DE2906737A1 - L-lysin- alpha -oxidase, verfahren zu ihrer gewinnung und ihre verwendung - Google Patents

Description

"L-Lysin-O^-oxidase, Verfahren zu ihrer Gewinnung und ihre Verwendung "

beanspruchte 27. Februar 1978, Japan, Nr. 20993/1978 Prioritäten: 16. Juni 1978, Japan, Nr, 7 3441/]978 22. September 1978,Japan,Nr. 115867/1978

Bisher wurde die Anwesenheit von L-Aminosäure-oxidasen in MicroorgöinJ sir.en, Schlangengift, der Rattenniere, der Geflügelleber und bei Ni.chtvertebrat.on beschrieben (Arch Biocheia. Biophys,, Ed. 146, S.54-63, 1971; J ,Bacteriology, Bd-. 121/11, S.656-662, 1975; und Tatfpa^is!>itsu,Kaku£an,Kosa, Bd, !7/Ii,

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INSPECTED

.· *Ϋ mm

S.42-45, 1972). Eine L-Aminosäure-oxidase mit sehr hoher Substratspesifitat für L-Lysin wurde bisher noch nicht beschrieben. Das heißt, die bekannten L-Aminosäure-oxidasen zeigen nur eine sehr geringe Enzymaktivität für L-Lysin, mit der Ausnahme eines L~7\roir.osäure~oxidase-Präparats aus Truthahnleber, das eine sehr hohe Aktivität für L-Lysin hat. Das Enzym aus der Truthahnleber oxidiert jedoch auch ver-

außer
schiedene andere Aminosäuren / L-Lysin, z.B. L-Arginin, L-Histidin und L-Ornithin, mit einer Geschwindigkeit, die gleich oder größer als die Oxidationsgeschwindigke.it von L-Lysin ist. Somit kann dieses Oxidase-Präparat nicht als ein Enzym angesehen werden, das eine speziell hohe Substratspezi fitat für L-Lysin hat.

Als L-Arainosäure-abbauende Enzyme mit Antitumoraktivität

sind L-Asparaginase (Tanpakushitsu.Keikusan.Koso, Bd. 15/V, S. 515, 1970), L-Glutaminase (Nature, Bd. 227, S.1136, 197Ο und Science, Bd. 172, S.732, 1971), L-Phenylalanin-ammoniak-lyase (Cancer Res., Bd. 32, S. 285, 1972, und Bd. 33, S,2529, 1973), L-Methionin-|"-lyase (Cancer Res., Bd. 33, S. 1866, 1973), L-Tyrosin-phenol-lyase (Cancer Res., Bd. 36, S. 167, 1976), L-Leucin-dehydrogenase (FEBS Letters, Bd. 33, S. 286, 1973) und Threonin-desaminase (Cancer Res., Bd. 37, S. 2523, 1977) beschrieben worden. Bisher ist jedoch keine L-Aminosäure-oxidase mit Antitumoraktivität bekannt geworden.

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Gegenstand der Erfindung ist somit eine L-Lysin-crt-oxidase, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie aus L-Lysin durch oxidative Desaminierung in Gegenwart von Wasser und Sauerstoff, o/-Keto-£-aminocapronsäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid bildet, eine sehr niedrige Michaelis-Konstante und eine sehr hohe Substratspexifität für L-Lysin hat.

Die er findungs gemäße L-Lysin-iX-oxidase hat folgende physikalische und chemische Eigenschaften: 1) Enzymatische Aktivität

Das erfindungsgeinäße Enzym desaminiert oxidativ dletX-Aniinogruppen einer L-Arainosäure in Gegenwart von Sauerstoff und bildet eineiv-Ketoisäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid wie die herkömmlichen L-Arninosäure-oxidasen. Die erfindungsgemäße L-Aminoi-.äure~oxidase ist jedoch durch ihre sehr hohe Substratspezifitat für L-Lysin gekennzeichnet, wobei 1 Mol L-Lysin mit je 1 Mol Sauerstoff und Wasser sü einem Mol oC-Keto-E-aminocapronsäure und je: 1 Mol Ammoniak und Wasserstoffperoxid gemäß folgender Gleichung reagiertt

NH „ i 2	+ U2	!- H9O -	NH2
«fH2>4			(CH2),
I			ί I
CH5NH2			C = C
COOH		COOH
L-Lysin		oC-Keto-<?- säure
	i
j + NH3 + H2O2
-amino-c ap ron-
+H2O

Δ - Piperidin-2-carbonHäure

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In Tabelle I ist die relative Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms gegenüber verschiedenen Substraten angegeben. Es wird das gereinigte Enzym verwendet, die Bestimmung erfolgt mit der Sauerstoffelektrode.

Tabelle I

Substrat; (IQ mMol)	!Relative Aktivität (%)	Substrat · (10 ntftol)	L-Serin	Relativp' Aktivität (%) j
L--Lysln	100,0	L-Threonin	< 0,5
L-Ornithin	18,2	D-Lysin	< 0,5
!j-Phenylalanin	8,3	ε - Aminocapronsäure '■'	< 0,5
L-Arginin	6,1	δ - Amin ο ν a 1 e r i a η s ä u r e	< 0,5
L-Histidin·	3,8	Putrescin·	< 0,5
L-Asparagin	< 0,5	Cadaverin	< 0;5
L~Glutamin	< 0,5	L-Citrullin-	< 0,5
L--Tryptophan	< 0.5 f	Homocitrullin·	< 0;5
L-Methionin·	< 0,5	2,4-Diaminobuttersäure	< 0,5
L-Prolin>	< 0,5	α,3-Diaminopropionsäure	< 0,5
Jj-Glutaminsäure	< 0,5	ε-Ν-Acetyl-L-lysin	< 0,5
L-Asparaginsäure	< 0,5	D, L-Homo Iy si n·	< 0,5
L-Cystcin	< 0.5	δ-Hydroxy-Iysin	31,1
L-GIyein	< 0,5	L-Lyεin - hydroxamat	37,1
L-Alanin	< 0,5	L-Lysin -"äthylester	6 2,1
L-HydroxyproIi η	< 0,5	S -(β »Amino fit hy 1) -L-cystein	83,3
L-Leucin	< 0,5	S-(ß-Aminopropyl)-L-cystein	9;8
L-Isoleucin	' < 0,5	S-(B .-»f -Pyridyläjrhy 1) -L- cystttin	3Ί ?8
L-Valin	< 0;5	2,7

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Wie aus der Tabelle I ersichtlich, hat das erfindungsgemäße Enzym eine sehr hohe Substratspezifität für L-Lysin. Das Enzym zeigt zwaä? auch Aktivität gegenüber L-Ornithin, L-Phenylalanin, L-Histidin und L-Arginin, die Affinität für diese Aminosäuren ist jedoch wesentlich niedriger als für L-Lysin. Die Michaelis-Konstante (Km) des Enzyms für L-Lysin ist sehr niedrig (4 χ 10 Mol), wogegen die Km-Werte für L-Ornithin und L-Phenylalanin 4,4 χ IO Mol bzw. 1,4 χ Mol betragen. Die Km-Werte für die anderen Aminosäuren lie-

— 2 —2

gen bei 1 χ 10 bis 2 χ 10 Mol. Das heißt, das erfindungsgemäße Enzym ist eine L-Aminosäure-oxidase, die praktisch keine Aktivität für andere Aminosäuren als L-Lysin hat, wenn die Substratkon?;enfcration niedrig ist, und die außerdem eine sehr hohe Substratspezifität für L~Lysin besitzt. Das erfindungsgemäße Enzym ist somit eine L~LysincK-oxidase (E C 1, 4, 3; L-Lysin: Sauerstoff-oxidoreduktaise (desaminicrend))«

3) Bestimmung der Enzymaktivität

Die Aktivität des erfindungsgemäßen Enzyms wird gemäß "Analytical Biochemistry", Bd, 25, S.228, 1968, gemessen:

Ein Gemisch aus 0,7 ml 0,1 m Kaliuraphosphatpuf far, pH 8,0, 0,1 ml Katalase (750 U/ml), 0,1 ml 0,1 m L-Lysinlösung und 0,1 ml einer Lösung des erfindungsgereäßen Enzyms wird

20 Minuten unter schwachem Rühren bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 25proa;entiger Trichloressigsäurfö beendet. Das Gemisch wird dann mit 1,9 ml 1 m Acetatpuffer, pH 5,0, und 0,8 ml einer 0, !prozentigen- Lö-

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sung von S-Methyl^-benzothiazolon-hydrazon-hydrochlorid versetzt und weitere 30 Minuten bei 30 C inkubiert. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, die optische Dichte wird bei 318 nm gemessen. Die Menge an gebildeter oi-Keto-£- aiai no c apron sä ure wird anhand der Eichkurve bestimmt. Eine Einheit des Enzyms wird als die Menge definiert, die 1 AiKoI

oi-Keto-£.~aminocapronsäure bei 37 C je Minute bildet. Die relative EnEvmaktivität wird ciuch durch manometrische und polarographische Messung des Sauerstoffverbrauche bestimmt.

4} pH-Optimum

Die Enzymaktivität für L-Lysin wird bei verschiedenen pH-Werten unter Verwendung von Acetat-Puffer, pH 5 oder 6_f Phosphatpuffer, pH 6, 7 und 8, Tris-Salzsäurepuffer, pH 7,5

8,5
8,0/und 9,0 , und Glycin-Natriumhydroxid-Puffer, pH 9,0, 9,5 und 10,0, bestimmt. Das pH-Optimum für das erfindungsgemäße Enzym liegt bei 8 bis 9.

5) pH-Stabilität und thermische Stabilität Das Enzym wird 20 Minuten bei 45°C und einem pH-Wert. 3 bis 11 inkubiert, dann wird die Restenzymaktivität bestimmt. Das erfindungsgemäße Enzym ist bei einem pH-Wert von 7 bis 10 stabil (siehe Fig.1).

Die thermische Stabilität wird durch 20minütige Inkubation bei pH 7,4 bei verschiedenen Temperaturen bestimmte Das erfindvtngsgemäße Enzym ist bis zu einer Temperatur von 55°C

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- Ύ

Λ-

stabil (siehe Fig.2).

6) Temperatur-Optimum

Die Enzymaktivität wird bei verschiedenen Temperaturen in 0,1 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4 , bestimmt. Das Temperatur-Optimum des erfindungsgemäßen Enzyms liegt zwischen 45 und 5O°C.

7) Hemmung, Aktivierung und Stabilisierung

Die Enzymaktivität wird in Gegenwart verschiedener Metallionen und verschiedener Zusatzstoffe bestimmt.

Das Enzym wird durch Kupferionen, p-Chlorquecksilberbenzoesäure und Quecksilber(ID-chlorid geharemt (siehe Tabellen II und III). Ein Aktivator konnte nicht festgestellt werden. Das Enzym wird durch Natriumchlorid, Kaliumchlorid und Phosphate stabilisiert.

Tabelle II

Metall ionen (ImMoI)	Relative Aktivität U)	Metall ionen (ImMoI)	Relative Aktivität (%)
Zn	92,7	Ba	100,0
Co	91,6	Ca	102,5
Mn	97,1	Pe	200,0
Mg	99,6	Li	98,4
Cu	78,5	K	100,0

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- p-

Tabelle III ·

Inhibitoren Relative Aktivität (%)

Cystein . 100,3

Glutathion 103,5

Tiron (Brenzkatechin-3,5-

disulfonsäui'e-natriumsalz) 96,5

N-Äthylmaleinimid 108,7

Äthylendiamin-tetraessigsäure 93,8

p-Chlorquecksilber-benzoesäure 42,9

Quecksilber(υ)-chlorid 19,2

8) Absorptionsspektrum (siehe Fig.3)

/Imax 277 nrn ( £ - 247000)

388 nm (8 = 24000)

466 nip ( 2- = 22000)

a" bei 280 nm 21,7

XCIu

A 28Ο/Λ 260 1,54

9) Coenzym

Das erfindungsgemäße Enzym-Präparat wird erhitzt oder mit Trichlorei5.<-.!i«.,5äurc behandelt und dünn zentrifugiert. Das Absorptionsspektrum des überstandos stimmt mit dem Absorptionsspektrum von Flavin-adenin-dinucj.eotid (PAD) überein. Außerdem aktiviert der Überstand das Apoenzym der D-Aminosäuraoxiciase, d.h. das Coenz/m der erfindung&gsmäßen L-Lysin-af-oxidase ist Flavin-adenin-dinucleotid.

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- r-

^9067

Auch aus dem R_f-Wert der Dünnschichtchromatographie wird das Coenzym als Flavin-adenin-dinucleotid identifiziert. Im erfindungsgemäßen Enzympräparat sind 2 Mol Flavin-adenindinucleotid je Mol Enzym vorhanden.

10) Elektrophorese in Polyacrylamid-Gel und Natrium-dodecylsulfat-polyacrylamid-Gel:

Man erhält ein einziges Band ,

11) Der isoelektrische Punkt liegt bei 4,35.

12) Die Sedimentationskonstantc S°„,~ ,, beträgt. 6,88.

£,\J J W

13) Molekulargewicht

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt gemäß der Gelfiltration mit vernetztem Dextran (Sephadex G-200) 112 000 (- 10 000). Das Enzym enthält zwei identische Untereinheiten, wobei das Molekulargewicht jeder Untereinheit gemäß der Elektrophorese mit Natrium-dodecylsulfatpolyacrylamid-Gel 56 000 (- 5000) beträgt. Gemäß dem Sedimentationfigleichgev.'ichtsverfahren in der Ultrazentrifuge hat das Enzym ein Molekulargewicht von 119 000«

«■ ' ■.

14) Aminosäuren-Analyse

Die in Tabelle IV angegebenen Werte sind auf der Basis, daß eine Untereinheit ein Molekulargewicht von 56 000 hat, berechnet.

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.'Al.

Tabelle

IV

Aminosäuren	Aminosäurereste (Mol Ziinino- säure / Mol Untereinheit)	48 Std.	72 Std.	geschätzte Aminosäurereste
Lysin	24 Std.	26,1	26,8	26
Histidin	26, X	11,4	11,6	12
Arginin	IJ, 8	14,8	15,3	15
Asparaginsäure	15f9	61,2	59,2	59
Threonin	57,6	28,3	27,2	28
Serin	27,1	25,3	23,5	25
G1ut ami ηεäure	25,1	45,5	44,5	44
Prolin	42,2	21,6	25,5	23
Glycin	22,5	42,9	42,5	42
Alanin	39,5	38,2	37,1	37
1/2 Cystin	35,6			7
Valin		27,6	26,9	26
Methionin	24,5	10,6	10,4	11
Isoleucin	11,8	22,0	22,7	21
Leucin	19,6	45,6	45,5	45
Thyrosin	42,6	27,8	27,1	28
Phenylalanin	30,5	20,5	27,1	20
Tryptophan	19,5			16

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Gewinnung der er£indungsgern~lßen L-Lysin-tt-oxidate, das dadurch gekennzeichnet ist, daß rann einen Stamm der Gattung Trichoderrua ' in einem I-ic-dium kultiviert und daraus die L-Lvsin-Oi-oxidase

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isoliert.

Als Microorganismus für das erfindungsgemäße Verfahren ist jeder Stamm geeignet, der L-Lysin-^-oxidase produziert, d.h. neu-isolierte natürliche Stämme, bekannte kultivierte Stämme und mutante Stämme, die in herkömmlicher Weise durch künstliche Mutation erhalten worden sind, z.B. durch physikalische Behandlung, wie Bestrahlung mit UV-, Röntgen- und /-Strahlen,, oder durch chemische Behandlung mit 2.B. Nitrosoguanidin. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird die Fähigkeit von Genen von Trichoderma-Microorganismen benützt., L-Lysin-<X-oxidase zu synthetisieren. So kann man im erfindungygemäßen Verfahren rekombinierte Microorganismen verwenden, d.h. die L-Lysin-Of-oxidase produzierenden Gene von Trichoderraa-Micro-Organismen können mit dem Körper anderer Microorganismen kombiniert werden_t( z.B. durch Zellfusion unter Verwendung von Protoplasten.

Der neue Stamm, Trichoderma viride Y 244-2-90, der aus dem Boden des Mount Mitsumine, Saitama, Japan, stammt, hat eine besonders hohe Fähigkeit, L-Lysin-^-oxidayo zu produzieren. Dieser Stamm und seine Mutanten werden deshalb im erfindungsgeiuäßen»Verfahren bevorzugt.

Der Stamm Trichoderma viride Y 244-2-90 wurde am 7. Oktober 1977 bai Fermentation Rocoarch Institut«, Agency of Industriell Science and Technology,· Inage, Chiba-City, Japan, unter der Nr. FERM-P 4256 sowie am 29. Dezember .1978 bei

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- yi -

./fi, 290B737

der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryland, V.St.Α., unter der Nr. ATCC 20536 hinterlegt. Der Stamm PERM-P 4256 wurde auch direkt von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Techno-

bei
logVfder American Type Culture Collection am 30. Januar 1979

unter der Nr. ATCC 20538 hinterlegt.

Der Stamm Trichoderma viride Y 2 44-2-90 hat folgende taxorumerische Eigenschaften:

1) Wachstum in verschiedenen Kulturmedien

Der Stamm wird auf die in Tabelle V angegebenen Medien geimpft und zu Riesenkolonien kultiviert. Die Kulturen werden mit bloßem Auge beobachtet.

Tabelle

Medien

Malzextrakt-G1 ucose-Agar

Czapek 's
Agar

Synthetischer Mucor-Agar

YpS⁺⁾-

It g c

Zustand der Kolonien

Hyphen sind weiß·, laug und wachsen spärlich auf dem Medium. Gutes Wachstum

Farbe

farblos

Hyphen sind weiß und lang und We>chsen nur sehr spärlich auf dfc;n Medium

Hyphen Kind weiß,lang u r.d £ i. 1 ζ ΐ ihn! i c h. Gute ε Wachstum

farblos

farblos

Hyphen «ind weiß, Irfnoj unrl f!'!;.-; ähnlich, Gi.itc:-":b.vä un-

lv<·.: chKt. um

lieh

Konidien-Bildung

Tief grüne Konid.1 enk 1 uiTipen an der Peripherie

Tiefgrüne Konod i e η, £ ■ ρ ä χ 1 i c: h cxn der Peripherie

TiefgrüTic Konidien auf dor gas am te η OLe χ" £ 1 ä ch e außer dar Mit"te

Ti ei grü nc K os < i -■ ciieiif sehr üppig,-ro it hnaiuiivAa α=_;;Γ

Κΐί:. te

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BAD ORfQfNAL

¹YpSi 1% lösliche Stärke, 0,4% Hefeextrakt, 0,1% K₃PO₄, O,O5% MgSO₄.7H₂O

2) Morphologische Eigenschaften

Der erfindungsgemäße Stamm wird auf einem Malzextrakt-Agarmedium kultiviert und mit Trichoderma viride IFO 4 847 als

Kontroll-Microorganismus verglichen. (IFO: Instituted: Fermentation, Osaka, Japan) ,.

Organe

Trichoderma viride Y244-2-9O

Trichoderma viride IFO 4847

Konidia Konidia

Sterigmata

Zweige von Sterigmata

Konidi osporen

Durchmesser der Hyphen

6 - 8 μ

2 - 3 iu (sphärisch)

- 3 χ 8 - 10

2 - 3 p.

2 - 3 JJL

3 - 4 11

/^u

7 μ

3-4x3-8^ (sphäroid)

2-3x6- 10

2 - 3 μ 2,5- 3 ja.

. 3 - 4 ja

Die mikroskopische Untersuchung steigt, daß der erfindungsgemäße Stamm rncisnenweise einze-lürp grüne Koni dien am Ende der kurzen, kreisförmig verzweigten Sterigaiata bildet. Die Organarten des erfindungsgemäßen Stammes entsprachen, denen von Trichoderma viride IFO 484 7, d.h. dieser Stamm ist dem erfinduugsgeiuMßen Stemm am ähnlichsten. Die beider; Stämme unterscheiden sich jedoch in der Form und dem Einäringungsgrad der Koniöien sowie in einigen- anderen Eiyeui-.chaftem.

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miCM^O HL·,

-yi-.·/*· ?906^r'37

3) Physiologische Eigenschaften

a) Assimilierung von Kohlenstoff

Der erfindungsgemäße Staram wird unter Schütteln bei 28 C 6 Tage in Czapek's Medium bebrütet, das mit 2 bis 3% der folgenden Verbindungen als einzige assimilierbare Kohlenstoffquelle versetzt worden ist:

Kohlenstoffquelle Wachstum

Glucose, Kaitose, Arabinose,

D-Xylose, Mannose, Fructose,

gut Galactose, Lactose, Rhammose,

lösliche Stärke

Saccharose, Raffinose, Inulin schlecht

b) Assimilierung von Stickstoff

Der erfindungsgemäße Stamm wird unter Schütteln bei 28 C 7 Tage in Czapek's Medium bebrütet, das mit 1% der folgenden Verbindungen als einsige assimilierbare Stickstoffquelle versetzt worden ist:

S tick stofifque1Ie Wachs turn

Natriumnitrat gut

Gelatine, Fapton, Ammoniumnitrat,
Aminoriiu:r.3ulfat, Kaliumnitrat, srhl M-Ammoniumchlorid

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.Λ7- 2 9 ü b 7 3

c) pH-Optimum für das Wachstum

Der erfindungsgemäße Stamm wird unter Schütteln bei 28 C 6 Tage in YpS-Medium (siehe Tabelle V) bei verschiedenen pH-Werten bebrütet. Das Wachstum ist bei pH 2 recht gut, bei pH 4, 6 und 8 gut und bei pH IO schlecht.

d) Temperatur-Optimum für das Wachstum

Der erfindungsgemäße Stamm wird unter Schütteln in dem YpS-Medium (sieh« Tabelle V) unter Schütteln bebrütet. Das Wachstum ist bei 20 bis 28°C gut, bei 37°C schlecht.

Anhand der mycologisehen und insbesondere der morphologischen Eigenschaften gehört, der erfindungsgemäße Stamm zu der Klacse der Fungi Iiap^rfecti, Unterklasse der Deutromycetes, Kategorie dor Moniliale, Familie der Moniliaceae und Stamm der Trichodarina, und ist somit gemäß "Ainsworth and Bisby's Dictionary' of Fungi", 5. Ausgabe, 1961-, ein Stamm von Trichodsrma viri de.

Die Verfahren und Bedingungen für die Kultivierung von L-LyGin-^-oxidase produzierenden Microorganismen sind nicht

besonders kritisch« i'iix* den Wildstainm Trichoderma viride Y 244-2-90 ist es günstiger, ein festes Medium als ein flüssiges 2VX verwenden. Ein Stamm, der für eine Kultur in flüssigem Medium geeignet int, k&rm jedoch durch Stamni-Verbesserurigsvfcrftihren erhalten v;ei:den. Standardvorfahren und -bedingungen für die Kultur der? L-Lysin-oxidaas produxiere:>Klcn

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Wildstanvmes Y 2 44-2-90 können je nach Art. und Eigenschaften der verwendeten Microorganismen abgewandelt werden.

Beispiele für im erfindungsgemäßen Verfahren verwendbare feste Medien sind ein Medium aus Weizenkleie, das durch Sprühen von 60 bis 80 Gewichtsprozent Wasser auf handelsübliche Weizenkleie hergestellt werden kann, natürliche Getreidemedien , die Reis, Reiskleiö oder Mais enthalten, und Medien, die zusätzlich eine assimilierbare Kohlenstoffquelle (z.B. Glucose, Glycerin, Maltose, lösliche Stärke oder Äthanol), eine Stickstoffquelle (z.B. Aminosäuren, Pepton, Sojabohnenmshl, Protein-Hydrolysate, Maisquellwasser, Flcis"hextrakt, HefeeKtiakt oder Natriumnitrat) und geringe

ande;.es Sübs 1-üns;en/

Meiigen"~7~eritfiä"Jten (*.B. Natrium-, Kalium-, Mangan-, CaI-e.lum~ öder Zinksalbe £>ov.^rie Phosphate und Sulfate) * Man kaim diese Medien auch in geeignete Präparate einmischen und da« Gemisch in geeignete Größen und Formen granulieren«

Der erfindungsgomäße Stamm wird bei einer Temperatur von 20 bic 30°C, einem pi-i-Kert von 4 bis 8 während 3 bis 25 Tagen bebrüt:«t. Bei der Flüssigkultur des erfindungsgemäßen Staum.sts kenn, man verschiedene Medien verwenden, z.B. unter aeroben BGcl.i.i*gungon ein Malzextraktmediuiti (2 % Malzextrakt, 2% Glucose» und 0,1% Pepton), Saburaud's Medium (4% Maltor.o. und 1% Pepton), ein YpS-Medium (1,5% lösliche Stärke, 0,4'c Hefeextrakt, 0,1% K₂PO₄ und 0,05%. MySO₄.7H₂O) oder c?in Spo-

a_u s _C a sei η _ / rulations.iii:odium (1,5% Glucose, 0,5% Aminosäure»^ "0"",TC^-MaIze>ri idkt, 0,J% Hefeextrakt und 1% Glycerin), nie Bebrütung

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erfolgt vorzugsweise unter ausreichender Belüftung mit Sauerstoff. In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Stamm Trichoderma viride Y244-2-9O oder dessen künstliche Mutant© in einem Weizenkleie-Medium, das mit 70 Gewichtsprozent Wasscsr angefeuchtet worden ist, bei 28°C 14 Tage lang bebrütet. Das Kultursubstrat wird mit Wassex" extrahiert, wobei man einen Rohextrakt von L-Lysin™ o(~oxidase erhält. (Für weitergehende Einzelheiten siehe Beispiel I) «- Die weitere Behandlung bzw, Reinigung der L-Lysin-Ci-O5dLdase hängt von dem jeweiligen Verwendungszweck ab.

dera So können die Enzympräparat© in Form von von/ Kultursubstrat abgetrennten Piljsz.ellen, behandelten Pilstzellen, Kulturflüssigkeit t -filtrat oder -extrakten, fceilgsreinigton Ensymlösungen odor Pulver, oder gereinigten Enzympulvern oder Lösungen vorliegen.

Zur Isolierung dor L-Lysin-tf-oxidase werden die Pilzzellen

dem
aus/Kultursubistr&t gesammelt, das Enzym wird mittels eines

und
geeigneten Puffers/ Ultraschallbehandlung oder mechanischer« Vermählen

'- extrahiert. Das erfindungsgemäße Enzym kann aus der

wirkungs-Kulturbrühe oder dem Wasserextrekt einer festen Kultur ,

den voll direkt ge.samineIt werden, da das Enzym au«/ Pilzzellen leicht ausgcfschicden wird. Elektrophoretisch reine L-Lyin·- ^X-oxidftse erhält man aus der Hoh-Enzymlösung in herkömmlicher Weise ρ s.B«. durch Dialyse, Aussalzen reit Aninioniuiasulfat, Ausfälltn mit organischen Lösungsmitteln, wie Äthanol und Aceton, loneaau^tausch-Chrpmatographie, z.B. an Diäthyiaminoäthyl-Celluloce oder Diäthylaiv-irioäthy!-Dextran-, durch

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Adsorptionschromatographie, wie an Hydroxyapatit, und Gelfiltration, z.B. an vernetztem Dextran.

Die erfindungsgemäße gereinigte. L-Lysin-<X-oxidase zeigt bei einer Konzentration von 3,3 mü/ml eine vollständige Hemmung der Proliferation und in einer konzentration von 1 mU/ml eine 50prozentige Hemmung der Proliferation von L5178 Y-Maus-Leukämiezellen in vitro.

Bei diesem Versuch werden 0,1 ml einer Lösung des Enzyms in Phosphat/Natriumchlorid-Puffor zu 0,9 ml einer Suspension

5 /

von 10 /ml kultivierten L-5178Y-ZeI.len in der logarithmischen Wachstunvsphase gegeben. Das Gemisch wird in einem Kohlendioxidinkubator 4 8 Stunden bei 37°C inkubiert, dann wird die Anzahl der Zellen in einem Mikrozellsähler gemessen.

Die Aktivität, des er findungri gemäßen Enzyms und seine Antitumoraktivität werden bei allen Reinigungsstufen parallel untersucht.

Da das erfindungsgemäße Enzym eine sehr hohe Substrcitspezifität für L-Lysin hat, kann man es zur Bestimmung von L-Lysin verwenden _f insbesondere 2-ur Bestimmung des Lysingehaltes in Nahrungsmitteln und Getränken und für die Diagnose van Lysin-Urämie oder Hyperlysinämic, Bei dieser Bestimmung kann man die Menge an gebildeter <-Y~Keto~E-aminocapronsäure, die Menge an Wasserstoffperoxid oder die Menge an Sauerstoff, die entweder durch die Zersetzung des Wasserstoffperoxids

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- rf -

freigesetzt wird oder die während der enzymatischen Reaktion verbraucht wird, bestimmen. Das Wasserstoffperoxid wird kolorimetrisch mit Peroxidase, die freigesetzte Menge an Sauerstoff mit KatalasG und die verbrauchte Menge an Sauerstoff mittels einer Sauerstoffelektrode, wobei das erfindungsge-

ist, mäße Enisyra auf eine Membran auf gebracht-/ bestimmt. Das erfindungsgemäße Enzym ist auch bei Untersuchungen des L-Lysin-Metabolismus von Bedeutung und kann für biochemische Forschungen verwendet werden. Man erwartet/ daß das Enzym auch als Therapeutikum für Hyperlysinämie geeignet ist. Auch für die Herstellung von Nahrungsmitteln mit niedrigem Lysingehalt für Hyperlysiiieiinie-Patienten ist es geeignet.

L-Lysin 1st eine der essentiellen Aminosäuren und ist in geringen Mengen in den pflanzlichen Proteinen enthalten. Sie wird als begrenzende Aminosäure in Reis, Roggen und Mais und als primäre begrenzende Aminosäure in Weizen, Sesam und Hafer angesehen. Die Anreicherung mit L-Lysin bei pflanzlichen Nahrungsmitteln und Futterstoffen wird weltweit zur Verbesserung des Nährwertes dieser Nahrungsmittel durchgeführt. Daher ist die Bestimmung von L-Lysin in natürlichen und angereicherten Nahrungsmitteln für die Ernährungswissenschaft, bei der Ernährung von Menschen und Haustieren sowie bei der Diagnose von metabolischen Störungen sehr wichtig.

Die Nachfrage nach und die Herstellung von L-Lysin ist foei der Nahrungsmittel- und Futterstoff induntrie. stark angestiegen. Andererseits wurden durch Untersuchungen

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der Ernährungsphysiologie und der pathologischen Biochemie die in vivo-Verhältnisse zwischen dem L-Lysin-Spiegel und den Ernährungs- bzw. pathologischen Bedingungen klargestellt. Für all diese Untersuchungen ist der Bedarf an einer einfachen und empfindlichen Bestimmungsrr.ethode für L-Lysin sehr groß.

Bisher wurde die Bestimmung von L-Lysin entweder chromatographisch, wie durch Pcipierchromatographie, Dünnschichtchromatographie, Ionenaustausch-Chromatographie oder durch Gas-Flüssig-Chromatographie, oder anhand spezifischer chemischer, microbiologischer und enzymatischer Verfahren durchgeführt. Beim herkömmlichen enzymatischem Verfahren kann man

1) das Kohlendioxid bestimmen, das unter Einwirkung von L~Lysin-decarboxylase aus dem in eier Proba enthaltenen L-Lysin freigesetzt wird (siehe "Methods of Biochemical Analysis", Bd.4,S.285-306,Interscience Publishers, Inc., 1957), oder

2) die Menge an oxidiertem NADH bestimmen, nachdem eine L-Lysin enthaltende Probe mit c(-Ketoglutarsäure und Saccharopin-d«hydrogenase inkubiert worden ist (vgl. "Analytical Biochemistry", Bd. 49, S. 225-231, 1972), oder

3) die bei der Inkubation von L-Lysin und oi-Ketoglutarsäure in Gegenwart von L-Lysin:cX-Ketoglutari3äure-£~aminotransferase gebildete A -Piperidin-6-earbonsäure messen (vgl. "Analytical Biochemistry", Bd. 87, S.283-289, 1978).

Die Erfindung betrifft somit die Verwendimg der erfindungsgemäßen L~liyir.in-drGy.idnr>a zur Bestimmung von L-Lysin.

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-U-

Gemäß der erfindungsgemaßen Ausführungsform, die eine einfache und empfindliche Methode darstellt, wird eine L-Lysin enthaltende Probe mit L-Lysin-oC-oxidase versetzt und der Gehalt an während der enzymatischem. Zersetzung verbrauchtem Sauerstoff/ die Menge an während der Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid, Ammoniak und ^-Keto-2-arniriocapronsäure oder Δ -Piperidin-2-carbonsaure, die ein intramolekulares ümlagerungsprodukt der o(-Keto-£-aminocarbonsäure unter Wasserabspaltung ist, bestimmt. Für diese Bestimmung ist jede L-Lysin-of-oxidase geeignet, unabhängig von ihrer Herkunft und der Abstammung; bevorzugt ist das Enzym aus dem Stamm Trichoderma viride Y244-2-9O (FERM-P 424G bfcw.ATCC 20536 und 20538), der aus dem Boden des Mount Mitsumine, Saitama, Japan, stammt«

verwendeten

Die Form und die Reinheit des/Enzympräparats hängen vom Nachweissystem ab, d.h. die Anwesenheit von Verunreinigungen in der L-Lysin->"X"Qxidase ist möglich, vorausgesetzt, diese Substanzen beeinträchtigen nicht die Zersetzung von L-Lysin und/oder die Nachweisreaktionen der gebildeten Verbindungen. Die L-Lysin-o(~oxidase kann in Form einer Lösung oder als adsorbiertes oder immobilisiertes Enzym auf einem geeigneten Träger vorliegen.

Bei Verwendung eines Enzyms aus Trichoderma liegt der pH-Wert für die enzymatische Reaktion bei 5 bis 10_f vorzugsweise bei 7 bis 3.0. Die Temperatur darf nicht höher als 60°C »ein und liegt vorzugsweise bei 30 bis 55°C» Um das pH-Optimum auf-

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recht zu erhalten, können verschiedene Püfferlösungen verwendet werden, vorausgesetzt, sie hemmen die enzymatische Reaktion nicht, z.B. herkömmliche Phosphat-, Tris-Salzsäure-, Acetat-, Borat- oder Glycin-Kaliumhydroxidpuffer.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung der L-Lysin-oi-oxidase zur Bestimmung von L-Lysin wird die enz^mEfcische Reaktion mit einem Nachweissystem für die gebildeten Substanzen kombiniert, nämlich für den während der Reaktion verbrauchten Sauerstoff oder das gebildete Wasserstoffperoxid, Ammoniak, die gebildete cK-Keto-£-aminocapronsäure oder Δ -Piperidin-2-carbonsäure. Der Nachweis dieser Verbindungen ist in keiner Weise begrenzt, man kann die optimale Methode oder auch verschiedene Verfahren verwenden.

Zur Bestimmung des verbrauchten Sauerstoffs kann man in einer bevorzugten Ausführungsform das Warburg-Fanometer oder eine Sauerstoffelektrode verwenden. Bei einer Modifikation der Sauerstoffelektrode kann man eine Enzymelektrode verwenden, die aus einer Sauerstoffelektrode besteht, z.B. die Clark'sehe Komplexelektrode oder galvanische Elektroden, auf die die L~Lysin-o(-oxidase aufgebracht ist. Die Elektroden werden dann in die L-Lysin enthaltende Probelösung eingebracht und die Geschwindigkeit, mit der der Sauerstoff verbraucht wird, gemessen. Man kann auch eine Bezugselektrode und eine Kompensationselektrode kombinieren und den elektrischen Strom sowie die Spannung zwischen ä&xi beiden E lek tr öden meß Ben.«

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Die L-Lysin-c(-oxidase kann man auf die " Sauerstoffelektrode dadurch aufbringen, daß man z.B. eine Enzymlösung oder ein Präparat, in dem das Enzym chemisch oder physikalisch an einen geeigneten Träger gebunden ist, am Kopf der Elektroden mittels einer halb-durchlässigen Membran befestigt oder dadurch, daß man den Kopf der Elektroden mit einer Collagen-Membran oder einer porösen organischen hochmolekularen Membran, an die das Enzym gebunden ist, bedeckt.

Das Enzym kann auf verschiedene Weisen an den Träger gebunden werden, z.B. durch Einschluß in Polyacryl amid-Gel, durch Vermischen des Enzyms mit einem anderen inaktiven Protein, durch Vernetzen der beiden Bestandteile mit Glutaraldehyd oder durch Fixieren des Enzyms auf ein organisches hochmolekulares Pulver.

Das Wasserstoffperoxid kann auf drei verschiedene Weisen nachgewiesen und bestimmt werden, nämlich spektroskopisch, elektrochemisch oder durch Fluoreszen^-TMassungen.

Bei der; spektroskopischen Bestimmung des Wasserfitoffperoxids werden ein Aktivierungsmittel für Wasserstoffperoxid und ein Indikator kombiniert. Beispiele für geeignete Jvktivierungs·- mittel sind d:ie Peroxidasen aus Meerrettich oder Süßkartoffeln und/oder ein Jodid odex* Molybdat. Bei spiele für einen geeigneten Indikator sind tf-Dianisidin, o-Tolidin, o-Toluidin, 2,6-Diohloriijdophonol, Bsnzidin, 3, 3 ' , 5,5' -TetraalkyIbenzidine (3,3* -DiiKJithy 1-5 _f 5' -diäthyü bcnzidin ; 3 , 3 ' , 5 , 5 · -Tetra-

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methylbenzidin; 3,3',5,5'-Tetraäthylbenzidin oder 3,3',5,5'-Tetraisopropylbenzidin), 4-Methoxy-l-naphthol oder 2,2'-Azino·· di-/~3-äthylbenzthiazolin-6-sulfonsäure7~diammoniumsalz und Korabinationen von 4-Aminoantipyrin und Phenol. Anstelle von Phenol kann man in dieser Kombination mehrwertige Alkohole oder Phenolderivate verwenden, wie 2,4-Dichlorphenol, Katechin, Resorcin, Hydrochinon, Cresol, Guajakol,Pyrogallol oder Orzin, Anilin oder dessen Derivate, wie Dimethylanilin oder Diäthy!anilin. Anstelle von 4-Aminoantipyrin kann man 4-Aminopyrazon, 4-Aminopyrazolon·-Derivate und 3-Methylbenzothiazolon-hydrazon und dessen Sulfonsäurederivate verwenden. Außerdem ist jeder Indikator geeignet, der unter den Nach-

■^wird/

weisbedingungen quantitativ oxidiert/und somit seine Farbe verändert.

Eine andere spektroskopische Bestimmungsmethode für Wasserstoffperoxid besteht darin, daß man aus Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Methanol und Katalase Formaldehyd bildet und dieses mit einem Hydrazon, z.B. 3-Methyl-2-sulfonyl-benzothiasolon-hydrazon, 3-Methylbensothiazolon-hydrazon und 4~7i.mino~3~hydrazino~5-i[iercapt.o~-l, 2 , 4~triazol, in Gegenwart eines Oxidationsmittels, z.B. Kaliuracyanoferrat, Eisen (III)-chlorid, Cer (IV)~amn"ioni umsulfat oder Orotsäure, umsetzt.

Das Wasserstoffperoxid kann man auch anhand der Änderungen des Absorptionsspektrums von NMTd or NADPK bestimmen. Dabei wird unter der Einwirkung von Wasserstoffperoxid-glutathionperoxiclase Glutathion in ein oxidiertes Glutathion umgewan-

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- ρ - ■

delt, dieses mit Glutathion-Reduktase in Gegenwart von NADPH reduziert und die Menge an oxidiertem NADPH bestimmt ("Analytical Biochemistry", Bd. 76, S.184-197, 1976). Man kann das NADH auch mit Wasserstoffperoxid-NADH-Peroxidase oxidieren und die Änderung der optischen Dichte bestimmen (japanische Patentanmeldung Nr. 15492/1978). Auch die bekannten Bestimmungen mit Katalase-Acetylaceton, die Oxidation von Alkohol mit Aldehyd-Dehydrogenase, die Oxidation und Entfärbung von Indigo-Carmin mit einem Kupfer ion-llistamin-System sind geeignet.

Für die e3.ektrochemische Bestimmung des Wasserstoffperoxids kann man ein polarographisches Verfahren mit Platinelektroden oder eine Katalaseelektrode verwenden und das Ausmaß und die Geschwindigkeit dor Sauerstoffzunähme bestimmen. Auch die Oxidation von Jodionen zu Jod mit Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Molybdat-Katalysators und die Bestimmung der Geschwindigkeit dieser Oxidation mit einem Potentiometer oder einem Ampere-Meter ist geeignet.

Eine bekannte Fluoreszenzmethode zur Bestimmung von Wasserstoffperoxid ist die Umwandlung von Ilomovanillinsäure in die fluoreszierende 2,2* -Dihydroxy-3, 3 ' -diinethoxy-dipheny 1-5, 5 ' dioßsigsäure mit Wasserstoffperoxid und Peroxidase, wobei die BildungBgeschwiridigkeit dos fluoreszierenden Produkts gemessen wird. Anstelle von Homovanillinsäure kann man für diese Reaktion z.B. auch p~JJvdroxypher.y !essigsäure oder Diaoetyl-2 ' >7 ' -Dichloi'fluoEeszin verwenden. Umgekehrt kann man eine

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fluoreszierende Verbindung, wie G-Methoxy-V-hydroxy-l^-benzopyron, 3,5-Diacetyl-l,4-dihydrolutidin unter Einwirkung von Wasserstoffperoxidase in das entsprechende nicht-fluoreszierende Produkt umwandeln und die Abnahme der Fluoreszenz im Reaktionssystem bestimmen.

Für die Bestimmung des Ammoniaks ist die herkömmliche Nessler-Methode, die Bestimmung mit Phenosafranin, Ninhydrin, Indophenol, mittels einer /unmoniak-Ionenelektrode oder anhand der Änderungen der optischen Dichte, die durch die Reaktion von o(-Ketoglutarat mit Glutaminsäure-dehydrogenase in Gegenwart von NADH oder NADPH verursacht wird, geeignet. Alle diese Methoden geben zufriedenstellende Ergebnd sse.

Zur Bestimmung der o^-Keto- £r aminocapronsäure kann man die Färbreaktionen mit 3-Methyl~2-ben2othiazolon-hydrazon oder 2,4-Dinitrophenylhydrazii) verv;enden.

Eine spezifische Bestimmungsmethode für Ä -Piperidin~2-carbonsäure ist die herkömmliche kolorimetrische Bestimmung unter Verwendung von tf-Aminobenzaldehyd«

Bei der Ausführung der L-Lysin-Bestimmung unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms sind keine Grenzen gesetzt; so kann man.z.B. die Bestimmung dadurch vereinfachen, daß man die L-Lysin-Cf-oxidase in einem Proberöhrchen fixiert. Einen Schnelltestsi-.ri-iifen oder -film kann man durch Imprägnieren des Papiers oder des Films mit L-Lysin-cv-oxidase v/ie auch mit

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Peroxidase und einem Indikator zur Verfügung stellen. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Gewinnung des Enzyms

In einem 300 ml fassenden Kolben werden 8 g Weizenkleie, 5 ml Wasser und 1 g Reishüllen 30 Minuten bei 120°C sterilisiert.

Dieses Medium wird mit Trichoderma viride Y244-2-90 (FERM P4256 bzw. ATCC-20536 und 20538) beimpft und 7 Tage bei 28°C bebrütet.

In 6 fünf Liter fassenden Kolben werden je 200 g Weizenkleie, und 140 ml Wasser bsi 120°C 30 Minuten sterilisiert, dann unter sterilen Bedingungen mit der Impfkultur beimpft und 14 Tage bei 28°C bebrütet. Die Kultur wird 1 Stunde mit 9 1 Wasser behandelt, filtriert und durch eine Filterhilfe durchlaufen gelassen. Man erhält etwa 9 Liter Roh-Knsymlösung, die bis zvi 30% der Sättigungakonzentratlon mit Ammoniumsulfat versetzt wird. Die dabei ausfallenden Feststoffe werden absentrifugiert« Der überstand, wird bis zu 60% der Sättigungskonzentration isit. weiterem Arnmoniumsulfat versetzt. Der dabei gebildete Niederschlag wird in 5CO ml 0,02 ra Kaliumphosphatpufferf pH 7,4, gelöst, und über Nacht gegen diesen Puffer dialysiert. Der während der Dia.ly.se ausgefallene Niederschlag v.'ird abscntrifugit'.rt, der Überstand wird auf eine Säule (3,5 x. 27 csn) , die mit Diäthylaminoäthyl-Cellulose in 0,02 ir· Kriliuruphocphatpuffer, pH 7,4, gefüllt ist,- aufcjogeb«r

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- rf -

Die Säule wird mit dem gleichen Puffernder jedoch 0,5 m Natriumchlorid enthält, gewaschen und mit 0,02 m Kaliumphosphatpuffer, pH 7,4, der 0,2 m Natriumchlorid enthält, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt, dialyslert und eingeengt, dann an einer Säule (2 χ 140 cm) mit vernetzte™ Dextran filtriert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und mit Ammoniumsulfat bis zu 60% der Sättigungskonzentration versetzt. Der Niederschlag wird abzentrifugiert, in 5 ml 0,02 m Tris-Salzsäure-Puffer, pH 0,4, der 0,1 m Natriumchlorid enthält, gelöst und über Nacht gegen diesen Puffer dialysiert.

Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert. Der Überstand wird auf eine Säule (0,7 χ 4 crn) mit vernetztem Diäthylaminoäthyl-Daxtran aufgegeben. Die Säule wird mit 0,02 m Tris-Salzsäure-Puffer, der 0,15 m Natriumchlorid enthält, gewaschen und mit 0,02 m Tris-Salzsäure-Puffer, der 0,2 m Natriumchlorid enthält, eluiert. Die aktiven Fraktionen werden gesammelt und gegen 0,01 m Kaliumphosphat-Puffer dialysiert. Die dialysierte Lösung wird zentrifugiert, der überstand wird gefriergetrocknet. Man erhält .18,4 mg gereinigte L-Lysin-cA-oxldase in einer Ausbeute von 6,6% und mit einer spezifischen Aktivität von 85,5 U/mg Protein.

Beispiel 2

L~Lys in--Bestimmung

ZvIs Farbrea-gouü vierdcri 45 mg l'hanol , 25 mg 4-Λ*ΐ!3 noantipyrin und 8 mg r-ieerrotti chperot-r.idase (100 U/rng) ir: 50 iril 0,25 m

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•3*· 29Ü6737

Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, gelöst.

70 yug des gemäß Beispiel 1 gewonnenen und gereinigten Enzyms (85,5 U/mg) werden in 30 ml 0,02 m Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,4, gelöst. 0,1 ml dieser Lösung (0,2 U/ml) werden mit 0,7 ml des Farbreagens in einem Proberöhrchen geschüttelt und 5 Minuten bei 37°C inkubiert. 0,2 ml einer Standard-L-Lysinlösung (0 bis 1 ^aMo l/ml) oder einer Probenlösung werden zugesetzt, das Gemisch wird unter aeroben Bedingungen unter Schütteln 20 Minuten inkubiert. Die optische Dichte dieses Gemisches wird bei 500 mn unter Verwendung eines Kontrollgemisches, das keine L--Lysin-tf-oxidase enthält, gemessen. Aua der auf diese Weise erhaltenen Eichkurve (vgl. Fig.4) wird der L-Lysin-Gshalt der Probe bestimmt.

Die Verläßlichkeit dieser Bestirnmungsinethode wird dadurch getestet, daß man bekannte Mengen an L-Lysin zu einem Gemisch von 17 verschiedenen Aminosäuren und Ammoniak in äquimolaren Mengen zugibt. Die quantitative L-Lysin-Bestimroung ist in Tabelle Vl angegeben. Auch verschiedene Serumproben, die mit O bis 0,3 ^Mol/ml L-Lysin versetzt worden sind, werden ohne weitere Behandlung untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengefaßt.

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Tabelle VI

Zum Standard zuge	erfindungsgemäße
setztes Lysin	L-Lysinbestimmung
tyiMol)	(^tIMo IJ
O	0,054
O,O25	0,080
0,050	0,104
0,100	0,153
0,140	0,194

Tabelle

VII

Zum Serum zuge setztes Lysin (juMol/ml Sarum)	Erfindungagemäße L-Lysinbestimmung (yuMol/ml Serum)	Pferd	Rind	Kalb
0 0,2 0,4 0,8 1,6 3,2	Hund	0,08 0,30 0,54 0,94 1,68 3,26	0,09 0,32 0,52 0,96 1,76 3,40	Q/14 0,36 0,58 1,00 1,84 3,44
0,12 0,36 0,56 .1,00 1,72 3,28

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Beispiel 3

In einem Proberöhrchen werden 0,7 ml 0,1 m Kaliumphosphat-Puffer, pH 8,0, 0,1 ml Katalase (3250 U/ml) und 0,1 ml gemäß Beispiel 1 hergestellte L-Lysin-CÄ-oxidase (0,4 U/ml) 5 Minuten bei 37°C erhitzt, dann mit 0,1 ml einer Standard-Lysin-Lösung (0 bis 5 yuMol/ml) oder einer Probenlösung versetzt. Das Geraisch wird unter aeroben Bedingungen und unter Schütteln 20 Minuten bei 37°c inkubiert. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,1 ml 25prozentiger Trichloressigsäure beendet. Die Lösung wird mit 1,9 ml 1 m Acetatpuffer, pH 5,0, und 0,8 ml einer 0,Iprozentigen Lösung von 3-Methyl-2-benzothiazolonhydrazon(hydrochlorid) versetzt, geschüttelt und bei 50°C 30 Minuten inkubiert. Das Gemisch wird auf Raumtemperatur abgekühlt, die optische Dichte wird bei 318 nm gegen ein Kontrollgemisch, das'keine L~Lysin-o(-oxidase enthält, gemessen. Man erhält die Eichkurve der Fig.5.

Beispiel 4

Das gemäß Beispiel 3 her-gestellte und unterbrochene Reaktionsgemisch wird mit 5 ml einer 0,02 m o-Aminobenzaldehydlösung in, 0,2 m Kaliurnphosphat-Puffer, pH 8,0, versetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert„ Die optische Dichte wird bei 450 nm gemessen, und man erhält die Eichkurve der Fig.6.

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e e r s e

11 e

Claims (9)

2 y U 6 7 3 ? Pate nt ansprüche

1. L-Lysin-tX-oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus L-Lysin in Gegenwart von Wasser und Sauerstoff durch oxidative Desaminierung of-Keto-E-aminocapronsäure, Ammoniak und Wasserstoffperoxid bildet, eine sehr niedrige Michaelis-Konstante und eine sehr hohe Substratspezifität für L-Lysin hat.

2. L-Lysin-CK-oxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr Coenzym Flavin-adenin-dinucleotid ist.

3« L-Lysin-o(~oxidase nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zwei identische Untereinheiten mit einem Molekulargewicht von 56000 (- 5000) enthält, bestimmt durch Elektrophorese in Natriuin-dodecylsulfat-polyacrylamid™ Gel, und daß das durch Gelfiltration bestimmte Molekulargewicht 112000 (- 10000) sowie das durch Sedimentationsgleichgewicht in der Ultrazentrifuge bestimmte Molekμlargevπ.cht etwa 11.9000 beträgt.

4. Verfahren zur Gewinnung der L-Lysin~$-~oxidase nach Anspruch 1 bjs 3, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm der Gattung Trichodsrma in einem Medium kultiviert und dtiraxis die Lysin~oxida.se isoiiex't.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den MicrcorgnnjEmus Trichoderma viride oder dessen

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Mutante kultiviert.

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6. Verfahren nach Anspruch 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Microorganismus Trichoderma viride Y244-2-9O (FERM-P4256 bzw. ATCC 20536 und 20538) kultiviert.

7. Verwendung der L-Lysin-o(-oxidase nach Anspruch 1 bis 3 zur Bestimmung von L-Lysin.

8. Ausführungsform nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß mein eine L-Lysin enthaltende Probe mit L-Lysin-O\--oxidase in Gegenwart von Sauerstoff versetzt und den Gehalt an während der zersetzung verbrauchtem Sauerstoff sowie die Menge an während der Reaktion gebildetem Wasserstoffperoxid, Ammoniak, ^'-Keto-E.-aminocapronsäure oder &. -Piperidin-2-

carbonsäure bestimmt.

9. Ausführimgsform nach Anspruch 7 und 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine L-Lysin-Or-oxidase verwendet, die durch aerobe Bebrütiing eines Stammes dar Gattung Triehoderrna erhalten worden ist.

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