する可能性が高い遊離の夾雑物の多く は糖ィ匕アミノ酸であり、遊離の糖ィ匕ペプチドが増加する可能性は低い。輸液中に多く 含まれるのはペプチドではなくアミノ酸であるためである。
[0060] 2点目に、糖ィ匕蛋白質のプロテアーゼ処理により遊離する a 糖ィ匕ペプチドは、原 理上、その糖ィ匕蛋白質を構成する各ポリペプチドの各 N末端から、最大 1個ずつしか 生じ得ないため、糖化蛋白質内部に複数の ε 糖ィ匕部位を含むことにより多量に遊 離する可能性を有する ε 糖ィ匕ペプチドに比較して、夾雑し得る絶対量が少ない。
[0061] 3点目に、 HbAlcにおいては、ヘモグロビン「 α鎖」由来の α 糖ィ匕ペプチドの夾 雑は現実にほとんど起こらない。 Delpierre、J. Biol. Chem. , 279:27613— 20 (2 004)の Table IIにおいて、糖ィ匕ヘモグロビンにおいて糖ィ匕を受けている部位ごとの 相対量が示されており、これにおいて「 j8鎖」の N末端における aー糖ィ匕が最も多ぐ 相対量 0. 32である。また、「ひ鎖」内部の ε 糖化の合計相対量は約 0. 4、「 鎖」 内部の ε—糖化の合計相対量は 0. 22である。これに対し、「ひ鎖」の Ν末端におけ る α 糖化の相対量は 0. 01にすぎず、従って、ヘモグロビン「 α鎖」由来の α 糖 化ペプチドの夾雑は実質的な問題とならず、本発明の測定方法において、夾雑物と しての (X 糖ィ匕ペプチドが消去されないことは測定値に実質的な悪影響を与えない
[0062] 万一、遊離の oc 糖ィ匕ペプチドが特に多く夾雑するような状況が起こり得たとしても 、その場合には、プロテアーゼ処理前にフルクトシルペプチドォキシダーゼによる α 糖ィ匕ペプチド消去を行うことにより、プロテアーゼ処理後に新たに遊離する α 糖 化ペプチドのみを算出することができる。また、プロテアーゼの選択に関し上述した 通り、夾雑物の生成が極力抑制されるような基質特異性を有するプロテア一ゼを選 択することによつても、夾雑物としての α 糖ィ匕ペプチドの生成を十分に抑制するこ とがでさる。
[0063] カロえて、フルクトシルペプチドォキシダーゼの選択に関し上述した通り、例えば糖ィ匕 ヘモグロビンの「ひ鎖」側から遊離し得る α—糖ィ匕ペプチドである Fru— Val— Leu ( フルクトシルバリルロイシン）には作用せず、「 β鎖」側から遊離し得る OC 糖化ぺプ チドである Fru— Val— His (フルクトシルノ リルヒスチジン）には作用するフルクトシル ペプチドォキシダーゼを用いることにより、測定酵素により夾雑物質を測り込むことな ぐ正確な測定値を得ることが可能である。
[0064] 本発明の「消去用酵素」としては、糖ィ匕アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドに良好に作 用し、過酸ィ匕水素を生成するケトァミンォキシダーゼであればいかなる酵素を用いて も良い。「 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチドに作用するケトァミンォキシ ダーゼ」、「ひ—糖ィ匕アミノ酸に作用するケトアミンォキシダーゼ」及び/又は 糖 化アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチド、及び α 糖ィ匕アミノ酸に作用するケトァミン ォキシダーゼ」が好まし!/、。
[0065] 「 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチドに特異性の高いケトアミンォキシダ ーゼ」の例としては、ギペレラ（Gibberella)属、フサリウム（Fusarium)属由来の酵素 などが知られている。具体的には、フルクトシルリジンォキシダーゼ (フサリウム属由来 、ギペレラ属由来、特開平 11-243950参照）、ケトァミンォキシダーゼ (フサリウム属由 来、 Genzyme社 (米国)販売）、フルクトサミンォキシダーゼ (旭化成（日本)製、 PCT ZJP02Z00721参照）などが挙げられる。これらの酵素は、 a—糖ィ匕アミノ酸に実 質的に作用しな 、点で特徴的である。
[0066] また、「 a 糖ィ匕アミノ酸に特異性が高いケトアミンォキシダーゼ」の例としては、コリ ネノ クテリゥム (Corynebacterium)属、ァグロノくクテリウム (Agrobacterium)、ァー スロバクタ一（Arthrobacter)由来の酵素などが知られている。 FAOX— C (コリネバ クテリゥム由来、 Bisci Biotechnol Biochem. 66 : 1256— 61, 2002参照）、 FAO X— TE (コリネバクテリゥム由来、キッコ一マン社（日本)製）、フルクトシルアミノ酸ォ キシダーゼ (コリネバクテリゥム属由来、シグマ ·アルドリッチ社 (米国)製）、 AgaE— li ke Protein (ァグロノ クテリゥム属由来、 Biosci Biotechnol Biochem. 66 : 2323 - 9, 2002参照）、 ArFAOD (アース口パクター属由来、 Biotechnol Lett. 27: 2 7- 32, 2005参照）などが挙げられる。これらの酵素は、 ε—糖化アミノ酸及び ε - 糖化ペプチドに実質的に作用しな 、点で特徴的である。
[0067] また、「 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖ィ匕ペプチド、及び a 糖ィ匕アミノ酸に作 用するケトアミンォキシダーゼ」の例としては、ギペレラ（Gibberella)属、フサリウム属 (Fusarium)、ぺ-シリウム (Penicillium)属、ァスぺノレギノレス (Aspergillus)属、力 ンジダ（Candida)属、アクレモ -ゥム（Acremonium)属、デバリオマイセス（Debary omyces)属、ピキア（Pichia)属及びトリコスポロン（Trichosporon)属、バチルス（B acillus)属由来の酵素などが知られている。具体的には、フルクトシルアミノ酸ォキシ ダーゼ (フサリウム属由来、特開平 8— 154672参照）、フルクトシルアミノ酸ォキシダ ーゼ（ぺ -シリウム属由来、ァスペルギルス'テレウス由来、 Eur J Biochem. 242 : 499 - 505, 1996参照）、フルクトシルァミンォキシダーゼ（ァスペルギルス属由来、 Agric biol chem 55 : 333— 8, 1991参照）、アマドリアーゼ I、 Π (ァスペルギルス- フミガーッス由来、 J Biol Chem. 272 : 3437—43 1997参照）、フルクトシルァミノ 酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス属由来、 Diazyme社（米国）製）、フルクトシルァミノ 酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス' -ドランス由来、 Arch Microbiol. 178 : 344— 5 0, 2002参照）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス 'ォリゼ一由来、 Appl Environ Microbiol. 70 : 5882— 90, 2004参照）、フルクトシルァミンデグリ カーゼ (カンジダ属由来、米国特許第 5387109号参照）、ケトアミンォキシダーゼ (ァ クレモ-ゥム属、デバリオマイセス属由来、米国特許第 5370990号参照）、フルクト シルァミンォキシダーゼ（ピキア属由来、 Mar Biotechnol 6 : 625— 32, 2004参 照）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（トリコスポロン属由来、特開 2000— 245454 号参照）、フルクトシルァミン酸ィ匕酵素（バチルス属由来、特開 2002— 125663号参 照）、ケトァミンォキシダーゼ (旭化成社（日本)製、特開 2004— 222570号参照）、 F AOD—E (キッコーマン社（日本)製)などが挙げられる。
[0068] なお、これらの酵素を含め上記した全てのケトァミンォキシダーゼは、 (X—糖化べ プチドに対し作用しない。従って、これらを任意に組み合わせて消去を行うことにより 、 a—糖ィ匕ペプチドを残して、夾雑物質を効率よく消去することができる。複数の酵 素の組み合せにより、 a 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖化アミノ酸及び ε 糖ィ匕ペプチドを 全て消去することが、夾雑物質をより完全に消去できる点で最も好ましい。
[0069] ケトァミンォキシダーゼの活性は特開平 11— 155579号公報（フルクトシルアミノ酸 ォキシダーゼ遺伝子、新規な組換え体 DNA及びフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ の製造法)記載の方法にて測定し、 37°C、 1分間に 1 molの過酸ィ匕水素を生成す る酵素量を 1Uと定義した。
[0070] 本発明の「消去用酵素」は、処理液中に含まれる糖化アミノ酸及び/又は糖化ぺプ チドの量にもよるが、例えば、終濃度が、 0. l〜50UZmL、好ましくは 1〜： LOUZm Lとなるように添加すればよい。作用させる際の pHは、例えば、 pH3〜l l、特に好ま しくは pH5〜9であり、ケトァミンォキシダーゼの至適 pHを考慮し、反応に適した pH となるように、緩衝剤を用いて調整するのが好ましいが、作用可能な pHであればこれ に限定されない。 pHの調製法は、特に限定されず、緩衝剤としては、例えば、 N— [ トリス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス (ヒドロキシ メチル）—ァミノメタン、硼酸塩、クェン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、 HEP ES等が挙げられる。また、必要により適宜、反応液の pHを、緩衝剤を用いて上記 p Hに調整してもよい。
[0071] 作用時間は、例えば、 1〜120分間、好ましくは 1〜30分間であり、基質となる糖ィ匕 アミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドの量にもよる力 ケトァミンォキシダーゼ力 それらに 作用するのに充分な時間であればよい。作用温度は、例えば、 20〜45°Cであり、通 常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択することができる。
[0072] ケトァミンォキシダーゼの作用により生成した過酸ィ匕水素は、カタラーゼ等によって 分解してもよい。本発明に用いられる緩衝剤としては、例えば、 N— [トリス (ヒドロキシ メチル)メチル]グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス (ヒドロキシメチル）—ァミノ メタン、硼酸塩、クェン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、 HEPES等が挙げら れる。さらに必要により、本発明の目的を損なわない範囲で、種々の添加物、例えば 、溶解補助剤、安定化剤等として、界面活性剤（トリトン X— 100、ブリッジ 35、ツイ一 ン 80、コール酸塩等）、還元剤（ジチオスレィトール、メルカプトエタノール、 L シス ティン等）、牛血清アルブミン、糖類 (グリセリン、乳糖、シユークロース等)等を適宜添 カロしてちょい。
[0073] 糖ィ匕ヘモグロビンを含有する試料をプロテアーゼ処理後、本発明の「消去用酵素」 を用いて誤差原因物質を消去する。この消去をプロテアーゼ処理後に行うことは重 要である。本発明者らは、実際にプロテアーゼ処理前に消去を行ったところ、定量的 な正確な測定はできな力つた。これに対して、本発明は、この消去を、プロテアーゼ 処理後の試料に対し、 1種類以上のケトァミンォキシダーゼを作用させて行うことを特 徴とする。 [0074] 消去用酵素は、 oc 糖化アミノ酸を消去する酵素、 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε —糖化ペプチドを消去する酵素、ある 、はこれらの 、かなる組合わせで用いてもよ!ヽ 力 処理後に試料中の遊離の ex 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、及び ε 糖ィ匕 ペプチドが消去され、 a 糖ィ匕ペプチドが残ることが望ましぐこのためには「 α—ァ ミノ基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸に作用するケトアミンォキシダーゼ」及び「 ε—ァミノ 基が糖ィ匕された糖ィ匕アミノ酸及び/又はペプチドに作用するケトアミンォキシダーゼ」 を組み合わせて用いることが望ましい。また、ケトァミンォキシダーゼは α 糖ィ匕ぺプ チドに作用しな 、ことが望ま 、。プロテアーゼ処理前時点で消去対象物質が特に 多量に存在することが明らかな場合等には、プロテアーゼ処理前に別途消去工程を さらに導入してもよい。
[0075] プロテアーゼ処理後に消去用酵素を作用させる際には、プロテアーゼが消去用酵 素を迅速に分解してしまわないように、反応条件を工夫することができる。例えば、プ 口テアーゼと消去用酵素の反応至適 ρΗや作用適温の相違、また各酵素の活性に及 ぼす塩類や金属、キレート剤、プロテアーゼ阻害剤の影響などを考慮して、プロテア ーゼが消去用酵素を分解しにくい条件を設定することができる。また、処理液の希釈 や消去酵素の大量添加等により、両酵素の量的バランスを調整する方法も使用可能 である。あるいは、膜濾過、クロマトグラフィー、塩析等の方法によりプロテア一ゼを物 理的に除去することもできる。又は熱処理、酸'アルカリ処理、希釈等によってプロテ ァーゼを失活させることも可能である。プロテアーゼによる消去用酵素の分解が測定 値に悪影響を与えな 、程度にとどまるのであれば、特別な条件設定を行わな 、ことも 可能である。
[0076] 本発明の方法はさらに、消去対象物質の消去後に、 oc 糖化ペプチドに作用する ォキシダーゼを用いて、 a 糖ィ匕ペプチド量を測定することを含む。例えば、消去後 に、試料に「測定用酵素」である FPOXなどのフルクトシルペプチドォキシダーゼを作 用させて OC—糖ィ匕ペプチド量を正確に測定することができる。
[0077] 用いるフルクトシルペプチドォキシダーゼは処理液中に含まれる a—糖化ペプチド の量にもよるが、例えば、終濃度が、 0. l〜50UZmL、好ましくは 1〜： LOUZmLと なるように添加すればよい。作用させる際の pHは、例えば、 pH3〜l l、特に好ましく は pH5〜9であり、フルクトシルペプチドォキシダーゼの至適 pHを考慮し、測定に適 した pHとなるように、緩衝剤を用いて調整するのが好ましいが、作用可能な pHであ ればこれに限定されない。 pHの調製法は、特に限定されず、緩衝剤としては、例え ば、 N— [トリス (ヒドロキシメチル)メチル]グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ ヒドロキシメチル）一ァミノメタン、硼酸塩、クェン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシ ン、 HEPES等が挙げられる。また、必要により適宜、プロテアーゼ処理後の処理液 の pHを、緩衝剤を用いて上記 pHに調整してもよい。作用時間は、例えば、 1〜120 分間、好ましくは 1〜30分間であり、基質となる糖ィ匕ペプチドの量にもよる力 フルクト シルペプチドォキシダーゼ力 それらのペプチドに作用するのに充分な時間であれ ばよい。作用温度は、例えば、 20〜45°Cであり、通常の酵素反応に用いられる温度 を適宜選択することができる。
[0078] フルクトシルペプチドォキシダーゼの作用により生成した過酸化水素は、 、かなる 方法により測定してもよぐ例えば、酸素電極を用いる電気的方法、好ましくは、パー ォキシダーゼ及び適当な発色基質を用いる酵素的方法等が挙げられる。例えば、本 発明では、酵素的方法を用いて、短時間に、簡単な操作で測定を行うことが好ましい 。酵素的方法により過酸ィ匕水素を測定するための試薬としては、例えば、緩衝剤 (P H4〜10力 子ましい） 5〜500mM、好ましくは 50〜： LOOmM、発色基質として 4 ァ ミノアンチピリン 0. 01〜50mM、好ましくは 0. l〜20mM、パーォキシダーゼ 0. 1 〜50UZmL、好ましくは l〜20UZml等の組成を含む試薬を挙げることができる。 測定系に用いられる緩衝剤としては、例えば、 N— [トリス (ヒドロキシメチル)メチル]グ リシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス (ヒドロキシメチル）—ァミノメタン、硼酸塩、ク ェン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、 HEPES等が挙げられる。
[0079] 発色基質としては、 4ーァミノアンチピリンの他に、例えば、 ADOS (N ェチルー N
- (2—ヒドロキシ一 3—スルホプロピル） m—ァ-シジン）、 ALOS (N ェチルー N— (2 ヒドロキシ一 3—スルホプロピル）ァ-リン）、 DA— 67 (10— (カルボキシメ チルァミノカルボ-ル）—3、 7 ビス（ジメチルァミノ）—フエノシァジン）、 DA— 64 (N （カルボキシメチルァミノカルボ-ル）ー4、 4' ビス（ジメチルァミノ）ージフエ-ル ァミン)等が挙げられる。 [0080] さらに必要により種々の添加物、例えば、溶解補助剤、安定化剤等として、界面活 性剤（トリトン X— 100、ブリッジ 35、ツイーン 80、コール酸塩等）、還元剤（ジチオスレ ィトール、メルカプトエタノール、 L—システィン等）、牛血清アルブミン、糖類 (グリセリ ン、乳糖、シユークロース等)等を適宜添加してもよい。
[0081] 過酸化水素の測定を行う際、一般に、ォキシダーゼの作用により過酸化水素を生 成する工程を同時に行うことが好ましぐ本発明では、前述の過酸化水素を測定する ための試薬に、フルクトシルペプチドォキシダーゼを、例えば、 0. l〜50UZmL、 好ましくは 1〜： LOUZmL添加することが好ましい。これらの測定用試薬は、乾燥物 又は溶解した状態で用いてもよぐ薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含 浸させて用いてもよい。
[0082] また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用するこ ともできる。測定温度は、例えば、 20〜45°Cであり、通常の酵素反応に用いられる温 度を適宜選択することができる。測定に要する時間は、種々の測定条件により適宜選 択できる力 例えば、 0. 1〜60分間、特に、 1〜： LO分間が好ましい。上記測定試薬 の発色の程度 (吸光度変化量)を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して 、試料中に含まれる糖ィ匕ペプチドあるいは糖ィ匕蛋白質を測定することができる。測定 には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
[0083] 本発明はさらに、ひ一糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖化ペプチド又はそ れらの組合わせ物に作用し、かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない 1種類又は複数の ケトァミンォキシダーゼを含有し、試料中の α—糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド又はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする消去試薬を提 供する。
[0084] 本発明で消去用に用いるケトァミンォキシダーゼを組み合わせることにより、消去試 薬を調製することができる。この消去試薬を使用することによって、目的とする複数の 消去対象物質を同時に効率よく消去できる。この消去試薬は、基質特異性の異なる 、上で説明した 1種類以上のケトァミンォキシダーゼを含有し、さらに、消去効率を向 上させ、酵素の安定ィヒに貢献する各種の安定剤や緩衝剤その他の成分を含んでも 良い。 [0085] ケトァミンォキシダーゼの具体例は、上記「消去用酵素」の具体例に挙げた酵素、 即ち、フルクトシルリジンォキシダーゼ (フサリウム属又はギペレラ属由来）、ケトァミン ォキシダーゼ（フサリウム属由来、 Genzyme社 (米国）販売）、フルクトサミンォキシダ ーゼ (旭化成（日本)製）、 FAOX— C (コリネバクテリゥム由来）、 FAOX— TE (コリネ ノ クテリゥム由来、キッコ一マン社（日本)販売）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（ コリネバタテリゥム属由来、シグマ ·アルドリッチ社 (米国）販売）、 AgaE— like Prote in (ァグロバタテリゥム属由来）、 ArFAOD (アースロバクタ一由来）、フルクトシルアミ ノ酸ォキシダーゼ（ぺ -シリウム属由来、ァスペルギルス'テレウス由来）、フルクトシ ルァミンォキシダーゼ（ァスペルギルス属由来）、アマドリアーゼ I、 II (ァスペルギルス' フミガーッス由来）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス属由来、 Diaz yme社（米国）販売）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス ·ニダランス 由来）、フルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ（ァスペルギルス'オリゼー由来）、フルクト シルァミンデグリカーゼ (カンジダ属由来）、ケトァミンォキシダーゼ (アクレモ-ゥム' デバリオマイセス由来）、フルクトシルァミンォキシダーゼ（ピキア属由来）、フルクトシ ルアミノ酸ォキシダーゼ（トリコスポロン属由来）、フルクトシルァミン酸化酵素（バチル ス属由来）、ケトァミンォキシダーゼ (旭化成社（日本)製）、 FAOD E (キッコーマン 社（日本)製)またはそれらの組合わせである。
[0086] さらに本発明は、上記消去試薬と、プロテアーゼ処理用のプロテアーゼ含有試薬、 及び測定用の 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼを含有する試薬を含む、 糖ィ匕ヘモグロビンなどの糖ィ匕蛋白質測定用のキットを提供する。本発明の糖化へモ グロビンなどの糖ィ匕蛋白質の測定用キットは、上述の各試薬を異なる容器に含むも のとして調製すれば良ぐ例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品と して提供でさる。
[0087] 本発明にお 、て好ま 、 a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼは、フルクトシ ルペプチドォキシダーゼである。
[0088] 本発明に基づく糖ィ匕ヘモグロビンを定量する酵素反応試薬には、各種既知の成分
、例えば界面活性剤、塩類、緩衝剤、 pH調製剤や防腐剤などを適宜選択して添カロ することができる。 [0089] さらに本発明の測定方法、消去試薬およびキットは、電極等を用いる過酸化水素の 定量等の系に応用してもょ 、。
[0090] 具体的には、 a 糖ィ匕ジペプチドに作用するフルクトシルペプチドォキシダーゼの 力価は、例えば、下記の方法で測定することができ、他の方法でも測定可能である。
[0091] (1)試薬の調製
試薬 1 (R1) : 1. OkUのパーォキシダーゼ（以下、 PODと略称する。キッコ一マン社 (日本国)製）、 lOOmgの 4ーァミノアンチピリン (以下、 4AAと略称する。東京化成社 (日本国)製)を 0. 1Mのリン酸カリウム緩衝液 (pH8. 0)に溶解し、 1Lに定容する。
[0092] 試薬 2 (R2) : 500mgの TOOS (N ェチル N— (2 ヒドロキシ— 3—スルホプロ ピル）— m—トルイジン、同仁ィ匕学社（日本国)製)をイオン交換水に溶解し、 lOOmL に定容する。
[0093] 試薬 3 (R3)：フルクトシル Val— His (MW416、製造方法は特開 2003— 235585 参照） 1. 25gをイオン交換水に溶解し、 lOmLに定容する。
[0094] (2)測定
2. 7mLの R1に、 100 Lの R2を加え、さらに、 100 Lのフルクトシルペプチドォ キシダーゼを含む酵素液を加えて混和し、 37°Cで、 5分間予備加温する。
[0095] その後、 100 Lの R3をカ卩えてよく混合したのち、分光光度計 (U 2000A、日立 社（日本国)製)を用い、 37°C、 5分間の 555nmにおける吸光度の変化を測定する。 なお、対照液は、 100 Lの R3の代わりに、 100 Lのイオン交換水を加える以外は 前記と同様に操作する。予め調製した過酸ィ匕水素の標準溶液を用いて、その生成す る色素量（吸光度）との関係より得られたグラフから、吸光度の変化に相当する過酸 化水素量を求め、この数値を酵素液中の活性単位とする。 1分間に: molの過酸 化水素を生成する酵素量を 1Uとする。
実施例
[0096] 次に、本発明の実施例を詳細に述べるが、本発明の範囲は何らこれにより限定さ れるものではない。
[0097] 実施例 1
< HbAlc測定における夾雑物質消去試験 > ヘモグロビン Ale (HbAlc)を測定対象糖ィ匕蛋白質として、プロテアーゼ処理によ り生じる a 糖ィ匕ペプチドを FPOXで測定する系において、遊離及びプロテアーゼ 処理により生じると考えられる各種夾雑物質を人為的に添加したモデル系を使用し、 HbAlc測定試験における本発明の夾雑物質消去効果を検証した。
[0098] ( 1)測定対象糖化蛋白質： HbAlc測定用常用標準物質 (福祉医療技術振興会ス タンダードレファレンスセンター（日本国）製） 130gZL(HbAlc値： 5. 8%)
(2)添カ卩夾雑物質： Fru— Val (フルクトシルバリン、 α—糖ィ匕アミノ酸）、 Fru— Gly ( フルクトシルグリシン、 α—糖ィ匕アミノ酸）、 ε -Fru-Lys ( ε —フルクトシルリジン、 ε—糖ィ匕アミノ酸）、 Fru— Val— Leu (フルクトシルノリルロイシン、 α—糖化べプチ ド、糖ィ匕ヘモグロビンの「 ex鎖」 Ν末端から遊離する oc 糖ィ匕ジペプチドに相当）
(3)夾雑物質添加 HbAlcの調製
( 1)の HbAlcを 6区分に小分けし、第 1区分に Fru— Valを、第 2区分に Fru— Gly を、第 3区分に ε — Fru— Lysを、第 4区分に Fru— Val— Leuを、それぞれ試料中 濃度が 250 Mとなるように添加した。また第 5区分には、全ての夾雑物質を試料中 濃度が各 250 Mとなるように添カ卩した。これらの添加夾雑物を、遊離のもの及びプ 口テアーゼ処理により生じた測定誤差原因となる夾雑物質とみなし、以下の消去処 理を含む測定に供した。また、第 6区分には夾雑物質の代わりに生理食塩水を添カロ して、添加物なしの試料とした。
[0099] (4)試薬の調製
表 1に示す組成で、測定に使用する試薬を調製した。
[表 1]
測定用試薬組成
A. プロテアーゼ含有試薬
2 5 0 mM CH E S緩衝液 （和光純薬社製） p H 9. 0 1 . 0 U/m 1 バチルス由来プロテアーゼ （ロシュ社製）
B . 消去試薬 1
2 0 mM MO P S緩衝液 （同仁化学研究所社製） p H 7. 5 5 0 mM 塩化ナトリウム （和光純薬社製）
2 5 0 U/m 1 カタラーゼ （キッコーマン社製）
8. 0 U/m 1 ケトアミンォキシダーゼ
(以下 F A〇X— T E、 キッコ一マン社製）
8. 0 U/m 1 ケトアミンォキシダーゼ
(以下 F AO D_ E、 キッコ一マン社製）
5. 0 mM E D TA 2ナトリウム （同仁化学研究所社製） 0. 2 % B T— 7 (日光ケミカルズ）
0. 3 % B T - 9 (日光ケミカルズ）
C. 測定用試薬
3 0 0 mM T E S緩衝液 （同仁化学研究所社製） p H 8. 0 0. 1 5 mM DA- 6 4 (和光純薬社製）
2 4 U/m 1 フルク トシルぺプチドォキシダーゼ
(F P O X— C E、 キッコ一マン社製）
1 5 U/m 1 P O D (キッコーマン社製）
0. 1 5 % アジ化ナトリウム （和光純薬社製）
[0100] Bの消去試薬 1には、基質特異性の異なる 2種類のケトァミンォキシダーゼを共に 含む。 FAOX— TEは ex—糖ィ匕アミノ酸に、 FAOD— Eは ε—糖化アミノ酸及び ε - 糖ィ匕ペプチドに特異性が高いタイプのケトァミンォキシダーゼである。また、さらに本 発明の消去試薬として、ケトァミンォキシダーゼのうち FAOXのみを含むもの（消去試 薬 2)及び FAODのみを含むもの（消去試薬 3)を調製した。
[0101] (5)測定方法
(3)で調製した各試料 20 μ 1に対し、溶血剤 (スルホライザ：シスメッタス (株)製、 日 本国) 40 μ 1及び精製水 40 μ 1を混合して溶血試料とした。次 、で、この溶血試料各 10 μ 1に、 Αのプロテアーゼ含有試薬試薬 30 μ 1を混合し、 37°C、 90分間プロテア一 ゼ処理を行った。処理後の試料 40 1〖こ Bの消去試薬 220 1を混合し、 37°C、 5分 間反応させた。 750nmにおける吸光度を測定し (A )、 Cの測定用試薬 100 /z lを添
0
加し、 37°C、 5分間インキュベーションし、 750nmにおける吸光度を測定した (A ) 0 また、試料の代わりに生理食塩水を用いた系によりブランクの吸光度変化 (ブランク Δ Α=Αブランク一 Αブランク）を測定した。さらに、既知濃度の検体を用いて、ブラ
1 0
ンクの吸光度変化を差し引いた検体の吸光度変化 (A — A )—ブランク Δ Αを求め
1 0
ることにより、糖ィ匕ヘモグロビンの濃度を算出し、糖ィ匕ヘモグロビン濃度をへモグロビ ン濃度で割ることにより、糖ィ匕ヘモグロビン値 (HbAlc値 (％) )を算出した。消去試 薬 1、 2、 3のそれぞれを使用した系について測定を行い、比較例として、 Bの消去試 薬を使用せず、消去工程を行わない系で同様の測定を行った。以上の結果を表 2に 示す。
[表 2]
各種夾雑物質の添加に対する H b A 1 c測定値の比較
Figure imgf000027_0001
ヘモグロビン濃度 （H b ) ： 1 3 0 g / L
[0102] 消去 1、消去 2、及び消去 3は、消去試薬としてそれぞれ消去試薬 1、 2、及び 3を使 用した時の結果を示す。
[0103] 表 1に示すとおり、消去を行わない糖ィ匕ヘモグロビン測定においては、夾雑物質の 添加をそのまま反映して、添加物質なしの測定値よりも HbAlc値が顕著に高く測定 され、正確な値が得られなかった。特に、 a—アミノ酸である Fru— Val及び Fru— G1 yを添加したものにつ 、て測定誤差が大き力つた。全ての夾雑物質を共存させた時 は、添加なしの系の測定値が 5. 8%であるのに対し 43. 7%であり、夾雑物質存在 下では実際と著しくかけ離れた測定値となった。これに対し、本発明の消去試薬 1を 用いた消去工程を含む測定にぉ 、ては、全ての添加物にっ 、て夾雑物質による測 定誤差がなくなり、添加物質なしの系で得られた HbAlc値と一致した結果が得られ 、夾雑物質が効率よく消去されて正確な測定が行えることが確認できた。
[0104] 本発明の消去試薬 1は、 a—糖ィ匕アミノ酸に特異性が高いタイプと ε—糖ィ匕ァミノ 酸及び ε 糖ィ匕ペプチドに特異性が高いタイプの 2種類のケトアミンォキシダーゼを 共に含み、各種夾雑物質の完全な消去が達成された。別の組成の消去試薬を用い た例として、消去 2及び消去 3を示した力 これらにおいても、比較例とくらべて測定 値の正確性が顕著に向上していることがわかる。消去 2及び消去 3においては、消去 酵素の基質特異性によって消去しきれな 、夾雑物質が若干残った。これらは消去し 残した物質に特異性の高い既知のケトァミンォキシダーゼを消去試薬に組みこむこと で完全に消去できることが消去 1の結果より明らかである。そのような方法以外にも、 例えば、 ε Fru— Lysが残る場合については、 ε Fru— Lysに作用しにくい性質 の FPOX (FPOX— EE、キッコ一マン社（日本国）製）を測定酵素として用いることに より、 ε —Fru Lysの測り込みを低減し、測定誤差を低減することができる。
[0105] なお、消去系の有無及び種類によらず、実施例における測定値は、 Fru— Val— L eu添加の影響を全く受けなカゝつた。これは使用した FPOXの基質特異性を反映した 結果である力 このことより、本発明において、 a 糖ィ匕ペプチド以外の各種糖ィ匕ァ ミノ酸及び/又は糖ィ匕ペプチドが効率よく消去されることに加えて、 a—糖化ペプチド の中でも糖ィ匕ヘモグロビン「 j8鎖」由来の Fru— Val— His及び「 α鎖」由来の Fru— Val— Leuが区別され、精度よぐ「 β鎖」由来の Fru— Val— Hisのみ、すなわち Hb Aleを測定できることが示された。すなわち本発明において、測定誤差原因となる各 種夾雑物質を消去することにより HbAlcの正確な測定が実現することが示された。
[0106] 実施例 2
<ヒト血液サンプルに針する夾雑物皙消去効 の確認 >
ヒト血液サンプル中のヘモグロビン Ale (HbAlc)を測定対象糖化タンパク質として 、プロテアーゼ処理により生じる a 糖ィ匕ペプチドを FPOXで測定する系において、 遊離及びプロテアーゼ処理により生じる夾雑物質に対する消去効果を検証した。さら に実施例 1と同様、プロテアーゼ処理後に夾雑物質を添加したときにも、消去効果が 認められるかどうかをあわせて確認した。測定対象の HbAlcとして、ヒト血液サンプ ルを用いる以外は、実施例 1に示した方法と同様の実験を行った。表 3には、 750nm の吸光度を測定し、検体の吸光度変化力 ブランクの吸光度変化を差し引いた値を 示した。
[表 3]
Figure imgf000029_0001
[0107] まずコントロール実験として、実施例 1と同様に HbAlc標準物質を用いたときの消去 効果を確認した。例えば消去 3においても消去効果が認められる力 消去 2, 3を組 み合わせた消去 1において、最も高い消去効果が認められた。この結果はヒト血液サ ンプルを用いたときもほぼ同様であり、消去 1によって系に含まれる夾雑物質が良好 に消去され、正確な HbAlcの測定が出来るようになったと考えられる。
[0108] さらにヒト血液サンプルに夾雑物質を添加したときの消去効果も確認した。夾雑物 質として α位のアミノ基が糖ィ匕された Fru-Val (輸液等によって生じる α糖ィ匕アミノ酸） と、 ε位のアミノ基が糖ィ匕された ε -Fru-Lys (系に夾雑する血液タンパクやプロテア ーゼ自身の切断によって生じる ε糖ィ匕アミノ酸)を加えたとき、本発明の消去を行わ ずに測定すると、非常に高い値を示してしまう。しかし本発明の消去を行うと、良好に 夾雑物質の影響を除くことができた。コントロール実験と同様、最も高い消去効果は 消去 1で認められ、この時の値 0.021はヒト血球に夾雑物質を添加せずに消去 1を行 つた値と同じレベルにまで下がることが示された。このことは、例えば輸液に含まれる 糖とアミノ酸によってヒト血液中の糖ィ匕アミノ酸の濃度が上昇した場合にぉ 、ても、ま た系に夾雑するタンパク等の切断によって生じる ε糖ィ匕アミノ酸が存在していても、 本消去法によって良好に誤差原因物質を消去できることを意味している。
[0109] 以上の結果より、本発明の夾雑物質消去法の有用性が示唆された。
[0110] 本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明 細書にとり入れるものとする。

Claims

請求の範囲
[1] 全血及び/又は血球試料にプロテアーゼを作用させた後、 1種類又は複数のケトァ ミンォキシダーゼを含有する消去試薬を作用させて、 oc 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖化ァ ミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド、又はそれらの組合わせ物を消去した後に、 α 糖化ぺプ チドに作用するォキシダーゼを用いて前記試料中の OC 糖ィ匕ペプチドを測定するこ とを特徴とする糖ィ匕蛋白質の測定方法。
[2] ケトァミンォキシダーゼが、 oc—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖化アミノ酸及び ε—糖化ぺプ チドを消去することを特徴とする、請求項 1に記載の方法。
[3] ケトアミンォキシダーゼが、 a—糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ a—糖化ペプチドに作 用しない酵素、 ε—糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε—糖ィ匕ペプチドに作用し、かつ α—糖 化ペプチドに作用しない酵素、 ε 糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε 糖化ペプチド、及び a 糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ ex 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素、あるいはそれ らの酵素の組合わせであることを特徴とする、請求項 1に記載の方法。
[4] a—糖ィ匕アミノ酸に作用し、かつ ex—糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素力 コリネバ クテリウム属、アースロバクター属又はァグロバタテリゥム属由来のフルクトシルァミノ 酸ォキシダーゼであることを特徴とする、請求項 3に記載の方法。
[5] ε—糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε—糖ィ匕ペプチドに作用し、かつ ex—糖ィ匕ペプチドに 作用しない酵素力 フサリウム属又はギペレラ属由来のフルクトシルアミノ酸ォキシダ ーゼであることを特徴とする、請求項 3に記載の方法。
[6] ε—糖ィ匕アミノ酸及び/又は ε—糖ィ匕ペプチド、及び ex—糖ィ匕アミノ酸に作用し、 かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない酵素力 ギべレラ属、フサリウム属、ぺ-シリウム 属、ァスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニゥム属、デバリオマイセス属、ピキア属 、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトァミンォキシダーゼであることを特徴とす る、請求項 3に記載の方法。
[7] a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ力 フルクトシルペプチドォキシダーゼ であることを特徴とする、請求項 1〜6のいずれか 1項に記載の方法。
[8] 糖ィ匕蛋白質が糖ィ匕ヘモグロビンであることを特徴とする請求項 1〜7のいずれか 1項 に記載の方法。
[9] a 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕アミノ酸、 ε 糖ィ匕ペプチド又はそれらの組合わせ物 に作用し、かつ α 糖ィ匕ペプチドに作用しない 1種類又は複数のケトアミンォキシダ ーゼを含有し、試料中の α—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖ィ匕アミノ酸、 ε—糖化ペプチド又 はそれらの組合わせ物を消去することを特徴とする消去試薬。
[10] ケトァミンォキシダーゼ力 コリネバクテリウム属、アースロバクター属、ァグロバクテ リウム属、フサリウム属又はギペレラ属由来のフルクトシルアミノ酸ォキシダーゼ、ギべ レラ属、ぺニシリウム属、ァスペルギルス属、カンジダ属、アクレモニゥム属、デバリオ マイセス属、ピキア属、トリコスポロン属又はバチルス属由来のケトァミンォキシダーゼ またはそれらの組合わせであることを特徴とする、請求項 9に記載の消去試薬。
[11] プロテアーゼを含有する試薬、請求項 9又は 10に記載の消去試薬、及び oc 糖ィ匕 ペプチドに作用するォキシダーゼを含有する試薬を含む糖ィヒ蛋白質測定用キット。
[12] a 糖ィ匕ペプチドに作用するォキシダーゼ力 フルクトシルペプチドォキシダーゼ であることを特徴とする、請求項 11に記載のキット。
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