JP4861986B2 - タンパク質の切断方法およびその用途 - Google Patents
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Description
本発明は、タンパク質の切断方法、および、それを用いたタンパク質糖化率の測定方法に関する。
生体の状態を示す指標として、各種タンパク質の糖化率が測定されている。中でも、血球中のヘモグロビン（Ｈｂ）の糖化率、特にＨｂＡ１ｃは、生体内血糖値の過去の履歴を反映していることから、糖尿病の診断や治療等における重要な指標とされている。ＨｂＡ１ｃは、ＨｂＡ（α２β２）のβ鎖Ｎ末端アミノ酸（バリン）にグルコースが結合しており、その糖化率（％）は、総Ｈｂ量に対するＨｂＡ１ｃ量の割合（％）で表される。
ＨｂＡ１ｃは、一般に、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法、免疫法、酵素法、電気泳動法等によって測定されており、例えば、ＨｂＡ１ｃのリファレンス測定として、プロテアーゼＧｌｕ−ＣによりＨｂのβ鎖Ｎ末端の６ペプチドとその糖化物である糖化６ペプチドとを切り出し、これをＨＰＬＣで分離精製した後、キャピラリー電気泳動またはＬＣ−ＭＳで定量を行う方法が開示されている（非特許文献１）。また、中でも酵素法は、例えば、以下のような測定方法である。まず、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以下、「ＦＡＯＤ」という）をＨｂの糖化部分に作用させ、過酸化水素を発生させる。この過酸化水素量は、前記Ｈｂの糖化量に対応する。この反応液に、さらにペルオキシダーゼ（以下、「ＰＯＤ」という）と酸化により発色する発色基質とを添加し、ＰＯＤを触媒として過酸化水素と発色基質との間で酸化還元反応させる。そして、前記発色基質の発色程度を測定して糖化量を求め、糖化量と総Ｈｂ量とからＨｂＡ１ｃ（％）を算出できる。
前述のように、ＨｂＡ１ｃは、β鎖Ｎ末端バリンの糖化が特徴であるため、ＦＡＯＤがＮ末端糖化バリンに効率良く作用することが望まれている。しかしながら、ＦＡＯＤはタンパク質に直接作用し難いため、通常、プロテアーゼ処理によってＨｂのβ鎖Ｎ末端を切り出し、これにＦＡＯＤを作用させる方法が試みられている。具体的には、エンド型およびエキソ型プロテアーゼ（特許文献１）、セリンカルボキシペプチダーゼ（特許文献２）、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸を遊離させるプロテアーゼ（特許文献３〜５）、α鎖Ｎ末端よりβ鎖Ｎ末端の糖化アミノ酸または糖化ペプチドを切り出す作用が強いプロテアーゼ（特許文献６）等を用いる方法が報告されている（特許文献７〜１０）。また、尿素を添加してヘモグロビンを煮沸により変性させてプロテアーゼで処理する方法も報告されている。
しかしながら、これらの方法によっては、プロテアーゼ処理に長時間を要してしまい、検査を迅速に行うことが困難である。前述のキャピラリー電気泳動やＬＣ−ＭＳのためのプロテアーゼ処理においても、３７℃で１８時間の処理が必要と報告されている。また、プロテアーゼ処理の短縮化として、例えば、ｐＨ３の酸性条件下、モルシンにより１時間程度で処理を行う例が開示されているが（特許文献１１）、酵素反応を行うには中性付近が好ましく、そのような条件での処理については開示されていない。また、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端以外の糖化率を測定する場合も、前述のＨｂＡ１ｃと同様に、切断の迅速性に問題がある。
梅本雅夫、「ＨｂＡ１ｃの国際標準化に目ざすＩＦＣＣ法」臨床検査、Ｖｏｌ．４６、Ｎｏ．７、２００２年７月
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そこで、本発明は、プロテアーゼによりタンパク質からアミノ酸またはペプチドを効率良く切り出す方法、それを用いたタンパク質の糖化率の測定方法、ならびに、それに用いる促進剤の提供を目的とする。
本発明はプロテアーゼによってタンパク質からアミノ酸またはペプチドを切断する方法であって、下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することを特徴とする。下記式において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、糖残基である。
Ｒ−Ｘ ・・・（Ｉ）
また、本発明は、タンパク質をプロテアーゼで切断する工程、得られたタンパク質切断物の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる工程、および、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、タンパク質の糖化率を決定する工程を含むタンパク質の糖化率の測定方法であって、前記タンパク質の切断を、本発明のタンパク質の切断方法により行い、得られたアミノ酸またはペプチドの糖化部分に前記ＦＡＯＤを作用させることを特徴とする。
また、本発明は、タンパク質をプロテアーゼで切断する工程、得られたタンパク質切断物の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる工程、および、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、タンパク質の糖化率を決定する工程を含むタンパク質の糖化率の測定方法であって、前記タンパク質の切断を、本発明のタンパク質の切断方法により行い、得られたアミノ酸またはペプチドの糖化部分に前記ＦＡＯＤを作用させることを特徴とする。
さらに、本発明の促進剤は、プロテアーゼによるタンパク質からのアミノ酸またはペプチドの切断を促進する促進剤であって、前記式（Ｉ）で表される化合物を含むことを特徴とする。
本発明のタンパク質切断方法によれば、メカニズムは不明であるが、前記式（Ｉ）で表される化合物（以下、「促進化合物」ともいう）の存在下、タンパク質をプロテアーゼ処理することによって、短時間でアミノ酸またはペプチドを切り出すことができる。また、糖化率の測定において、各タンパク質に特徴的な部分を従来法よりもさらに迅速に切り出すことができる。このため、本発明の切断方法によってタンパク質を処理すれば、プロテアーゼ処理の短縮化や、各糖化タンパク質に特徴的な糖化アミノ酸やペプチドの切り出しを効率的に行えることから、ＦＡＯＤを特徴的な糖化部分（例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端バリン、または、リジン等の糖化部分）に作用させ易く、糖化率の測定精度も向上する。したがって、このような本発明の切断方法および糖化率測定方法は、例えば、糖尿病の診断や治療等、医療分野において極めて有用であるといえる。また、このように前記化合物が糖化タンパク質の切断を促進することは本発明者らが初めて見出したことであるため、前記式（Ｉ）で表される化合物を含む本発明の促進剤は、前述のような医療分野において極めて有用な試薬となる。
１．タンパク質の切断方法
以下に、本発明において使用する下記式（Ｉ）で表される促進化合物について説明する。
以下に、本発明において使用する下記式（Ｉ）で表される促進化合物について説明する。
Ｒ−Ｘ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基（例えば、シクロアルキルの炭素数が３〜８であり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が４〜１３）等があげられる。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。
前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基である。具体例としては、炭素数９〜１６の直鎖アルキル基もしくは直鎖アシル基、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキル基もしくは分枝鎖アシル基、または、シクロアルキルで置換された直鎖アルキル基（例えば、シクロアルキルの炭素数が３〜８であり、シクロアルキルを除く直鎖の炭素数が４〜１３）等があげられる。前記シクロアルキルは、例えば、シクロヘキシル、シクロペンチル、シクロブチル等があげられる。
前記式（Ｉ）において、Ｘは、糖残基であり、例えば、単糖または二糖の残基であることが好ましい。前記単糖としては、例えば、マンノシド、グルコシド、チオグルコシド等、二糖としては、マルトシド、フルクトピラノシル−グルコピラノシド、チオマルトシド等があげられる。これらの糖の構造は、α、β、Ｄ、Ｌのいずれでもよい。また、糖の環式構造に結合する水素や、ＯＨ基の水素は、例えば、Ｎａ、Ｋ、ハロゲン等で置換されてもよい。なお、本発明において、Ｒと糖残基の環式構造との結合を介している原子（例えば、−Ｏ−、−Ｓ−等）は、糖残基の構成要素とする。
本発明における前記促進化合物の具体例としては、例えば、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、６−シクロヘキシルヘキシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート（β−Ｄ−フルクトピラノシル−α−Ｄ−グルコピラノシドモノドデカノエート）、ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−デシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）、ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド（ｎ−ノニル−β−Ｄ−チオマルトシド）、５−シクロヘキシルペンチル−β−Ｄ−マルトシド、ウンデシル−β−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−αβ−Ｄ−マルトシド、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド、および、３−オキサトリデシル−α−Ｄ−マンノシド等があげられる。これらの化合物の化学式を以下に示す。
これらの中でも、前記式（Ｉ）におけるＲ（アルキル鎖）の炭素数が１２以上である、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート、ヘキサデシル−β−Ｄ−マルトシド等が好ましい。また、Ｒの炭素数が同じ場合（例えば、炭素数が同じアルキル基とアシル基）、より好ましくはアシル基であり、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトピラノシド）が好ましい。
本発明の糖化タンパク質の切断方法は、前述のように、プロテアーゼによってタンパク質からアミノ酸またはペプチドを切断する方法であって、前記式（Ｉ）で表される促進化合物の存在下、タンパク質をプロテアーゼ処理することを特徴とする。このように、プロテアーゼ処理を前記促進化合物の存在下で行うことによって、非存在でのプロテアーゼ処理よりも、アミノ酸やペプチドの切り出しを効率良く行うことができる。このため、例えば、処理に使用するプロテアーゼの増量も不要となる。このようにタンパク質からアミノ酸またはペプチドを効率良く切断できるメカニズムは不明であるが、前記促進化合物を共存させることにより、タンパク質がプロテアーゼで処理され易い構造に変化していると推測される。なお、本発明において、切断対象を「タンパク質」としているが、部分的に糖化されたタンパク質も含み、本発明の切断方法は、後述するようにタンパク質の糖化率測定に適用できる。
本発明において、切断対象のタンパク質は特に制限されないが、例えば、ヘモグロビン（Ｈｂ）が好ましい。Ｈｂからプロテアーゼによって切り出されるアミノ酸やペプチドは、特に制限されず、使用するプロテアーゼによって適宜決定できる。後述する糖化率の測定を前提とした場合、前記アミノ酸は、通常、β鎖Ｎ末端バリン、リジンまたはこれらの糖化物である。β鎖Ｎ末端の糖化バリン（フルクトシルバリン）は、そのα−アミノ基が糖化されており、糖化リジンは、ε−アミノ基が糖化されている。また、ペプチドは、通常、β鎖Ｎ末端バリンを含むペプチド（以下、「β鎖Ｎ末端ペプチド」ともいう）や、リジンを含むペプチド（以下、「リジンペプチド」ともいう）である。切り出されるペプチドの長さは、特に制限されず、タンパク質の種類や使用するプロテアーゼによって適宜設定できるが、Ｈｂの場合、アミノ酸残基数が、例えば、２〜６であり、より好ましくは２〜４であり、具体的には、フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ、フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ、フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ等である。
本発明は、前述のように、前記促進化合物存在下でのプロテアーゼ処理によって、タンパク質からアミノ酸やペプチドを効率良く切断できることが特徴であって、使用するプロテアーゼの種類は特に制限されない。すなわち、切断対象のタンパク質や切り出されるアミノ酸やペプチドの種類に応じて、プロテアーゼを適宜決定できる。
前記プロテアーゼとしては、例えば、メタロプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、セリンカルボキシペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ブロメライン、パパイン、ブタ膵臓由来トリプシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来プロテアーゼ、Ａｓｐｅｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚａｅ由来プロテアーゼ等が使用でき、好ましくはエンドプロテアーゼである。市販品としては、例えば、メタロプロテアーゼ（アークレイ社製）、プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製）、ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製）、パパインＭ−４０（天野エンザイム社製）、商品名プロテアーゼＮ（フルカ社製）、商品名プロテアーゼＮ「アマノ」（天野製薬社製）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ属由来メタロプロテイナーゼ（東洋紡社製：商品名トヨチーム）、エンドプロテイナーゼＧｌｕ−Ｃ（ロシュ社製）等があげられる。
特に、タンパク質がＨｂであって、β鎖Ｎ末端ペプチドを切り出す場合には、β鎖Ｎ末端に特異的に作用してＮ末端ペプチドの切断を触媒するプロテアーゼ（例えば、特開２０００−３００２９４号公報、特開２００４−３４４０５２号公報等）が好ましい。このプロテアーゼを前記促進化合物の存在下で使用すれば、例えば、タンパク質においてβ鎖Ｎ末端バリン以外が糖化されていても（例えば、側鎖基（ε−アミノ基）が糖化されたリジンやアルギニン等）、極めて迅速且つ特異的にβ鎖Ｎ末端ペプチドの切断を行うことができる。また、β鎖Ｎ末端バリンの切断を触媒するプロテアーゼとしては、例えば、国際公開第２０００／５０５７９号パンフレット（日本国特許３６６８８０１）、国際公開第２０００／６１７３２号パンフレット、特開２００２−３１５６００号公報等に開示されているプロテアーゼがあげられる。
タンパク質がＨｂであって、リジンもしくはリジンを含むペプチドを切り出す場合には、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレットに記載のプロテアーゼ等が好ましい。このプロテアーゼを前記促進化合物の存在下で使用すれば、極めて迅速且つ特異的にリジンもしくはリジンを含むペプチドの切断を行うことができる。
また、タンパク質がＨｂであって、プロテアーゼが、β鎖Ｎ末端アミノ酸もしくはペプチドと、リジンもしくはリジンペプチドとの両方を切り出す場合、前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理すると、いずれの切り出しも促進されるが、特に、リジンやリジンペプチドの切断促進（例えば、数倍）よりも、β鎖Ｎ末端の切断促進（数倍から数十倍）が顕著にみられる。これによって、特にβ鎖Ｎ末端の切断物を得ることが可能となる。したがって、前記両者を同様に切り出すプロテアーゼであっても、促進化合物の併用によって、リジンやリジンペプチドよりも多くのβ鎖Ｎ末端切断物（例えば、約１０倍以上）を得ることができるため、バリンのα位アミノ基の糖化に対応するＨｂＡ１ｃを、リジンやリジンペプチドの影響を抑制して測定することが可能となる。
本発明のタンパク質の切断方法は、例えば、タンパク質を含む試料に、前記促進化合物とプロテアーゼとを添加することによって行える。なお、前記促進化合物とプロテアーゼの添加順序は何ら制限されず、同時でもよいし、それぞれを順不同で添加することもできる。
前記試料は、特に制限されず、目的のタンパク質が含まれる試料があげられる。中でも、後述するようにＨｂの糖化率測定に適用する場合は、例えば、全血試料、血球試料、それらの溶血試料等があげられる。全血試料や血球試料の溶血方法は、特に制限されず、例えば、浸透圧差を利用する方法、超音波による方法等が使用できる。浸透圧差を利用する場合、全血（または血球）に対して、例えば、２〜１００倍体積量の精製水を添加して溶血させればよい。また、界面活性剤を試料に添加して溶血することもできる。
プロテアーゼ処理の反応液における前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．０１〜２００ｍＭの範囲であり、好ましくは０．４〜１００ｍＭである。前記反応液中のタンパク質濃度（例えば、Ｈｂ濃度）が０．００５ｍＭの場合、前記促進化合物の添加割合は、例えば、０．４〜１００ｍＭの範囲であり、好ましくは１〜１００ｍＭである。
前記反応液におけるプロテアーゼの添加割合は、例えば、０．００１〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０１〜３０，０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１０００ＫＵ／Ｌである。前記反応液中のタンパク質濃度（例えば、Ｈｂ）が０．００５ｍＭの場合、プロテアーゼの添加割合は、例えば、０．０１〜３００，０００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．０５〜３０，０００ＫＵ／Ｌであり、特に好ましくは０．１〜１０，０００ＫＵ／Ｌである。
プロテアーゼ処理の条件は特に制限されないが、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間は制限されず、特に上限は制限されず、例えば、０．１〜６０分程度でプロテアーゼ処理を行うことが可能である。処理時間は、好ましくは０．１〜４５分、より好ましくは０．２〜２０分であり、特に好ましくは０．２〜５分である。本発明は、従来の方法と異なり、前記式（Ｉ）で表される促進化合物存在下でプロテアーゼ処理を施すことによって迅速にアミノ酸やペプチドの切り出しを行えるため、前述のような処理時間であっても十分に切断処理が可能である。従来の方法によれば、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端の切断に、通常、２〜２４時間のプロテアーゼ処理が必要であることからも、極めて迅速に切断できることがわかる。
前記プロテアーゼ処理は、例えば、緩衝液中で行うことが好ましく、トリス塩酸緩衝液、ＥＰＰＳ緩衝液、ＰＩＰＥＳ緩衝液、リン酸緩衝液、ＡＤＡ緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液等が使用できる。また、プロテアーゼ反応液のｐＨは、例えば、４〜１０の範囲であり、好ましくは６〜９であり、例えば、前述のような緩衝液によってｐＨを調整してもよい。
また、本発明のタンパク質の切断方法においては、前記促進化合物の他にさらにニトロ化合物を加えた条件下でプロテアーゼ処理を行ってもよい。このニトロ化合物としては、例えば、亜硝酸やその塩があげられる。亜硝酸塩としては、特に制限されないが、例えば、亜硝酸カリウム、亜硝酸アミル、亜硝酸ブチル、ニトログリセリン、亜硝酸ナトリウム、パラニトロクロルベンゼン、トリニトロトルエン、ニトロベンゼン等があげられる。プロテアーゼ処理の反応液における前記ニトロ化合物の添加割合は、特に制限されないが、例えば、前記反応液中のタンパク質濃度（例えば、Ｈｂ濃度）が０．００５ｍＭの場合、前記ニトロ化合物の添加割合は、例えば、０．００５ｍＭ以上が好ましく、より好ましくは０．０５〜２ｍＭである。
本発明のタンパク質の切断方法は、このようにタンパク質のアミノ酸やペプチドを効率良く切り出すことができるため、前述のような酵素法によるタンパク質糖化率の測定方法に有用である。さらに、酵素法には限られず、例えば、切り出した糖化アミノ酸や糖化ペプチドを抗原とする免疫法にも有用であり、また、ＨＰＬＣ法や電気泳動法での分離を向上することも可能である。したがって、タンパク質の糖化率の各種測定方法において、測定試料の処理工程として極めて有用である。また、Ｈｂは、前述のように、β鎖Ｎ末端バリンの糖化量からＨｂＡ１ｃ値を求めることができ、また、リジンの糖化量からＬｙｓ糖化率（ＧＨｂＬｙｓ値）を求めることができる。このため、本発明の切断方法によって、前述のように、Ｈｂからβ鎖Ｎ末端バリンやそれを含むペプチド、リジンやそれを含むペプチドを切り出せば、Ｈｂの糖化率をさらに精度良く測定できる。
２．糖化率の測定方法
本発明のタンパク質の糖化率の測定方法は、前述のように、タンパク質をプロテアーゼで切断する工程、得られたタンパク質切断物の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる工程、および、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、タンパク質の糖化率を決定する工程を含むタンパク質の糖化率の測定方法であって、前記タンパク質の切断を、本発明のタンパク質の切断方法により行い、得られたアミノ酸またはペプチドの糖化部分に前記ＦＡＯＤを作用させることを特徴とする。
本発明のタンパク質の糖化率の測定方法は、前述のように、タンパク質をプロテアーゼで切断する工程、得られたタンパク質切断物の糖化部分にＦＡＯＤを作用させる工程、および、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することにより、タンパク質の糖化率を決定する工程を含むタンパク質の糖化率の測定方法であって、前記タンパク質の切断を、本発明のタンパク質の切断方法により行い、得られたアミノ酸またはペプチドの糖化部分に前記ＦＡＯＤを作用させることを特徴とする。
（ＨｂＡ１ｃの測定方法）
本発明のタンパク質の糖化率の測定方法について、糖化ＨｂのＨｂＡ１ｃを測定する例をあげて説明する。
本発明のタンパク質の糖化率の測定方法について、糖化ＨｂのＨｂＡ１ｃを測定する例をあげて説明する。
糖化ＨｂのＨｂＡ１ｃを測定する場合、プロテアーゼによるＨｂ切断物は、β鎖Ｎ末端糖化バリンまたは前記糖化バリンを含むペプチドであって、β鎖Ｎ末端バリンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させればよい。なお、切り出すアミノ酸やペプチドは、前述のように、使用するプロテアーゼの種類の選択によって決定できる。
ＨｂＡ１ｃの測定方法に使用するＦＡＯＤは、特に制限されないが、α−アミノ基が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して、α−ケトアルデヒドおよび過酸化水素を発生する反応を触媒する酵素（以下、「ＦＡＯＤ−α」という）が好ましい。このような触媒反応は、例えば、下記式（１）で表すことができる。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１）
前記式（１）において、Ｒ１は、水酸基もしくは糖化反応前の糖に由来する残基（糖残基）を意味する。前記糖残基（Ｒ１）は、反応前の糖がアルドースの場合はアルドース残基であり、反応前の糖がケトースの場合、ケトース残基である。例えば、反応前の糖がグルコースの場合は、アマドリ転位により、反応後の構造はフルクトース構造をとるが、この場合、糖残基（Ｒ１）は、グルコース残基（アルドース残基）となる。この糖残基（Ｒ１）は、例えば、
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
−［ＣＨ（ＯＨ）］ｎ−ＣＨ２ＯＨ
で示すことができ、ｎは、０〜６の整数である。
前記式（Ｉ）において、Ｒ２は、特に制限されないが、例えば、下記式（２）で示すアミノ酸残基またはペプチド残基である。
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
−ＣＨＲ３−ＣＯ−Ｒ４ …（２）
前記式（２）において、Ｒ３はアミノ酸側鎖基を示し、Ｒ４は水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基を示し、例えば、下記式（３）で示すことができる。下記式（３）において、ｎは、０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様に、アミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（３）
このようなＦＡＯＤ−αとしては、例えば、商品名ＦＰＯＸ−ＣＥ（キッコーマン社製）、商品名ＦＰＯＸ−ＥＥ（キッコーマン社製）、国際公開第２００４／０２９２５１号パンフレットに記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、特開２００４−２７５０１３号公報や特開２００４−２７５０６３号公報記載のフルクトシルアミンオキシダーゼ、ペニシリウム属由来のＦＡＯＤ（特開平８−３３６３８６号公報）等が使用できる。
このようなＦＡＯＤを使用すれば、例えば、β鎖Ｎ末端バリン以外が糖化されていても、バリンの糖化部分以外には作用し難いため、より精度の高いＨｂＡ１ｃの測定が可能となる。
なお、ＦＡＯＤは、前記（１）以外の基質特異性をさらに有していてもよい。このようなＦＡＯＤとしては、例えば、前記糖化α−アミノ基と糖化アミノ酸側鎖基の両方に作用するＦＡＯＤ（以下、「ＦＡＯＤ−αＳ」という）があげられ、例えば、市販の商品名ＦＯＤ（旭化成社製）、ギベレラ属由来ＦＡＯＤ（特開平８−１５４６７２号公報）、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（特開平７−２８９２５３号公報）、アスペルギルス属由来ＦＡＯＤ（ＷＯ９９／２００３９）等があげられる。このようなＦＡＯＤの場合、例えば、プロテアーゼの種類を適宜選択し、β鎖Ｎ末端のアミノ酸やペプチドを特異的に切断するプロテアーゼと組み合わせることによって、他の糖化部位への作用を抑制することが可能である。
ＨｂＡ１ｃ測定方法において、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応の測定は、例えば、前記反応により生じる過酸化水素量の測定や、前記反応で消費される酸素量の測定があげられる。前記過酸化水素量は、例えば、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）と酸化により発色する基質とを用いて、これらと過酸化水素との反応により基質を発色させ、この発色程度を測定することにより行うことができる。
前記酸化により発色する基質（発色基質）としては、特に制限されず、例えば、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ″，Ｎ″−ヘキサ（３−スルホプロピル）−４，４’，４″−トリアミノトリフェニルメタンヘキサナトリウム塩（例えば、商品名ＴＰＭ−ＰＳ、同仁化学社製）、１０−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−３，７−ビス（ジメチルアミノ）フェノチアジンまたはその塩（例えば、商品名ＤＡ−６７、和光純薬社製）、Ｎ−（カルボキシメチルアミノカルボニル）−４，４’−ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）、トリンダー試薬と４−アミノアンチピリンとを組み合わせた基質等があげられる。トリンダー試薬としては、例えば、フェノール、フェノール誘導体、アニリン誘導体、ナフトール、ナフトール誘導体、ナフチルアミン、ナフチルアミン誘導体等があげられる。また、４−アミノアンチピリンの他に、アミノアンチピリン誘導体、バニリンジアミンスルホン酸、メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）、スルホン化メチルベンズチアゾリノンヒドラゾン（ＳＭＢＴＨ）等も使用できる。
以下に、ＨｂＡ１ｃ測定方法について具体例を示すが、これには制限されない。
まず、前述と同様にして、前記式（Ｉ）で表される促進化合物の存在下で、Ｈｂ含有試料をプロテアーゼ処理する。
そして、前記プロテアーゼ処理により得られたβ鎖Ｎ末端アミノ酸またはペプチド断片をＦＡＯＤで処理する。前記プロテアーゼ処理によって、例えば、Ｈｂβ鎖Ｎ末端からフルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓが切り出された場合には、このＦＡＯＤ処理によって、Ｖａｌのα−アミノ基に結合した糖が遊離し、α−ケトアルデヒド（糖残基）、Ｖａｌ−Ｈｉｓおよび過酸化水素が生成される。
ＦＡＯＤ処理は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行うことが好ましく、前記緩衝液としては、特に制限されず、前記プロテアーゼ処理と同様の緩衝液が使用できる。ＦＡＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、６〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜３８℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０．１〜６０分、好ましくは０．１〜５分である。
ＦＡＯＤ処理の反応液におけるＦＡＯＤの添加割合は、例えば、０．０１〜５０ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜１０ＫＵ／Ｌである。
つぎに、前記ＦＡＯＤ処理によって生じた過酸化水素の量を、ＰＯＤおよび前記発色基質を用いて測定する。なお、過酸化水素量は、ＰＯＤ等を用いた酵素的手法の他に、電気的手法等によって測定することもできる。
ＰＯＤ反応は、前記プロテアーゼ処理と同様に緩衝液中で行われることが好ましく、前述のような緩衝液が使用できる。ＰＯＤ処理の条件は、特に制限されないが、反応液のｐＨは、例えば、５〜９であり、処理温度は、例えば、１０〜４０℃の範囲であり、好ましくは２５〜３７℃である。処理時間も特に制限されず、例えば、０．１〜５分である。
ＰＯＤ反応液におけるＰＯＤの添加割合は、例えば、０．０１〜３００ＫＵ／Ｌの範囲であり、好ましくは０．５〜４０ＫＵ／Ｌである。また、前記反応液における発色基質の添加割合は、例えば、０．００１〜１０ｍＭの範囲であり、好ましくは０．００５〜２ｍＭである。
このように発色基質を用いた場合、例えば、その発色（例えば、反応液の吸光度）を分光光度計で測定すればよい。過酸化水素量は、Ｈｂにおけるβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量（糖化濃度：ＨｂＡ１ｃ濃度）に対応するため、測定した吸光度からバリンの糖化量を算出できる。そして、下記式に示すように、このＨｂのβ鎖Ｎ末端バリンの糖化量と試料中の全Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）との比（１００分率）を算出することによって、ＨｂＡ１ｃ（％）を求めることができる。なお、Ｈｂ量は、従来公知の方法や、市販の試薬キットによって測定できる。
ＨｂＡ１ｃ％＝（β鎖Ｎ末端バリンの糖化量／Ｈｂ量）×１００
ＨｂＡ１ｃ％＝（β鎖Ｎ末端バリンの糖化量／Ｈｂ量）×１００
吸光度からのＨｂ糖化量の算出は、例えば、Ｈｂのβ鎖Ｎ末端の既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。例えば、β鎖Ｎ末端糖化量が既知であるＨｂ標準液について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、β鎖Ｎ末端の糖化量が算出できる。
また、以下のようにすれば、前記式（Ｉ）で表される促進化合物で処理した同じ試料を用いてＨｂ量をより正確に測定し、且つ、ＨｂＡ１ｃ値をより正確に求めることができる。すなわち、本発明の測定方法において、プロテアーゼによるＨｂの切断に先立って、前記Ｈｂを含む試料に前記式（Ｉ）で表される促進化合物を添加し、前記促進化合物を添加した試料の光学的変化量を測定して、この光学的変化量から前記試料中のＨｂ量を算出する。他方、前記化合物が添加された試料中のＨｂをプロテアーゼによって切断した後、前記糖化部分とＦＡＯＤとの酸化還元反応を測定することによりＨｂの糖化量を測定する。そして、前記Ｈｂ量と前記糖化量とからＨｂＡ１ｃ値（ＨｂＡ１ｃ％）を求めることが好ましい。
この方法では、プロテアーゼの添加に先立って、Ｈｂを含む試料に前記式（Ｉ）で表される促進化合物を添加し、例えば、前記試料の吸光度測定を行う。そして、測定した吸光度と予め準備した検量線とからＨｂ量を求めればよい。このように、前記化合物でＨｂを処理しておけば、Ｈｂの量を容易かつ正確に求めることができる。そのメカニズムは不明であるが、前記式（Ｉ）で表される促進化合物によって、ヘモグロビンの構造が変化し、不安定なＨｂが安定化されているためと推測される。前記検量線は、例えば、既知Ｈｂ量（Ｈｂ濃度）である複数のＨｂ含有試料を前述の方法により測定し、これらの測定値と既知Ｈｂ量とから作成することができる。なお、吸光度の測定波長は特に制限されないが、例えば、４００〜６６０ｎｍの範囲であり、前記化合物による試料の処理時間は、例えば、０．２〜３０分の範囲である。この方法によりＨｂ測定を行う場合、前記化合物の添加後であってプロテアーゼの添加前に吸光度測定を行う以外は、前述と同様にして引き続きプロテアーゼ処理等を行い、ＨｂＡ１ｃ濃度を求めることができるため、より簡便な測定方法となる。
（ＧＨｂＬｙｓの測定方法）
本発明の糖化率の測定方法としては、この他にも、例えば、糖化ＨｂのＧＨｂＬｙｓ（Ｌｙｓ糖化率）の測定があげられる。前述のＨｂＡ１ｃは、血糖値の動きに緩やかに応答するため、数時間程度の高血糖が持続しなければＨｂＡ１ｃの上昇は確認されない。これに対して、ＧＨｂＬｙｓは、数十分程度の高血糖状態にも敏感に反応する。このため、ＧＨｂＬｙｓを測定すれば、例えば、血糖値が高くなる食後１〜２時間における高血糖を検出することができる。したがって、ＧＨＬｙｓは、高血糖の指標となり、その測定は臨床分野において極めて有用となる。
本発明の糖化率の測定方法としては、この他にも、例えば、糖化ＨｂのＧＨｂＬｙｓ（Ｌｙｓ糖化率）の測定があげられる。前述のＨｂＡ１ｃは、血糖値の動きに緩やかに応答するため、数時間程度の高血糖が持続しなければＨｂＡ１ｃの上昇は確認されない。これに対して、ＧＨｂＬｙｓは、数十分程度の高血糖状態にも敏感に反応する。このため、ＧＨｂＬｙｓを測定すれば、例えば、血糖値が高くなる食後１〜２時間における高血糖を検出することができる。したがって、ＧＨＬｙｓは、高血糖の指標となり、その測定は臨床分野において極めて有用となる。
糖化ＨｂのＧＨｂＬｙｓを測定する場合、プロテアーゼによるＨｂ切断物は、ε−アミノ基が糖化されたリジンまたはそれを含む糖化ペプチドであって、リジンの糖化部分にＦＡＯＤを作用させればよい。なお、切り出すアミノ酸やペプチドは、前述のように、使用するプロテアーゼの種類の選択によって決定できる。
ＧＨｂＬｙｓの測定方法に使用するＦＡＯＤは、特に制限されないが、少なくとも、アミノ酸側鎖のアミノ基（例えば、ε−アミノ基）が糖化されたアミノ酸またはペプチドに作用して下記式（１’）に示す反応を触媒する酵素（ＦＡＯＤ−Ｓ）が好ましい。
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１’）
Ｒ１−ＣＯ−ＣＨ２−ＮＨ−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ ＋ Ｏ２
→Ｒ１−ＣＯ−ＣＨＯ ＋ ＮＨ２−Ｒ２ ＋ Ｈ２Ｏ２ …（１’）
前記式（１’）は、Ｒ２以外は、前記式（１）と同じである。前記式（１’）において、Ｒ２は下記式（４’）で示すことができる。下記式（４’）において「−（ＣＨ２）４−」は、リジンの側鎖基のうち、糖化されたアミノ基以外の部分を示す。
−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４’）
−（ＣＨ２）４−ＣＨ（ＮＨ−Ｒ６）−ＣＯ−Ｒ７ …（４’）
また、前記式（４’）において、Ｒ６は、水素、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（５’）で示すことができる。なお、下記式（５’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５’）
−（ＣＯ−ＣＲ３Ｈ−ＮＨ）ｎ−Ｈ …（５’）
また、前記式（４’）において、Ｒ７は、水酸基、アミノ酸残基またはペプチド残基であり、例えば、下記式（４’）で示すことができる。なお、下記式（６’）において、ｎは０以上の整数であり、Ｒ３は、前述と同様にアミノ酸側鎖基を示し、アミノ酸側鎖基は全て同一でも、異なっていても良い。
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
−（ＮＨ−ＣＨＲ３−ＣＯ）ｎ−ＯＨ …（６’）
前記糖化されたアミノ酸側鎖に特異的に作用するＦＡＯＤ−Ｓとしては、例えば、フサリウム属由来ＦＡＯＤ（日本生物工学会大会 平成１２年度「Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ由来アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の変換；藤原真紀 他」）等があげられる。
なお、ＦＡＯＤは、前記（１’）以外の基質特異性をさらに有していてもよい。このようなＦＡＯＤとしては、前述のようなＦＡＯＤ−αＳがあげられる。このようなＦＡＯＤの場合、例えば、国際公開第２００２／００６５１９号パンフレットに記載のプロテアーゼ等のように、Ｎ末端のα位アミノ基が糖化された糖化アミノ酸を生成しないプロテアーゼ（例えば、リジンやリジンを含むペプチドを特異的に切断するプロテアーゼ）を選択し、これと組み合わせることによって、他の糖化部位への作用を抑制することが可能である。
ＧＨｂＬｙｓの測定は、まず、前記促進化合物の存在下で試料のプロテアーゼ処理を行い、リジンまたはリジンを含むペプチドを切り出し、これを前述のＦＡＯＤで処理する。そして、前述と同様の方法によってＨｂのリジンの糖化量を求め、下記式に示すように、このＨｂのリジン糖化量と試料中の全Ｈｂ量との比（１００分率）を算出することによって、ＧＨｂＬｙｓ（％）を求めることができる。
ＧＨｂＬｙｓ％＝（Ｌｙｓ糖化量／Ｈｂ量）×１００
ＧＨｂＬｙｓ％＝（Ｌｙｓ糖化量／Ｈｂ量）×１００
吸光度からのＬｙｓ糖化量の算出は、例えば、Ｈｂのリジンの既知糖化量と吸光度との関係をプロットした検量線を用いることによって行える。例えば、Ｌｙｓ糖化量が既知であるＨｂ標準液について、前述と同様にして吸光度測定を行い、この標準液の測定値と既知糖化量との関係を示す検量線を作成しておく。そして、この検量線に前述のように測定した吸光度を代入することによって、Ｌｙｓ糖化量が算出できる。
（ＨｂＡ１ｃとＧＨｂＬｙｓの測定）
前述のようなＨｂの二種類の糖化率（ＨｂＡ１ｃおよびＧＨｂＬｙｓ）は、ＦＡＯＤの基質特異性を利用することによって、同じ試料を用いて連続的に測定することも可能である。すなわち、Ｈｂを含む試料に前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行い、β鎖Ｎ末端バリンもしくはβ鎖Ｎ末端ペプチドと、リジンもしくはリジンを含むペプチドとを切り出す。そして、まず、α−アミノ基の糖化部分（例えば、バリンの糖化部分）に特異的に作用し且つアミノ酸側鎖の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−αで処理することによって、ＨｂＡ１ｃを測定する。その後、さらに、アミノ酸側鎖の糖化部分（リジン側鎖の糖化部分）に特異的に作用し且つα−アミノ基の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−Ｓで処理することによって、ＧＨｂＬｙｓを測定すればよい。また、ＦＡＯＤの処理順序は、これには制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−Ｓで処理することによってＧＨｂＬｙｓを測定した後、ＦＡＯＤ−αで処理することによってＨｂＡ１ｃを測定してもよい。
前述のようなＨｂの二種類の糖化率（ＨｂＡ１ｃおよびＧＨｂＬｙｓ）は、ＦＡＯＤの基質特異性を利用することによって、同じ試料を用いて連続的に測定することも可能である。すなわち、Ｈｂを含む試料に前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行い、β鎖Ｎ末端バリンもしくはβ鎖Ｎ末端ペプチドと、リジンもしくはリジンを含むペプチドとを切り出す。そして、まず、α−アミノ基の糖化部分（例えば、バリンの糖化部分）に特異的に作用し且つアミノ酸側鎖の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−αで処理することによって、ＨｂＡ１ｃを測定する。その後、さらに、アミノ酸側鎖の糖化部分（リジン側鎖の糖化部分）に特異的に作用し且つα−アミノ基の糖化部分には作用し難いＦＡＯＤ−Ｓで処理することによって、ＧＨｂＬｙｓを測定すればよい。また、ＦＡＯＤの処理順序は、これには制限されず、例えば、ＦＡＯＤ−Ｓで処理することによってＧＨｂＬｙｓを測定した後、ＦＡＯＤ−αで処理することによってＨｂＡ１ｃを測定してもよい。
ＨｂＡ１ｃやＧＨｂＬｙｓのような血球内のタンパク質の糖化率を、全血試料を用いて測定する場合、前述のように前記促進化合物を使用することによって、さらに以下のような効果を得ることも可能である。血球内タンパク質の糖化率測定にあたって、全血試料は溶血処理を施して溶血試料として使用される。この際、溶血試料中には血清中の糖化タンパク質（例えば、糖化アルブミン）が共存するが、前記促進化合物の存在下でプロテアーゼ処理を行えば、メカニズムは不明であるが、前述のような糖化Ｈｂの切断は促進されるものの、糖化アルブミンの切断は抑制される。このため、例えば、糖化アルブミン等が混在し、その糖化部位にもＦＡＯＤが作用するという問題も回避できる。なお、このような問題は、例えば、プロテアーゼがＨｂにもアルブミンにも作用し、且つ、後に添加するＦＡＯＤがいずれのタンパク質切断物にも作用する場合に生じるものである。したがって、この問題は、前述のように目的タンパク質の目的部位（ＦＡＯＤが作用する糖化アミノ酸や糖化ペプチド）を選択的に切り出すプロテアーゼを選択することによっても解消できる。
以上のような本発明の糖化率の測定において、各処理工程は、前述のように別々に行ってもよいが、例えば、以下に示すような組み合わせで各処理を同時に行ってもよい。また、プロテアーゼ、ＦＡＯＤ、ＰＯＤ、発色基質の添加順序も特に制限されない。
１：溶血処理＋プロテアーゼ処理
２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
２：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理
３：ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
４：プロテアーゼ処理＋ＦＡＯＤ処理＋ＰＯＤ処理
つぎに、本発明のタンパク質切断促進剤は、前述のように、プロテアーゼによるタンパク質からのアミノ酸またはペプチドの切断を促進する促進剤であって、前記式（Ｉ）で表される促進化合物を含むことを特徴とする。
本発明のタンパク質切断促進剤は、前記化合物を含んでいればよく、これのみでもよいし、β鎖Ｎ末端ペプチド等の切断に影響を与えないものであれば他の物質を含んでもよい。他の物質としては、例えば、亜硝酸のようなニトロ化合物があげられる。なお、本発明の促進剤における前記化合物の濃度は特に制限されず、試料に添加した際に前述のような濃度となるような濃度であればよい。
以下、実施例および比較例により本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
前記式（Ｉ）で表される種々の化合物存在下でＨｂの切断を行い、酵素法によってＨｂＡ１ｃを測定した。測定に用いた試料、試薬および測定方法を以下に示す。なお、下記第１試薬（Ｒ１−１）における化合物としては、下記Ｎｏ．１−９の化合物を使用し、Ｎｏ．１０は化合物未添加（精製水）とした。
（試料）
（１）ＨｂＡ０試料
健常人のＨｂを強陽イオン交換カラム（商品名ＰＯＲＯＳ−ＨＳ５０：アプライドバイオシステムズ社製）に供して、定法によってＨｂＡ０の分画を精製回収した。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が０％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
（２）低ＨｂＡ１ｃ試料
糖尿病患者の血球に等量の精製水を加えて血球を溶血させ、遠心分離により血球膜を除去したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が１２％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
（３）高ＨｂＡ１ｃ試料
健常人のＨｂを強陽イオン交換カラム（商品名ＰＯＲＯＳ−ＨＳ５０：アプライドバイオシステムズ社製）に供して、ＨｂＡ１ｃの分画を精製回収した。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が３０％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
（１）ＨｂＡ０試料
健常人のＨｂを強陽イオン交換カラム（商品名ＰＯＲＯＳ−ＨＳ５０：アプライドバイオシステムズ社製）に供して、定法によってＨｂＡ０の分画を精製回収した。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が０％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
（２）低ＨｂＡ１ｃ試料
糖尿病患者の血球に等量の精製水を加えて血球を溶血させ、遠心分離により血球膜を除去したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が１２％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
（３）高ＨｂＡ１ｃ試料
健常人のＨｂを強陽イオン交換カラム（商品名ＰＯＲＯＳ−ＨＳ５０：アプライドバイオシステムズ社製）に供して、ＨｂＡ１ｃの分画を精製回収した。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が３０％、ヘモグロビン濃度が２ｇ／Ｌであった。
なお、前記各試料のＨｂＡ１ｃ％は、測定装置（商品名ＨＡ−８１６０：アークレイ社製）で測定し、ヘモグロビン濃度は、常法であるアルカリヘマチン法で測定した。
（方法）
前記各試料１５μＬと各第１試薬（Ｒ１−１）７６μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに、第２試薬（Ｒ２−１）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表２に示す。
前記各試料１５μＬと各第１試薬（Ｒ１−１）７６μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに、第２試薬（Ｒ２−１）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製、以下同じ）によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表２に示す。
前記表２に示すように、前記式（Ｉ）で表される化合物（Ｎｏ．１〜５）を用いれば、各試料におけるＨｂＡ１ｃ％の増加に従って吸光度が増加した。これは、ＨｂＡ１ｃの特徴であるβ鎖Ｎ末端ペプチドが、短時間（５分）で切り出され、ＦＡＯＤが作用したことを意味する。これに対して、前記式（Ｉ）におけるＲ（直鎖アルキル）の炭素数が９未満である化合物（Ｎｏ．６および７）、コール酸（Ｎｏ．８）、糖残基を有さない一般的な界面活性剤（Ｎｏ．９）を使用した場合、また、前記（Ｉ）で表される化合物の非存在下（Ｎｏ．１０）では、各試料におけるＨｂＡ１ｃ％の増加に伴う吸光度増加は見られなかった。すなわち、短時間でＮ末端ペプチドの切り出しを効率良く行うことは出来なかった。
実施例１における第１試薬（Ｒ１−１）に、さらにＮａＮＯ２を加えた第１試薬（Ｒ１−２）を調製し、前記実施例１と同様にして吸光度の測定を行った。この結果を下記表４に示す。なお、第１試薬（Ｒ１−１）を使用した実施例１の結果も、下記表４にあわせて示す。
前記表４に示すように、さらに亜硝酸を添加することによって、さらなる吸光度の増加が見られた。この結果から、前記式（Ｉ）で表される化合物に加えて亜硝酸を併存させることにより、β鎖Ｎ末端ペプチドの切り出しをより一層促進できることがわかる。
ＨｂＡ１ｃの標準物質を用いて、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法の測定精度を確認した。
（試料）
標準物質として、ＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質（ＪＤＳ ＨｂＡ１ｃ Ｌｏｔ２：福祉・医療技術振興会製）、認証ＨｂＡ１ｃキャリブレータ（ＨｂＡ１ｃ標準化ＩＦＣＣワーキンググループ製）、および、認証ＨｂＡ１ｃコントロール（ＨｂＡ１ｃ標準化ＩＦＣＣワーキンググループ製）を使用し、これらを精製水で２５倍希釈したものを標準試料とした。
標準物質として、ＨｂＡ１ｃ測定用実試料標準物質（ＪＤＳ ＨｂＡ１ｃ Ｌｏｔ２：福祉・医療技術振興会製）、認証ＨｂＡ１ｃキャリブレータ（ＨｂＡ１ｃ標準化ＩＦＣＣワーキンググループ製）、および、認証ＨｂＡ１ｃコントロール（ＨｂＡ１ｃ標準化ＩＦＣＣワーキンググループ製）を使用し、これらを精製水で２５倍希釈したものを標準試料とした。
（方法）
前記各標準試料１３μＬと第１試薬（Ｒ１−３）７８μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに、前記実施例１と同じ第２試薬（Ｒ２−１）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。そして、この吸光度差から以下のようにしてＨｂＡ１ｃ％を算出し、この算出結果と、前記標準試料のＨｂＡ１ｃ％表示値との相関関係を確認した。前記吸光度差から求めたＨｂＡ１ｃ％と表示値との結果を、下記表６と図１のグラフに示す。
前記各標準試料１３μＬと第１試薬（Ｒ１−３）７８μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに、前記実施例１と同じ第２試薬（Ｒ２−１）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。そして、この吸光度差から以下のようにしてＨｂＡ１ｃ％を算出し、この算出結果と、前記標準試料のＨｂＡ１ｃ％表示値との相関関係を確認した。前記吸光度差から求めたＨｂＡ１ｃ％と表示値との結果を、下記表６と図１のグラフに示す。
（ＨｂＡ１ｃ％の算出方法）
標準試料のＨｂ濃度の表示値に、ＨｂＡ１ｃ％の表示値を乗ずることによって、ＨｂＡ１ｃ濃度を算出した。この値をＨｂＡ１ｃ濃度の表示値とする。この標準試料のＨｂＡ１ｃ濃度表示値と標準試料の吸光度差とから一次相関式を求め、これを検量線とした。そして、この検量線を用いて吸光度差（Ａ１．５−Ａ０）からＨｂＡ１ｃ濃度を算出し、このＨｂＡ１ｃ濃度算出値をＨｂ濃度で割って１００倍することによりＨｂＡ１ｃ％を求めた。なお、Ｈｂ濃度は、次のようにして算出した。まず、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）を用いて、Ｈｂ濃度の表示値との一次相関式を求め、検量線を作成した。そして、この検量線を用いて、Ａ０からＨｂ濃度を算出した。
標準試料のＨｂ濃度の表示値に、ＨｂＡ１ｃ％の表示値を乗ずることによって、ＨｂＡ１ｃ濃度を算出した。この値をＨｂＡ１ｃ濃度の表示値とする。この標準試料のＨｂＡ１ｃ濃度表示値と標準試料の吸光度差とから一次相関式を求め、これを検量線とした。そして、この検量線を用いて吸光度差（Ａ１．５−Ａ０）からＨｂＡ１ｃ濃度を算出し、このＨｂＡ１ｃ濃度算出値をＨｂ濃度で割って１００倍することによりＨｂＡ１ｃ％を求めた。なお、Ｈｂ濃度は、次のようにして算出した。まず、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）を用いて、Ｈｂ濃度の表示値との一次相関式を求め、検量線を作成した。そして、この検量線を用いて、Ａ０からＨｂ濃度を算出した。
同図に示すように、吸光度からの算出値と標準試料の表示値との相関係数は０．９９５と高く、極めて優れた相関関係を示した。この結果から、本発明の測定方法によれば、ＨｂＡ１ｃ％を正確に測定できると言える。
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの存在下でＨｂをプロテアーゼ処理し、Ｎ末端ジペプチド（フルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓ）が切断されているか否かを確認した。
（試料）
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ Ｐ１８６−４（ＨｂＡ１ｃ％＝４４％、ＳＣＩＰＡＣ社製）と、商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＨｂＡ１ｃ Ｆｒｅｅ）Ｐ２１１１−３（ＨｂＡ１ｃ％＝０％、ＳＣＩＰＡＣ社製）とを使用した。
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ Ｐ１８６−４（ＨｂＡ１ｃ％＝４４％、ＳＣＩＰＡＣ社製）と、商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＨｂＡ１ｃ Ｆｒｅｅ）Ｐ２１１１−３（ＨｂＡ１ｃ％＝０％、ＳＣＩＰＡＣ社製）とを使用した。
（ＨＰＬＣ）
ＨＰＬＣカラムは、商品名ＹＭＣ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ２５０×６．０（ＹＭＣ社製）を使用し、溶離液は、Ａ液（体積比ＫＨ２ＰＯ４：メタノール＝１００：２）およびＢ液（体積比ＫＨ２ＰＯ４：メタノール＝１００：１００）をそれぞれ使用した。サンプル量は１００μＬ、検出波長は２１５ｎｍ、溶離液の流速は流速１ｍＬ／分とし、溶離開始から２分までＡ液（１００％）を使用し、それから１０分かけてＢ液の体積比率を１００％に上昇させ、さらに１５分間Ｂ液（１００％）を使用した。ＨＰＬＣの標準試料としては、Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｂａｃｈｅｍ社製）、ならびに、前記Ｖａｌ−Ｈｉｓとグルコースとから常法によって調製したフルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓを使用した。なお、Ｖａｌ−Ｈｉｓのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅは約６．４分であり、フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅは約１０．３分である。
ＨＰＬＣカラムは、商品名ＹＭＣ ＰＡＣＫ ＯＤＳ−ＡＭ２５０×６．０（ＹＭＣ社製）を使用し、溶離液は、Ａ液（体積比ＫＨ２ＰＯ４：メタノール＝１００：２）およびＢ液（体積比ＫＨ２ＰＯ４：メタノール＝１００：１００）をそれぞれ使用した。サンプル量は１００μＬ、検出波長は２１５ｎｍ、溶離液の流速は流速１ｍＬ／分とし、溶離開始から２分までＡ液（１００％）を使用し、それから１０分かけてＢ液の体積比率を１００％に上昇させ、さらに１５分間Ｂ液（１００％）を使用した。ＨＰＬＣの標準試料としては、Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｂａｃｈｅｍ社製）、ならびに、前記Ｖａｌ−Ｈｉｓとグルコースとから常法によって調製したフルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓを使用した。なお、Ｖａｌ−Ｈｉｓのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅは約６．４分であり、フルクトシルＶａｌ−Ｈｉｓのｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｔｉｍｅは約１０．３分である。
前記各試料５２０μＬと第１試薬（Ｒ１−４）１５６０μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに前記第２試薬（Ｒ２−４）５２０μＬを添加して３７℃で１分間プロテアーゼ処理を行った。この反応液をウルトラフリー４フィルターユニット（分子量５０００：ミリポア社製）に移して遠心ろ過（４℃、３０００ｒｐｍ、２０分）し、得られたろ液をサンプルとしてＨＰＬＣに供した。この結果を図２に示す。同図は、サンプルのクロマトグラムであり、同図（Ａ）は、ＨｂＡ１ｃ％＝４４％の試料を使用した結果、同図（Ｂ）は、ＨｂＡ１ｃ％＝０％の試料を使用した結果を示す。
ＨｂＡ１ｃ＝４４％の試料の結果を示す同図（Ａ）は、ＨｂＡ１ｃ％＝０％の試料の結果を示す同図（Ｂ）と比較すると、Ｖａｌ−Ｈｉｓ（ＶＨ）のピークよりもフルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓ（Ｆ−ＶＨ）のピークが高く検出された。このことから、ＨｂＡ１ｃのＮ末端より、糖化されたＶａｌ−Ｈｉｓ（フルクトシル−Ｖａｌ−Ｈｉｓ）が極めて短時間（１分間）で効率よく切断されていることがわかる。
化合物としてドデシルマルトシド類の検討を行った。なお、下記第１試薬（Ｒ１−５）における化合物としては、下記表に示すもの（Ｎｏ．１〜６）を使用した。
（試料）
健常者より採血した全血と、糖尿病患者より採血した全血とから、それぞれ血球を回収し、等量の精製水を加えて血球を溶血させ、遠心分離により血球膜を除去したものを試料とした。健常者由来の試料は、ＨｂＡ１ｃ％＝３．５％であり、糖尿病患者由来の試料は、ＨｂＡ１ｃ％＝８．５％であった。
健常者より採血した全血と、糖尿病患者より採血した全血とから、それぞれ血球を回収し、等量の精製水を加えて血球を溶血させ、遠心分離により血球膜を除去したものを試料とした。健常者由来の試料は、ＨｂＡ１ｃ％＝３．５％であり、糖尿病患者由来の試料は、ＨｂＡ１ｃ％＝８．５％であった。
（方法）
前記各試料１３μＬと各第１試薬（Ｒ１−５）７８μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに第２試薬（Ｒ２−５）２６μＬを添加して３７℃で４分間、プロテアーゼ処理を行った。さらに第３試薬（Ｒ３−５）１５μＬを添加して発色反応を行った。第３試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第３試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表９に示す。
前記各試料１３μＬと各第１試薬（Ｒ１−５）７８μＬとを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、さらに第２試薬（Ｒ２−５）２６μＬを添加して３７℃で４分間、プロテアーゼ処理を行った。さらに第３試薬（Ｒ３−５）１５μＬを添加して発色反応を行った。第３試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第３試薬の添加１．５分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１．５）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１．５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表９に示す。
前記表９に示すように、直鎖アルキルの炭素数が９未満である化合物（Ｎｏ．１）を使用した場合、健常者試料と糖尿病患者試料とではＨｂＡ１ｃ値が異なるにもかかわらず、同程度の吸光度しか得られなかった。これは、β鎖Ｎ末端ペプチドを効率良く切り出せていないことを示す。これに対して、前記式（Ｉ）で表される化合物（Ｎｏ．２〜６）を使用した場合、両試料間で吸光度に差が見られ、β鎖Ｎ末端を効率良く切り出せていることがわかる。
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドと組み合わせるプロテアーゼの種類について検討した。
前記第２試薬（Ｒ２−６）におけるプロテアーゼとしては、以下のもの（Ｎｏ．１−６）を使用した。
Ｎｏ．１ メタロプロテアーゼ（アークレイ社製） １３００ＫＵ／Ｌ
Ｎｏ．２ プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．３ プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．４ プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．５ ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．６ パパインＭ−４０（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．１ メタロプロテアーゼ（アークレイ社製） １３００ＫＵ／Ｌ
Ｎｏ．２ プロテアーゼＡ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．３ プロテアーゼＭ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．４ プロテアーゼＳ「アマノ」Ｇ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．５ ペプチダーゼＲ（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
Ｎｏ．６ パパインＭ−４０（天野エンザイム社製） ０．１ｇ／Ｌ
（試料）
（１）ＨｂＡ０試料
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＨｂＡ１ｃ Ｆｒｅｅ）Ｐ２１１１−３（ＨｂＡ１ｃ％＝０％、ＳＣＩＰＡＣ社製）を精製水で２５倍希釈（体積）したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が０％であった。
（２）低ＨｂＡ１ｃ試料
糖尿病患者の血球に精製水を２５倍体積量添加して溶血させたものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が８．５％であった。
（３）高ＨｂＡ１ｃ試料
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ Ｐ１８６−４（ＨｂＡ１ｃ％＝４４％、ＳＣＩＰＡＣ社製）を精製水で２５倍希釈（体積）したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が４４％であった。
（１）ＨｂＡ０試料
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ＨｂＡ１ｃ Ｆｒｅｅ）Ｐ２１１１−３（ＨｂＡ１ｃ％＝０％、ＳＣＩＰＡＣ社製）を精製水で２５倍希釈（体積）したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が０％であった。
（２）低ＨｂＡ１ｃ試料
糖尿病患者の血球に精製水を２５倍体積量添加して溶血させたものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が８．５％であった。
（３）高ＨｂＡ１ｃ試料
商品名Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ Ａ１ｃ Ｐ１８６−４（ＨｂＡ１ｃ％＝４４％、ＳＣＩＰＡＣ社製）を精製水で２５倍希釈（体積）したものを試料とした。この試料は、ＨｂＡ１ｃ％が４４％であった。
（方法）
前記各試料１３μＬと第１試薬（Ｒ１−６）７８μＬを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−６）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１０分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１０）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１０−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表１１に示す。
前記各試料１３μＬと第１試薬（Ｒ１−６）７８μＬを混合して３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−６）２６μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加１０分後の反応液における波長５７１ｎｍの吸光度（Ａ１０）とを、前記生化学自動分析装置によって測定し、その差（Ａ１０−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表１１に示す。
前記表１１に示すように、各試料のＨｂＡ１ｃ％の増加にしたがって吸光度が増加したことから、各種プロテアーゼが使用可能であることがわかった。
ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの存在下でＨｂのプロテアーゼ処理を行い、得られた断片を用いて免疫法によりＨｂＡ１ｃを測定した。
ラテックス試薬：商品名コバス試薬ＨｂＡ１ｃ、Ｒ２（ロシュ社製）
凝集試薬： 商品名コバス試薬ＨｂＡ１ｃ、Ｒ３（ロシュ社製）
溶血試薬： 商品名ＨｂＡ１ｃ溶血試薬「ロッシュ」（ロシュ社製）
（標準試料・血球試料）
Ｈｂのβ鎖Ｎ末端のペプチド配列（６残基：Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）であって、Ｖａｌのα−アミノ基を定法により糖化させたものを標準物質とし、これを６μｍｏｌ／Ｌとなるように溶血試薬に溶解して標準試料を調製した。また、血球試料としては、糖尿病患者の血球（ＨｂＡ１ｃ％＝１１．６％、ＨｂＡ１ｃ濃度５．１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｈｂ濃度＝２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）を使用した。
凝集試薬： 商品名コバス試薬ＨｂＡ１ｃ、Ｒ３（ロシュ社製）
溶血試薬： 商品名ＨｂＡ１ｃ溶血試薬「ロッシュ」（ロシュ社製）
（標準試料・血球試料）
Ｈｂのβ鎖Ｎ末端のペプチド配列（６残基：Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ）であって、Ｖａｌのα−アミノ基を定法により糖化させたものを標準物質とし、これを６μｍｏｌ／Ｌとなるように溶血試薬に溶解して標準試料を調製した。また、血球試料としては、糖尿病患者の血球（ＨｂＡ１ｃ％＝１１．６％、ＨｂＡ１ｃ濃度５．１０μｍｏｌ／Ｌ、Ｈｂ濃度＝２．２ｍｍｏｌ／Ｌ）を使用した。
試料（標準試料、血球試料）１０μＬとプロテアーゼ試薬（試薬Ａ（−）、試薬Ｂ（＋））５００μＬとを混合して溶血試料を調製し、これを３７℃で所定時間（１０分、１５０分、２７０分）処理した。処理後の溶血試料３０μＬに精製水１２０μＬを添加して希釈液を調製し、前記希釈液２μＬに前記ラテックス試薬８０μＬを加え３７℃で５分処理し、さらに、凝集試薬１６μＬを添加した。そして、この反応液について、前記凝集試薬を添加後３０秒〜６０秒間の吸光度変化（波長５４５ｎｍ）を測定した。そして、試薬キット（コバス試薬ＨｂＡ１ｃ）の使用説明書に従って、吸光度からＨｂＡ１ｃ濃度を算出した。また、コントロールとして試料に代えて精製水を使用し、同様にして吸光度測定を行った。これらの結果を下記表１３に示す。下記表において（＋）はドデシル−β−Ｄ−マルトシド添加、（−）はドデシル−β−Ｄ−マルトシド無添加を表す。
前記表１３（Ｂ）に示すように、ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを添加した試薬Ｂ（＋）を使用した場合、血球試料と精製水における吸光度の差は、プロテアーゼ処理時間の増加に伴って増加した。また、前記表１３（Ａ）に示す標準試料の結果（吸光度差）を用いて、２７０分処理した場合の吸光度差から換算したＨｂＡ１ｃ濃度は、５．０７μｍｏｌ／Ｌであり、予め求めた糖尿病患者試料のＨｂＡ１ｃ濃度（５．１μｍｏｌ／Ｌ）とほぼ一致したことから、２７０分の処理によって完全にβ鎖Ｎ末端ペプチドを切り出せたことがわかる。これに対して、ドデシル−β−Ｄ−マルトシド無添加の試薬Ａ（−）を使用した場合、プロテアーゼ処理時間の増加により緩やかな吸光度上昇が見られたが、２７０分のプロテアーゼ処理を行った場合のＨｂＡ１ｃ濃度換算値は０．９６μｍｏｌ／Ｌであり、予め求めた糖尿病患者試料のＨｂＡ１ｃ濃度の約１／５程度に止まっていた。この結果から、本発明のＨｂ切断方法によれば、β鎖Ｎ末端を効率よく切り出すことができ、且つ、免疫法によるＨｂＡ１ｃ測定にも有効であるといえる。
出願人らが別途出願しているテトラゾリウム化合物を用いてプロテアーゼによる切断を促進する方法（ＷＯ０２／０２７０１２）と、本発明における促進化合物を用いた方法とに関して、ＨｂＡ１ｃ測定における効果を比較した。前記テトラゾリウム化合物としては、２−（４−ヨードフェニル）−３−（２，４−ジニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムモノナトリウム塩（商品名ＷＳＴ−３、同仁化学研究所社製）を使用した。
なお、下記第１試薬（Ｒ１−８）における化合物としては、実施例としてｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（化合物Ｎｏ．１）、参考例としてＷＳＴ−３（化合物Ｎｏ．２）を使用した。また、化合物を添加していないもの（Ｎｏ．３：精製水）を比較例とした。
（試料）
健常人の全血を精製水で３１倍希釈したもの、および、下記商品を精製水で３１倍希釈したものを試料とした。試料のコントロールとして精製水を使用した。
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
健常人の全血を精製水で３１倍希釈したもの、および、下記商品を精製水で３１倍希釈したものを試料とした。試料のコントロールとして精製水を使用した。
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
（方法）
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに各第１試薬（Ｒ１−８）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−８）１９．５μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ５）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表１５に示す。下記表１５において、かっこ内の数値は、試料コントロール（精製水）の結果との差を示す。
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに各第１試薬（Ｒ１−８）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−８）１９．５μＬを添加して３７℃でプロテアーゼ処理ならびに発色反応を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加５分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ５）とを、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ５−Ａ０）を求めた。これらの結果を下記表１５に示す。下記表１５において、かっこ内の数値は、試料コントロール（精製水）の結果との差を示す。
前記表１５に示すように、促進化合物を添加していない比較例（Ｎｏ．３）では吸光度の増加が見られなかったのに対して、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドを用いた実施例（Ｎｏ．１）によれば、各試料におけるＨｂＡ１ｃ％の増加に従って吸光度が増加した。これは、ＨｂＡ１ｃの特徴であるβ鎖Ｎ末端ペプチドが、短時間（５分）で切り出され、ＦＡＯＤが作用したことを意味する。また、ＷＳＴ−３を添加した参考例（Ｎｏ．２）では、５分という極めて短時間の処理ではＨｂＡ１ｃ％の増加に伴う吸光度増加が見られなかった。以上の結果から、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドによれば、切り出しに要する時間を、従来技術よりも格段に短縮化できることがわかる。
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの存在下でＨｂの切断を行い、酵素法によって、ＨｂＡ１ｃとＧＨｂＬｙｓとを連続的に測定した。なお、ＦＡＯＤは、α位が糖化されたペプチド（β鎖Ｎ末端ペプチド）に特異的に作用するＦＰＯＸ−ＣＥ（商品名；キッコーマン社製）と、ε位が糖化されたペプチド（リジンペプチド）に特異的に作用するＦＡＯＤＬ（商品名；アークレイ社製）とを組み合わせて使用した。
（試料）
健常人の全血を下記希釈液で３１倍希釈したもの、および、下記商品を下記希釈液で３１倍希釈したものを試料とした。試料のコントロールとして精製水を使用した。
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
（希釈液）
ＰＩＰＥＳ ３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７）
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド ０．５ｇ／Ｌ
ＫＮＯ２ ３ｍＭ
健常人の全血を下記希釈液で３１倍希釈したもの、および、下記商品を下記希釈液で３１倍希釈したものを試料とした。試料のコントロールとして精製水を使用した。
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｌｏｗ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝３．２％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｍｅｄｉｕｍ ＨｂＡ１ｃ，Ｍｅｄｉｕｍ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝５．１％）
ＩＦＣＣ ｃｏｎｔｒｏｌ Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｈｉｇｈ ＨｂＡ１ｃ，Ｎｏｒｍａｌ Ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ（ＨｂＡ１ｃ％＝７．５％）
（希釈液）
ＰＩＰＥＳ ３０ｍｍｏｌ／Ｌ（ｐＨ７）
ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド ０．５ｇ／Ｌ
ＫＮＯ２ ３ｍＭ
（方法）
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに各第１試薬（Ｒ１−９）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−８）１９．５μＬを添加して３７℃で４分間プロテアーゼ処理ならびに第１段階目の発色反応を行った。この反応後、さらに、第３試薬（Ｒ３−９）１９．５μＬを添加し、第２段階目の発色反応（３７℃、６分間）を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加４分後（第３試薬添加直前）の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ４）、および、第３試薬の添加６分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ１０）を、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ４−Ａ０）および（Ａ１０−Ａ４）を求めた。
前記各試料６．５μＬと精製水６．５μＬとを混合し、さらに各第１試薬（Ｒ１−９）７８μＬを混合した。この混合液を３７℃で５分間インキュベートした後、第２試薬（Ｒ２−８）１９．５μＬを添加して３７℃で４分間プロテアーゼ処理ならびに第１段階目の発色反応を行った。この反応後、さらに、第３試薬（Ｒ３−９）１９．５μＬを添加し、第２段階目の発色反応（３７℃、６分間）を行った。そして、第２試薬添加直前の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ０）と、第２試薬の添加４分後（第３試薬添加直前）の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ４）、および、第３試薬の添加６分後の反応液における波長６５８ｎｍの吸光度（Ａ１０）を、生化学自動分析装置（商品名ＪＣＡ−ＢＭ８：日本電子社製）により測定し、その差（Ａ４−Ａ０）および（Ａ１０−Ａ４）を求めた。
これらの結果を下記表１７に示す。表１７において、（Ａ４−Ａ０）の吸光度は、ＨｂＡ１ｃに対応し、（Ａ１０−Ａ４）の吸光度はＧＨｂＬｙｓに対応する。かっこ内の数値は、試料コントロール（精製水）の結果との差を示す。
前述のように、ＦＰＯＸ−ＣＥは、β鎖Ｎ末端ペプチドに反応し、ＦＡＯＤＬは、ε位糖化リジンペプチドに反応するが、β鎖Ｎ末端ペプチドに反応しないことが知られている。このため、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシドの存在下でのプロテアーゼ処理により、Ｈｂからβ鎖Ｎ末端ペプチドとε位糖化リジンペプチドとが切り出されるが、基質特異性の異なる二種類のＦＡＯＤを使用することによって、それらを連続的に測定することが可能である。そこで、表１７の結果を見ると、各ＦＡＯＤ処理後の吸光度が、各試料のＨｂＡ１ｃ％の増加に従って増加していることが確認できる。したがって、本実施例の方法により、二種類の糖化率が連続的に測定可能であるといえる。
以上のように、本発明のタンパク質の切断方法によれば、例えば、ＨｂＡ１ｃの特徴部分であるβ鎖Ｎ末端ペプチド等を迅速に切り出すことができため、精度良くタンパク質の糖化量を決定することができる。したがって、本発明のタンパク質の切断方法や糖化量の測定方法は、臨床検査の分野等において極めて有用である。
Claims (21)
- プロテアーゼによってタンパク質からアミノ酸またはペプチドを切断する方法であって、
下記式（Ｉ）で表される化合物と亜硝酸又はその塩との存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することを特徴とするタンパク質の切断方法。
Ｒ-Ｘ ・・・（Ｉ）
前記式において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、糖残基である。 - 前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数９〜１６の直鎖アルキルもしくは直鎖アシル、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキルもしくは分枝鎖アシル、または、炭素数３〜８のシクロアルキルで置換された直鎖炭素数が４〜１３の直鎖アルキルである、請求項１記載の切断方法。
- 前記式（Ｉ）において、Ｘは、単糖または二糖の糖残基である、請求項１記載の切断方法。
- 前記式（Ｉ）において、Ｘは、マンノシド、マルトシド、フルクトピラノシル-グルコピラノシドおよびチオマルトシドからなる群から選択された少なくとも一つの糖残基である請求項３記載の切断方法。
- 前記化合物が、６-シクロヘキシルヘキシル-β-Ｄ-マルトシド、スクロースモノラウレート、ｎ-デシル-β-Ｄ-マルトシド、ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、ｎ-ノニル-β-Ｄ-チオマルトシド、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトシド、５-シクロヘキシルペンチル-β-Ｄ-マルトシド、ウンデシル-β-Ｄ-マルトシド、３-オキサトリデシル-α-Ｄ-マンノシド、および、ドデシル-αβ-Ｄ-マルトシドからなる群から選択された少なくとも一つの化合物である、請求項１記載の切断方法。
- 前記タンパク質が、ヘモグロビンである、請求項１記載の切断方法。
- ヘモグロビンから切断されるアミノ酸が、β鎖Ｎ末端バリン、リジンおよびこれらの糖化物からなる群から選択された少なくとも一つであり、ヘモグロビンから切断されるペプチドが、β鎖Ｎ末端バリンを含むペプチド、β鎖Ｎ末端糖化バリンを含むペプチド、リジンを含むペプチドおよび糖化リジンを含むペプチドからなる群から選択された少なくとも一つである、請求項６記載の切断方法。
- タンパク質から切断されるペプチドが、アミノ酸残基数２〜６のペプチドである、請求項１記載の切断方法。
- タンパク質をプロテアーゼで切断する工程、得られたタンパク質切断物の糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる工程、および、前記糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの酸化還元反応を測定することにより、タンパク質の糖化率を決定する工程を含むタンパク質の糖化率の測定方法であって、
前記タンパク質の切断を、下記式（Ｉ）で表される化合物の存在下で、タンパク質をプロテアーゼ処理することを特徴とするタンパク質の切断方法により行い、前記切断工程により得られたアミノ酸またはペプチドの糖化部分に前記フルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させることを特徴とするタンパク質の糖化率の測定方法。
Ｒ-Ｘ ・・・（Ｉ）
前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、糖残基である。 - タンパク質が、ヘモグロビンである、請求項９記載の測定方法。
- ヘモグロビンの糖化率が、ＨｂＡ１ｃ値である、請求項１０記載の測定方法。
- 前記タンパク質切断物が、β鎖Ｎ末端バリンまたはβ鎖Ｎ末端バリンを含むペプチドであって、β鎖Ｎ末端バリンの糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる、請求項１１記載の測定方法。
- ヘモグロビンの糖化率が、リジン糖化率である、請求項１０記載の測定方法。
- 前記タンパク質切断物が、リジンまたはリジンを含むペプチドであって、リジンの糖化部分にフルクトシルアミノ酸オキシダーゼを作用させる。請求項１３記載の測定方法。
- 試料中に含まれるヘモグロビンの糖化率を測定する方法であって、前記試料が、全血試料、血球試料、または、これらの溶血試料である請求項１０記載の測定方法。
- プロテアーゼによるヘモグロビンの切断に先立って、ヘモグロビンを含む試料に前記式（Ｉ）で表される化合物を添加し、
前記化合物を添加した試料の光学的変化量を測定してこの光学的変化量から前記試料中のヘモグロビン量を算出し、
他方、前記化合物が添加された試料中のヘモグロビンをプロテアーゼによって切断した後、前記切断物の糖化部分とフルクトシルアミノ酸オキシダーゼとの酸化還元反応を測定することによりヘモグロビンの糖化量を測定し、
前記ヘモグロビン量と前記糖化量とからＨｂの糖化率を求める請求項１０記載の測定方法。 - プロテアーゼによるタンパク質からのアミノ酸またはペプチドの切断を促進する促進剤であって、
下記式（Ｉ）で表される化合物と亜硝酸又はその塩とを含むことを特徴とする促進剤。
Ｒ-Ｘ ・・・（Ｉ）
前記式において、Ｒは、炭素数が９以上のアルキル基または置換アルキル基であり、Ｘは、糖残基である。 - 前記式（Ｉ）において、Ｒは、炭素数９〜１６の直鎖アルキルもしくは直鎖アシル、炭素数１０〜４０であり主鎖炭素数が９〜１６である分枝鎖アルキルもしくは分枝鎖アシル、または、炭素数３〜８のシクロアルキルで置換された直鎖炭素数が４〜１３の直鎖アルキルである、請求項１７記載の促進剤。
- 前記式（Ｉ）において、Ｘは、単糖または二糖の糖残基である、請求項１７記載の促進剤。
- 前記式（Ｉ）において、Ｘは、マンノシド、マルトシド、フルクトピラノシル-グルコピラノシドおよびチオマルトシドからなる群から選択された少なくとも一つの糖残基である請求項１７記載の促進剤。
- 前記化合物が、６-シクロヘキシルヘキシル-β-Ｄ-マルトシド、スクロースモノラウレート、ｎ-デシル-β-Ｄ-マルトシド、ｎ-ドデシル-β-Ｄ-マルトシド、ｎ-ノニル-β-Ｄ-チオマルトシド、ヘキサデシル-β-Ｄ-マルトシド、５-シクロヘキシルペンチル-β-Ｄ-マルトシド、ウンデシル-β-Ｄ-マルトシド、３-オキサトリデシル-α-Ｄ-マンノシド、および、ドデシル-αβ-Ｄ-マルトシドからなる群から選択された少なくとも一つの化合物である、請求項１７記載の促進剤。
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