JP3971702B2 - 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 - Google Patents
糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3971702B2 JP3971702B2 JP2002512410A JP2002512410A JP3971702B2 JP 3971702 B2 JP3971702 B2 JP 3971702B2 JP 2002512410 A JP2002512410 A JP 2002512410A JP 2002512410 A JP2002512410 A JP 2002512410A JP 3971702 B2 JP3971702 B2 JP 3971702B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- glycated
- hemoglobin
- amount
- measuring
- measurement
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/723—Glycosylated haemoglobin
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
- G01N33/721—Haemoglobin
- G01N33/725—Haemoglobin using peroxidative activity
Description
技術分野
本発明は、全血中に存在するヘモグロビンの糖化量を測定する方法に関する。
背景技術
血液中の糖化ヘモグロビンは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。
このような糖化ヘモグロビンは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ミニカラム法、免疫法等により、ヘモグロビンの糖化量または糖化率として測定されている。最近では、糖化アミノ酸酸化還元酵素（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法により、糖化タンパク質を測定できる方法が開発されており、この酵素法を用いたヘモグロビン糖化量（糖化ヘモグロビン）の測定が試みられている。
発明の開示
しかしながら、この方法には、次のような問題がある。糖化ヘモグロビンは血球内成分であるため、測定に際して血球の溶血処理が不可欠である。しかし、全血を試料とする場合、全血の状態で血球を溶血させると、血球成分と血漿成分とが混合した状態となる。このため、溶血処理した全血試料には、血球中成分である糖化ヘモグロビンだけでなく、特に、血漿中成分であり含有率も高いアルブミンも存在し、その糖化物である糖化アルブミンも存在するため、前記糖化アルブミンも同様にＦＡＯＤの作用を受け、糖化ヘモグロビンと共に測定されてしまう。したがって、前記糖化アルブミン等の他の糖タンパク質による影響を除去するために、全血試料から血漿と血球とを分離することが余儀なくされており、操作も煩雑であった。
そこで、本発明の目的は、全血試料の分離を行わずに、他の糖タンパク質が影響することなく、前記全血試料中のヘモグロビン糖化量を正確かつ容易に測定できるヘモグロビン糖化量の測定方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法は、全血中の糖化ヘモグロビンを選択的にプロテアーゼで分解し、この糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによりヘモグロビン糖化量を決定する方法である。なお、本発明において、「ヘモグロビン糖化量」とは、ヘモグロビン糖化率も含む。
このように、他のタンパク質やペプチドと区別して、糖化ヘモグロビンだけをプロテアーゼで選択的（特異的）に分解すれば、ＦＡＯＤはタンパク質および長いポリペプチド鎖には作用し難いため、全血について血球分離操作を行わなくても、他の糖化タンパク質、特に糖化アルブミン等の影響を受けることなくヘモグロビン糖化量を測定できる。このため、測定試料は、例えば、溶血処理した全血試料でもよい。
本発明の測定方法において、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するには、例えば、前記プロテアーゼとして、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを用いればよい。なお、本発明では、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを用いる方法に、特に限定されず、その他の手段により、糖化ヘモグロビンを選択的に分解してもよい。また、一般のプロテアーゼと、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼとを併用してもよい。
前記プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼであることが好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、例えば、商品名プロテアーゼＮ（シグマ・アルドリッチ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム（株）製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡績（株）製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。
本発明の測定方法において、前記ＦＡＯＤは、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記ＦＡＯＤと反応させる糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分は、使用するＦＡＯＤの触媒反応により異なるが、例えば、アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基や糖化α−アミノ基であることが好ましい。この中でも、後述する触媒機能を有するＦＡＯＤが作用し易いことから、前記アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基であることが好ましく、例えば、リジン残基側鎖の糖化アミノ基、アルギニン残基側鎖の糖化アミノ基等があげられる。
本発明の測定方法において、前記プロテアーゼは、全血１ｍＬに対して１，０００〜１０，０００，０００Ｕの範囲で添加することが好ましく、また、前記ＦＡＯＤは、全血１ｍＬに対して５００〜４０，０００Ｕの範囲で添加することが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、前記反応により生じる過酸化水素量の測定もしくは前記反応で消費される酸素量の測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記過酸化水素量の測定は、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する基質とを用いた測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
つぎに、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法は、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法によるヘモグロビン糖化量とＨｂＡ１ｃの量との相関関係から作成された検量線を準備し、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法から得られた全血試料中のヘモグロビン糖化量を前記検量線に代入することにより、前記全血試料中におけるＨｂＡ１ｃの量を求める測定方法である。
本発明者らは、さらに鋭意研究を行った結果、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法により求められる全血試料中におけるヘモグロビン糖化量が、前記全血試料中のＨｂＡ１ｃの量と高い相関関係にあることを見出した。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンのβ−鎖Ｎ末端のα−アミノ基が糖化された糖化ヘモグロビンをいい、糖化ヘモグロビンの中でも、特に重要な糖尿病の診断等における指標とされている。従来の方法によると、ＨｂＡ１ｃの測定は、糖化部分の中でも、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造部位であるβ−鎖Ｎ末端のα−アミノ基糖化部分に、ＦＡＯＤを特異的に作用させ、その酸化還元反応を測定する必要があった。この場合、使用するＦＡＯＤが、例えば、α−アミノ基糖化部位に対して基質特異性が高いことや、前記α−アミノ基糖化部位に十分に作用すること等が要求されているため、特別な方法をとらざるを得なかった。しかし、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、糖尿病診断の重要な指標となるＨｂＡ１ｃの測定を、正確かつ簡便に行うことができ、ＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等において実用化することが可能となる。
本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法において、前記検量線は、標準試料の既知ＨｂＡ１ｃ量と、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法による前記標準試料のヘモグロビン糖化量との相関関係から作成された検量線であることが好ましい。
つぎに、本発明の測定キットは、ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定キットであって、他のタンパク質およびペプチドと区別して糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを含む。このキットを使用すれば、前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定キットにおいて、プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましい。また、本発明の測定キットは、さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。前記糖化アミノ酸酸化還元酵素は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。本発明の測定キットは、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。前記酸化により発色する基質は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであることが好ましい。
つぎに、本発明の測定試薬は、ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定試薬であって、他のタンパク質およびペプチドと区別して選択的に糖化ヘモグロビンを分解するプロテアーゼを含有する。この試薬を用いれば、前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定試薬において、プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましい。また、本発明の測定試薬は、さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。前記糖化アミノ酸酸化還元酵素は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。本発明の測定試薬は、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。前記酸化により発色する基質は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明の測定方法において使用できるＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→ Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２
・・・（１）
前記式（１）において、Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ は、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸である。前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、糖化反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、糖化反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、糖化反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、糖化反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ ・・・（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で表わすことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＲ３Ｈ−ＣＯ）ｎ−ＯＨ ・・・（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
前記式（４）において、Ｒ５は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ５は
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−である。
前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で表わすことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ ・・・（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で表わすことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ ・・・（６）
使用するＦＡＯＤの触媒反応は、前述のような反応であれば特に制限されないが、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ２が前記式（４）に示す構造である）に作用する触媒反応であることが好ましい。また、前記ＦＡＯＤは、このような触媒機能のみに制限されず、さらにα−アミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ２が前記式（２）に示す構造である）に作用する触媒機能を併せ持ってもよい。
このようなＦＡＯＤとしては、例えば、フサリウム由来、ギベレラ由来、アスペルギルス由来のものがあり、市販の商品名フルクトシル・アミノ酸オキシダーゼ（旭化成社製）、商品名ケトアミンオキシダーゼ（ジェンザイム社製）等が使用できる。
つぎに、本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法の一例について説明する。
まず、全血を溶血する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
つぎに、前記溶血試料に対し、前記プロテアーゼを用いてプロテアーゼ処理を行い、前記試料中の糖化ヘモグロビンを選択的に分解する。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、糖化ヘモグロビンの量等により適宜決定される。
前記プロテアーゼとしてパパインを用いて、前記溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜４０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間１０分〜４０時間、ｐＨ５〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。
また、前記プロテアーゼとしてメタロプロテイナーゼを用いて、前記溶血試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜１０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．０２〜４０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間２分〜４０時間、ｐＨ６〜１１の範囲であり、好ましくは、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜８，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜１０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間２分〜１時間、ｐＨ７〜１０の範囲である。前記緩衝液は、前述と同様のものが使用できる。また、他のプロテイナーゼも同様に使用できる。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた糖化ヘモグロビン分解物を、ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。具体的には、ＦＡＯＤが、例えば、前記糖化ヘモグロビン分解物のリジン残基側鎖およびアルギニン残基側鎖の糖化アミノ基に作用する。また、ＦＡＯＤの種類によっては、その触媒機能により、さらに、糖化α−アミノ基にも作用してもよい。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
この処理条件は、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度２００〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．０２〜３０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜２０分、ｐＨ７〜９の範囲であり、反応液中のＦＡＯＤ濃度１，０００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜５ｇ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ７〜９の範囲である。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素の量を、前記ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を用いて、酸化還元反応を利用して測定する。
このＰＯＤによる酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、例えば、過酸化水素濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、基質濃度０．０００１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９であり、好ましくは、反応液中のＰＯＤ濃度１，０００〜５０，０００ＩＵ／Ｌ、基質濃度０．０００２〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
前記酸化により発色する基質を用いた場合は、その発色（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の濃度を測定でき、これから前記試料中のヘモグロビン糖化量を測定できる。
この測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。
１ ： 溶血処理＋プロテアーゼ処理
２ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３ ： ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
また、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび前記基質の添加順序も、特に制限されない。
つぎに、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法の一例について説明する。
まず、全血試料について、前述と同様にしてヘモグロビン糖化量の測定を行う。他方、糖化ヘモグロビンのうちＨｂＡ１ｃ量が既知である糖化ヘモグロビン標準液を準備し、これについて、前述と同様にしてヘモグロビン糖化量の測定を行い、この標準液についての測定値と既知のＨｂＡ１ｃ量との関係を示す検量線を作成する。前述のように、前記ヘモグロビン糖化量の測定値とＨｂＡ１ｃ量とは相関関係にあるため、この検量線に、本発明の測定方法による前記全血試料におけるヘモグロビン糖化量の測定値を代入することにより、前記全血試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めることができる。なお、検量線の作成において、前記ヘモグロビン糖化量の測定値としては、最終的に求めたヘモグロビン糖化量だけでなく、前記ヘモグロビン糖化量の測定においてＰＯＤ処理によって得られた反応液の吸光度値でもよいし、前記吸光度から求めた過酸化水素量を使用してもよい。このように、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、発明者らが新たに見出した相関関係を利用して、ヘモグロビン糖化量の測定値から全血中のＨｂＡ１ｃ量を高精度かつ簡便に測定できる。
実施例
（実施例１）
糖化ヘモグロビンおよび糖化アルブミンを含む試料をパパインで処理し、さらにＦＡＯＤによる酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素の測定を行った。測定に用いた試料、試薬およびその方法を以下に示す。
（試料）
糖化率２２．５％のヒト血清アルブミン（シグマ社製）
糖化率１４％のヒトヘモグロビン
なお、このヒトヘモグロビン試料は、以下の方法により調製し、その糖化率は、イオン交換カラムを使用したＨＰＬＣ法により求めた。
（ヒトヘモグロビンの調製）
健常者の全血を遠心分離（１５００Ｇ、１０分）して血球を回収し、これを生理食塩水で数回洗浄した後、ほぼ当量の精製水を添加して血球を溶血させた。この溶血液を遠心分離して血球膜を除去したものを、商品名ＧＬＹＣＯ・ＧＥＬＩＩ（ピアス社製）に供し、常法により糖化タンパク質含有画分を分取したものをヒトヘモグロビン試料とした。
（酸化還元反応液Ａの組成）
ＦＡＯＤ（旭化成工業社製、以下同じ） ２．０９ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（ＴｙｐｅＩＩＩ：東洋紡績社製、以下同じ） ７３０Ｕ／Ｌ
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム
（商品名ＤＡ６４：和光純薬工業社製、以下同じ） １．４６ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ７３ｍｍｏｌ／Ｌ
（方法）
前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）１ｍＬに、１ＫＵ／Ｌのパパイン（シグマ・アルドリッチ社製）１ｍＬを添加し、４０℃で２４時間反応させた。そして、これらの溶液０．０１８ｍＬに前記酸化還元反応液Ａ ０．１５ｍＬをそれぞれ添加して酸化還元反応を開始し、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）を用いて測定した。これらの結果を下記表１に示す。
（実施例２）
パパインの代わりに１ｇ／Ｌのブロメライン（天野エンザイム株式会社、以下同じ）１ｍＬを用いた以外は、実施例１と同様にして前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）を処理して吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
（比較例１）
パパインの代わりに１ｇ／Ｌのα−キモトリプシン１ｍＬを用いた以外は、前記実施例１と同様にして前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）を処理して吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
前記表１に示すように、実施例１および２のパパインおよびブロメラインによれば、ヒトヘモグロビン試料について高い吸光度が見られ、かつ、ヒト血清アルブミン試料についてはわずかな吸光度であることから、糖化アルブミンをほとんど分解せずに、糖化ヘモグロビンを選択的に分解できることがわかった。これに対して比較例１のα−キモトリプシンは、前記両試料について同様に高い吸光度が見られることから、糖化ヘモグロビンだけでなく糖化アルブミンにも作用し、選択的ではないことがわかる。
（実施例３および比較例２）
試料として全血、血漿、血球をそれぞれ用い、各種プロテアーゼで処理し、糖化ヘモグロビンの測定を行った。
（全血試料の調製）
ヘパリンナトリウム入り採血管を用いて健常者から全血を採取し、これに精製水を加えて８倍希釈して、前記全血中の血球を溶血させたものを全血試料とした。
（血漿試料の調製）
前記健常者の全血を遠心分離（１５００Ｇ、１０分）して血球を分離除去し、得られた上清に精製水を添加して８倍希釈したものを血漿試料とした。
（血球試料の調製）
前記遠心分離により得られた血球に、精製水を加えて１６倍に希釈し、前記血球を溶血させたものを血球試料とした。
（プロテアーゼ）
ブロメライン、パパイン（ロッシュ社製）、エラスターゼ（和光純薬工業社製）、α−キモトリプシン（和光純薬工業社製）、プロテナーゼＫ（和光純薬工業社製）を精製水に溶解し、濃度４ｇ／Ｌの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
（酸化還元反応液Ｂの組成）
ＰＯＤ ２０ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ６４ ０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（酸化還元反応液Ｃの組成）
ＦＡＯＤ １４．３ＫＵ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（測定方法）
前記各試料０．２ｍＬ、前記プロテアーゼ溶液０．１ｍＬおよびリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．７ｍＬを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液を商品名ウルトラフリー４ユニット５Ｋ（ミリポア社製）に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記各ろ液２５μＬに、前記酸化還元反応液Ｂ４５μＬを添加し、５分後に、さらに前記酸化還元反応液Ｃ２０μＬを添加して反応を開始し、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。この結果を下記表２に示す。なお、ブロメラインおよびパパインは実施例３であり、エラスターゼ、α−キモトリプシン、プロテナーゼＫは比較例２である。
前記表２に示すように、実施例３では、血漿試料について吸収はほとんど確認されなかった。このことから、実施例３で用いたプロテアーゼによれば糖化ヘモグロビンを選択的に分解でき、例えば、血漿由来の糖化アルブミン等をほとんど分解しないことがわかる。これに対して、比較例２では、糖化ヘモグロビンが存在しないはずの血漿試料中においても吸収が確認された。これは、比較例に用いたプロテアーゼによると、糖化ヘモグロビンと他の糖化タンパク質とを選択することなく分解してしまうため、例えば、血漿試料においては糖化アルブミン等が分解され、その結果、吸収が見られたと考えられる。
（実施例４）
（糖化ヘモグロビン標準液の調製）
精製水にＨｂＡ１ｃ標準試薬（ＳＲＬ社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．３％、７．８％、１１．２％、１４．７％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が１０ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。また、精製水にＨｂＡ１ｃ標準試薬（国際試薬社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ５．５％、１０．８％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が１０ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
（各種プロテアーゼ溶液の調製）
各種プロテアーゼを精製水に溶解して、濃度２ｇ／ＬのブロメラインＦ（天野エンザイム株式会社製）溶液および濃度１ｇ／Ｌのパパイン（ロッシュ社製）溶液を調製した。
（測定方法）
各濃度の糖化ヘモグロビン標準液０．５ｍＬ、プロテアーゼ溶液０．４ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応後、前記反応液を商品名ウルトラフリーＭＣ 分子量５０００（ミリポア社製、以下同じ）に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液２５μＬを精製水によって２倍希釈した後、この希釈液に前記酸化還元反応液Ｂ４５μＬを添加し、５分後、さらに前記酸化還元反応液Ｃ２０μＬを添加して反応を開始した。そして、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。これらの結果を下記表３および図１のグラフに示す。
図１は、糖化ヘモグロビン標準溶液中のＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度の相関関係を示すグラフである。パパインについての相関式はｙ＝２１０ｘ＋２．２、その相関係数はｒ＝０．９９８であり、ブロメラインについての相関式はｙ＝１３２１ｘ＋１．０、その相関係数はｒ＝０．９６８であった。
前記表３および図１に示すように、糖化ヘモグロビン標準液中のＨｂＡ１ｃ濃度の増加に伴い吸光度が増加したことから、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度（本発明の測定方法による糖化ヘモグロビンの測定値に相当）は高い相関関係にあることがわかる。したがって、このＨｂＡ１ｃ濃度と前記吸光度との検量線を予め準備すれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンについて前述のように測定を行い、この測定値と前記検量線とから全血試料中のＨｂＡ１ｃ量を間接的に求めることができる。
（実施例５）
溶血試料をメタロプロテイナーゼ、パパイン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼで処理して、本発明の測定方法によりヘモグロビンの糖化量を測定し、さらに、これからＨｂＡ１ｃ量を求めた。測定に用いた試料、試薬およびその方法を以下に示す。
（試料の調製）
採取した健常者および糖尿病患者の全血（合計１２検体）をそれぞれ約６時間静置して赤血球を沈降させ、これら血球画分０．１ｍＬに０．０５重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１．４ｍＬ添加して溶血させたものを溶血試料とした。
（標準液の調製）
０．０５重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に、ＨｂＡ１ｃ標準試薬（国際試薬社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度（％）がそれぞれ５．５％、１０．５％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が２００ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
（プロテアーゼ溶液の調製）
メタロプロテイナーゼ（東洋紡績社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）およびパパイン（ロシュ社製）を精製水に溶解して、濃度１ｇ／Ｌの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
（酸化還元反応液Ｄ）
ＰＯＤ ２０ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ−６４ ０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．８ｍｏｌ／Ｌ
（酸化還元反応液Ｅ）
ＦＡＯＤ １４．３ＫＵ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
（ヘモグロビン糖化量の測定方法）
サンプル０．２ｍＬ、プロテアーゼ溶液０．１６ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬを混合し、３７℃で３６時間反応させた。反応後、前記反応液を前記商品名ウルトラフリーＭＣ分子量５０００に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液２５μＬを精製水によって２倍希釈した後、この希釈液に酸化還元反応液Ｄ４５μＬを添加し、５分後に酸化還元反応液Ｅ２０μＬを添加して反応を開始した。そして、反応開始２分後の反応液の主波長７５１ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度測定を行った。この測定値は、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。
（ヘモグロビン濃度の測定方法）
商品名ヘモグロビンテストワコー（和光純薬工業社製）を用いてシアンメトヘモグロビン法により、サンプルのヘモグロビン濃度を測定した。
（検量線の作成）
前記各標準液について、自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社製）を用いてＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。一方、前記各標準液について、本発明の前記ヘモグロビン糖化量の測定方法により、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度の測定を行い、また、前記ヘモグロビン濃度測定方法によりヘモグロビン濃度を測定した。そして、前記ヘモグロビン糖化量に相当する吸光度をヘモグロビン濃度で割った値の百分率（％）と、前記自動測定器による測定値（％）とから一次回帰式を作成し、これを検量線とした。前記百分率は、ヘモグロビン糖化率（％）に比例する。以下に、前記各プロテアーゼを使用した場合の検量線の式を示す。
（ＨｂＡ１ｃの測定方法）
前記各溶血試料について、前記ヘモグロビン糖化率の測定方法によりヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度測定を行い、前記ヘモグロビン濃度の測定方法によりヘモグロビン濃度の測定を行った。そして、前記糖化量に相当する吸光度を前記ヘモグロビン濃度で割った百分率をヘモグロビン糖化率とし、これを前記各検量線に代入することにより前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めた。また、対照として、前記各試料について前記自動測定器によりＨｂＡ１ｃ量を測定した。これらの結果を図２に示す。図２は、本発明の測定方法により検量線から求めたＨｂＡ１ｃ量と、前記自動測定器で測定したＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
図示のように、本発明の測定方法により検量線から求めたＨｂＡ１ｃ（％）と、前記自動測定器によるＨｂＡ１ｃ（％）測定値との相関係数は、メタロプロテイナーゼの場合０．９９３７、プロテアーゼＮの場合０．９９３、パパインの場合０．９９４１と非常に高く、前記自動測定器と同様の測定精度でＨｂＡ１ｃ量を求められることがわかった。
（実施例６）
血漿試料を添加した溶血試料をメタロプロテイナーゼで処理してヘモグロビンの糖化量を測定し、前記血漿試料の添加による前記糖化量の変化を調べた。
（試料の調製）
採取した健常者（１検体）および糖尿病患者の全血（合計検体：患者検体、患者検体２）を遠心分離（１０００ｇ、約１５分間）し、各検体の血球画分および血漿画分を回収した。そして、検体毎に、血球画分０．０１ｍＬに、血漿画分を所定量（０ｍＬ、０．００５ｍＬ、０．０１０ｍＬ、０．０１５ｍＬ、０．０２０ｍＬ）添加し、この混合液に下記溶血試薬０．３ｍＬをそれぞれ加えて溶血させたものを溶血試料とした。
そして、前記各溶血試料０．０１ｍＬに下記メタロプロテイナーゼ試薬０．０６５ｍＬを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。さらに、下記酸化還元反応液Ｆ ０．０４５ｍＬを添加して３７℃で２分間インキュベーションした後、前記反応液の主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度測定を行った。この測定値は、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。血漿画分添加量によって反応溶液量が異なるため、反応溶液当たりの吸光度を補正した値を下記表４に示す。
※ＷＳＴ−３：２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルフォフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム モノソディウム塩
前記表４に示すように、血球画分に血漿画分を種々の濃度で添加しても、得られる吸光度にはほとんど変化が見られなかった。このことから、本発明の測定方法によれば、血漿中の糖化タンパク質により、糖化ヘモグロビンの糖化量の測定に影響が生じてないことがわかる。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明の測定方法によれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンの糖化率を、血球分離を行うことなく、簡便かつ高精度で測定できる。また、本発明の測定方法によるヘモグロビン糖化量の測定値とＨｂＡ１ｃ量とは高い相関関係にあるため、この相関関係から検量線を作成すれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンの糖化量を測定するだけで、高精度かつ簡便にＨｂＡ１ｃ量を決定することができる。このため、本発明の測定方法を、例えば、臨床検査の分野等に適用すれば、大量の検体を容易に測定することができ、糖化ヘモグロビン、特にＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての信頼性および重要性がさらに向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の一実施例において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフである。
図２は、本発明の測定方法のその他の実施例において、検量線から求めたＨｂＡ１ｃ（％）と自動測定器で測定したＨｂＡ１ｃ（％）との相関関係を示したグラフである。
本発明は、全血中に存在するヘモグロビンの糖化量を測定する方法に関する。
背景技術
血液中の糖化ヘモグロビンは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。
このような糖化ヘモグロビンは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ミニカラム法、免疫法等により、ヘモグロビンの糖化量または糖化率として測定されている。最近では、糖化アミノ酸酸化還元酵素（ＦＡＯＤ）を用いた酵素法により、糖化タンパク質を測定できる方法が開発されており、この酵素法を用いたヘモグロビン糖化量（糖化ヘモグロビン）の測定が試みられている。
発明の開示
しかしながら、この方法には、次のような問題がある。糖化ヘモグロビンは血球内成分であるため、測定に際して血球の溶血処理が不可欠である。しかし、全血を試料とする場合、全血の状態で血球を溶血させると、血球成分と血漿成分とが混合した状態となる。このため、溶血処理した全血試料には、血球中成分である糖化ヘモグロビンだけでなく、特に、血漿中成分であり含有率も高いアルブミンも存在し、その糖化物である糖化アルブミンも存在するため、前記糖化アルブミンも同様にＦＡＯＤの作用を受け、糖化ヘモグロビンと共に測定されてしまう。したがって、前記糖化アルブミン等の他の糖タンパク質による影響を除去するために、全血試料から血漿と血球とを分離することが余儀なくされており、操作も煩雑であった。
そこで、本発明の目的は、全血試料の分離を行わずに、他の糖タンパク質が影響することなく、前記全血試料中のヘモグロビン糖化量を正確かつ容易に測定できるヘモグロビン糖化量の測定方法の提供である。
前記目的を達成するために、本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法は、全血中の糖化ヘモグロビンを選択的にプロテアーゼで分解し、この糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分とＦＡＯＤとを反応させ、この酸化還元反応を測定することによりヘモグロビン糖化量を決定する方法である。なお、本発明において、「ヘモグロビン糖化量」とは、ヘモグロビン糖化率も含む。
このように、他のタンパク質やペプチドと区別して、糖化ヘモグロビンだけをプロテアーゼで選択的（特異的）に分解すれば、ＦＡＯＤはタンパク質および長いポリペプチド鎖には作用し難いため、全血について血球分離操作を行わなくても、他の糖化タンパク質、特に糖化アルブミン等の影響を受けることなくヘモグロビン糖化量を測定できる。このため、測定試料は、例えば、溶血処理した全血試料でもよい。
本発明の測定方法において、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するには、例えば、前記プロテアーゼとして、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを用いればよい。なお、本発明では、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを用いる方法に、特に限定されず、その他の手段により、糖化ヘモグロビンを選択的に分解してもよい。また、一般のプロテアーゼと、糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼとを併用してもよい。
前記プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼであることが好ましい。前記Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼとしては、例えば、商品名プロテアーゼＮ（シグマ・アルドリッチ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム（株）製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡績（株）製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインであり、特に好ましくはメタロプロテイナーゼである。
本発明の測定方法において、前記ＦＡＯＤは、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記ＦＡＯＤと反応させる糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分は、使用するＦＡＯＤの触媒反応により異なるが、例えば、アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基や糖化α−アミノ基であることが好ましい。この中でも、後述する触媒機能を有するＦＡＯＤが作用し易いことから、前記アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基であることが好ましく、例えば、リジン残基側鎖の糖化アミノ基、アルギニン残基側鎖の糖化アミノ基等があげられる。
本発明の測定方法において、前記プロテアーゼは、全血１ｍＬに対して１，０００〜１０，０００，０００Ｕの範囲で添加することが好ましく、また、前記ＦＡＯＤは、全血１ｍＬに対して５００〜４０，０００Ｕの範囲で添加することが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化還元反応の測定は、前記反応により生じる過酸化水素量の測定もしくは前記反応で消費される酸素量の測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記過酸化水素量の測定は、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する基質とを用いた測定であることが好ましい。
本発明の測定方法において、前記酸化により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。
つぎに、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法は、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法によるヘモグロビン糖化量とＨｂＡ１ｃの量との相関関係から作成された検量線を準備し、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法から得られた全血試料中のヘモグロビン糖化量を前記検量線に代入することにより、前記全血試料中におけるＨｂＡ１ｃの量を求める測定方法である。
本発明者らは、さらに鋭意研究を行った結果、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法により求められる全血試料中におけるヘモグロビン糖化量が、前記全血試料中のＨｂＡ１ｃの量と高い相関関係にあることを見出した。ＨｂＡ１ｃは、ヘモグロビンのβ−鎖Ｎ末端のα−アミノ基が糖化された糖化ヘモグロビンをいい、糖化ヘモグロビンの中でも、特に重要な糖尿病の診断等における指標とされている。従来の方法によると、ＨｂＡ１ｃの測定は、糖化部分の中でも、ＨｂＡ１ｃの特徴的構造部位であるβ−鎖Ｎ末端のα−アミノ基糖化部分に、ＦＡＯＤを特異的に作用させ、その酸化還元反応を測定する必要があった。この場合、使用するＦＡＯＤが、例えば、α−アミノ基糖化部位に対して基質特異性が高いことや、前記α−アミノ基糖化部位に十分に作用すること等が要求されているため、特別な方法をとらざるを得なかった。しかし、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、糖尿病診断の重要な指標となるＨｂＡ１ｃの測定を、正確かつ簡便に行うことができ、ＨｂＡ１ｃの測定を臨床検査等において実用化することが可能となる。
本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法において、前記検量線は、標準試料の既知ＨｂＡ１ｃ量と、前記本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法による前記標準試料のヘモグロビン糖化量との相関関係から作成された検量線であることが好ましい。
つぎに、本発明の測定キットは、ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定キットであって、他のタンパク質およびペプチドと区別して糖化ヘモグロビンを選択的に分解するプロテアーゼを含む。このキットを使用すれば、前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定キットにおいて、プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましい。また、本発明の測定キットは、さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。前記糖化アミノ酸酸化還元酵素は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。本発明の測定キットは、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。前記酸化により発色する基質は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであることが好ましい。
つぎに、本発明の測定試薬は、ヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定試薬であって、他のタンパク質およびペプチドと区別して選択的に糖化ヘモグロビンを分解するプロテアーゼを含有する。この試薬を用いれば、前記本発明の測定方法を容易に実施できる。
本発明の測定試薬において、プロテアーゼは、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼからなる群から選択された少なくとも一つのプロテアーゼであることが好ましい。また、本発明の測定試薬は、さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含むことが好ましい。前記糖化アミノ酸酸化還元酵素は、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択された少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素であることが好ましい。本発明の測定試薬は、さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含むことが好ましい。前記酸化により発色する基質は、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムであることが好ましい。
発明を実施するための最良の形態
本発明の測定方法において使用できるＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましい。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→ Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２
・・・（１）
前記式（１）において、Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ は、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸である。前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を示す。前記糖残基（Ｒ１）は、糖化反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、糖化反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、糖化反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、糖化反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（１）において、Ｒ２は、特に制限されないが、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ２は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ ・・・（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、また、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で表わすことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＲ３Ｈ−ＣＯ）ｎ−ＯＨ ・・・（３）
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ２は下記式（４）で示すことができる。
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ５は、
−ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ（ＮＨ２）−である。
前記式（４）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で表わすことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ ・・・（５）
また、前記式（４）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で表わすことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ ・・・（６）
使用するＦＡＯＤの触媒反応は、前述のような反応であれば特に制限されないが、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ２が前記式（４）に示す構造である）に作用する触媒反応であることが好ましい。また、前記ＦＡＯＤは、このような触媒機能のみに制限されず、さらにα−アミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ２が前記式（２）に示す構造である）に作用する触媒機能を併せ持ってもよい。
このようなＦＡＯＤとしては、例えば、フサリウム由来、ギベレラ由来、アスペルギルス由来のものがあり、市販の商品名フルクトシル・アミノ酸オキシダーゼ（旭化成社製）、商品名ケトアミンオキシダーゼ（ジェンザイム社製）等が使用できる。
つぎに、本発明のヘモグロビン糖化量の測定方法の一例について説明する。
まず、全血を溶血する。この溶血方法は、特に制限されず、例えば、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等が使用できる。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。
前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン−ｐ−ｔ−オクチルフェニル エーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン ソルビタン アルキル エステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレン アルキル エーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、商品名ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、商品名Ｔｗｅｅｎ−２０、商品名Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。
また、前記浸透圧の差を利用する場合は、例えば、全血の体積に対し２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させる。
つぎに、前記溶血試料に対し、前記プロテアーゼを用いてプロテアーゼ処理を行い、前記試料中の糖化ヘモグロビンを選択的に分解する。前記プロテアーゼ処理は、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、例えば、使用するプロテアーゼの種類、糖化ヘモグロビンの量等により適宜決定される。
前記プロテアーゼとしてパパインを用いて、前記溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜４０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間１０分〜４０時間、ｐＨ５〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。
また、前記プロテアーゼとしてメタロプロテイナーゼを用いて、前記溶血試料を処理する場合、例えば、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜１０，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．０２〜４０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間２分〜４０時間、ｐＨ６〜１１の範囲であり、好ましくは、反応液中のプロテアーゼ濃度１００〜８，０００ＫＵ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜１０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜６０℃、反応時間２分〜１時間、ｐＨ７〜１０の範囲である。前記緩衝液は、前述と同様のものが使用できる。また、他のプロテイナーゼも同様に使用できる。
つぎに、前記プロテアーゼ処理により得られた糖化ヘモグロビン分解物を、ＦＡＯＤで処理する。このＦＡＯＤ処理により、前記式（１）に示す反応が触媒される。具体的には、ＦＡＯＤが、例えば、前記糖化ヘモグロビン分解物のリジン残基側鎖およびアルギニン残基側鎖の糖化アミノ基に作用する。また、ＦＡＯＤの種類によっては、その触媒機能により、さらに、糖化α−アミノ基にも作用してもよい。
このＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。
この処理条件は、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度２００〜３０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．０２〜３０ｇ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜２０分、ｐＨ７〜９の範囲であり、反応液中のＦＡＯＤ濃度１，０００〜２０，０００Ｕ／Ｌ、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜５ｇ／Ｌ、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ７〜９の範囲である。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素の量を、前記ＰＯＤおよび酸化により発色する基質を用いて、酸化還元反応を利用して測定する。
このＰＯＤによる酸化還元反応は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、例えば、過酸化水素濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１〜１００，０００ＩＵ／Ｌ、基質濃度０．０００１〜１ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９であり、好ましくは、反応液中のＰＯＤ濃度１，０００〜５０，０００ＩＵ／Ｌ、基質濃度０．０００２〜０．１ｍｍｏｌ／Ｌ、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。
なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。
前記酸化により発色する基質を用いた場合は、その発色（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の濃度を測定でき、これから前記試料中のヘモグロビン糖化量を測定できる。
この測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。
１ ： 溶血処理＋プロテアーゼ処理
２ ： プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３ ： ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
また、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび前記基質の添加順序も、特に制限されない。
つぎに、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法の一例について説明する。
まず、全血試料について、前述と同様にしてヘモグロビン糖化量の測定を行う。他方、糖化ヘモグロビンのうちＨｂＡ１ｃ量が既知である糖化ヘモグロビン標準液を準備し、これについて、前述と同様にしてヘモグロビン糖化量の測定を行い、この標準液についての測定値と既知のＨｂＡ１ｃ量との関係を示す検量線を作成する。前述のように、前記ヘモグロビン糖化量の測定値とＨｂＡ１ｃ量とは相関関係にあるため、この検量線に、本発明の測定方法による前記全血試料におけるヘモグロビン糖化量の測定値を代入することにより、前記全血試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めることができる。なお、検量線の作成において、前記ヘモグロビン糖化量の測定値としては、最終的に求めたヘモグロビン糖化量だけでなく、前記ヘモグロビン糖化量の測定においてＰＯＤ処理によって得られた反応液の吸光度値でもよいし、前記吸光度から求めた過酸化水素量を使用してもよい。このように、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法によれば、発明者らが新たに見出した相関関係を利用して、ヘモグロビン糖化量の測定値から全血中のＨｂＡ１ｃ量を高精度かつ簡便に測定できる。
実施例
（実施例１）
糖化ヘモグロビンおよび糖化アルブミンを含む試料をパパインで処理し、さらにＦＡＯＤによる酸化還元反応を行い、発生した過酸化水素の測定を行った。測定に用いた試料、試薬およびその方法を以下に示す。
（試料）
糖化率２２．５％のヒト血清アルブミン（シグマ社製）
糖化率１４％のヒトヘモグロビン
なお、このヒトヘモグロビン試料は、以下の方法により調製し、その糖化率は、イオン交換カラムを使用したＨＰＬＣ法により求めた。
（ヒトヘモグロビンの調製）
健常者の全血を遠心分離（１５００Ｇ、１０分）して血球を回収し、これを生理食塩水で数回洗浄した後、ほぼ当量の精製水を添加して血球を溶血させた。この溶血液を遠心分離して血球膜を除去したものを、商品名ＧＬＹＣＯ・ＧＥＬＩＩ（ピアス社製）に供し、常法により糖化タンパク質含有画分を分取したものをヒトヘモグロビン試料とした。
（酸化還元反応液Ａの組成）
ＦＡＯＤ（旭化成工業社製、以下同じ） ２．０９ＫＵ／Ｌ
ＰＯＤ（ＴｙｐｅＩＩＩ：東洋紡績社製、以下同じ） ７３０Ｕ／Ｌ
Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム
（商品名ＤＡ６４：和光純薬工業社製、以下同じ） １．４６ｍｍｏｌ／Ｌ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．０） ７３ｍｍｏｌ／Ｌ
（方法）
前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）１ｍＬに、１ＫＵ／Ｌのパパイン（シグマ・アルドリッチ社製）１ｍＬを添加し、４０℃で２４時間反応させた。そして、これらの溶液０．０１８ｍＬに前記酸化還元反応液Ａ ０．１５ｍＬをそれぞれ添加して酸化還元反応を開始し、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）を用いて測定した。これらの結果を下記表１に示す。
（実施例２）
パパインの代わりに１ｇ／Ｌのブロメライン（天野エンザイム株式会社、以下同じ）１ｍＬを用いた以外は、実施例１と同様にして前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）を処理して吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
（比較例１）
パパインの代わりに１ｇ／Ｌのα−キモトリプシン１ｍＬを用いた以外は、前記実施例１と同様にして前記各試料（ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン）を処理して吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表１に示す。
（実施例３および比較例２）
試料として全血、血漿、血球をそれぞれ用い、各種プロテアーゼで処理し、糖化ヘモグロビンの測定を行った。
（全血試料の調製）
ヘパリンナトリウム入り採血管を用いて健常者から全血を採取し、これに精製水を加えて８倍希釈して、前記全血中の血球を溶血させたものを全血試料とした。
（血漿試料の調製）
前記健常者の全血を遠心分離（１５００Ｇ、１０分）して血球を分離除去し、得られた上清に精製水を添加して８倍希釈したものを血漿試料とした。
（血球試料の調製）
前記遠心分離により得られた血球に、精製水を加えて１６倍に希釈し、前記血球を溶血させたものを血球試料とした。
（プロテアーゼ）
ブロメライン、パパイン（ロッシュ社製）、エラスターゼ（和光純薬工業社製）、α−キモトリプシン（和光純薬工業社製）、プロテナーゼＫ（和光純薬工業社製）を精製水に溶解し、濃度４ｇ／Ｌの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
（酸化還元反応液Ｂの組成）
ＰＯＤ ２０ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ６４ ０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（酸化還元反応液Ｃの組成）
ＦＡＯＤ １４．３ＫＵ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０） ０．１ｍｏｌ／Ｌ
（測定方法）
前記各試料０．２ｍＬ、前記プロテアーゼ溶液０．１ｍＬおよびリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）０．７ｍＬを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応後、各反応液を商品名ウルトラフリー４ユニット５Ｋ（ミリポア社製）に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記各ろ液２５μＬに、前記酸化還元反応液Ｂ４５μＬを添加し、５分後に、さらに前記酸化還元反応液Ｃ２０μＬを添加して反応を開始し、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。この結果を下記表２に示す。なお、ブロメラインおよびパパインは実施例３であり、エラスターゼ、α−キモトリプシン、プロテナーゼＫは比較例２である。
（実施例４）
（糖化ヘモグロビン標準液の調製）
精製水にＨｂＡ１ｃ標準試薬（ＳＲＬ社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ４．３％、７．８％、１１．２％、１４．７％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が１０ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。また、精製水にＨｂＡ１ｃ標準試薬（国際試薬社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度がそれぞれ５．５％、１０．８％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が１０ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
（各種プロテアーゼ溶液の調製）
各種プロテアーゼを精製水に溶解して、濃度２ｇ／ＬのブロメラインＦ（天野エンザイム株式会社製）溶液および濃度１ｇ／Ｌのパパイン（ロッシュ社製）溶液を調製した。
（測定方法）
各濃度の糖化ヘモグロビン標準液０．５ｍＬ、プロテアーゼ溶液０．４ｍＬおよび１．０ｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．１ｍｌを混合し、３７℃で２４時間反応させた。反応後、前記反応液を商品名ウルトラフリーＭＣ 分子量５０００（ミリポア社製、以下同じ）に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液２５μＬを精製水によって２倍希釈した後、この希釈液に前記酸化還元反応液Ｂ４５μＬを添加し、５分後、さらに前記酸化還元反応液Ｃ２０μＬを添加して反応を開始した。そして、反応開始５分後の各反応液の主波長６９４ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。これらの結果を下記表３および図１のグラフに示す。
前記表３および図１に示すように、糖化ヘモグロビン標準液中のＨｂＡ１ｃ濃度の増加に伴い吸光度が増加したことから、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度（本発明の測定方法による糖化ヘモグロビンの測定値に相当）は高い相関関係にあることがわかる。したがって、このＨｂＡ１ｃ濃度と前記吸光度との検量線を予め準備すれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンについて前述のように測定を行い、この測定値と前記検量線とから全血試料中のＨｂＡ１ｃ量を間接的に求めることができる。
（実施例５）
溶血試料をメタロプロテイナーゼ、パパイン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ由来のプロテアーゼで処理して、本発明の測定方法によりヘモグロビンの糖化量を測定し、さらに、これからＨｂＡ１ｃ量を求めた。測定に用いた試料、試薬およびその方法を以下に示す。
（試料の調製）
採取した健常者および糖尿病患者の全血（合計１２検体）をそれぞれ約６時間静置して赤血球を沈降させ、これら血球画分０．１ｍＬに０．０５重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液を１．４ｍＬ添加して溶血させたものを溶血試料とした。
（標準液の調製）
０．０５重量％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００水溶液に、ＨｂＡ１ｃ標準試薬（国際試薬社製）を溶解して、ＨｂＡ１ｃ濃度（％）がそれぞれ５．５％、１０．５％であり、かつ、ヘモグロビン濃度が２００ｇ／Ｌである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
（プロテアーゼ溶液の調製）
メタロプロテイナーゼ（東洋紡績社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野エンザイム株式会社製）およびパパイン（ロシュ社製）を精製水に溶解して、濃度１ｇ／Ｌの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
（酸化還元反応液Ｄ）
ＰＯＤ ２０ＫＵ／Ｌ
商品名ＤＡ−６４ ０．０４ｍｍｏｌ／Ｌ
リン酸緩衝液（ｐＨ８．０） ０．８ｍｏｌ／Ｌ
（酸化還元反応液Ｅ）
ＦＡＯＤ １４．３ＫＵ／Ｌ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０） ０．１ｍｍｏｌ／Ｌ
（ヘモグロビン糖化量の測定方法）
サンプル０．２ｍＬ、プロテアーゼ溶液０．１６ｍＬおよび０．１ｍｏｌ／Ｌ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）０．０４ｍＬを混合し、３７℃で３６時間反応させた。反応後、前記反応液を前記商品名ウルトラフリーＭＣ分子量５０００に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液２５μＬを精製水によって２倍希釈した後、この希釈液に酸化還元反応液Ｄ４５μＬを添加し、５分後に酸化還元反応液Ｅ２０μＬを添加して反応を開始した。そして、反応開始２分後の反応液の主波長７５１ｎｍ、副波長８８４ｎｍにおける吸光度測定を行った。この測定値は、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。
（ヘモグロビン濃度の測定方法）
商品名ヘモグロビンテストワコー（和光純薬工業社製）を用いてシアンメトヘモグロビン法により、サンプルのヘモグロビン濃度を測定した。
（検量線の作成）
前記各標準液について、自動測定器（商品名ＨＡ−８１５０：アークレイ株式会社製）を用いてＨｂＡ１ｃ濃度（％）を測定した。一方、前記各標準液について、本発明の前記ヘモグロビン糖化量の測定方法により、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度の測定を行い、また、前記ヘモグロビン濃度測定方法によりヘモグロビン濃度を測定した。そして、前記ヘモグロビン糖化量に相当する吸光度をヘモグロビン濃度で割った値の百分率（％）と、前記自動測定器による測定値（％）とから一次回帰式を作成し、これを検量線とした。前記百分率は、ヘモグロビン糖化率（％）に比例する。以下に、前記各プロテアーゼを使用した場合の検量線の式を示す。
前記各溶血試料について、前記ヘモグロビン糖化率の測定方法によりヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度測定を行い、前記ヘモグロビン濃度の測定方法によりヘモグロビン濃度の測定を行った。そして、前記糖化量に相当する吸光度を前記ヘモグロビン濃度で割った百分率をヘモグロビン糖化率とし、これを前記各検量線に代入することにより前記試料中のＨｂＡ１ｃ量を求めた。また、対照として、前記各試料について前記自動測定器によりＨｂＡ１ｃ量を測定した。これらの結果を図２に示す。図２は、本発明の測定方法により検量線から求めたＨｂＡ１ｃ量と、前記自動測定器で測定したＨｂＡ１ｃ量との相関関係を示すグラフである。
図示のように、本発明の測定方法により検量線から求めたＨｂＡ１ｃ（％）と、前記自動測定器によるＨｂＡ１ｃ（％）測定値との相関係数は、メタロプロテイナーゼの場合０．９９３７、プロテアーゼＮの場合０．９９３、パパインの場合０．９９４１と非常に高く、前記自動測定器と同様の測定精度でＨｂＡ１ｃ量を求められることがわかった。
（実施例６）
血漿試料を添加した溶血試料をメタロプロテイナーゼで処理してヘモグロビンの糖化量を測定し、前記血漿試料の添加による前記糖化量の変化を調べた。
（試料の調製）
採取した健常者（１検体）および糖尿病患者の全血（合計検体：患者検体、患者検体２）を遠心分離（１０００ｇ、約１５分間）し、各検体の血球画分および血漿画分を回収した。そして、検体毎に、血球画分０．０１ｍＬに、血漿画分を所定量（０ｍＬ、０．００５ｍＬ、０．０１０ｍＬ、０．０１５ｍＬ、０．０２０ｍＬ）添加し、この混合液に下記溶血試薬０．３ｍＬをそれぞれ加えて溶血させたものを溶血試料とした。
そして、前記各溶血試料０．０１ｍＬに下記メタロプロテイナーゼ試薬０．０６５ｍＬを加え、３７℃で５分間インキュベーションした。さらに、下記酸化還元反応液Ｆ ０．０４５ｍＬを添加して３７℃で２分間インキュベーションした後、前記反応液の主波長７５１ｎｍ、副波長８０５ｎｍにおける吸光度測定を行った。この測定値は、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。血漿画分添加量によって反応溶液量が異なるため、反応溶液当たりの吸光度を補正した値を下記表４に示す。
産業上の利用可能性
以上のように、本発明の測定方法によれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンの糖化率を、血球分離を行うことなく、簡便かつ高精度で測定できる。また、本発明の測定方法によるヘモグロビン糖化量の測定値とＨｂＡ１ｃ量とは高い相関関係にあるため、この相関関係から検量線を作成すれば、全血試料中の糖化ヘモグロビンの糖化量を測定するだけで、高精度かつ簡便にＨｂＡ１ｃ量を決定することができる。このため、本発明の測定方法を、例えば、臨床検査の分野等に適用すれば、大量の検体を容易に測定することができ、糖化ヘモグロビン、特にＨｂＡ１ｃの糖尿病診断等の指標物質としての信頼性および重要性がさらに向上する。
【図面の簡単な説明】
図１は、本発明の測定方法の一実施例において、ＨｂＡ１ｃ濃度と吸光度との相関関係を示したグラフである。
図２は、本発明の測定方法のその他の実施例において、検量線から求めたＨｂＡ１ｃ（％）と自動測定器で測定したＨｂＡ１ｃ（％）との相関関係を示したグラフである。
Claims (22)
- ヘモグロビン糖化量の測定方法であって、
全血試料中の糖化ヘモグロビンを、ブロメライン、パパイン、プロテアーゼＮおよびBacillus 属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）からなる群から選択されるプロテアーゼにより選択的に分解すること、
前記分解による糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分と糖化アミノ酸酸化還元酵素とを反応させること、ならびに、
前記酸化還元反応を測定することによりヘモグロビンの糖化量を決定することを含むヘモグロビン糖化量の測定方法。 - 糖化アミノ酸酸化還元酵素と反応させる糖化ヘモグロビン分解物の糖化部分が、アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基である請求項１記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- アミノ酸残基側鎖の糖化アミノ基が、リジン残基およびアルギニン残基の少なくとも一方の側鎖の糖化アミノ基である請求項２記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 酸化還元反応の測定が、前記反応により生じる過酸化水素量の測定または消費される酵素量の測定である請求項１から３のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 過酸化水素量の測定が、ペルオキシダーゼと酸化により発色する基質とを用いた測定である請求項４記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 酸化により発色する基質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４ , ４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである請求項５記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- プロテアーゼを、全血試料１ｍＬに対して１，０００〜１０，０００，０００Ｕの範囲で添加する請求項１から６のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択される少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である請求項１から７のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 糖化アミノ酸酸化還元酵素を、全血試料１ｍＬに対して５００〜４０，０００Ｕの範囲で添加する請求項１から８のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 測定試料が、溶血処理した全血である請求項１から９のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法。
- 全血試料中におけるＨｂＡ１ｃの測定方法であって、
請求項１から１０のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法によるヘモグロビン糖化量とＨｂＡ１ｃ量との相関関係から作成された検量線を準備し、前記ヘモグロビン糖化量の測定方法から得られた全血試料中のヘモグロビン糖化量を前記検量線に代入することにより、前記全血試料中におけるＨｂＡ１ｃ量を求めることを含むＨｂＡ１ｃの測定方法。 - 検量線が、標準試料の既知ＨｂＡ１ｃ量と、請求項１から１１のいずれか一項に記載のヘモグロビン糖化量の測定方法による前記標準試料のヘモグロビン糖化量との相関関係から作成された検量線である請求項１２記載のＨｂＡ１ｃの測定方法。
- 全血試料中におけるヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定キットであって、全血試料中で他のタンパク質およびペプチドと区別して糖化ヘモグロビンを選択的に分解する、ブロメライン、パパイン、プロテアーゼＮおよび Bacillus 属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）からなる群から選択されるプロテアーゼを含む測定キット。
- さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含む請求項１３記載の測定キット。
- 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択される少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である請求項１４記載の測定キット。
- さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含む請求項１３から１５のいずれか一項に記載の測定キット。
- 酸化により発色する基質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４ , ４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである請求項１６記載の測定キット。
- 全血試料中におけるヘモグロビン糖化量の測定に使用される測定試薬であって、全血試料中で他のタンパク質およびペプチドと区別して糖化ヘモグロビンを選択的に分解する、ブロメライン、パパイン、プロテアーゼＮおよび Bacillus 属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）からなる群から選択されるプロテアーゼを含有する測定試薬。
- さらに、糖化アミノ酸酸化還元酵素を含む請求項１８記載の測定試薬。
- 糖化アミノ酸酸化還元酵素が、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸からなる群から選択される少なくとも一つの糖化アミンを基質とし、前記糖化アミンにおけるα−アミノ基糖化部分および側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して、過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素である請求項１９記載の測定試薬。
- さらに、ペルオキシダーゼおよび酸化により発色する基質を含む請求項１８から２０のいずれか一項に記載の測定試薬。
- 酸化により発色する基質が、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４ , ４−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである請求項２１記載の測定試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000214801 | 2000-07-14 | ||
| PCT/JP2001/006064 WO2002006519A1 (fr) | 2000-07-14 | 2001-07-12 | Procede pour determiner de maniere selective le taux d'hemoglobine glycosylee |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2007038171A Division JP4352154B2 (ja) | 2000-07-14 | 2007-02-19 | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3971702B2 true JP3971702B2 (ja) | 2007-09-05 |
Family
ID=18710319
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002512410A Expired - Fee Related JP3971702B2 (ja) | 2000-07-14 | 2001-07-12 | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 |
| JP2008156831A Withdrawn JP2008245657A (ja) | 2000-07-14 | 2008-06-16 | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2008156831A Withdrawn JP2008245657A (ja) | 2000-07-14 | 2008-06-16 | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | USRE46118E1 (ja) |
| EP (3) | EP2336351B1 (ja) |
| JP (2) | JP3971702B2 (ja) |
| CN (3) | CN1620512B (ja) |
| AU (1) | AU2001269513A1 (ja) |
| DE (1) | DE60143748D1 (ja) |
| WO (1) | WO2002006519A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010041419A1 (ja) | 2008-10-10 | 2010-04-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、並びにその利用 |
Families Citing this family (91)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6391005B1 (en) | 1998-03-30 | 2002-05-21 | Agilent Technologies, Inc. | Apparatus and method for penetration with shaft having a sensor for sensing penetration depth |
| EP1329721B8 (en) * | 2000-09-28 | 2010-05-26 | ARKRAY, Inc. | Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin |
| US8641644B2 (en) | 2000-11-21 | 2014-02-04 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Blood testing apparatus having a rotatable cartridge with multiple lancing elements and testing means |
| US9427532B2 (en) | 2001-06-12 | 2016-08-30 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9226699B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-01-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling module with a continuous compression tissue interface surface |
| US8337419B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-12-25 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US9795747B2 (en) | 2010-06-02 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US7981056B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-07-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| ES2336081T3 (es) | 2001-06-12 | 2010-04-08 | Pelikan Technologies Inc. | Dispositivo de puncion de auto-optimizacion con medios de adaptacion a variaciones temporales en las propiedades cutaneas. |
| US7025774B2 (en) | 2001-06-12 | 2006-04-11 | Pelikan Technologies, Inc. | Tissue penetration device |
| WO2002100254A2 (en) | 2001-06-12 | 2002-12-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for lancet launching device integrated onto a blood-sampling cartridge |
| DE60238119D1 (de) | 2001-06-12 | 2010-12-09 | Pelikan Technologies Inc | Elektrisches betätigungselement für eine lanzette |
| US7485436B2 (en) * | 2001-10-11 | 2009-02-03 | Arkray, Inc. | Method of stabilizing oxidation color former |
| US8026078B2 (en) * | 2002-01-31 | 2011-09-27 | Arkray Inc. | Method of quantifying glycosylated protein using redox reaction and quantification kit |
| US8372016B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-02-12 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing |
| US7901362B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-08 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8267870B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-09-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for body fluid sampling with hybrid actuation |
| US8221334B2 (en) | 2002-04-19 | 2012-07-17 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7232451B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7708701B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-05-04 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for a multi-use body fluid sampling device |
| US8784335B2 (en) | 2002-04-19 | 2014-07-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Body fluid sampling device with a capacitive sensor |
| US7175642B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-02-13 | Pelikan Technologies, Inc. | Methods and apparatus for lancet actuation |
| US9248267B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-02-02 | Sanofi-Aventis Deustchland Gmbh | Tissue penetration device |
| US7674232B2 (en) | 2002-04-19 | 2010-03-09 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7976476B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-07-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Device and method for variable speed lancet |
| US7491178B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-02-17 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7892183B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-02-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for body fluid sampling and analyte sensing |
| US7297122B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-11-20 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8360992B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-01-29 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9795334B2 (en) | 2002-04-19 | 2017-10-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7331931B2 (en) | 2002-04-19 | 2008-02-19 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US8579831B2 (en) | 2002-04-19 | 2013-11-12 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US9314194B2 (en) | 2002-04-19 | 2016-04-19 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| US8702624B2 (en) | 2006-09-29 | 2014-04-22 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Analyte measurement device with a single shot actuator |
| US7547287B2 (en) | 2002-04-19 | 2009-06-16 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7229458B2 (en) | 2002-04-19 | 2007-06-12 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7909778B2 (en) | 2002-04-19 | 2011-03-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for penetrating tissue |
| US7354732B2 (en) | 2002-06-14 | 2008-04-08 | Arkray, Inc. | Method of assay with sulfonic acid compound and nitro compound |
| JP3973160B2 (ja) * | 2002-07-17 | 2007-09-12 | アークレイ株式会社 | スルホン酸化合物を用いたタンパク質の分解方法 |
| DE60330376D1 (de) | 2002-10-23 | 2010-01-14 | Daiichi Pure Chemicals Co Ltd | Defructosylierungsverfahren |
| US8574895B2 (en) | 2002-12-30 | 2013-11-05 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus using optical techniques to measure analyte levels |
| JP4504923B2 (ja) | 2003-05-21 | 2010-07-14 | 旭化成ファーマ株式会社 | ヘモグロビンＡ１ｃ測定法およびそれに用いる酵素とその製造法 |
| ATE476137T1 (de) | 2003-05-30 | 2010-08-15 | Pelikan Technologies Inc | Verfahren und vorrichtung zur injektion von flüssigkeit |
| DK1633235T3 (da) | 2003-06-06 | 2014-08-18 | Sanofi Aventis Deutschland | Apparat til udtagelse af legemsvæskeprøver og detektering af analyt |
| WO2006001797A1 (en) | 2004-06-14 | 2006-01-05 | Pelikan Technologies, Inc. | Low pain penetrating |
| EP1671096A4 (en) | 2003-09-29 | 2009-09-16 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND APPARATUS FOR PROVIDING IMPROVED SAMPLE CAPTURING DEVICE |
| EP1680014A4 (en) | 2003-10-14 | 2009-01-21 | Pelikan Technologies Inc | METHOD AND APPARATUS PROVIDING A VARIABLE USER INTERFACE |
| KR20060123751A (ko) * | 2003-11-19 | 2006-12-04 | 다이이치 가가쿠 야쿠힝 가부시키가이샤 | 헤모글로빈 함유 시료 중의 기질의 측정방법 |
| ATE509119T1 (de) * | 2003-11-19 | 2011-05-15 | Sekisui Medical Co Ltd | Verfahren zum testen von glykosyliertem protein |
| DE602004025735D1 (de) | 2003-12-12 | 2010-04-08 | Arkray Inc | Verfahren zur messung von saccharifiziertem amin |
| EP1706026B1 (en) | 2003-12-31 | 2017-03-01 | Sanofi-Aventis Deutschland GmbH | Method and apparatus for improving fluidic flow and sample capture |
| US7822454B1 (en) | 2005-01-03 | 2010-10-26 | Pelikan Technologies, Inc. | Fluid sampling device with improved analyte detecting member configuration |
| US8828203B2 (en) | 2004-05-20 | 2014-09-09 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Printable hydrogels for biosensors |
| US9775553B2 (en) | 2004-06-03 | 2017-10-03 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for a fluid sampling device |
| WO2005120365A1 (en) | 2004-06-03 | 2005-12-22 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for a fluid sampling device |
| US8080423B2 (en) * | 2004-08-05 | 2011-12-20 | Asahi Kasei Pharma Corporation | Reagent containing protease reaction promoter and/or colorant stabilizer |
| US8652831B2 (en) | 2004-12-30 | 2014-02-18 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Method and apparatus for analyte measurement test time |
| US7361513B2 (en) * | 2005-04-08 | 2008-04-22 | Streck, Inc. | Cellular controls for glycated hemoglobin Hb A1c |
| CN101171342B (zh) * | 2005-05-06 | 2011-11-16 | 爱科来株式会社 | 蛋白质的切断方法及其用途 |
| US8507223B2 (en) | 2005-07-19 | 2013-08-13 | Kikkoman Corporation | Method for quantitative determination of glycated protein and kit for quantitative determination of the same |
| WO2007049762A1 (ja) * | 2005-10-27 | 2007-05-03 | Arkray, Inc. | アルブミン変性剤 |
| US7943385B2 (en) | 2006-07-25 | 2011-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| CA2654981C (en) * | 2006-07-25 | 2016-05-17 | General Atomics | Methods for assaying percentage of glycated hemoglobin |
| EP2048506A4 (en) | 2006-08-11 | 2010-04-21 | Arkray Inc | MARKERS FOR POSTPRANDIAL HYPERGLYKEMIA, METHOD OF DETERMINING THEREOF AND USE THEREOF |
| WO2008093723A1 (ja) * | 2007-01-30 | 2008-08-07 | Arkray, Inc. | ＨｂＡ１ｃ測定方法 |
| US8273577B2 (en) | 2007-01-30 | 2012-09-25 | Arkray, Inc. | Method for detecting phenothiazine-derivative color and color-developer reagent used therein |
| JP4697809B2 (ja) * | 2007-02-22 | 2011-06-08 | 旭化成ファーマ株式会社 | ロイコ色素の安定化方法 |
| US8715942B2 (en) * | 2007-11-20 | 2014-05-06 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Methods for the detection of glycated hemoglobin |
| EP2543706B1 (en) | 2008-03-19 | 2021-05-26 | ARKRAY, Inc. | Method for stabilizing of color developer and use thereof |
| WO2009126900A1 (en) | 2008-04-11 | 2009-10-15 | Pelikan Technologies, Inc. | Method and apparatus for analyte detecting device |
| WO2009140343A1 (en) * | 2008-05-13 | 2009-11-19 | General Atomics | Electrochemical biosensor for direct determination of percentage of glycated hemoglobin |
| US9375169B2 (en) | 2009-01-30 | 2016-06-28 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Cam drive for managing disposable penetrating member actions with a single motor and motor and control system |
| US8128545B2 (en) * | 2009-05-07 | 2012-03-06 | Cmd Corporation | Machine for securing a closure system onto a discrete pouch |
| EP2281900A1 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-09 | Roche Diagnostics GmbH | Fructosyl peptidyl oxidase and sensor for assaying a glycated protein |
| US8965476B2 (en) | 2010-04-16 | 2015-02-24 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Tissue penetration device |
| CN104313121A (zh) * | 2010-08-11 | 2015-01-28 | 协和梅迪克斯株式会社 | 糖化血红蛋白的测定方法 |
| JP2012108062A (ja) * | 2010-11-19 | 2012-06-07 | Hitachi High-Technologies Corp | 自動分析装置 |
| US10006922B2 (en) | 2011-12-22 | 2018-06-26 | Massachusetts Institute Of Technology | Raman spectroscopy for detection of glycated analytes |
| JP5858945B2 (ja) * | 2012-03-15 | 2016-02-10 | アークレイ株式会社 | 酵素を用いた測定方法 |
| JP5938713B2 (ja) * | 2013-03-11 | 2016-06-22 | 彰 三池 | ヘモグロビンの高感度測定法と試薬 |
| CN105431545B (zh) * | 2013-07-09 | 2021-06-18 | 日立化成诊断系统株式会社 | 糖化血红蛋白的测定方法 |
| CN111398605B (zh) | 2013-08-09 | 2024-04-05 | 龟甲万株式会社 | 糖化血红蛋白测定用组合物 |
| JP7094655B2 (ja) | 2014-11-07 | 2022-07-04 | キッコーマン株式会社 | アニオン性界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼ |
| CN106596209B (zh) * | 2015-10-14 | 2020-05-12 | 杭州量康科技有限公司 | 干血样本预处理及检测方法 |
| EP3457136A4 (en) * | 2016-05-13 | 2020-02-26 | Eiken Kagaku Kabushiki Kaisha | METHOD FOR CALCULATING THE RELATIONSHIP OF MEASURING OBJECT SUBSTANCE TO COMPARATIVE OBJECT SUBSTANCE, PROGRAM, STORAGE MEDIUM AND DEVICE |
| MX2019010478A (es) | 2017-03-03 | 2019-12-19 | Polymer Technology Systems Inc | Sistemas y métodos para la detección y cuantificación enzimáticas de a1c. |
| US11703513B2 (en) | 2017-08-07 | 2023-07-18 | Polymer Technology Systems, Inc. | Systems and methods for enzymatic A1C detection and quantification |
| CN109680036A (zh) * | 2017-10-02 | 2019-04-26 | 爱科来株式会社 | 糖化蛋白质的测定 |
| WO2019143637A1 (en) * | 2018-01-18 | 2019-07-25 | Cellics Therapeutics, Inc. | Methods and compositions for quantifying hemoglobin |
| CN113009024B (zh) * | 2018-12-29 | 2023-05-09 | 江山德瑞医疗科技有限公司 | 一种测定糖化血红蛋白中洗脱条件方法 |
| CA3147893C (en) * | 2019-07-22 | 2022-11-22 | Ortho-Clinical Diagnostics, Inc. | Glycated hemoglobin measurement |
Family Cites Families (24)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA971031A (en) * | 1972-12-11 | 1975-07-15 | Tadanobu Nakadai | Process for manufacturing soy sauce using enzymatic preparation(s) |
| US4465774A (en) * | 1981-07-16 | 1984-08-14 | Sherwood Medical Company | Standard or control material for glysocylated or total hemoglobin determination |
| JPH0288568A (ja) | 1988-09-27 | 1990-03-28 | Idemitsu Kosan Co Ltd | 含フッ素エポキシドおよびその製造法 |
| JPH02195900A (ja) | 1989-01-25 | 1990-08-02 | Sanyo Chem Ind Ltd | 糖化蛋白の測定法および測定試薬 |
| GB9116315D0 (en) | 1991-07-29 | 1991-09-11 | Genzyme Ltd | Assay |
| EP1239287A3 (en) * | 1992-03-04 | 2006-07-26 | Abbott Laboratories | Composition for use as an ion capture separation reactant |
| JP3157622B2 (ja) | 1992-06-05 | 2001-04-16 | 株式会社ミツカングループ本社 | フルクトシルアミンデグリカーゼ、その製造法及び該酵素を用いたアマドリ化合物の定量方法 |
| AU661207B2 (en) | 1992-11-17 | 1995-07-13 | Boehringer Mannheim Gmbh | Simultaneous determination of HbA1c and haemoglobin variants with a glycation analogus to HbA1c |
| JP3118625B2 (ja) | 1994-01-11 | 2000-12-18 | 長瀬産業株式会社 | 血球の分離方法 |
| EP0678576B1 (en) | 1994-03-03 | 2001-01-03 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase and process for producing the same |
| DE4425162A1 (de) | 1994-07-18 | 1996-01-25 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur quantitativen Bestimmung von glykierten Proteinen |
| US5712138A (en) * | 1994-10-05 | 1998-01-27 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosyl amino acid oxidase |
| WO1997013872A1 (fr) | 1995-10-12 | 1997-04-17 | Kyoto Daiichi Kagaku Co., Ltd. | Procede pour doser les composes d'amadori |
| DE69629489T2 (de) * | 1995-11-30 | 2004-07-22 | Kyoto Daichi Kagaku Co., Ltd. | Fructosylaminosäuren oxidase, verfahren zu ihrer herstellung und zum testen von amadori-verbindungen unter zuhilfenahme des enzyms |
| DE69835268T2 (de) | 1997-04-24 | 2006-11-23 | Arkray, Inc. | Verfahren zum enzymatischen nachweis eines verzuckerungsproteins |
| JP3987900B2 (ja) | 1997-11-26 | 2007-10-10 | アークレイ株式会社 | 糖化タンパク質の測定方法 |
| US6352835B1 (en) * | 1998-11-17 | 2002-03-05 | Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd. | Method of measuring substance in sample using a redox reaction |
| CN1218040C (zh) * | 1999-04-12 | 2005-09-07 | 爱科来株式会社 | α－糖化氨基酸释放酶 |
| JP2000300294A (ja) | 1999-04-16 | 2000-10-31 | Dai Ichi Pure Chem Co Ltd | ヘモグロビンＡ１ｃの定量法 |
| KR100369212B1 (ko) | 1999-07-07 | 2003-01-24 | 한국과학기술연구원 | 내연 기관의 배기 소음 및/또는 기체 이송 시스템의 덕트내부의 소음을 제어하기 위한 장치 및 방법 |
| JP3734212B2 (ja) | 1999-08-18 | 2006-01-11 | 旭化成ファーマ株式会社 | タンパク質の選択的断片化方法 |
| JP3949854B2 (ja) | 1999-10-01 | 2007-07-25 | キッコーマン株式会社 | 糖化蛋白質の測定方法 |
| JP4010474B2 (ja) | 2000-01-28 | 2007-11-21 | 旭化成ファーマ株式会社 | 糖化タンパク質割合測定方法 |
| EP1329721B8 (en) * | 2000-09-28 | 2010-05-26 | ARKRAY, Inc. | Method of quantifying hemoglobin and method of measuring glycation ratio of hemoglobin |
-
2001
- 2001-07-12 US US14/521,525 patent/USRE46118E1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 EP EP10010191.4A patent/EP2336351B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 CN CN018154131A patent/CN1620512B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 WO PCT/JP2001/006064 patent/WO2002006519A1/ja active Application Filing
- 2001-07-12 CN CN2008101309163A patent/CN101363044B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 EP EP01947995A patent/EP1304385B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 CN CN2010101563994A patent/CN101875963B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 AU AU2001269513A patent/AU2001269513A1/en not_active Abandoned
- 2001-07-12 JP JP2002512410A patent/JP3971702B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-07-12 US US14/521,534 patent/USRE46105E1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 DE DE60143748T patent/DE60143748D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 EP EP15174619.5A patent/EP2944699B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-07-12 US US10/332,790 patent/US7235378B2/en not_active Ceased
- 2001-07-12 US US14/329,019 patent/USRE46130E1/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-06-16 JP JP2008156831A patent/JP2008245657A/ja not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2010041419A1 (ja) | 2008-10-10 | 2010-04-15 | 東洋紡績株式会社 | 新規なフルクトシルバリルヒスチジンオキシダーゼ活性を有するタンパク質及びその改変体、並びにその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1620512A (zh) | 2005-05-25 |
| DE60143748D1 (de) | 2011-02-10 |
| CN101363044B (zh) | 2013-01-09 |
| USRE46105E1 (en) | 2016-08-16 |
| EP1304385B1 (en) | 2010-12-29 |
| US20030162242A1 (en) | 2003-08-28 |
| EP2336351A3 (en) | 2011-09-14 |
| AU2001269513A1 (en) | 2002-01-30 |
| CN101363044A (zh) | 2009-02-11 |
| CN101875963A (zh) | 2010-11-03 |
| USRE46118E1 (en) | 2016-08-23 |
| EP2336351B1 (en) | 2016-03-09 |
| EP1304385A1 (en) | 2003-04-23 |
| EP2944699B1 (en) | 2017-10-18 |
| US7235378B2 (en) | 2007-06-26 |
| USRE46130E1 (en) | 2016-08-30 |
| EP1304385A4 (en) | 2006-06-07 |
| WO2002006519A1 (fr) | 2002-01-24 |
| EP2944699A1 (en) | 2015-11-18 |
| EP2336351A2 (en) | 2011-06-22 |
| CN1620512B (zh) | 2010-06-02 |
| JP2008245657A (ja) | 2008-10-16 |
| CN101875963B (zh) | 2013-10-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3971702B2 (ja) | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 | |
| JP5097758B2 (ja) | 酸化還元反応を用いた糖化タンパク質の測定方法および測定キット | |
| JP5222331B2 (ja) | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 | |
| EP1329721B1 (en) | Method of measuring glycation ratio of hemoglobin | |
| JP4861986B2 (ja) | タンパク質の切断方法およびその用途 | |
| JP2000333696A (ja) | 糖化アミンの測定方法 | |
| JP5261180B2 (ja) | 食後高血糖マーカー、その測定方法およびその用途 | |
| JPWO2005056823A1 (ja) | 糖化アミンの測定方法 | |
| JPWO2002027012A1 (ja) | タンパク質分解物の製造方法 | |
| JP4756116B2 (ja) | 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 | |
| JP4352154B2 (ja) | 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 | |
| JP4143698B2 (ja) | Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムの誤発色防止方法および前記方法を用いた試薬溶液ならびに測定方法 | |
| JP3910156B2 (ja) | 試料の安定化方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060529 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060728 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20060802 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20070109 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070219 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20070424 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20070608 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 3971702 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100615 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20110615 Year of fee payment: 4 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120615 Year of fee payment: 5 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130615 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |