JP4756116B2 - 糖化アミンを測定するための試料の前処理方法および糖化アミンの測定方法 - Google Patents
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Description
→ R1−CO−CHO + NH2−R2 + H2O2 …(1)
前記式(1)において、R1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基(糖残基)を意味する。前記糖残基(R1)は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基(R1)は、グルコース残基(アルドース残基)となる。この糖残基(R1)は、例えば、
−[CH(OH)]n−CH2OH
で示すことができ、nは、0〜6の整数である。
前記式(1)において、R2は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチドの場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基(アミノ酸側鎖のアミノ基)が糖化されている場合とで異なる。
前記式(1)において、α−アミノ基が糖化されている場合、R2は、下記式(2)で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式(1)の反応を特異的に触媒するのが前記FAOD−αおよびFAOD−αSである。
−CHR3−CO−R4 …(2)
前記式(2)において、R3はアミノ酸側鎖基を示し、R4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式(3)で示すことができる。下記式(3)において、nは、0以上の整数であり、R3は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−(NH−CR3H−CO)n−OH …(3)
また、前記式(1)において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている(アミノ酸側鎖基が糖化されている)場合、R2は下記式(4)で示すことができる。この場合に前記式(1)の反応を特異的に触媒するのが前記FAOD−SおよびFAOD−αSである。
−R5−CH(NH−R6)−CO−R7 …(4)
前記式(4)において、R5は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、R5は
−CH2−CH2−CH2−CH2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、R5は、
−CH2−CH2−CH2−NH−CH(NH2)−
である。
また、前記式(4)において、R6は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式(5)で示すことができる。なお、下記式(5)において、nは0以上の整数であり、R3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−(CO−CR3H−NH)n−H …(5)
また、前記式(4)において、R7は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式(6)で示すことができる。なお、下記式(6)において、nは0以上の整数であり、R3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−(NH−CHR3−CO)n−OH …(6)
この実施形態は、前記糖化アミノ酸の分解にFAOD−αを使用し、糖化タンパク質の測定にFAOD−αSを用いた前記第1の測定方法の一例である。
R1−CO−CH2−NH−CHR3−COOH + H2O + O2
→ R1−CO−CHO + NH2−CHR3−COOH + H2O2 …(7)
前記式(7)において、R1は前述と同様の糖残基を示し、R3は前述と同様にアミノ酸側鎖を示す。
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じFAODを用いた前記第2の測定方法の一例である。FAODとしては、特に制限されず、例えば、FAOD−α、FAOD−S、FAOD−αSのいずれを用いてもよい。
この実施形態は、非測定対象糖化物である糖化アミノ酸の分解と測定対象である糖化タンパク質の測定に、同じFAODを用いた例である。但し、この実施形態は、前記第2の実施形態とは異なり、分解用FAODを、プロテアーゼによって必ずしも失活させる必要がない。酵素には基質特異性があるため、プロテアーゼとFAODとの組み合わせによっては、FAODをプロテアーゼで失活させ難い場合がある。このような場合に本実施形態の方法が有効になる。なお、はじめに添加した分解用FAODが、プロテアーゼにより生成した糖化タンパク質分解物と反応すると、測定精度を向上できないため、以下に示すように、FAODの添加割合を調整することが重要となる。
患者に、アミノ酸およびブドウ糖を含む点滴を行い、1時間後、血液を採取した。その血液を遠心分離(1000g、10分間)して血球と血漿とに分離し、前記血球画分0.006mL、前記血漿画分0.006mLおよび下記溶血試薬A 0.45mLとを混合して、前記血球を溶血させて溶血試料を調製した。
商品名TAPS(同仁化学社製) 140mmol/L
グリシンアミド(ナカライテスク社製) 60mmol/L
ポリオキシエチレンラウリルエーテル(ナカライテスク社製) 24g/L
(1)前記ペニシリウム属由来FAOD(特開平8−336386公報)
(2)前記アスペルギルス属由来FAOD(WO99/20039号)
(3)商品名FAOX−E(キッコーマン社製、以下同じ)
MOPS(同仁化学社製) 5mmol/L
テトラゾリウム化合物(商品名WST−3、同仁化学社製) 2mmol/L
NaN3(ナカライテスク社製) 0.05g/L
CaCl2(ナカライテスク社製) 5mmol/L
NaCl(ナカライテスク社製) 300mmol/L
メタロプロテアーゼ 3g/L
ギベレラ属由来FAOD(特開平8−154672号公報) 26KU/L
POD(東洋紡社製) 77.6KU/L
発色基質(商品名DA−64、和光純薬工業社製) 0.052mmol/L
Tris−HCl緩衝液(pH6.9) 200mmol/L
前記実施例1と同様に点滴後の血液を採血し、これを静置した。そして、自然沈降した血球を回収し、この血球画分0.01mLに下記溶血試薬B 0.3mLを添加して溶血試料を調製した。この溶血試料のHb濃度およびHbA1c濃度を、前記自動分析装置により分析した。なお、前記血球は自然沈降により回収しているため、前記血球画分は血漿成分を含んでいる。
商品名TAPS(同仁化学社製) 140mmol/L
グリシンアミド(ナカライテスク社製) 60mmol/L
ポリオキシエチレンラウリルエーテル(ナカライテスク社製) 24g/L
商品名FAOX−E(キッコーマン社製、以下同じ) 1KU/L
HbA1c(%)=(HbA1c濃度/Hb濃度)×100
Claims (1)
- 点滴後の患者から採取された試料中の糖化タンパク質をプロテアーゼで処理し、生成した糖化アミノ酸及び/又は糖化ペプチドをフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)で処理することにより糖化タンパク質の含有量を測定する方法において、
糖化タンパク質をプロテアーゼで処理する前に、前記試料中に存在する可能性のある、糖化タンパク質に由来しない糖化アミノ酸に、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ(FAOD)を作用させることにより、前記糖化アミノ酸を分解処理する前処理工程を含むことを特徴とする糖化タンパク質の含有量を測定する方法。
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