JP2005062067A

JP2005062067A - 異常糖化ヘモグロビンの検出方法

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Publication number: JP2005062067A
Application number: JP2003294561A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Yonehara; 聡米原; Ko Hirai; 香平井
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 2003-08-18
Filing date: 2003-08-18
Publication date: 2005-03-10

Abstract

【課題】異常ヘモグロビン（Ｈｂ）の検出方法を提供する。
【解決手段】予め、正常ヘモグロビンにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基の糖化量から、それらの比率を求めておき、前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象ヘモグロビンにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定した糖化量からそれらの比率を求め、この比率と、前記正常ヘモグロビンにおける比率とを比較し、前記両比率が一致すれば正常ヘモグロビン、両比率が相違すれば異常ヘモグロビンとする。
【選択図】なし

Description

本発明は、ヘモグロビン（Ｈｂ）における変異の有無を検出する方法に関する。

血液中の糖化Ｈｂは、生体内血糖値の過去の履歴を反映しているため、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされており、中でも、β鎖Ｎ末端のバリンが糖化したものは、「ＨｂＡ_1c」と呼ばれ、特に前記指標としての測定が行われている。

このような糖化Ｈｂは、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、ミニカラム法、免疫法等により、Ｈｂの糖化量または糖化率として測定されている。また、近年では、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼをＨｂの糖化部分に作用させ、その酸化反応により発生した過酸化水素を測定することによって前記糖化量等を求める酵素法も実用化されている。そして、Ｈｂの中でも特にHbA_1c（％）は、前記各種方法によって、そのβ鎖Ｎ末バリンの糖化を特異的に検出することによって測定されている。

しかしながら、Ｈｂの中には、１残基〜数残基のアミノ酸が変異した異常Ｈｂが存在する場合がある。そして、このような異常Ｈｂは、そのアミノ酸の変異箇所によってHbA_1c（％）の測定に様々な影響を与え、例えば、HbA_1c（％）値が真の値よりも増加もしくは減少する場合がある。このような誤った測定値を真のHbA_1c（％）であると誤認すれば、その誤認した測定値に基づいて診断等が行われるという問題が生じることとなる。したがって、臨床医療の分野においては、Ｈｂにおける異常の有無を確認することは非常に重要なことである。

しかしながら、例えば、ＨＰＬＣによりHbA_1c（％）を測定する場合には、例えば、臨床所見において異常Ｈｂの存在が推測されるにも関わらず、測定値が正常値範囲内にある場合等、前記臨床所見とHbA_1c（％）の測定値との不一致から異常Ｈｂの存在を発見するという、非常に不確実な方法しかなかった。そして、このような異常Ｈｂを有する場合には、異常Ｈｂと正常Ｈｂとを分離した上で、その糖化率を測定する必要があった（例えば、非特許文献１）。
ダブリュー.ギャリージョンら（W. Garry John et al.）、クリニカルケミストリー（Clinical Chemistry）、１９９７年、４３巻、６号、９６８〜９７５頁

そこで、本発明の目的は、異常Ｈｂの新たな検出方法の提供である。

前記目的を達成するために、本発明の異常Ｈｂの検出方法として、以下に示す第１の検出方法および第２の検出方法があげられる。

本発明の第１の検出方法は、予め、正常Ｈｂにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基(X₁〜X_n；ｎは２以上の整数）の糖化量のうち、いずれか１つのアミノ酸残基（X₁）の糖化量を基準値（x₁）として、前記基準値（x₁）と、他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x₂〜x_n）との比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）をそれぞれ求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定したアミノ酸残基（X₁）の糖化量（x_1'）と、測定した他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x_2'〜x_n'）から前記比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）を用いて換算したアミノ酸残基（X₁）の換算糖化量（x_2''〜x_n''）とを比較し、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂとする異常Ｈｂの検出方法である。

また、本発明の第２の検出方法は、予め、正常Ｈｂにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基の糖化量から、それらの比率を求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定した糖化量からそれらの比率を求め、この比率と、前記正常Ｈｂにおける比率とを比較し、前記両比率が一致すれば正常Ｈｂ、両比率が相違すれば異常Ｈｂとする異常Ｈｂの検出方法である。

このような本発明の第１および第２の検出方法によれば、コントロールとして正常Ｈｂにおける２箇所以上の糖化量を測定し、かつ、分析対象Ｈｂにおける同箇所の糖化量を測定することによって、分析対象Ｈｂにおける異常Ｈｂの有無が確認できる。このような方法は、特に前述のような、特異的な箇所の総量を測定できるＦＡＯＤを利用した酵素法や免疫法において有用であり、ＨＰＬＣのように様々なピークとして得られるという問題がなく、また、ＨＰＬＣ等の装置が不要であることから容易かつ簡便に検出を行うことができる。また、後述するように、本発明の検出方法を利用することによって、真のＨｂ糖化量または糖化率、具体的には真のHbA_1c（％）を決定できるため、臨床医療の分野において非常に有用な方法であるといえる。

本発明の第１の検出方法は、前述のとおり、予め、正常Ｈｂにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基(X₁〜X_n；ｎは２以上の整数）の糖化量のうち、いずれか１つのアミノ酸残基（X₁）の糖化量を基準値（x₁）として、前記基準値（x₁）と、他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x₂〜x_n）との比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）をそれぞれ求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定したアミノ酸残基（X₁）の糖化量（x_1'）と、測定した他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x_2'〜x_n'）から前記比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）を用いて換算したアミノ酸残基（X₁）の換算糖化量（x_2''〜x_n''）とを比較し、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂとする異常Ｈｂの検出方法である。

この第１の検出方法により、どのようにして異常Ｈｂか否かを判断するかについて、測定するアミノ酸残基数「X_n」の「ｎが２」である場合の一例を以下に説明する。まず、予め、コントロールとして正常Ｈｂについて異なる２箇所のアミノ酸残基(X₁、X₂)における糖化量を測定しておく。この結果を、結果[1]（x₁、x₂）と表す。そして、前記結果[1]における、アミノ酸残基（X₁）における糖化量を基準値（x₁）として、前記基準値（x₁）と、他のアミノ酸残基（X₂）の糖化量（x₂）との比率を求めておく。この結果を、結果[2]（x₁：x₂）と表す。

一方、前記異なる２箇所のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基(X₁、X₂)について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定する。この結果を、結果[3]（x_1'、x_2'）と表す。そして、前記結果[3]におけるアミノ酸残基（X₂）の糖化量（x_2'）から、前記結果[2]における比率（x₁：x₂）を用いて、アミノ酸残基（X₁）における糖化量を換算する。この換算した糖化量を、結果[4]（x_2''）と表す。なお、前記アミノ酸残基（X_n）における糖化量（x_n）を用いた場合、換算糖化量（x_n''）は、
x_n''＝（x_n'）・(x₁/x_n)
の式から求めることができ、前記アミノ酸残基（X²）の糖化量（x^2'）を使用する場合は、
x_2''＝(x_2')・(x₁/x₂)
となる。

このようにして求めた結果[4]の換算糖化量（x_2''）と、実際に測定した結果[3]におけるアミノ酸残基（X₁）の糖化量(x_1')とを比較する。そして、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂと判断することができるのである。

また、測定するアミノ酸残基数「X_n」の「ｎが５」である場合の一例を以下に説明する。まず、予め、コントロールとして正常Ｈｂについて異なる５箇所のアミノ酸残基(X₁〜X₅)における糖化量を測定しておく。この結果を、結果[1]（x₁、x₂、x₃、x₄、x₅）と表す。そして、前記結果[1]における、いずれか一つのアミノ酸残基（X₁）における糖化量を基準値（x₁）として、前記基準値（x₁）と、他のアミノ酸残基（X₂〜X₅）の糖化量（x₂〜x₅）との比率を求めておく。この結果を、結果[2]（x₁：x₂、 x₁：x₃、 x₁：x₄、 x₁：x₅）と表す。

一方、前記異なる５箇所のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基(X₁〜X₅)について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定する。この結果を、結果[3]（x_1'、x_2'、x_3'、x_4'、x_5'）と表す。そして、前記結果[3]におけるアミノ酸残基（X₂〜X₅）の糖化量（x_2'〜x_5'）から、前記結果[2]における比率（x₁：x₂、 x₁：x₃、 x₁：x₄、 x₁：x₅）を用いて、アミノ酸残基（X₁）における糖化量を換算する。この換算した糖化量を、結果[4]（x_2''〜x_5''）と表す。

このようにして求めた結果[4]に示す換算糖化量（x_2''〜x_5''）と、実際に測定した結果[3]におけるアミノ酸残基（X₁）の糖化量(x_1')とを比較する。そして、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂと判断することができるのである。

このように２箇所以上のアミノ酸残基における糖化量を測定すれば、例えば、結果[4]の全ての値と、結果[3]の糖化量(x_1')とが一致することによって、正常Ｈｂであることの信頼性がより一層増す。反対に、結果[4]の全ての値と、結果[3]の糖化量(x_1')とが異なる場合には、異常Ｈｂであることの信頼性が増す。さらに、このように２箇所以上で測定して異常Ｈｂと判断された場合、他の数値と比較して、値の異なる糖化量を示したアミノ酸残基に変異が生じていると推測することも可能になるのである。これは、例えば、結果[4]の値が４つであり、そのうちの１つの値のみが、結果[3]の糖化量(x_1')と異なる場合には、その値を示したアミノ酸残基に変異が生じている確立が高いと判断できるということである。一方、結果[4]の値が全て同じ値であり、結果[3]の糖化量(x_1')のみが異なる範囲である場合には、アミノ酸残基（X₁）に変異が生じている確立が高いと判断することができるのである。

糖化量を測定するアミノ酸残基は、異なる２箇所以上のアミノ酸残基(X₁〜X_n；ｎは２以上の整数)であれば、特に制限されないが、好ましくは２〜１０箇所であり、より好ましくは２〜４箇所である。

本発明の第１の検出方法において、正常ヘモグロビンにおける基準値（x₁）となる糖化量は、β鎖Ｎ末バリンの糖化量に相当するHbA_1c（％）であることが好ましい。HbA_1c（％）は、前述のように糖尿病の指標として特に重要であり、かつ、β鎖Ｎ末端バリンの糖化量に相当するからである。したがって、この場合、測定するアミノ酸残基のうち（X₁）は、β鎖Ｎ末端バリンであることが好ましい。

つぎに、本発明の第２の検出方法は、前述のとおり、予め、正常Ｈｂにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基（X₁〜X_n;ｎは２以上の整数）の糖化量から、それらの比率を求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定した糖化量からそれらの比率を求め、この比率と、前記正常Ｈｂにおける比率とを比較し、前記両比率が一致すれば正常Ｈｂ、両比率が相違すれば異常Ｈｂとする異常Ｈｂの検出方法である。

この第２の検出方法により、どのようにして異常Ｈｂか否かを判断するかについて、測定するアミノ酸残基数「X_n」の「ｎが２」である場合の一例を以下に説明する。まず、予め、コントロールとして正常Ｈｂについて異なる２箇所のアミノ酸残基(X₁、X₂)における糖化量を測定しておく。この結果を、結果[1]（x₁、x₂）と表す。そして、前記結果[1]における測定した糖化量の比率を求めておく。この結果を、結果[2]（x₁：x₂）と表す。

一方、前記異なる２箇所のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基(X₁、X₂)について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定する。この結果を、結果[3]（x_1'、x_2'）と表す。そして、前記結果[3]における測定した糖化量の比率を求める。この結果を、結果[4]（x_1'：x_2'）と表す。

このようにして求めた、コントロールの結果[2]と分析対象Ｈｂの結果[4]とを比較し、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂと判断することができるのである。

また、測定するアミノ酸残基数「X_n」の「ｎが５」である場合の一例を以下に説明する。まず、予め、コントロールとして正常Ｈｂについて異なる５箇所のアミノ酸残基(X₁〜X₅)における糖化量を測定しておく。この結果を、結果[1]（x₁、x₂、x₃、x₄、x₅）と表す。そして、前記結果[1]における各糖化量の比率を求めておく。この結果を、結果[2]（x₁：x₂：x₃：x₄：x₅）と表す。

一方、前記異なる５箇所のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基(X₁〜X₅)について、分析対象Ｈｂにおける糖化量をそれぞれ測定する。この結果を、結果[3]（x_1'、x_2'、x_3'、x_4'、x_5'）と表す。そして、前記結果[3]における各糖化量の比率を求める。この結果を、結果[4]（x_1'：x_2'：x_3'：x_4'：x_5'）と表す。

このようにして求めた結果[2]（x₁：x₂：x₃：x₄：x₅）と、結果[4]（x_1'：x_2'：x_3'：x_4'：x_5'）とを比較し、両者が異なれば異常Ｈｂ、両者が一致すれば正常Ｈｂと判断する。

このように２箇所以上のアミノ酸残基における糖化量を測定すれば、前述の本発明の第１の検出方法と同様に、結果[2]における比率と、結果[4]における比率が全て一致することによって、正常Ｈｂであることの信頼性がより一層増すのである。反対に、結果[4]における比率と結果[3]における比率との間で、異なる部分が多い程、異常Ｈｂであることの信頼性が増すのである。さらに、このように２箇所以上で測定すれば、前述と同様に、いずれの部位に変異を有する異常Ｈｂであるかを決定することも可能になるのである。これは、例えば、結果[4]の比率のうち１つの値のみが、結果[3]の比率と異なる場合には、その値を示したアミノ酸残基に変異が生じている確立が高いと判断できるのである。

第２の検出方法においても、糖化量を測定するアミノ酸残基は、異なる２箇所以上のアミノ酸残基(X₁〜X_n；ｎは２以上の整数)であれば、特に制限されないが、好ましくは２〜１０箇所であり、より好ましくは２〜４箇所である。

本発明の検出方法において、アミノ酸残基の糖化量の測定方法は特に制限されないが、酵素法や免疫法を使用することが好ましい。この酵素法とは、例えば、糖化Ｈｂの糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下「ＦＡＯＤ」という）を作用させ、この酸化反応を測定することによって、前記Ｈｂの糖化程度を測定する方法である。

前記ＦＡＯＤと反応させる糖化Ｈｂの糖化部分は、使用するＦＡＯＤの触媒反応により異なるが、例えば、Ｎ末端バリンの糖化α−アミノ基や、リジン残基やアルギニン残基等の側鎖の糖化アミノ基が好ましい。

前記酸化反応の測定は、例えば、前記反応により生じる過酸化水素量の測定が好ましく、例えば、ペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する基質とを用いた測定であることが好ましい。

前記酸化により発色する基質としては、特に制限されず、例えば、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合せた基質等があげられる。前記トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、前記４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。このような発色性基質の中でも、特に好ましくは、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウムである。

本発明において使用するＦＡＯＤとしては、下記式（１）に示す反応を触媒するＦＡＯＤであることが好ましく、具体的には、例えば、α−アミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）、アミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンに特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−Ｓ」という）、α−アミノ基が糖化された糖化アミンおよびアミノ酸側鎖のアミノ基が糖化された糖化アミンのいずれにも特異的に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）等があげられる。

R¹-CO-CH₂-NH-R² ＋ H₂O ＋ O₂
→ R¹-CO-CHO ＋ NH₂-R² ＋ H₂O₂ ．．．（１）
前記式（１）において、Ｒ¹は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ¹）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ¹）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ¹）は、例えば、
-[CH(OH)]_n-CH₂OH
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。

前記式（１）において、Ｒ²は、特に制限されないが、糖化アミンが糖化アミノ酸または糖化ペプチドの場合、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基（アミノ酸側鎖のアミノ基）が糖化されている場合とで異なる。

前記式（１）において、α−アミノ基が糖化されている場合、Ｒ²は、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−αおよびＦＡＯＤ−αＳである。

-CHR³-CO-R⁴ …(2)
前記式（２）において、Ｒ³はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ⁴は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ³は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。

-(NH-CR³H-CO)_n-OH …(3)
また、前記式（１）において、α−アミノ基以外のアミノ基が糖化されている（アミノ酸側鎖基が糖化されている）場合、Ｒ²は下記式（４）で示すことができる。この場合に前記式（１）の反応を特異的に触媒するのが前記ＦＡＯＤ−ＳおよびＦＡＯＤ−αＳである。

-R⁵-CH(NH-R⁶)-CO-R⁷ …(4)
前記式（４）において、Ｒ⁵は、アミノ酸側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。例えば、糖化されたアミノ酸がリジンの場合、Ｒ⁵は
-CH₂-CH₂-CH₂-CH₂-
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、Ｒ⁵は、
-CH₂-CH₂-CH₂-NH-CH(NH₂)-
である。

また、前記式（４）において、Ｒ⁶は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５）で示すことができる。なお、下記式（５）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。

-(CO-CR³H-NH)_n-H …(5)
また、前記式（４）において、Ｒ⁷は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（６）で示すことができる。なお、下記式（６）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ³は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。

-(NH-CHR³-CO)_n-OH …(6)
前記糖化α−アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ−αとしては、例えば、市販の商品名フルクトシル−アミノ酸オキシダーゼ（ＦＡＯＸ−Ｅ）（キッコーマン社製）、ペニシリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６公報）等があげられる。前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会平成１２年度「Fusarium oxysporum 由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀他」）等があげられる。また、前記糖化α−アミノ基および糖化アミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ−αＳとしては、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平8-154672号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平7-289253号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ99/20039号）等があげられる。

なお、前記式（１）において、α−アミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ²が前記式（２）に示す構造である）に作用する触媒機能を有するものが、ＦＡＯＤ−αであり、α−アミノ基以外のアミノ基に糖が結合した糖化部位（前記Ｒ²が前記式（４）に示す構造である）に作用する触媒反応を有するものがＦＡＯＤ−Ｓであり、両方の触媒機能を有するものＦＡＯＤ−αＳである。

本発明においては、前述のようなＦＡＯＤの基質特異性を利用して糖化量の測定を行うため、ＦＡＯＤが作用し易いようにＨｂをプロテアーゼで処理し、この処理物に対してＦＡＯＤを作用させることが好ましい。

前記プロテアーゼとしては、特に限定されず、例えば、使用するＦＡＯＤの特異的な触媒作用に応じて、前記ＦＡＯＤが作用し易いアミノ酸残基や、前記アミノ酸残基を含むペプチド断片（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を遊離できるものを適宜選択すればよい。前記プロテアーゼとしては、糖化Ｈｂを選択的に分解できることから、例えば、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、メタロプロテイナーゼ、Bacillus subtillis由来のプロテアーゼ等が好ましい。前記Bacillus subtilis由来プロテアーゼとしては、商品名プロテアーゼＮ（例えば、フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）等があげられる。前記メタロプロテイナーゼとしては、Bacillus属由来メタロプロテイナーゼ（ＥＣ３．４．２４．４）（例えば、東洋紡社製：商品名トヨチーム）等があげられる。これらの中でもより好ましくはメタロプロテイナーゼ、ブロメライン、パパインである。なお、ＦＡＯＤとプロテアーゼの組み合わせとしては、後述するように、それぞれの触媒作用に応じて適宜決定することができる。

糖化量を測定する２箇所以上のアミノ酸残基としては、特に制限されないが、例えば、２箇所以上のアミノ酸残基が、全てβ鎖におけるアミノ酸残基であってもよいし、全てα鎖におけるアミノ酸残基であってもよい。また、少なくとも、α鎖のアミノ酸残基およびβ鎖のアミノ酸残基の双方を含んでもよい。

２箇所以上のアミノ酸残基のうち少なくとも２箇所がβ鎖のアミノ酸残基である場合、β鎖におけるＮ末端バリン残基と、β鎖におけるリジン残基またはアルギニン残基とを含むことが好ましく、より好ましくは前記Ｎ末端バリン残基とリジン残基とを含むことが好ましい。

２箇所以上のアミノ酸残基のうち少なくとも２箇所がβ鎖におけるアミノ酸残基およびα鎖におけるアミノ酸残基である場合、β鎖におけるアミノ酸残基がＮ末端バリンであって、α鎖におけるアミノ酸残基がリジン残基、アルギニン残基またはＮ末端バリンであることが好ましい。前記α鎖におけるアミノ酸残基は、より好ましくはリジン残基またはＮ末端バリンである。

つぎに、本発明の検出方法において、異なる２箇所以上のアミノ酸残基の糖化量を測定する方法を、以下、具体例をあげて説明する。なお、以下に示す方法には制限されず、例えば、ＦＡＯＤの基質特異性、プロテアーゼの基質特異性等に応じて適宜決定できる。

ＨｂのＮ末端バリンの糖化量
Ｎ末端バリンは、ＦＡＯＤとして、例えば、糖化されたα-アミノ基に特異的に作用する酵素、すなわち前述のＦＡＯＤ-αを用いて測定することができる。

具体的には、糖化Ｈｂ試料にＦＡＯＤ−αを作用させ、この酸化反応を前述のような方法で測定することにより、Ｎ末端バリンの糖化量を求めることができる。より好ましくは、予め、糖化Ｈｂ試料をプロテアーゼで処理し、そのＨｂ分解物をＦＡＯＤ−αで処理し、同様に糖化量を求める。

特にβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量を測定する場合には、前記ＦＡＯＤ−αとしては、例えば、商品名ＦＡＯＸ−ＴＥ（キッコーマン社製）が使用できる。このＦＡＯＤ−αは、α-アミノ基が糖化された遊離の「バリン」に特異的に作用するため、Ｎ末端配列が「Val-His-Leu・・・」となるβ鎖のＮ末端バリンの糖化量測定に適している。ＦＡＯＤ−α処理を行う前のプロテアーゼとしては、ＦＡＯＤ−αが作用し易いように、Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、例えば、アンギオテンシン変換酵素等が使用できる。具体的には、糖化Ｈｂ試料をズブチリシン、プロナーゼ等で処理することによってVal-His-Leuのトリペプチドを遊離させ、さらにHis-Leuに特異的なアンギオテンシン変換酵素で処理することによって糖化バリン（フルクトシルバリン）を遊離することができる。そしてこの糖化バリンをＦＡＯＤ−αで処理すればよい。

一方、α鎖Ｎ末端バリンの糖化量を測定する場合には、前記ＦＡＯＤ−αとして、例えば、Fusarium sp.GL2-1(FERM BP-8451)から常套手段によって得られるＦＡＯＤが使用できる。このＦＡＯＤ−αは、α-アミノ基が糖化された遊離のVal、Val-Leu、Val-Leu-Serに特異的に作用するため、Ｎ末端配列が「Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Asp・・・」となるα鎖のＮ末端バリンの糖化量測定に適している。ＦＡＯＤ−α処理を行う前のプロテアーゼとしては、ＦＡＯＤ−αが作用し易いように、Ｎ末端バリン、もしくはこれを含むペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチド等）を、特異的に遊離できるプロテアーゼが好ましく、例えば、エンドプロティナーゼＡＳＰ−Ｎ等が使用できる。具体的には、糖化Ｈｂ試料を前記エンドプロティナーゼＡＳＰ-Ｎで処理することによって、Val-Leu-Ser-Pro-Ala-Aspペプチドを遊離させ、さらにカルボキシペプチダーゼＹで処理することによって糖化Val-Leuを遊離できる。

リジン側鎖またはアルギニン側鎖の糖化量
（１）リジンまたはアルギニンの側鎖における糖化量は、ＦＡＯＤとして、例えば、アミノ酸残基側鎖の糖化部分にのみ作用するＦＡＯＤ−Ｓを用いて測定することができる。

具体的には、糖化Ｈｂ試料にＦＡＯＤ−Ｓを作用させ、この酸化反応を前述のような方法で測定することにより、リジンまたはアルギニンの糖化量を求めることができる。より好ましくは、予め、糖化Ｈｂ試料をプロテアーゼで処理し、そのＨｂ分解物をＦＡＯＤ−αで処理し、同様に糖化量を求めることができる。

以上のような方法によれば、２箇所以上のアミノ酸残基における糖化量の測定を、同じ糖化Ｈｂ試料を用いて別々に行い、得られた糖化量を用いて、本発明の第１または第２の検出方法を前述のようにして行うことができる。一方、以下のような方法によれば、糖化量を測定するアミノ酸残基が２箇所以上であっても、同じ糖化Ｈｂ試料を用いて連続的に測定を行い、糖化量を求めることもできる。

リジンもしくはアルギニン側鎖の糖化量、およびＮ末端バリンの糖化量
リジンもしくはアルギニン側鎖の糖化量、およびＮ末端バリンの糖化量を連続的に測定する場合、ＦＡＯＤとしては、糖化されたアミノ酸残基側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ-Ｓと、糖化されたα-アミノ基に特異的に作用するＦＡＯＤ-αを使用することができる。

まず、糖化Ｈｂ試料にＦＡＯＤ-Ｓを添加し、このＦＡＯＤによりリジン残基側鎖またはアルギニン残基側鎖の糖化部分を酸化反応させ、その酸化反応を測定することにより、前記側鎖における糖化量を求める。この反応液に、さらにＦＡＯＤ−αを添加し、このＦＡＯＤ−αによりＮ末端バリンの糖化部分を酸化反応させ、その酸化反応を測定することにより糖化量を求める。このようにすれば、一つの反応系において、連続的に異なる２箇所以上のアミノ酸残基における糖化量を測定できるのである。

また、前述と同様に、各種ＦＡＯＤ処理に先立って、糖化Ｈｂ試料をプロテアーゼ処理によって分解しておくことが好ましい。例えば、前記ＦＡＯＤ−Ｓ処理の前に、予め、リジン残基またはアルギニン残基、もしくはこれらを含み、かつ、前記ＦＡＯＤ−Ｓが作用しやすい断片を遊離させることが好ましく、このようなプロテアーゼとしては、例えば、ズブチリシン、パパイン、ブロメライン、メタロプロティナーゼ等が使用あげられる。

また、前記ＦＡＯＤ-α処理前にも、さらに糖化Ｈｂ試料をプロテアーゼ処理することが好ましい。例えば、前記ＦＡＯＤ−α処理の前に、予め、Ｎ末端バリン、またはこれを含むペプチドであって、前記ＦＡＯＤ−αが作用しやすい断片を遊離させることが好ましく、このようなプロテアーゼとしては、例えば、アンギオテンシン変換酵素、ＧＡＲＥ（WO 00/050579号公報、WO 00-061732号公報記載）等が使用あげられる。

特にβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量を測定する場合には、前記ＦＡＯＤ−αとしては、前述のような商品名ＦＡＯＸ−ＴＥ（キッコーマン社製）が使用できる。そして、このＦＡＯＤ−αが作用し易い、バリンまたはこれを含むペプチド（Val-His、Val-His-Leu）断片を遊離させるプロテアーゼとして、例えば、プロティナーゼＫ等が使用できる。

なお、ＦＡＯＤ−ＳとＦＡＯＤ−αの処理順序は、逆であってもよい。すなわち、糖化Ｈｂ試料にＦＡＯＤ-αを添加し、このＦＡＯＤ−αによりＮ末端バリンの糖化部分を酸化反応させ、その酸化反応を測定することにより糖化量を求めた後、さらにＦＡＯＤ−Ｓを添加し、このＦＡＯＤ-Ｓによりリジン残基側鎖またはアルギニン残基側鎖の糖化部分を酸化反応させ、その酸化反応を測定することにより糖化量を求めることもできる。

本発明の検出方法において、使用する糖化Ｈｂ試料としては、特に制限されず、糖化Ｈｂを含有する全血試料、血球試料、溶血試料等があげられる。全血試料や血球試料については、界面活性剤を用いる方法、超音波による方法、浸透圧の差を利用する方法等、従来公知の溶血方法によって溶血処理を行い、溶血試料として使用すればよい。この中でも、操作の簡便性等の理由から、界面活性剤を用いる方法が好ましい。

前記界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレン-p-t-オクチルフェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンソルビタンアルキルエステル（Ｔｗｅｅｎ系界面活性剤等）、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（Ｂｒｉｊ系界面活性剤等）等の非イオン性界面活性剤が使用でき、具体的には、例えば、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｂｒｉｊ３５等があげられる。前記界面活性剤による処理条件は、通常、処理溶液中の血球濃度が１〜１０体積％の場合、前記処理溶液中の濃度が０．１〜１重量％になるように前記界面活性剤を添加し、室温で５秒〜１分程度攪拌すればよい。

また、前述のように糖化Ｈｂ試料にプロテアーゼ処理を施す場合、通常、緩衝液中で行われ、その処理条件は、使用するプロテアーゼの種類、糖化ヘモグロビンの量等により適宜決定される。

通常、反応液中のヘモグロビン濃度０．０５〜２００ｇ／リットル、反応温度１０〜６０℃、反応時間５分〜４０時間、ｐＨ５〜９の範囲である。また、前記緩衝液の種類も特に制限されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。

プロテアーゼとしてメタロプロテイナーゼを用いて、前記溶血試料を処理する場合、通常、反応液中のプロテアーゼ濃度１０〜２０００ＫＵ／リットル、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜４０ｇ／リットル、反応温度１５〜６０℃、反応時間１０分〜４０時間、ｐＨ６〜９の範囲である。前記緩衝液は、前述と同様のものが使用できる。また、他のプロテイナーゼも同様に使用できる。

糖化Ｈｂ試料をＦＡＯＤ処理する際も、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、同様のものが使用できる。

この処理条件は、例えば、反応液中のＦＡＯＤ濃度２００〜３０，０００Ｕ／リットル、反応液中のヘモグロビン濃度０．１〜１０ｇ／リットル、反応温度１５〜３７℃、反応時間１〜２０分、ｐＨ７〜９の範囲である。

糖化Ｈｂ試料の糖化部分を各種ＦＡＯＤにより酸化させる酸化反応の測定は、前述のようにＰＯＤおよび酸化により発色する基質を使用した過酸化水素量の測定であることが好ましい。

このＰＯＤを用いた過酸化水素量の測定は、通常、緩衝液中で行われ、その条件は、過酸化水素濃度等により適宜決定される。通常、反応液中のＰＯＤ濃度１〜２００００ＩＵ／リットル、基質濃度０．０００１〜１ｍｍｏｌ／リットル、反応温度２０〜３７℃、反応時間１〜５分、ｐＨ６〜９である。また、前記緩衝液は、特に制限されず、前記ＦＡＯＤ処理等と同様の緩衝液等が使用できる。なお、前記過酸化水素量は、前記ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、例えば、電気的手法により測定することもできる。

前記酸化により発色する基質を用いた場合は、その発色（反応液の吸光度）を分光光度計で測定することにより、過酸化水素の濃度を測定でき、これから前記試料中のヘモグロビン糖化量を測定できる。

本発明の検出方法において、糖化量の測定は、各処理工程を別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで同時に行ってもよい処理工程がある。また、前記ＦＡＯＤ、ＰＯＤおよび基質の添加順序も、特に制限されない。

１：溶血処理＋プロテアーゼ処理
２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
次に、本発明の検出方法を利用して、真のＨｂＡ_1c（％）を決定する方法について説明する。

従来の酵素法によれば、β鎖Ｎ末端バリンの糖化量に基づいてＨｂＡ_1c（％）が算出されるため、異常Ｈｂの影響により、前記糖化量自体が正確に測定されていない場合には、それから算出されるＨｂＡ_1c（％）も誤った値となる。例えば、糖化されているにも関わらず、Ｈｂの異常によって、酵素がその糖化部分と反応できなかったり、測定対象とするアミノ酸残基以外の部位が、変異によって酵素と反応するようになるため、そのような結果が生じていた。そこで、前述のように、異なる２箇所以上のアミノ酸残基における糖化量を測定する本発明の異常Ｈｂの検出方法を利用すれば、糖化Ｈｂ試料が異常Ｈｂであるか正常Ｈｂであるかを容易に検出するだけでなく、その糖化量の結果から、異常Ｈｂの影響を受けずに真のＨｂＡ１ｃ（％）を決定することができることを、本発明者らが見出したのである。

Ｈｂのサブユニット構成比に異常がある場合
本発明の検出方法、例えば、第２の検出方法を利用した一例を示す。まず、前述のような方法により、コントロールとなる正常Ｈｂについて、α鎖における一箇所のアミノ酸残基（X₁；例えば、リジン）の糖化量（x₁）と、β鎖における一箇所のアミノ酸残基（X₂；例えば、Ｎ末端バリン）の糖化量（x₂）とを測定し、その比率を求める（x₁：x₂）。一方、分析対象Ｈｂについて、同様にα鎖およびβ鎖のアミノ酸残基の糖化量（x_1'：x_2'）を測定する。そして、コントロールの比率（x₁：x₂）と分析対象Ｈｂの比率（x_1'：x_2'）とを比較することによって、両比率が同じであれば正常Ｈｂ、異なる場合には異常Ｈｂであると判断できる。

そして、正常Ｈｂと判断された場合には、測定した糖化量から得られるＨｂＡ_1c（％）が真のＨｂＡ_1c（％）と決定できる。なお、糖化量（x_1'）からＨｂＡ_1c（％）を求める場合には、標準ＨｂについてのＨｂＡ_1c（％）とアミノ酸残基（X₁）の糖化量（x₁）との検量線を用いて、また、糖化量（x_2'）からＨｂＡ_1c（％）を求める場合には、ＨｂＡ_1c（％）とアミノ酸残基（X₂）の糖化量（x₂）との検量線を用いて、算出することができる。なお、この場合、いずれの糖化量から算出したＨｂＡ_1c（％）も同程度の値となる。

一方、異常と判断された場合は、以下のようにして真の糖化量およびＨｂＡ_1c（％）が決定できる。正常Ｈｂは、αサブユニット：βサブユニットが２：２の構成比となる４量体（α2β2）である。したがって、前記正常Ｈｂの糖化量の比率（x₁：x₂）は、α２量体の糖化量とβ２量体の糖化量との比率といえる。そうすると、正常Ｈｂのα鎖（１量体）の糖化量は（x₁/2）、β鎖（１量体）の糖化量は（x₂/2）となるため、この１量体当たりの糖化量と、分析対象Ｈｂの糖化量比率（x_1'：x_2'）から、前記分析対象Ｈｂの構成比を求めることができる。

具体的に説明すると、例えば、正常Ｈｂの比率が（x₁：x₂）=10：8を示す場合、α１量体とβ１量体の比率は、［5：4］となる。一方、分析対象Ｈｂの比率が（x_1'：x_2'）=15：4を示した場合、分析対象Ｈｂの構成比は、α：β＝15/5：4/4（すなわち３：１）となる。このような計算により、分析対象Ｈｂが、α３量体、β１量体から形成される異常Ｈｂであることがわかる。そして、このようにαサブユニットが３量体、βサブユニットが１量体であることから、x_1'、x_2'より、真の糖化量がそれぞれ 2/3*(x_1')および 2*(x_2')として算出できる。このように真の糖化量が算出できるため、さらに、これらの値から真の糖化率、真のＨｂＡ_1c（％）を算出できるのである。

Ｈｂのサブユニット構造に異常がある場合
次に、βサブユニットに代えてγサブユニットを有する異常Ｈｂ（α２γ２）の真のＨｂＡ_1c（％）を決定する方法の一例を説明する。

γサブユニットは、βサブユニットに類似した配列構造を示すが、Ｎ末端がＶａｌではなくＧｌｙに変化している。このため、β鎖のアミノ酸残基（Ｎ末端バリン）について糖化量（x_1'）を測定しても、１つのβ鎖がγ鎖に変化した場合には、１量体に対応する糖化量しか検出されず、２つのβ鎖がともにγ鎖に変化した場合には、β鎖における糖化量は検出されない。一方、α鎖のアミノ酸残基（例えば、リジン）について糖化量を測定した場合、Ｈｂはαサブユニットの２量体を維持するため、正しい糖化量（x_2'）を示すこととなる。このため、コントロールである正常なＨｂについての、β鎖N末端バリンの糖化量(x₁)と、α鎖リジンの糖化量（x₂）との比率（x₁:x₂）に対して、異なる挙動を示すことから、異常Ｈｂであるとの判断ができる。そして、この正常Ｈｂについての比率と、分析対象Hbの比率とから、α鎖もしくはβ鎖の１量体当たりの糖化量を導くことができるため、その糖化量から真の糖化率、真のＨｂＡ_1c（％）を算出できるのである。

以上のように、本発明の検出方法によれば、例えば、酵素法によって容易かつ簡便に異常Ｈｂであるか否かを検出できる。また、この検出方法を利用することによって、真のＨｂＡ_1c（％）を決定することができ、ＨｂＡ_1c（％）の糖尿病の指標としての信頼性を向上することができる。

Claims

予め、正常ヘモグロビンにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基(X₁〜X_n；ｎは２以上の整数)の糖化量のうち、いずれか１つのアミノ酸残基（X₁）の糖化量を基準値（x₁）として、前記基準値（x₁）と他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x₂〜x_n）との比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）をそれぞれ求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象ヘモグロビンにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定したアミノ酸残基（X₁）の糖化量（x_1'）と、測定した他のアミノ酸残基（X₂〜X_n）の糖化量（x_2'〜x_n'）から前記比率（x₁：x₂〜x₁：x_n）を用いて換算したアミノ酸残基（X₁）の換算糖化量（x_2''〜x_n''）とを比較し、両者が異なれば異常ヘモグロビン、両者が一致すれば正常ヘモグロビンとする異常ヘモグロビンの検出方法。
予め、正常ヘモグロビンにおける異なる２箇所以上のアミノ酸残基の糖化量から、それらの比率を求めておき、
前記異なる２箇所以上のアミノ酸残基と同じアミノ酸残基について、分析対象ヘモグロビンにおける糖化量をそれぞれ測定し、測定した糖化量からそれらの比率を求め、この比率と、前記正常ヘモグロビンにおける比率とを比較し、前記両比率が一致すれば正常ヘモグロビン、両比率が相違すれば異常ヘモグロビンとする異常ヘモグロビンの検出方法。