JP4352154B2 - 糖化ヘモグロビンの選択的測定方法 - Google Patents
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R1−CO−CH2−NH−R2 + H2O + O2
→ R1−CO−CHO + NH2−R2 + H2O2 ・・・(1)
前記式(1)において、R1−CO−CH2−NH−R2 は、例えば、糖化タンパク質、糖化ペプチドおよび糖化アミノ酸である。前記式(1)において、R1は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基(糖残基)を示す。前記糖残基(R1)は、糖化反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、糖化反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、糖化反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、糖化反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基(R1)は、グルコース残基(アルドース残基)となる。この糖残基(R1)は、例えば、
−[CH(OH)]n−CH2OH
で示すことができ、nは、0〜6の整数である。
前記式(1)において、R2は、特に制限されないが、α−アミノ基が糖化されている場合と、それ以外のアミノ基が糖化されている場合とで異なる。
−CHR3−CO−R4 ・・・(2)
前記式(2)において、R3はアミノ酸側鎖基を示し、また、R4は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式(3)で表わすことができる。下記式(3)において、nは、0以上の整数であり、R3は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示す。
−(NH−CR3H−CO)n−OH ・・・(3)
−CH2−CH2−CH2−CH2−
であり、
例えば、糖化されたアミノ酸がアルギニンの場合、R5は、
−CH2−CH2−CH2−NH−CH(NH2)−である。
−(CO−CR3H−NH)n−H ・・・(5)
−(NH−CHR3−CO)n−OH ・・・(6)
1 : 溶血処理+プロテアーゼ処理
2 : プロテアーゼ処理+FAOD処理
3 : FAOD処理+POD処理
また、前記FAOD、PODおよび前記基質の添加順序も、特に制限されない。
糖化率22.5%のヒト血清アルブミン(シグマ社製)
糖化率14%のヒトヘモグロビン
健常者の全血を遠心分離(1500G、10分)して血球を回収し、これを生理食塩水で数回洗浄した後、ほぼ当量の精製水を添加して血球を溶血させた。この溶血液を遠心分離して血球膜を除去したものを、商品名GLYCO・GELII(ピアス社製)に供し、常法により糖化タンパク質含有画分を分取したものをヒトヘモグロビン試料とした。
FAOD(旭化成工業社製、以下同じ) 2.09KU/L
POD(TypeIII:東洋紡績社製、以下同じ) 730U/L
N−(カルボキシメチルアミノカルボニル)−4,4−ビス(ジメチルアミノ)ジフェニルアミンナトリウム
(商品名DA64:和光純薬工業社製、以下同じ) 1.46mmol/L
Tris−HCl緩衝液(pH8.0) 73mmol/L
前記各試料(ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン)1mLに、1KU/Lのパパイン(シグマ・アルドリッチ社製)1mLを添加し、40℃で24時間反応させた。そして、これらの溶液0.018mLに前記酸化還元反応液A 0.15mLをそれぞれ添加して酸化還元反応を開始し、反応開始5分後の各反応液の主波長694nm、副波長884nmにおける吸光度を、生化学自動分析装置(商品名JCA−BM8 :日本電子社製、以下同じ)を用いて測定した。これらの結果を下記表1に示す。
パパインの代わりに1g/Lのα−キモトリプシン1mLを用いた以外は、前記実施例1と同様にして前記各試料(ヒト血清アルブミン、ヒトヘモグロビン)を処理して吸光度の測定を行った。これらの結果を下記表1に示す。
試料として全血、血漿、血球をそれぞれ用い、各種プロテアーゼで処理し、糖化ヘモグロビンの測定を行った。
ヘパリンナトリウム入り採血管を用いて健常者から全血を採取し、これに精製水を加えて8倍希釈して、前記全血中の血球を溶血させたものを全血試料とした。
前記健常者の全血を遠心分離(1500G、10分)して血球を分離除去し、得られた上清に精製水を添加して8倍希釈したものを血漿試料とした。
前記遠心分離により得られた血球に、精製水を加えて16倍に希釈し、前記血球を溶血させたものを血球試料とした。
ブロメライン、パパイン(ロッシュ社製)、エラスターゼ(和光純薬工業社製)、α−キモトリプシン(和光純薬工業社製)、プロテナーゼK(和光純薬工業社製)を精製水に溶解し、濃度4g/Lの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
POD 20KU/L
商品名DA64 0.04mmol/L
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1mol/L
FAOD 14.3KU/L
リン酸カリウム緩衝液(pH7.0) 0.1mol/L
前記各試料0.2mL、前記プロテアーゼ溶液0.1mLおよびリン酸カリウム緩衝液(pH7.0)0.7mLを混合し、37℃で24時間反応させた。反応後、各反応液を商品名ウルトラフリー4ユニット5K(ミリポア社製)に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記各ろ液25μLに、前記酸化還元反応液B45μLを添加し、5分後に、さらに前記酸化還元反応液C20μLを添加して反応を開始し、反応開始5分後の各反応液の主波長694nm、副波長884nmにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。この結果を下記表2に示す。なお、ブロメラインおよびパパインは実施例3であり、エラスターゼ、α−キモトリプシン、プロテナーゼKは比較例2である。
精製水にHbA1c標準試薬(SRL社製)を溶解して、HbA1c濃度がそれぞれ4.3%、7.8%、11.2%、14.7%であり、かつ、ヘモグロビン濃度が10g/Lである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。また、精製水にHbA1c標準試薬(国際試薬社製)を溶解して、HbA1c濃度がそれぞれ5.5%、10.8%であり、かつ、ヘモグロビン濃度が10g/Lである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
各種プロテアーゼを精製水に溶解して、濃度2g/LのブロメラインF(天野エンザイム株式会社製)溶液および濃度1g/Lのパパイン(ロッシュ社製)溶液を調製した。
各濃度の糖化ヘモグロビン標準液0.5mL、プロテアーゼ溶液0.4mLおよび1.0mol/L リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)0.1mlを混合し、37℃で24時間反応させた。反応後、前記反応液を商品名ウルトラフリーMC 分子量5000(ミリポア社製、以下同じ)に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液25μLを精製水によって2倍希釈した後、この希釈液に前記酸化還元反応液B45μLを添加し、5分後、さらに前記酸化還元反応液C20μLを添加して反応を開始した。そして、反応開始5分後の各反応液の主波長694nm、副波長884nmにおける吸光度を、前記生化学自動分析装置を用いて測定した。これらの結果を下記表3および図1のグラフに示す。
採取した健常者および糖尿病患者の全血(合計12検体)をそれぞれ約6時間静置して赤血球を沈降させ、これら血球画分0.1mLに0.05重量%TritonX−100水溶液を1.4mL添加して溶血させたものを溶血試料とした。
0.05重量%TritonX−100水溶液に、HbA1c標準試薬(国際試薬社製)を溶解して、HbA1c濃度(%)がそれぞれ5.5%、10.5%であり、かつ、ヘモグロビン濃度が200g/Lである糖化ヘモグロビン標準液を調製した。
メタロプロテイナーゼ(東洋紡績社製)、商品名プロテアーゼN「アマノ」(天野エンザイム株式会社製)およびパパイン(ロシュ社製)を精製水に溶解して、濃度1g/Lの各種プロテアーゼ溶液をそれぞれ調製した。
POD 20KU/L
商品名DA−64 0.04mmol/L
リン酸緩衝液(pH8.0) 0.8mol/L
FAOD 14.3KU/L
リン酸カリウム緩衝液(pH8.0) 0.1mmol/L
サンプル0.2mL、プロテアーゼ溶液0.16mLおよび0.1mol/L リン酸カリウム緩衝液(pH8.0)0.04mLを混合し、37℃で36時間反応させた。反応後、前記反応液を前記商品名ウルトラフリーMC分子量5000に供して遠心分離を行い、ろ液を回収した。前記ろ液25μLを精製水によって2倍希釈した後、この希釈液に酸化還元反応液D45μLを添加し、5分後に酸化還元反応液E20μLを添加して反応を開始した。そして、反応開始2分後の反応液の主波長751nm、副波長884nmにおける吸光度測定を行った。この測定値は、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度である。
商品名ヘモグロビンテストワコー(和光純薬工業社製)を用いてシアンメトヘモグロビン法により、サンプルのヘモグロビン濃度を測定した。
前記各標準液について、自動測定器(商品名HA−8150:アークレイ株式会社製)を用いてHbA1c濃度(%)を測定した。一方、前記各標準液について、本発明の前記ヘモグロビン糖化量の測定方法により、ヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度の測定を行い、また、前記ヘモグロビン濃度測定方法によりヘモグロビン濃度を測定した。そして、前記ヘモグロビン糖化量に相当する吸光度をヘモグロビン濃度で割った値の百分率(%)と、前記自動測定器による測定値(%)とから一次回帰式を作成し、これを検量線とした。前記百分率は、ヘモグロビン糖化率(%)に比例する。以下に、前記各プロテアーゼを使用した場合の検量線の式を示す。
プロテアーゼ 一次回帰式
メタロプロテイナーゼ y=15846x+3.2
プロテアーゼN「アマノ」 y=16659x+3.3
パパイン y=17258x+3.4
前記各溶血試料について、前記ヘモグロビン糖化率の測定方法によりヘモグロビンの糖化量に相当する吸光度測定を行い、前記ヘモグロビン濃度の測定方法によりヘモグロビン濃度の測定を行った。そして、前記糖化量に相当する吸光度を前記ヘモグロビン濃度で割った百分率をヘモグロビン糖化率とし、これを前記各検量線に代入することにより前記試料中のHbA1c量を求めた。また、対照として、前記各試料について前記自動測定器によりHbA1c量を測定した。これらの結果を図2に示す。図2は、本発明の測定方法により検量線から求めたHbA1c量と、前記自動測定器で測定したHbA1c量との相関関係を示すグラフである。
採取した健常者(1検体)および糖尿病患者の全血(合計検体:患者検体、患者検体2)を遠心分離(1000g、約15分間)し、各検体の血球画分および血漿画分を回収した。そして、検体毎に、血球画分0.01mLに、血漿画分を所定量(0mL、0.005mL、0.010mL、0.015mL、0.020mL)添加し、この混合液に下記溶血試薬0.3mLをそれぞれ加えて溶血させたものを溶血試料とした。
ポリオキシエチレンラウリルエーテル 9g/L
CHES緩衝液(pH9.4) 100mmol/L
メタロプロテイナーゼ(東洋紡績社製) 4000KU/L
WST−3(同仁化学社製) 2mmol/L
MES 5mmol/L
CaCl2 5mmol/L
NaCl 50mmol/L
※ WST−3:2−(4−ヨードフェニル)−3−(2,4−ジニトロフェニル)−5−(2,4−ジスルフォフェニル)−2H−テトラゾリウム モノソディウム塩
FAOD 30KU/L
POD 90KU/L
DA−64 0.06mmol/L
リン酸緩衝液(pH7.0) 200mmol/L
Claims (4)
- ヘモグロビン糖化量の測定方法であって、
溶血試薬を用い、全血、全血を静置沈降させた血球画分、及び、全血由来の血球と血漿との混合物からなる群から選択される試料を溶血して血球成分と血漿成分とが混合した溶血試料を調製する工程、
前記溶血試料において選択的に糖化ヘモグロビンを分解可能なプロテアーゼであるメタロプロテアーゼ(エキソ型プロテアーゼを除く)を用いて前記溶血試料をプロテアーゼ処理して糖化ヘモグロビン分解物を得る工程、及び、
前記プロテアーゼ処理物を、前記糖化ヘモグロビン分解物に含まれるα−アミノ基糖化部分及び側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して過酸化水素を生成する反応を触媒する糖化アミノ酸酸化還元酵素と反応させる工程を含む、ヘモグロビン糖化量の測定方法。 - 請求項1記載の測定方法によるヘモグロビン糖化量とHbA1c量との相関関係から全血試料中におけるHbA1c量を求める工程を含む、HbA1cの測定方法。
- ヘモグロビン糖化量の測定キットであって、
全血、全血を静置沈降させた血球画分、及び、全血由来の血球と血漿との混合物からなる群から選択される試料を溶血して血球成分と血漿成分とが混合した溶血試料を調製するために使用する溶血試薬と、
前記溶血試料において選択的に糖化ヘモグロビンを分解して糖化ヘモグロビン分解物を得るためのプロテアーゼであるメタロプロテアーゼ(エキソ型プロテアーゼを除く)を含むプロテアーゼ試薬と、
前記糖化ヘモグロビン分解物に含まれるα−アミノ基糖化部分及び側鎖アミノ基糖化部分の少なくとも一方に作用して過酸化水素を生成する反応を触媒する糖化アミノ酸酸化還元酵素とを含む、ヘモグロビン糖化量の測定キット。 - HbA1c測定のために使用する請求項3記載のヘモグロビン糖化量の測定キット。
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