DE69635503T2

DE69635503T2 - Fructosyl-Aminosäureoxidase und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE69635503T2
Application number: DE69635503T
Authority: DE
Inventors: Nobuo Kameoka-shi Kato; Yasuyoshi Otsu-shi Sakai; Yoshiki Kyoto-shi Tani; Masayuki cho 1 Yagi; Fumiyo Hirakata-shi Funatsu
Original assignee: Arkray Inc
Current assignee: Arkray Inc
Priority date: 1995-04-11
Filing date: 1996-04-04
Publication date: 2006-08-17
Anticipated expiration: 2016-04-05
Also published as: DE69635503D1; EP0737744B1; EP0737744A2; US5824527A; CN1097092C; CN1143111A; EP0737744A3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine neue Fructosylaminosäure-Oxidase. Insbesondere bezieht sie sich auf eine Fructosylaminosäure-Oxidase, die durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Penicillium erhältlich ist, auf ein Verfahren zur Bestimmung einer Amadori-Verbindung unter Verwendung des Enzyms und auf ein Reagens oder einen Kit, das bzw. der das Enzym enthält.
Hintergrund der Erfindung
Wenn reaktive Substanzen, wie Proteine, Peptide und Aminosäuren, die eine oder mehrere Aminogruppen aufweisen, neben einem reduzierenden Zucker, wie einer Aldose, die eine oder mehrere Aldehydgruppen aufweist, vorliegen, verbinden sie sich nichtenzymatisch und irreversibel über die Amino- und Aldehydgruppen, und dann erfolgt eine Amadori-Umlagerung unter Bildung einer Amadori-Verbindung. Da die Erzeugungsgeschwindigkeit einer Amadori-Verbindung eine Funktion der Konzentration der Reaktanten, der Kontaktzeit, der Temperatur und dergleichen ist, können aus der Menge von Amadori-Verbindungen verschiedene nützliche Informationen über eine Probe, die solche reaktive Substanzen enthält, abgeleitet werden. Beispiele für Materialien, die eine Amadori-Verbindung enthalten, sind Lebensmittel, wie Sojasauce, und Körperflüssigkeiten, wie Blut.
In einem lebenden Körper werden Fructosylamine durch die Glykierungsreaktion zwischen Glucose und verschiedenen Aminosäuren gebildet. Fructosylamine, die entstehen, wenn Hämoglobin und Albumin in Blut glykiert werden, nennt man zum Beispiel Glycohämoglobin bzw. Glycoalbumin. Die Reduktionsfähigkeit eines Glycoderivats eines Proteins in Blut wird "Fructosamin" genannt. Die Konzentration dieser Glycoderivate in Blut spiegelt einen Mittelwert von Blutzuckerspiegeln über eine bestimmte Zeitspanne hinweg wider, und ihre Bestimmung kann ein wichtiger Hinweis für die Diagnose und Kontrolle von Diabeteszuständen sein. Daher ist die Entwicklung eines Verfahrens zur Messung einer Amadori-Verbindung in Blut von großem klinischem Nutzen. Weiterhin kann der Zustand der Konservierung und die Zeit nach der Herstellung eines Lebensmittels auf der Basis der Menge der Amadori-Verbindungen in dem Lebensmittel abgeschätzt werden, und daher kann das Verfahren zur Messung einer Amadori-Verbindung auch zur Qualitätskontrolle eines Lebensmittels beitragen. Wie oben erwähnt, sollte ein Assay für Amadori-Verbindungen für eine Vielzahl von Gebieten, die Medizin und Lebensmittel betreffen, nützlich sein.
Weiterhin kann der Zustand der Konservierung und die Haltbarkeit nach der Herstellung eines Lebensmittels auf der Grundlage der Menge an Amadori-Verbindungen in dem Lebensmittel abgeschätzt werden. Daher kann das Verfahren zur Messung der Amadori-Verbindung auch zur Qualitätskontrolle eines Lebensmittels beitragen.
Wie oben exemplarisch dargestellt, sollte ein Assay für Amadori-Verbindungen für einen weiten Bereich von Gebieten, die Medizin und Lebensmittel beinhalten, geeignet sein.
Beispiele für einen Assay für Amadori-Verbindungen sind ein Verfahren, das HPLC (high performance liquid chromatography) [Chromatogr. Sci. 10: 659 (1979)], eine Säule, die mit festen Materialien gefüllt ist, an die Borsäure gebunden ist [Clin. Chem. 28: 2088–2094 (1982)], Elektrophorese [Clin. Chem. 26: 1598–1602 (1980)] oder eine Antigen-Antikörper-Reaktion [JJCLA 18: 620 (1993), J. Clin. Lab. Inst. Reag. 16: 33–37 (1993)] verwendet, ein Verfahren zur Messung der Menge an Fructosamin [Clin. Chem. Acta 127: 87–95 (1982)] und eine kolorimetrische Bestimmung nach Oxidation mit Thiobarbitursäure [Clin. Chem. Acta 112: 179–204 (1981)].
Diese bestehenden Verfahren erfordern jedoch kostspielige Geräte und sind nicht notwendigerweise ausreichend genau und schnell.
Auf dem Gebiet des klinischen Assays und der Lebensmittelanalyse wird ein Verfahren immer beliebter, bei dem ein enzymatischer Prozess verwendet wird und das es ermöglicht, eine Zielsubstanz aufgrund der Merkmale von Enzymen (Spezifität in Bezug auf Substrat, Reaktion, Struktur, aktives Zentrum) mit Genauigkeit und Schnelligkeit selektiv zu analysieren.
Es wurden Assays zur Bestimmung von Amadori-Verbindungen auf der Basis der Menge des verbrauchten Sauerstoffs oder des bei der Reaktion zwischen einer Amadori-Verbindung und einer Oxidoreductase erzeugten Wasserstoffperoxids vorgeschlagen (z.B. Japanische Patentschriften Nr. 5-33997 und 6-65300 und Japanische Offenlegungsschriften Nr. 2-195900, 3-155780, 4-4874, 5-192193, 6-46846 und 7-289253). Weiterhin wurden auch Assays für Glycoprotein für die Diagnose von Diabetes vorgeschlagen (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 2-195899, 2-195900, 5-192193, 6-46846 und 7-289253).
Die von einer Oxidoreductase katalysierte Zersetzung von Amadori-Verbindungen kann durch das folgende Reaktionsschema dargestellt werden: R¹-CO-CH₂-NH-R² + O₂ + H₂O → R¹-CO-CHO + R²-NH₂ + H₂O₂ wobei R¹ ein Aldoserest ist und R² ein Aminosäure-, Protein- oder Peptidrest ist.
Beispiele für Enzyme, die die obige Reaktion katalysieren, sind die folgenden:

1. Fructosylaminosäure-Oxidase, die von Corynebacterium (Japanische Patentschriften Nr. 5-33997 und 6-65300) oder Aspergillus (Japanische Offenlegungsschriften Nr. 3-155780) abgeleitet ist;
2. Fructosylamin-Deglycase, die von Candida abgeleitet ist (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 6-46846);
3. Fructosylaminosäure-Deglycase, die von Penicillium abgeleitet ist (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-4874);
4. Ketoamin-Oxidase, die von Corynebacterium, Fusarium, Acremonium oder Debaryomyces abgeleitet ist (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 5-192193); und
5. Alkyllysinase, die nach dem Verfahren hergestellt werden kann, das in J. Biol. Chem., Vol. 239, S. 3790–3796 (1964), beschrieben ist.

Assays, die diese bereits vorhandenen Enzyme beinhalteten, haben jedoch Nachteile.
Indikatoren für die Diagnose von Diabetes in Blut sind zum Beispiel Glycoalbumin, Glycohämoglobin und Fructosylamin. Glycoalbumin entsteht, wenn eine Glucose an die ε-Position eines Lysinrests in einem Protein gebunden wird [J. Biol. Chem. 261: 13542–13545 (1986)]. Im Falle von Glycohämoglobin wird eine Glucose neben einem Lysinrest auch an den N-terminalen Valinrest der β-Kette gebunden [J. Biol. Chem. 254: 3892–3898 (1979)]. Daher ist es bei der Bestimmung von Glycoproteinen als Indikatoren für Diabetes notwendig, ein Enzym zu verwenden, das hochspezifisch für Fructosylvalin sowie für Fructosyllysin ist. Ein von Corynebacterium abgeleitetes Enzym wirkt jedoch nicht auf Fructosyllysin. Die Wirkung eines Enzyms von Aspergillus auf Glycoproteine oder hydrolysierte Produkte davon ist nicht klar. Die in der Japanischen Offenlegungsschrift Nr. 5-192193 beschriebene Ketoamin-Oxidase kann zwar auf Fructosylvalin wirken, ergibt jedoch keine genaue Bestimmung von Glycoproteinen mit einem an einen Zucker gebundenen Lysinrest. Da die Fructosylamin-Deglycase hochgradig spezifisch für Difructosyllysin ist, kann sie keinen Assay für die spezifische Bestimmung einer Substanz, bei der ein Lysinrest in der ε-Position glykiert ist und/oder ein Valinrest glykiert ist, ergeben. Weiterhin kann ein Verfahren, bei dem eine Alkyllysinase verwendet wird, nicht zuverlässig oder genau sein, da das Enzym unspezifisch ist und auch dann mit Substanzen reagiert, wenn der Lysinrest an eine Nichtzucker-Struktureinheit gebunden ist. Die Fructosylaminosäure-Deglycase aus Penicillium (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-4874) wirkt sowohl auf Fructosyllysin als auch auf Fructosylalanin.
Wie oben beschrieben, können die bereits vorhandenen Enzyme keinen notwendigerweise genauen Assay für die gewünschten Glycoproteine ergeben, und daher besteht Bedarf an der Entwicklung eines Enzyms, das spezifischer für Fructosyllysin als für Fructosylvalin ist.
Für die Verbesserung der Genauigkeit und Brauchbarkeit eines Assays, das einen enzymatischen Prozess beinhaltet, ist es im Allgemeinen wesentlich, ein Enzym mit einer katalytischen Aktivität zu verwenden, die für die Zwecke des Assays geeignet ist. Es ist also notwendig, ein geeignetes Enzym auszuwählen, wobei man viele Faktoren, wie die zu bestimmende Substanz (d.h. das Substrat), den Zustand der Probe und die Messbedingungen, berücksichtigt, um den Assay mit Genauigkeit und Reproduzierbarkeit durchzuführen. Für einen solchen Zweck muss man zuvor viele Enzyme erhalten und ihre Aktivität, Substratspezifität, Temperaturstabilität, pH-Stabilität und dergleichen klären. Daher ist es notwendig, immer mehr Fructosylaminosäure-Oxidasen zu entwickeln und zu charakterisieren.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die Erfinder haben intensive Studien durchgeführt, um eine neue Fructosylaminosäure-Oxidase bereitzustellen, die spezifisch für Amadori-Verbindungen und insbesondere für Glycoprotein ist, und haben herausgefunden, dass ein Penicillium-Stamm, wenn er in Gegenwart von Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N^α-Z-Lysin kultiviert wird, ein Enzym mit der gewünschten Aktivität produziert.
Die vorliegende Erfindung stellt also bereit:

(1) eine Fructosylaminosäure-Oxidase, die durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Penicillium hergestellt wird und die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften hat: 1) sie katalysiert die Oxidation einer Amadori-Verbindung in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von α-Ketoaldehyd, Aminoderivaten und Wasserstoffperoxid; 2) sie ist im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil, wobei das pH-Optimum 7,5 beträgt; 3) sie ist im Temperaturbereich von etwa 15 bis 50 °C stabil, wobei das Temperaturoptimum 25 °C beträgt; und 4) das Molekulargewicht beträgt etwa 38 700 (38,7 kDa), wenn man es anhand einer Gelfiltration mit Superdex^® 200 pg abschätzt;
(2) Penicillium janthinellum S-3413 (FERM BP-5475);
(3) ein Verfahren zur Herstellung einer Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß dem obigen Punkt (1), das das Kultivieren eines Penicillium-Stamms in einem Medium und das Gewinnen des Produkts mit Fructosylaminosäure-Oxidase-Aktivität umfasst;
(4) einen Assay für eine Amadori-Verbindung in einer Probe, der das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß dem obigen Punkt (1) und das Bestimmen der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an erzeugtem Wasserstoffperoxid umfasst;
(5) ein Reagens oder Kit für einen Assay für Amadori-Verbindungen, das bzw. der die Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß dem obigen Punkt (1) umfasst.

Der oben genannte Penicillium-Stamm kann in einem Medium, das Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N^α-Z-lysin enthält, eine Fructosylaminosäure-Oxidase erzeugen.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält ein Medium, das Fructosyllysin enthält, Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N^α-Z-Lysin; es wird zum Kultivieren eines Mikroorganismus, der eine Fructosylaminosäure-Oxidase der vorliegenden Erfindung zu erzeugen vermag, verwendet und umfasst Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N^α-Z-Lysin (das im Folgenden als "FZL" abgekürzt werden kann), das erhalten wird, indem man Glucose 3 bis 60 Minuten lang zusammen mit Lysin und/oder N^α-Z-Lysin bei 100 bis 150 °C autoklaviert. Wie im Folgenden beschrieben, ist die Fructosylaminosäure-Oxidase der vorliegenden Erfindung unerwartet sowohl für Fructosylvalin als auch -lysin spezifisch und ist dadurch gekennzeichnet, dass die Wirkung auf ersteres höher ist. In der gesamten Beschreibung kann der Ausdruck "Fructosylaminosäure-Oxidase" der vorliegenden Erfindung als "FAOD" abgekürzt werden.
Das Enzym der vorliegenden Erfindung kann hergestellt werden, indem man einen Penicillium-Stamm, der ein FAOD produzieren kann, in einem Medium kultiviert, das Fructosyllysin und/oder FZL enthält.
Beispiele für Penicillium-Stämme sind Penicillium janthinellum S-3413 (FERM BP-5475), Penicillium janthinellum (IFO Nr. 4651, 6581, 7905), Penicillium oxalicum (IFO Nr. 5748), Penicillium javanicum (IFO Nr. 7994), Penicillium chrysogenum (IFO Nr. 4897) und Penicillium cyaneum (IFO Nr. 5337).
FAODs der vorliegenden Erfindung haben die folgenden physikalisch-chemischen Merkmale:

1) sie katalysieren die Oxidation einer Amadori-Verbindung in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von α-Ketoaldehyd, Aminoderivaten und Wasserstoffperoxid;
2) sie ist im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil, wobei das pH-Optimum 7,5 beträgt;
3) sie ist im Temperaturbereich von etwa 15 bis 50 °C stabil, wobei das Temperaturoptimum 25 °C beträgt; und
4) das Molekulargewicht beträgt etwa 38 700 (38,7 kDa), wenn man es anhand einer Gelfiltration mit Superdex^® 200 pg abschätzt.

Fructosyllysin und/oder FZL, das für die Herstellung eines FAOD der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann hergestellt werden, indem man 0,01 bis 50 Gew.-% Glucose 3 bis 60 Minuten lang zusammen mit 0,01 bis 20 Gew,-% Lysin und/oder N^α-Z-Lysin in einer Lösung bei 100 bis 150 °C autoklaviert. Insbesondere wird es hergestellt, indem man eine Lösung, die in einem Gesamtvolumen von 1000 ml 200 g Glucose und 10 g N^α-Z-Lysin enthält, 20 Minuten lang bei 120 °C autoklaviert.
Ein Medium, das Fructosyllysin und/oder FZL enthält (im Folgenden als FZL-Medium bezeichnet), kann erhalten werden, indem man nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltenes Fructosyllysin und/oder FZL zu einem der herkömmlichen Medien gibt, aber es kann zweckmäßigerweise hergestellt werden, indem man ein Gemisch (vorzugsweise pH 5,5 bis 6,0), das 0,01 bis 50 Gew.-% Glucose, 0,01 bis 20 Gew.-% Lysin und/oder N^α-Z-Lysin, 0,1 Gew.-% K₂HPO₄, 0,1 Gew.-% NaH₂PO₄, 0,05 Gew.-% MgSO₄·7H₂O, 0,01 Gew.-% CaCl₂·2H₂O und 0,2 Gew.-% Hefeextrakt umfasst, 3 bis 60 Minuten lang bei 100 bis 150 °C autoklaviert.
Das Medium, das für die Herstellung eines FAOD der vorliegenden Erfindung verwendet wird, kann ein synthetisches oder natürliches Medium sein, das in der Technik allgemein verwendet wird, und eine Kohlenstoffquelle, Stickstoffquelle, anorganische Substanzen und andere Nährstoffe enthält. Beispiele für die Kohlenstoffquelle sind Glucose, Xylose und Glycerin; Beispiele für die Stickstoffquelle sind Pepton, Caseinaufschluss und Hefeextrakt; und Beispiele für die anorganische Substanz sind Natrium, Kalium, Calcium, Mangan, Magnesium und Cobalt, die in einem normalen Medium gewöhnlich enthalten sind.
Das FAOD der vorliegenden Erfindung kann im höchsten Ausmaß induziert werden, wenn ein Mikroorganismus, der dasselbe produzieren kann, in einem Medium kultiviert wird, das Fructosyllysin und/oder FZL enthält. Beispiele für ein bevorzugtes Medium sind ein Fructosyllysin und/oder FZL enthaltendes Medium (z.B. 1,0% Glucose, 0,5% Fructosyllysin und/oder FZL, 1,0% K₂HPO₄, 0,1% NaH₂PO₄, 0,05% MgSO₄·7H₂O, 0,01% CaCl₂·2H₂O und 0,01% Vitaminmischung), wobei Fructosyllysin und/oder FZL als einzige Stickstoffquelle und Glucose als Kohlenstoffquelle verwendet werden.
Ein Medium (pH 5,5 bis 6,0), das 20 g (2%) Glucose, 10 g (1%) Fructosyllysin und/oder FZL, 1,0 g (0,1%) K₂HPO₄, 1,0 g (0,1%) NaH₂PO₄, 0,5 g (0,05%) MgSO₄·7H₂O, 0,1 g (0,01%) CaCl₂·2H₂O und 2,0 g (0,2%) Hefeextrakt in 1000 ml Gesamtvolumen enthält, ist besonders bevorzugt.
Das Medium, das Fructosyllysin und/oder FZL enthält, kann hergestellt werden, indem man Fructosyllysin und/oder FZL zu irgendeinem herkömmlichen Medium gibt oder indem man ein Medium autoklaviert, das Glucose zusammen mit Lysin und/oder N^α-Z-Lysin enthält. Das nach einem der beiden Verfahren erhältliche Medium ist durch die Gegenwart von Fructosyllysin und/oder FZL braun gefärbt und wird daher als "durch FZL braun gefärbtes Medium" oder "durch GL (Glycolysin und/oder Glyco-N^α-Z-Lysin) braun gefärbtes Medium" bezeichnet.
Die Kultivierung erfolgt normalerweise in einem Temperaturbereich von 25 bis 37 °C, vorzugsweise 28 °C, in einem Medium mit einem pH-Bereich von 4,0 bis 8,0, vorzugsweise 5,5 bis 6,0. Die Kulturbedingungen können jedoch in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren, wie den Bedingungen der Mikroorganismen, variieren und sollten nicht auf die oben beschriebenen beschränkt werden. Wenn zum Beispiel ein P.-janthinellum-S-3413-Stamm 20 bis 48 Stunden lang, vorzugsweise 36 Stunden lang, unter diesen Bedingungen kultiviert wird, wird FAOD im Kulturmedium angereichert (siehe 1). Dann wird das resultierende Kulturmedium in herkömmlicher Weise behandelt, um Nucleinsäuren und Zellwandfragmente zu entfernen, so dass man ein Enzympräparat erhält.
Da die Enzymaktivität von FAODs der vorliegenden Erfindung normalerweise in Bakterien/Pilzzellen akkumuliert ist, werden die Zellen in der Kultur geerntet und gemahlen, um das Enzym zu extrahieren.
Das Mahlen der Zellen kann in herkömmlicher Weise erfolgen, zum Beispiel mittels mechanischen Mahlens, Selbstverdau mit einem Lösungsmittel, Gefrieren, Ultraschallbehandlung oder Druckbehandlung.
Das Verfahren der Isolierung und Reinigung eines Enzyms ist ebenfalls in der Technik bekannt. Es kann durchgeführt werden, indem man bekannte Verfahren, wie Aussalzen mit Ammoniumsulfat, Fällung mit einem organischen Lösungsmittel, wie Ethanol, Innenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Chromatographie, Gelfiltration und Affinitätschromatographie, miteinander kombiniert.
Zum Beispiel werden Mycelien geerntet, indem man die resultierende Kultur einer zentrifugalen oder Saugfiltration unterzieht, gewaschen, in 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) suspendiert, mit Dyno-Mill gemahlen und zentrifugiert. Dann wird der Überstand als zellfreier Extrakt gereinigt, zum Beispiel durch Fraktionierung mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchromatographie auf DEAE-Sephacel^®.
Für Zwecke der vorliegenden Erfindung kann es sich bei dem FAOD der vorliegenden Erfindung um beliebige enzymhaltige Substanzen und Lösungen handeln, die während des gesamten Reinigungsvorgangs erhältlich sind, unabhängig von der Reinheit des Enzyms, einschließlich des Kulturmediums, solange die Lösung die Fähigkeit hat, die Oxidation von Amadori-Verbindungen, wie sie oben definiert wurden, zu katalysieren.
Weiterhin fallen auch alle Fragmente eines Enzymmoleküls, die mit der enzymatischen Aktivität assoziiert sind und die Fähigkeit besitzen, eine Amadori-Verbindung zu oxidieren, in den Schutzumfang der Erfindung, da solche Fragmente für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ebenfalls geeignet sind.
Das so erhaltene FAOD ist für die Bestimmung von Amadori-Verbindungen, insbesondere Glycoproteinen, bei der Diagnose von Diabetes geeignet.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung von FAOD bereit, das das Kultivieren eines Penicillium-Stammes, der eine FAOD produzieren kann, in einem Medium und das Gewinnen von FAOD aus der resultierenden Kultur umfasst. In einem Aspekt enthält das Medium Fructosyllysin und/oder Fructosyl-N^α-Z-lysin.
P. janthinellum S-3413 (im Folgenden als S-3413-Stamm bezeichnet), einer der Stämme, die FAOD der vorliegenden Erfindung produzieren, ist ein neuer Pilz, der von den Erfindern aus dem Boden isoliert wurde. Die Klassifizierung des isolierten Pilzes erfolgte gemäß der Lehre von Udagawa Shunichi et al., "Kinrui-Zukan", Kodan-sha Scientific, 1993. Seine mykologischen Merkmale werden im Folgenden gezeigt.

(1) Er bildet keine Ascus-Generation.
(2) Er bildet Penicillium-typische Konidien.
(3) Er weist eine birnenförmige Phialide auf, die sich an der Oberseite plötzlich verjüngt und eine lange feine Spitze bildet.
(4) Die Konidien sind verzweigt und breiten sich unregelmäßig aus.
(5) Er bildet kein Sklerotium.
(6) Die Konidienverknüpfung breitet sich merklich aus.
(7) Die Wachstumsbedingungen in Medium sind wie folgt:

Der Stamm S-3413 wurde ursprünglich als inländische Hinterlegung eines Mikroorganismus (FERM P-14867, Hinterlegungsdatum: 14. März 1994) beim "National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology", Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, hinterlegt und am 14. März 1996 unter dem Budapester Abkommen in eine internationale (FERM BP-5475) umgewandelt.
FAODs der vorliegenden Erfindung haben die folgenden Merkmale:
1. Normale Induktionsmerkmale
Das FAOD der vorliegenden Erfindung ist ein mit Fructosyllysin und/oder FZL induzierbares Enzym und wird erzeugt, indem man einen Penicillium-Stamm kultiviert, der in einem Medium, das Fructosyllysin und/oder FZL als Stickstoffquelle und Glucose als Kohlenstoffquelle enthält, FAOD erzeugen kann. Ein FAOD kann in einem durch GL braun gefärbten Medium induziert werden, das man erhält, indem man Glucose zusammen mit Lysin und/oder N^α-Z-Lysin autoklaviert, aber nicht in einem Medium, das Glucose und Lysin und/oder N^α-Z-Lysin enthält, die getrennt autoklaviert werden, was darauf hinweist, dass das Enzym spezifisch für Amadori-Verbindungen ist.
2. Reaktionsspezifität und Substratspezifität
Das FAOD der vorliegenden Erfindung besitzt in der folgenden Reaktion katalytische Wirkung: R¹-CO-CH₂-NH-R² + O₂ + H₂O → R¹-CO-CHO + R²-NH₂ + H₂O₂ wobei R¹ ein Aldoserest ist und R² ein Aminosäure-, Protein- oder Peptidrest ist.
In dem obigen Reaktionsschema sind Amadori-Verbindungen der Formel R¹-CO-CH₂-NH-R², wobei R¹ -OH, -(CH₂)_n- oder -[CH(OH)]_n-CH₂OH ist (wobei n eine ganze Zahl von 0 bis 6 ist) und R² = -CHR³-[CONHR³]_mCOOH ist (wobei R³ ein Seitenkettenrest einer α-Aminosäure ist und m eine ganze Zahl von 1 bis 480 ist), als Substrat bevorzugt. Von diesen sind Verbindungen, bei denen R³ ein Seitenkettenrest einer aus Lysin, Polylysin, Valin und Asparagin ausgewählten Aminosäure ist, n 5 bis 6 ist und m 55 oder weniger ist, besonders bevorzugt.
Die Substratspezifität von FAOD der vorliegenden Erfindung ist in der folgenden Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1 Substratspezifität von gereinigtem FAOD

¹⁾: nicht nachgewiesen
²⁾: Fructosyl-Humanserumalbumin

Wie aus Tabelle 1 hervorgeht, wirkt das FAOD der vorliegenden Erfindung hochspezifisch auf FZL und Fructosylvalin.
Beispiele für FAOD-produzierende Stämme von Penicillium und die Substratspezifität von FAODs sind in der folgenden Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Substratspezifität von FAOD, das aus Penicillium-Stämmen gereinigt wurde, die in FZL-braungefärbtem Medium gezüchtet wurden

¹⁾: nicht nachgewiesen

Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, sind FAODs der vorliegenden Erfindung aktiver gegenüber Fructosylvalin als gegenüber Fructosyllysin, was zeigt, dass das FAOD für die Analyse von Glycohämoglobin geeignet ist.
3. pH- und Temperaturbedingungen
Bestimmung der pH-Bedingungen:
Die pH-Bedingungen wurden bestimmt, indem man FAOD zu einem Gemisch von 0,1 M Essigsäure (Ac), Kaliumphosphatpuffer (K-P), Tris-HCl-Puffer oder Glycin(Gly)-NaOH-Puffer (pH 4,0 bis 11,0) gab, 10 Minuten lang bei 25 °C inkubierte und die Aktivität von FAOD unter Normalbedingungen (25 °C, pH 8,0) bestimmte. Wenn das FAOD der vorliegenden Erfindung nach dem obigen Verfahren bewertet wird, ist es im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0, vorzugsweise pH 6,0 bis 9,0, stabil. Das pH-Optimum beträgt 7,5 (siehe 2).
Bestimmung der Temperaturbedingungen
Die Temperaturbedingung wurde bestimmt, indem man FAOD bei einer Temperatur im Bereich von 15 bis 60 °C zu einem Gemisch von 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gab, 10 Minuten lang unter denselben Bedingungen inkubierte und die Aktivität von FAOD unter Normalbedingungen bestimmte.
Das FAOD der vorliegenden Erfindung ist in einem Temperaturbereich von 15 bis 50 °C, vorzugsweise 15 bis 45 °C, besonders bevorzugt etwa 15 °C, stabil. Die Enzymreaktion verläuft effizient bei 15 bis 45 °C, vorzugsweise 15 bis 40 °C, besonders bevorzugt 25 °C (siehe 3).
4. Bewertung des Titers
Eine Titration wurde wie folgt durchgeführt:
(1) Methode unter Verwendung der kolorimetrischen Bestimmung des erzeugten Wasserstoffperoxids
A. Messung der Erzeugungsgeschwindigkeit
Eine 100 mM Lösung von Fructosylvalin (im Folgenden als FV abgekürzt) wurde hergestellt, indem man FV, das zuvor erhalten wurde, in destilliertem Wasser löste. Zu 100 μl 45 mM 4-Aminoantipyrin, 100 μl Peroxidase (60 E/ml), 100 μl 60 mM Phenol, 1 ml 0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) und 50 μl Enzymlösung wurde destilliertes Wasser gegeben, so dass man ein Gesamtvolumen von 2,95 ml erhielt. Das Gemisch wurde bei 25 °C äquilibriert, und 50 μl 100 mM FV-Lösung wurden hinzugefügt. Dann wurde der zeitliche Verlauf der Extinktion bei 505 nm gemessen. Die in einer Minute erzeugte Menge (μmol) an Wasserstoffperoxid wurde auf der Basis des molaren Extinktionskoeffizienten (5,16 × 10³ M^–1cm^–1) des erzeugten Chinonpigments berechnet. Der resultierende Zahlenwert wurde als eine Einheit (E) der Enzymaktivität genommen.
B. Endpunktmethode
In derselben Weise, wie es bei der obigen Methode A beschrieben ist, wurde eine Lösung hergestellt, und eine Substratlösung wurde hinzugefügt. Nach 30 Minuten Inkubation bei 30 °C wurde die Extinktion bei 505 nm gemessen. Die Enzymaktivität wurde auf der Basis der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid bewertet, wobei man sich auf eine Eichkurve bezog, die zuvor unter Verwendung einer Standard-Wasserstoffperoxidlösung erhalten wurde.
(2) Methode der Bestimmung der Sauerstoffabsorption aufgrund der Enzymreaktion
Zu einem Gemisch von 1 ml 0,1 M Tris-HCL-Puffer (pH 8,0) und 50 μl einer Enzymlösung wurde destilliertes Wasser hinzugefügt, so dass man eine Lösung mit einem Gesamtvolumen von 3,0 ml erhielt. Die resultierende Lösung wurde in eine Zelle einer von Lank Brothers Co. hergestellten Sauerstoffelektrode gefüllt. Die Lösung wurde bei 25 °C gerührt, damit der gelöste Sauerstoff bei dieser Temperatur äquilibriert werden konnte, und 100 μl 50 mM FV wurden hinzugefügt. Dann wurde die Sauerstoffabsorption mit einem Recorder kontinuierlich gemessen, um eine Anfangsgeschwindigkeit zu erhalten. Die Menge des in einer Minute absorbierten Sauerstoffs wurde auf der Basis einer Eichkurve bestimmt und als eine Enzymeinheit genommen.
5. Inhibition, Aktivierung und Stabilisierung des Enzyms
(1) Wirkung von Metall
Zu einer Enzymlösung wurde eine Lösung gegeben, die ein zu testendes Metallion. in einer Endkonzentration von 1 mM in 0,1 M Tris-HCL-Puffer (pH 8,0) enthielt. Nach 5 Minuten Inkubation bei 30 °C wurde die Enzymaktivität bewertet. Die Ergebnisse sind unten in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3 Wirkung von Metallionen auf die Aktivität von FAOD aus P. janthinellum S-3413
Wie aus Tabelle 3 hervorgeht, scheint die Aktivität des FAOD der vorliegenden Erfindung durch Kupfer- und Bariumionen gehemmt zu werden und wird durch Cobalt-, Zink-, Silber- und Quecksilberionen stark gehemmt.
(2) Wirkung verschiedener Inhibitoren
Die hemmende Wirkung verschiedener Substanzen wurde in einer Weise getestet, die der oben unter (1) beschriebenen im Wesentlichen analog war. Im vorliegenden Test betrug die Endkonzentration an Quecksilber(II)-para-chlorbenzoat (PCMB) 0,1 mM, während die von anderen Substanzen 1 mM betrug. Die Ergebnis se sind in Tabelle 4 gezeigt. Die stabilisierende Wirkung wurde untersucht, indem man das gereinigte FAOD über Nacht gegen 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1 mM Dithiothreit (DTT) enthielt, dialysierte und die Enzymaktivität bestimmte.
Tabelle 4 Wirkung verschiedener Inhibitoren auf die FAOD-Aktivität

¹⁾: PCMB, para-Chlorquecksilberbenzoat
²⁾: DTNB, 5,5'-Dithiobis(2-nitrobenzoesäure)
³⁾: EDTA, Ethylendiamintetraessigsäure

Aus Tabelle 4 geht hervor, dass die Aktivität von FAOD durch PCMB, DTNB, Hydrazin, Phenylhydrazin und Hydroxylamin stark gehemmt wird, was darauf hinweist, dass eine SH- und/oder Carbonylgruppe eine wichtige Rolle bei der Enzymreaktion spielt.
Das Enzym wird durch Dithiothreit (DTT) stabilisiert, und ein zu bevorzugendes Lösungsmittel für die Konservierung ist 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1 mM DTT enthält.
6. Molekulargewicht
Das Molekulargewicht beträgt etwa 38 700 (38,7 kDa), wenn man es anhand einer Gelfiltration auf Superdex^® 200 pg bestimmt (siehe 4).
SDS-PAGE (Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) wurde nach der Davis-Methode durchgeführt, wobei man ein 10%-Gel mit 40 mA während 3 Stunden verwendet und die Proteine mit Coomassie^®-Brillantblau G-250 anfärbte. Wenn das Molekulargewicht einer Untereinheit von FAOD durch SDS-PAGE unter Verwendung einer Eichkurve bestimmt wurde, die man erhielt, indem man Standardproteine einschließlich Phosphorylase B, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Kohlensäure-Anhydrase und Soja-Trypsin-Inhibitor in derselben Weise einer Elektrophorese unterzog, betrug es etwa 48 700 (48,7 kDa) (siehe 5). Dies deutet darauf hin, dass das FAOD der vorliegenden Erfindung ein Monomer ist.
7. Vergleich mit bekannten Enzymen
FAOD der vorliegenden Erfindung wurde mit bekannten, von verschiedenen Mikroorganismen abgeleiteten Fructosylaminosäure-Oxidasen verglichen.
Tabelle 5 Vergleich von Fructosylaminosäure-Oxidasen, die von verschiedenen Mikroorganismen abgeleitet sind

¹⁾: T. Horiuchi et al., Agric. Biol. Chem., 53 (1), 103–110 (1989)
²⁾: T. Horiuchi et al., Agric. Biol. Chem., 55 (2), 333–338 (1991)
³⁾: spezifische Aktivität gegenüber Fructosyl-N^α-Z-lysin
⁴⁾: spezifische Aktivität gegenüber N^ε-D-Fructosyl-N^α-formyllysin

Wie aus Tabelle 5 hervorgeht, können die folgenden Unterschiede zwischen FAOD der vorliegenden Erfindung und anderen, die von zwei Stämmen abgeleitet sind, beobachtet werden.

(1) Molekulargewicht: FAOD der vorliegenden Erfindung ist ein Monomer, während die anderen Dimere sind.
(2) Coenzym: FAOD der vorliegenden Erfindung erfordert kovalent gebundenes FAD, während die anderen nichtkovalent gebundenes FAD erfordern.
(3) pH-Optimum, Temperaturoptimum und Hemmung durch SH-Reagentien: Die Daten weisen darauf hin, dass FAOD der vorliegenden Erfindung von anderen Enzymen unterscheidbar ist.

Der Unterschied zwischen FAOD der vorliegenden Erfindung und der von Penicillium abgeleiteten Fructosylaminosäure-Deglycase (Japanische Offenlegungsschrift Nr. 4-4874) ist im Folgenden gezeigt.

(1) Substratspezifität: Die Fructosylaminosäure-Deglycase wirkt auf Fructosyllysin und Fructosylalanin, während FAOD der vorliegenden Erfindung auf Fructosyllysin und Fructosylvalin wirkt, wobei Fructosylvalin bevorzugt ist.
(2) Induktionsspezifität: Die Fructosylaminosäure-Deglycase kann in einem von Fructosylaminosäure freien Medium erzeugt werden, während FAOD der vorliegenden Erfindung induziert wird, indem man einen Penicillium-Stamm in einem Medium wachsen lässt, das Fructosyllysin enthält.
(3) Herstellungsverfahren: FAOD der vorliegenden Erfindung wird effizient hergestellt, indem man einen Penicillium-Stamm in "braungefärbtem Medium" kultiviert.

Wie oben diskutiert, ist das FAOD der vorliegenden Erfindung für einen Assay für Amadori-Verbindungen geeignet. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung einen Assay für eine Amadori-Verbindung in einer Probe bereit, der das In-Kontakt-Bringen der Probe, die die Amadori-Verbindung enthält, mit dem FAOD der vorliegenden Erfindung und das Bestimmen der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an erzeugtem Wasserstoffperoxid umfasst. Der Assay der vorliegenden Erfindung beruht auf der Messung der Menge an Glycoprotein und/oder der Glykierungsrate oder der Bestimmung von Fructosylamin in einer von einem lebenden Körper abgeleiteten Probe.
Die Enzymaktivität eines FAOD wird anhand des folgenden Reaktionsschemas bewertet: R¹-CO-CH₂-NH-R² + O₂ + H₂O → R¹-CO-CHO + R²-NH₂ + H₂O₂ wobei R¹ ein Aldoserest ist und R² ein Aminosäure-, Protein- oder Peptidrest ist.
Als zu testende Probelösung können beliebige Lösungen verwendet werden, die eine oder mehrere Amadori-Verbindungen enthalten, zum Beispiel solche, die aus Lebensmitteln stammen, wie Sojasauce, und solche, die aus einem lebenden Körper stammen, wie Blut (z.B. Vollblut, Plasma oder Serum) oder Urin.
Das FAOD der vorliegenden Erfindung wird mit einer Probe umgesetzt, die eine Amadori-Verbindung in einem geeigneten Puffer enthält. Der geeignete pH-Wert und die geeignete Temperatur des Reaktionsgemischs können zwar in Abhängigkeit von dem zu verwendenden Enzym und der zu testenden Probe variieren, doch können sie innerhalb des oben definierten Bereichs liegen, d.h. pH 6,0 bis 9,0, vorzugsweise 7,5, und eine Temperatur von 15 bis 45 °C, vorzugsweise 15 bis 40 °C. Als Puffer kann Kaliumphosphatpuffer verwendet werden.
Die in einem Assay zu verwendende Menge an FAOD beträgt im Falle der Endpunktmethode normalerweise 0,1 Einheiten/ml oder mehr, vorzugsweise 1 bis 100 Einheiten/ml.
Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann die Bestimmung von Amadori-Verbindungen nach einem der im Folgenden gezeigten bekannten Assays durchgeführt werden.
(1) Verfahren auf der Basis der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid
Die Menge der Amadori-Verbindungen in einer Probe kann gemäß einem Verfahren zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid, wie einem kolorimetrischen Verfahren oder einem Verfahren unter Verwendung einer Wasserstoffperoxidelektrode, anhand der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid abgeschätzt werden. Die Menge der Amadori-Verbindung in einer Probe wird dann unter Verwendung einer Eichkurve abgeschätzt, die die Beziehung zwischen der Menge des Wasserstoffperoxids und der Menge der Amadori-Verbindungen betrifft. Insbesondere kann die Abschätzung in einer ähnlichen Weise erfolgen, wie es oben unter "4. Bewertung des Titers" beschrieben ist, außer dass die Menge an FAOD 1 Einheit/ml beträgt und dass die zu testende Probe vor der Messung des erzeugten Wasserstoffperoxids verdünnt wird.
Als farbentwickelndes System für Wasserstoffperoxid können beliebige Systeme verwendet werden, die aufgrund der oxidativen Kondensation zwischen einem Chromogen, wie Phenol, und einem Koppler, wie 4-Aminoantipyrin, 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon, in Gegenwart von Peroxidase eine Farbe entwickeln. Beispiele für das Chromogen sind Phenolderivate, Anilinderivate und Toluidinderivate, zum Beispiel N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidin, N,N-Dimethylanilin, N,N-Diethylanilin, 2,4-Dichlorphenol, N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethoxyanilin, N-Ethyl-N-(3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin und N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3,5-dimethylanilin. Ein farbentwickelndes Mittel des Leukotyps, das bei Oxidation in Gegenwart von Peroxidase eine Farbe entwickelt, ist ebenfalls verfügbar. Solche "farbentwickelnden Mittel des Leukotyps" sind in der Technik bekannt, und Beispiele dafür sind o-Dianisidin, o-Tolidin, 3,3-Diaminobenzidin, 3,3,5,5-Tetramethylbenzidin, N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4-bis(dimethylamino)biphenylamin und 10-(Carboxymethylaminocarbonyl)-3,7-bis(dimethylamino)phenothiazin.
(2) Bestimmung anhand der Menge an verbrauchtem Sauerstoff
Die Menge einer Amadori-Verbindung in einer Probe kann anhand der Menge an verbrauchtem Sauerstoff abgeschätzt werden, die berechnet wird, indem man die Sauerstoffmenge am Ende der Reaktion von der Menge zu Beginn der Reaktion subtrahiert, wobei man eine Eichkurve verwendet, die die Beziehung zwischen der Menge des verbrauchten Sauerstoffs und der Menge der Amadori-Verbindungen betrifft. Insbesondere kann die Abschätzung in einer ähnlichen Weise wie bei der oben unter "4. Bewertung des Titers" beschriebenen Titration erfolgen, außer dass die Menge an FAOD 1 Einheit/ml beträgt und dass die hinzuzufügende Probe vor der Messung des verbrauchten Sauerstoffs zuvor in geeigneter Weise verdünnt wird.
Gemäß dem Assay der vorliegenden Erfindung kann eine Probelösung so, wie sie ist, verwendet werden, aber unter bestimmten Umständen kann es bevorzugt sein, die Probe vorzubehandeln, um den Lysin- und/oder Valinrest freizusetzen, an den der Zucker im Glycoprotein gebunden ist.
Für diesen Zweck wird die Probe mit einer Protease (enzymatische Methode) oder mit einer chemischen Substanz, wie Salzsäure (chemische Methode), behandelt. Die enzymatische Methode wird bevorzugt. In einem solchen Fall können bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung Proteasen des endo- und exo-Typs, die in der Technik bekannt sind, verwendet werden. Beispiele für Proteasen des endo-Typs sind Trypsin, α-Chymotrypsin, Subtilisin, Proteinase K, Papain, Kathepsin B, Pepsin, Thermolysin, Protease XIV, Lysylendopeptidase, Pronase und Bromelain F. Beispiele für Proteasen des exo-Typs sind Aminopeptidase und Carboxypeptidase. Das Verfahren der Enzymbehandlung ist ebenfalls bekannt, und zum Beispiel kann die Trypsinbehandlung so durchgeführt werden, wie es in den folgenden Beispielen beschrieben ist.
Wie oben erwähnt, ist das FAOD der vorliegenden Erfindung spezifisch für Fructosylvalin und ist dadurch für einen Assay von Glycohämoglobin geeignet. In einem anderen Aspekt ist das FAOD der vorliegenden Erfindung spezifisch für Fructosyllysin, das in einem Glycoprotein vorhanden ist, und ist für die Diagnose und Steuerung der Bedingungen von Diabetes geeignet, was das Messen von Glycoproteinen in einer Blutprobe umfasst.
Wenn ein Assay mit Blut (z.B. Vollblut, Plasma oder Serum) durchzuführen ist, kann eine von einem lebenden Körper stammende Blutprobe so, wie sie ist, oder nach einer Vorbehandlung, wie Dialyse, verwendet werden.
Weiterhin können Enzyme (z.B. FAOD oder Peroxidase), die bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, in flüssigem Zustand oder nach Immobilisieren auf einem geeigneten festen Träger verwendet werden. Zum Beispiel kann eine Säule, die mit auf Kügelchen immobilisiertem Enzym gepackt ist, verwendet werden, um eine automatische Vorrichtung zur Bestimmung von Glycoprotein zu erhalten, die die Effizienz eines Routineassays, wie einer klinischen Untersuchung, bei der viele Proben genau und schnell getestet werden müssen, verbessern muss. Das immobilisierte Enzym hat noch einen weiteren Vorteil im Hinblick auf die Wirtschaftlichkeit, da es wiederholt verwendet werden kann.
Weiterhin ist es möglich, einen Kit bereitzustellen, indem man ein oder mehrere Enzyme in geeigneter Weise mit einem oder mehreren farbentwickelnden Reagentien kombiniert. Ein solcher Kit ist sowohl für den klinischen Assay als auch für die Analyse von Lebensmitteln auf Amadori-Verbindungen geeignet.
Die Immobilisierung des Enzyms kann nach einem in der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel wird sie nach einem Trägerbindungsverfahren, einem Vernetzungsverfahren, Einschlussverfahren oder Komplexbildungsverfahren durchgeführt. Beispiele für Träger sind Polymergel, Mikrokapsel, Agarose, Alginsäure und Carrageen. Das Enzym kann nach einem in der Technik trekannten Verfahren über eine kovalente Bindung, ionische Bindung, durch physikalische Absorption oder biochemische Affinität an einen Träger gebunden werden.
Wenn ein immobilisiertes Enzym verwendet wird, kann der Assay im Durchfluss- oder diskontinuierlichen System durchgeführt werden. Wie oben beschrieben, eignet sich das immobilisierte Enzym besonders gut für einen Routineassay (klinische Untersuchung) von Glycoproteinen in Blutproben. Bei der klinischen Untersuchung für die Diagnose von Diabetes wird das Ergebnis als Kriterium für die Diagnose als Konzentration an Glycoprotein oder Glykierungsrate, d.h. das Verhältnis der Konzentration des Glycoproteins zu der des gesamten Proteins in der Probe, oder als Menge an Fructosylamin ausgedrückt. Die gesamte Proteinkonzentration kann in herkömmlicher Weise bestimmt werden, zum Beispiel durch die Messung der Extinktion bei 280 nm, nach dem Bradford-Verfahren, dem Lowry-Verfahren, dem Kugelverfahren, anhand der natürlichen Fluoreszenz von Albumin oder der Extinktion von Hämoglobin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Reagens oder einen Kit bereit, das bzw. der in einem Assay für Amadori-Verbindungen verwendet wird, das bzw. der in einem Aspekt der Erfindung ein FAOD der vorliegenden Erfindung sowie einen Puffer umfasst, dessen pH-Wert vorzugsweise 6,0 bis 9,0, besonders bevorzugt 7,5, beträgt. Wenn das FAOD immobilisiert ist, kann der feste Träger aus einem Polymergel und dergleichen ausgewählt sein, und Alginsäure wird bevorzugt.
Im Falle eines Endpunktassays enthält das Reagens gewöhnlich 1 bis 100 Einheiten FAOD pro ml für jede Probe sowie Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) als Puffer.
Wenn Amadori-Verbindungen auf der Basis des erzeugten Wasserstoffperoxids bestimmt werden, können jedes farbentwickelnde System, das aufgrund einer oxidativen Kondensation eine Farbe entwickelt, und farbentwickelnde Mittel des Leukotyps verwendet werden, wie es oben in "(1) Verfahren auf der Basis der Menge an erzeugtem Wasserstoffperoxid" beschrieben ist.
Das in dem Assay der vorliegenden Erfindung für Amadori-Verbindungen verwendete Reagens kann mit einem geeigneten Farbentwicklungsmittel zusammen mit einem Farbkriterium oder einer Standardsubstanz kombiniert werden, was einen Kit ergibt, der für eine vorläufige Diagnose oder Untersuchung geeignet ist.
Das oben beschriebene Reagens bzw. der oben beschriebene Kit wird zur Messung der Menge des Glycoproteins und/oder der Glykierungsrate oder zur Bestimmung von Fructosamin in einer von einem lebenden Körper stammenden Probe verwendet.
Wie oben beschrieben ist, ist das FAOD der vorliegenden Erfindung spezifisch sowohl für Fructosyllysin als auch für Fructosylvalin und eignet sich daher für die Entwicklung von neuen klinischen Assays und Lebensmittelanalysen und trägt dadurch zur Diagnose von Diabetes und zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln bei. Insbesondere wird erwartet, dass es für eine Diagnose von Diabetes geeignet ist, wenn die Menge des Glycoproteins und/oder die Glykierungsrate oder die Menge an Fructosylamin im Blut als Hinweis für die Diagnose oder Kontrolle von Diabeteszuständen verwendet wird. Es ist jetzt möglich, Glycoproteine mit Hilfe eines Assays unter Verwendung eines Reagens der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung von Amadori-Verbindungen genau und effizient zu bestimmen, was die Diagnose oder Kontrolle von Diabeteszuständen erleichtert.
Kurze Erklärung der Zeichnungen
1 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Kulturzeit und der Menge des in einem Kulturmedium durch P. janthinellum S-3413 erzeugten FAOD zeigt.
2 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem pH-Optimum und der Aktivität von FAOD in einem Lösungsmittel zeigt.
3 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen dem Temperaturoptimum und der Aktivität von FAOD in einem Lösungsmittel zeigt.
4 ist eine Graphik, die das durch Gelfiltration auf Superdex^® 200 pg gemessene Molekulargewicht von FAOD zeigt.
5 ist ein Photo, das das Migrationsmuster eines aus P. janthinellum S-3413 gereinigten FAOD auf SDS-PAGE zeigt.
6 zeigt das Absorptionsspektrum eines aus P. janthinellum S-3413 gereinigten FAOD.
7 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Menge an glykiertem Hämoglobin und der Menge des aufgrund der FAOD-Wirkung erzeugten Wasserstoffperoxids zeigt.
8 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Menge an glykiertem Hämoglobin und der Menge des aufgrund der FAOD-Wirkung erzeugten Wasserstoffperoxids zeigt.
9 ist eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Hämoglobin-Alc-Konzentration und der Menge des aufgrund der FAOD-Wirkung erzeugten Wasserstoffperoxids zeigt.
Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung ausführlicher, sollen deren Umfang jedoch nicht einschränken.
Beispiel 1: Fermentierung von P. janthinellum S-3413 und Reinigung von FAOD
1) Fermentierung
P. janthinellum S-3413 (FERM BP-5475) wurde in ein Medium (pH 6,0, 10 l) eingeimpft, das 0,5% FZL, 1,0% Glucose, 0,1% K₂HPO₄, 0,1% NaH₂PO₄, 0,05% MgSO₄, 0,01% CaCl₂ und 0,2% Hefeextrakt enthielt, und 36 Stunden lang bei 28 °C unter Belüftung (2 l/min) und Rühren (500 U/min) mit Hilfe eines Flaschenfermenters gezüchtet. Die Kultur wurde filtriert, um Mycelien zu ernten.
2) Herstellung des Rohextrakts
Ein Teil der Mycelien (410 g, Nassgewicht) wurde in 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5, 800 ml), der 0,1 mM DTT enthielt, suspendiert und mit einer Dino-Mill gemahlen. Das gemahlene Gemisch wurde 20 Minuten lang mit 9500 U/min zentrifugiert, wobei man den Überstand (zellfreier Extrakt) als Rohextrakt erhielt, der dann einer Reinigung unterzogen wurde.
Reinigung
Zu dem Rohextrakt wurde Ammoniumsulfat bis 40% Sättigung gegeben, und das Gemisch wurde 10 Minuten lang mit 12 000 U/min zentrifugiert. Zu dem Überstand wurde Ammoniumsulfat bis 75% Sättigung gegeben, und es wurde gerührt und 10 Minuten lang mit 12 000 U/min zentrifugiert.
Die Niederschläge wurden in 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1 mM DTT enthielt (im Folgenden als "Puffer A" bezeichnet), gelöst, und die Lösung wurde über Nacht gegen Puffer A dialysiert, wobei das Dialyse-Lösungsmittel zweimal gewechselt wurde. Die resultierende Enzymlösung wurde auf eine DEAE-Sephacel^®-Säule (4,2 × 26 cm) aufgetragen, die mit Puffer A äquilibriert worden war. Aktivität wurde in den Waschfraktionen mit Puffer A beobachtet, die aufgefangen und einer Fraktionierung mit Ammoniumsulfat im Bereich von 0 bis 55% Sättigung unterzogen wurden. Die resultierende Substanz wurde auf einer Säule mit Phenyl-Sepharose^® 6FF (niedriger Substitutionsgrad) (HR 10/10), die mit dem 25% Ammoniumsulfat enthaltenden Puffer A äquilibriert worden war, adsorbiert. Nach dem Waschen mit demselben Puffer wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von 25 bis 0% Sättigung von Ammoniumsulfat eluiert. Die aktiven Fraktionen wurden vereinigt, mit Ammoniumsulfat konzentriert und einer Gelfiltration auf einer Säule mit Superdex^® 200 pg unterworfen, das mit 0,2 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), der 0,1 M DTT enthielt, äquilibriert worden war, was ein gereinigtes Enzympräparat von 70 bis 100 Einheiten ergab.
Dre Gelfiltration mit Superdex^® 200 pg ergab auf der Basis einer Eichkurve, dass das Molekulargewicht etwa 38 700 (38,7 kDa) betrug, wie in 4 gezeigt ist.
Das gereinigte Enzym wurde zur Bestimmung des Molekulargewichts durch SDS-PAGE nach der Davis-Methode verwendet, wobei man ein 10%-Gel mit 40 mA während 3 Stunden verwendete und die Proteine mit Coomassie^®-Brillantblau G-250 anfärbte. Das Molekulargewicht wurde mit Hilfe einer Eichkurve abgeschätzt, die hergestellt wurde, indem man Standardproteine einschließlich Phosphorylase B, Rinderserumalbumin (BSA), Ovalbumin, Kohlensäure-Anhydrase und Soja-Trypsin-Inhibitor in derselben Weise einer Elektrophorese unterzog. SDS-PAGE zeigte, dass das Molekulargewicht der gereinigten Enzym-Untereinheit etwa 48 700 (48,7 kDa) betrug (siehe 5).
Das UV-Absorptionsspektrum des gereinigten Enzyms ist in 6 gezeigt, die darauf hinweist, dass das Enzym ein Flavin-Enzym ist.
Weiterhin zeigte das in Beispiel 1 hergestellte FAOD hinsichtlich der Enzymaktivität, des pH-Werts und der Temperaturstabilität und der Wirkung von Metallen und Inhibitoren dieselben Werte oder physikalisch-chemischen Eigenschaften, wie sie oben beschrieben sind.
Beispiel 2: Bestimmung von alykiertem Hämoglobin
1) Vorbereitung der Probe

Eine Probelösung als Substrat für FAOD wurde wie folgt hergestellt. Zu einer Lösung von 0 bis 15 mg Glycohämoglobin-Kontrolle E (Sigma) in 100 μl destilliertem Wasser wurde 1 ml Chlorwasserstoffsäure in Aceton (1 N HCl/Aceton, 1:100) gegeben. Das Gemisch wurde 10 min lang mit 12 000 U/min zentrifugiert, und die Sedimente wurden mit 500 μl Diethylether gewaschen und unter Vakuum bis zur Trockne konzentriert. Zu dem Rückstand wurden 100 μl 8 M Harnstoff gegeben. Das resultierende Gemisch wurde 20 Minuten lang in siedendem Wasser erhitzt, abgekühlt, mit 300 μl 5,4 E/ml Trypsin gemischt, 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und 5 Minuten lang in siedendem Wasser erhitzt, wobei man eine Probelösung erhielt. 2) Bestimmung der Aktivität

3 mM N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4-bis(dimethylamino)biphenylamin-Lösung	30 μl
Peroxidase-Lösung (60 Einheiten/ml)	30 μl
0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)	300 μl
FAOD-Lösung (25 Einheiten/ml)	5 μl

Die FAOD-Lösung (25 Einheiten/ml) wurde hergestellt, indem man das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte FAOD mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) verdünnte. Nachdem alle oben aufgeführten Reagentien miteinander kombiniert worden waren, wurde das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 1 ml eingestellt, was ein FAOD-Reaktionsgemisch ergab. Zu dem FAOD-Reaktionsgemisch wurde eine Probenlösung (150 μl) als oben unter 1) erhaltenen Substrat gegeben. Das Gemisch wurde bei 30 °C inkubiert, und 30 Minuten später wurde die Extinktion bei 727 nm gemessen, um die Beziehung zwischen der Menge des glykierten Hämoglobins und der Extinktion zu bewerten.
3 Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt, wobei die Ordinate die Extinktion bei 727 nm angibt, was der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids entspricht, und die Abszisse die Menge des glykierten Hämoglobins angibt. 7 zeigt, dass die Menge des glykierten Hämoglobins und die Menge des Wasserstoffperoxids miteinander korrelieren.
Beispiel 3: Bestimmung von glykiertem Nämoglobin
1) Vorbereitung der Probe

Eine Probelösung als Substrat für FAOD wurde wie folgt hergestellt. Zu einer Lösung von 30 mg Glycohämoglobin-Kontrolle E (Sigma) in 200 μl destilliertem Wasser wurde 1 ml 570 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,8), der 8 M Harnstoff, 0,2% Dinatrium-EDTA und 40 μl 2-Mercaptoethanol enthielt, gegeben, und das Gemisch wurde 2 Stunden lang unter Stickstoffatmosphäre stehen gelassen. Nach der Zugabe von 400 μl 1 M Natriumiodacetat wurde das Gemisch 30 Minuten lang stehen gelassen, und dann wurden weitere 40 μl 2-Mercaptoethanol hinzugefügt. Das Gemisch wurde gegen 0,1 M Ammoniumhydrogencarbonat dialysiert, mit 10 ml 10 mg/ml TPCK-Trypsin gemischt, 3 Stunden lang bei 37 °C inkubiert und 5 Minuten lang in siedendem Wasser erhitzt, wobei man eine Probelösung erhielt. 2) Bestimmung der Aktivität

3 mM N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4-bis(dimethylamino)biphenylamin-Lösung	30 μl
Peroxidase-Lösung (60 Einheiten/ml)	30 μl
0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)	300 μl
FAOD-Lösung (25 Einheiten/ml)	10 μl
Probe	0 bis 13,2 mg

Die FAOD-Lösung (25 Einheiten/ml) wurde hergestellt, indem man das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte FAOD mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) verdünnte. Nachdem alle oben aufgeführten Reagentien miteinander kombiniert worden waren, wurde das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 900 μl eingestellt, wobei man ein FAOD-Reaktionsgemisch erhielt. Das FAOD-Reaktionsgemisch wurde bei 30 °C inkubiert, und 30 Minuten später wurde die Extinktion bei 727 nm gemessen, um die Beziehung zwischen der Menge des glykierten Hämoglobins und der Extinktion zu bewerten.
3) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt, wobei die Ordinate die Extinktion bei 727 nm angibt, was der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids entspricht, und die Abszisse die Menge des glykierten Hämoglobins angibt. 8 zeigt, dass die Menge des glykierten Hämoglobins und die Menge des Wasserstoffperoxids miteinander korrelieren.
Beispiel 4: Messung der Hämoglobin-Alc-Konzentration
1) Vorbereitung der Probe
Eine Probelösung als Substrat wurde wie folgt hergestellt. Hämoglobin-A0-Reagens (Sigma Co.) wurde in destilliertem Wasser gelöst, was eine 2,3 mM Lösung ergab, die unter Verwendung einer automatischen Glycohämoglobin-Messvorrichtung (Kyoto Daiichi Kagaku Co. Ltd.) fraktioniert wurde. Fraktionen, die jeweils gereinigtes Hämoglobin Alc und Hämoglobin A0 enthielten, wurden aufgefangen. Probelösungen als Substrat, die jeweils eine unterschiedliche Hämoglobin-Alc-Konzentration von 0% bis 52,0% aufweisen, wurden hergestellt, indem man diese Fraktionen in unterschiedlichen Verhältnissen miteinander mischte.
2) Vorbehandlung der Probe
Ein 200-μl-Gemisch aus 250 μg einer oben in 1) erhaltenen Probelösung, 5 μl 500 E/ml Aminopeptidase und 15 μl 1,0 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) in destilliertem Wasser wurden 30 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 200 μl 10%iger Trichloressigsäure wurde das Gemisch gerührt, 20 Minuten lang bei 0 °C stehen gelassen und 10 Minuten lang mit 12 000 U/min zentrifugiert.

Der resultierende Überstand wurde mit etwa 40 μl 5 N NaOH neutralisiert. 3) Bestimmung der Aktivität

3 mM N-(Carboxymethylaminocarbonyl)-4,4-bis(dimethylamino)biphenylamin-Lösung	100 μl
Peroxidase-Lösung (60 Einheiten/ml)	100 μl
0,1 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)	1000 μl
FAOD-Lösung (16 Einheiten/ml)	15 μl
Probe	0 bis 13,2 mg

Die FAOD-Lösung (16 Einheiten/ml) wurde hergestellt, indem man das in Beispiel 1 erhaltene gereinigte FAOD mit 0,1 M Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) verdünnte. Nachdem alle oben aufgeführten Reagentien miteinander kombiniert worden waren, wurde das Gesamtvolumen mit destilliertem Wasser auf 2,6 ml eingestellt, wobei man ein FAOD-Reaktionsgemisch erhielt. Das FAOD-Reaktionsgemisch wurde 2 Minuten lang bei 30 °C inkubiert. Nach der Zugabe von 400 μl des oben in 2) erhaltenen vorbehandelten Substrats wurde das Gemisch weitere 30 Minuten lang inkubiert und dann einer Messung der Extinktion bei 727 nm unterzogen, um die Beziehungen zwischen der Hämoglobin-Alc-Konzentration eines Substrats und der Extinktion zu bewerten.
4) Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt, wobei die Ordinate die Extinktion bei 727 nm angibt, was der Menge des erzeugten Wasserstoffperoxids entspricht, und die Abszisse die Hämoglobin-Alc-Konzentration angibt. 9 zeigt, dass die Hämoglobin-Alc-Konzentration und die Menge des Wasserstoffperoxids miteinander korrelieren.

Claims

Fructosylaminosäure-Oxidase, die durch Kultivieren eines Stammes der Gattung Penicillium hergestellt wird und die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften hat: 1) sie katalysiert die Oxidation einer Amadori-Verbindung in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von α-Ketoaldehyd, Aminoderivaten und Wasserstoffperoxid; 2) sie ist im pH-Bereich von 4,0 bis 11,0 stabil, wobei das pH-Optimum 7,5 beträgt; 3) sie ist im Temperaturbereich von etwa 15 bis 50 °C stabil, wobei das Temperaturoptimum 25 °C beträgt; und 4) das Molekulargewicht beträgt etwa 38 700 (38,7 kDa), wenn man es anhand einer Gelfiltration mit Superdex^® 200 pg abschätzt.
Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß Anspruch 1, die auf Fructosylvalin und/oder Fructosyllysin wirkt.
Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Penicillium-Stamm aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Penicillium janthinellum S-3413 (FERM BP-5475), Penicillium janthinellum (IFO Nr. 4651, 6581, 7905), Penicillium oxalicum (IFO Nr. 5748), Penicillium javanicum (IFO Nr. 7994), Penicillium chrysogenum (IFO Nr. 4897) und Penicillium cyaneum (IFO Nr. 5337) besteht.
Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß Anspruch 2, wobei es sich bei dem Penicillium-Stamm um Penicillium janthinellum S-3413 (FERM BP-5475) handelt.
Penicillium janthinellum S-3413 (FERM BP-5475).
Verfahren zur Herstellung einer Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß Anspruch 1, das das Kultivieren eines Penicillium-Stamms in einem Medium und das Gewinnen des Produkts mit Fructosylaminosäure-Oxidase-Aktivität umfasst.
Assay für eine Amadori-Verbindung in einer Probe, umfassend das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einer Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 und das Bestimmen der Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder an erzeugtem Wasserstoffperoxid.
Reagens oder Kit für einen Assay für Amadori-Verbindungen, das bzw. der die Fructosylaminosäure-Oxidase gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 umfasst.