DE3447410C2

DE3447410C2 - Neue Glutathionoxidase, deren Herstellung und Verwendung derselben

Info

Publication number: DE3447410C2
Application number: DE3447410A
Authority: DE
Inventors: Susumu Ootsu Matsui; Tsutomu Kyoto Taniguchi; Satoko Uji Uchida
Original assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Current assignee: TAKARA SHUZO CO Ltd KYOTO JP
Priority date: 1983-12-23
Filing date: 1984-12-24
Publication date: 1986-11-13
Also published as: DE3447410A1; US4610963A

Abstract

Die neue Glutathionoxidase wird aus Mikroorganismusstämmen gewonnen, die zum Genus Calodon und Cortinarius der Klasse Basidiomyceten gehören. Sie ist absolut spezifisch gegen reduziertes Glutathion und unterscheidet sich enzymologisch von den bekannten Glutathionoxidasen. Sie bietet sich an als Komponente eines Reagenz zur quantitativen Bestimmung von reduziertem Glutathion in z. B. biologischen Flüssigkeiten und Nahrungsmitteln und sie kann ferner mit Erfolg in Analysemethoden eingesetzt werden, in denen der störende Einfluß von reduziertem Glutathion ausgeschaltet werden muß.

Description

2. Verfahren zur Herstellung der Giuiathionoxidase T-I des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Calodon suaveolens FERM BP-398 oder Coitinarius bovinus FERM BP-399 kultiviert und das Enzym aus der Kulturbrühe isoliert

3. Verwendung der neuen Glutathionoxidase T-I nach Anspruch 1 als aktive Komponente in einem

Reagenz zur Bestimmung von reduziertem Glutathion.

Die Erfindung betrifft den in den Patentansprüchen angegebenen Gegenstand, der sich auf eine neue Glutathionoxidase bezieht, die mit dem Stamm FERM BP-398 oder FERM BP-399 gewonnen wird, die zum Genus Calodon oder Coumarins der blasse Basidiomyceten gehören, und ferner auf die Verwendung der neuen Glutathionoxidase als aktiv? Komponente in einem Reagenz zur Durchführung eines Verfahrens zur (quantitati ven) Bestimmung von reduzierten* Glutathion (in Testlösungen wie biologischen Flüssigkeiten und Nahrungs mitteln, sowie zur Durchführung von analytischen Methoden, bei denen die interferierende Wirkung von reduzierten! Glutathion eliminiert -werden muß).

Reduziertes Glutathion (im folgenden als GSH bezeichnet), ist ein einfaches Tripetid der Struktur γ-L-Glutamyl-L-cysteinyl-glycin, das ein weitverbreitetes Vorkommen in Tieren, Pflanzen und Mikroorganismen hat. In Lebewesen dient GSH als eine Komponente des Aminosäure-Transportsystems, es wirkt als en· Aktivator für einige Arten von Enzymen sowie als ein Schutzmittel zur Verhütung der Autooxidation von Lipiden und es entfaltet außerdem eine Wirkung zur Entgiftung verschiedener schädlicher Substanzen. Zur Bestimmung von GSH, das sich durch derartig wichtige physiologische Wirkungen auszeichnet, stehen bisher chemische Methoden zur Verfügung, bei denen als Reagenzien zum Beispiel 5,5'-Dithio-bis-(2-nitrobenzoesäure), o-Phthalaldehyd und dgl„ die mit einer SH-Gruppe reagieren, zum Einsatz gelangen, und ferner Methoden, zu deren Durchführung Enzyme wie Glutathionreduktase, Glyoxalase I und dgl. verwendet werden. Die erstgenannten Methoden werden zum Beispiel in Arch. Biochem. and Biophys„ Vol. 82, S. 70 (1959) und AnaL Biochem., Vol. 74, S. 214 (1976) und die letztgenannten in J. Biol. Chem, Vol. 227, S. 339 (1957) und ibid. Vol. 190. S. 685 (1951) beschrieben. In diesen Druckschriften wird jedoch betont, daß diese Verfahren mit zahlreichen Problemen behaftet sind in

so bezug auf Reaktionsspezifität und Empfindlichkeit sowie ?m Hinblick auf Umständlichkeit der Verfahrensdurchführung, Einfluß von Verunreinigungen und dergleichen. In den letzten Jahren ist ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von GSH unter Verwendung von Glutathionsulfhydryloxidase in der JP-OS 1 46 598/1982 beschrieben worden. Da aber die bei dieser Bestimmungsmethode eingesetzte Glutathionsulfhydryloxidase nicht nur auf GSH, sondern auch auf andere SH-Verbindungen wie L-Cystein, Dithiothreitol und dgl. einwirkt, mangelt es dieser Methode an einer hohen Spezifität gegenüber GSH. Es bestand daher das Bedürfnis nach einem Verfahren, bei dem die quantitative Bestimmung von GSH in biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blutserum, Urin und dgl.) und Nahrungsmitteln mit einem Enzym erzielt werden kann, das einzig und allein gegenüber GSH spezifisch ist.

In jüngster Zeit findet ein Verfahren zur Analyse verschiedener Komponenten in biologischen Flüssigkeiten

wie Blut, Urin u.dgl., sowie in Nahrungsmitteln weitverbreitet Verwendung, das sich der Oxidase-Peroxidase· Wasserstoff-donativen Chromogenreaktion bedient. So wird z. B. zur Messung von Glukose oder Gesamtcholesterin in Blutserum eine colorimetrische Methode, bei der Glukoseoxidase oder Cholesterinesterase oder -oxidase auf Blutserum einwirken gelassen und das gebildete Waserstoffperoxid mit Peroxidase abgefangen wird, in großem Umfang als Routineuntersuchungsmethode eingesetzt. Insbesondere eine Farbbildungsmetho de mit 4-Amino-antipyrin-phenol hat sich als führendes enzymatisches Verfahren durchgesetzt wegen seiner Einfachheit und raschen Durchführbarkeit sowie der Stabilität des verwendeten Reagenz. Bei dieser colorimetrischen Methode wird der gebildete rote Chinonfarbstoff bei 500 nm gemessen, doch hat dieses Verfahren den Nachteil, daß aufgrund der Tatsache, daß GSH als reduzierende Substanz im Blutserum als ein Wasserstoffdona-

§ tor wirkt eine Wechselwirkung mit dem Peroxidase-Wasserstoffdonator-Farbentwicklungssystem, das ein Was-

Is serstoffperoxid-Bestimmungssystem darstellt erfolgt

s Erfindungsgemäß wurde überraschenderweise festgestellt daß die von den Stämmen FERM BP-398 und

g FERM BP-399 produzierte Glutathionoxidase, die sich im Filtrat der Kulturbrühen dieser Stämme befindet

% spezifisch nur auf GSH allein einwirkt und somit eine Glutathionoxidase mit ausgezeichneten Eigenschaften

I darstellt Eine ausführliche Untersuchung der enzymologischen Eigenschaften dieses Enzyms ergab, daß dieses

?f als neue Glutathionoxidüse T-I bezeichnete Enzym verschieden ist von den bereits bekannten Glutathionoxida-

i sen.

I Die erfindungsgemäfle Glutathionoxidase T-I und das dieselbe enthaltende Reagenz zur Bestimmung von

j reduziert*, m Glutathion ist zum Beispiel zur Durchführung eines Verfahrens verwendbar, bei dem die quantitati-

-3 ve Bestimmung von GSH dadurch erfolgt, daß das die Glutathionoxidase T-I enthaltende Reagenz auf eine

ff GSH-enthaltende Testlösung einwirken gelasen wird, worauf die Menge an verbrauchtem Sauerstoff oder

i gebildetem Wasserstoffperoxyd in der Reaktionslösung gemessen wird.

ι; Ferner ist dieses Reagenz zur Durchführung eines Verfahrens zur Analyse anderer Komponenten als GSH in

H einer GSH-enthaltenden Testlösung mit Hilfe der Oxidase-Peroxidase-Wasserstoff-donativen Chromogenreak-

'f tion, bei der GSH als eine interferierende Substanz wirkt, verwendbar, wobei bei dieser Analysemethode in

% Stufe (a) das die Glutathionoxidase T-I endialtende Reagenz auf die Testlösung einwirken gelassen wird zur

% Eliminierung des störenden Effekts der gleichzeitig vorliegenden GSH und in Stufe (b) die iit der verbleibenden

ii Testlösung verbleibende, zu bestimmende Komponente analysiert wird.

'{· Zur Herstellung der Glutathionoxidase T-I wird der zum Genus Calodon oder Cordinarius gehörende,

|l Enzym-produzierende Stamm FERM BP-398 oder FERM BP-399 kultiviert und das erfind *gsgemäße Enzym

ξ aus dem Kulturmedium gesammelt

Die Erfindung wird durch die beigefügce Zeichnung veranschaulicht, in der darstellt

Fig. 1 die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Aktivität der erfindungsgemäß gewonnenen Glutathionoxidase T-1, F i g. 2 die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität,

Fig.3 die Beziehung zwischen dem pH-Wert und der Aktivität nach 60min langer Behandlung des erfindungsgemäßen Enzyms bei 37° C und bei variierenden pH-Werten,

F i g. 4 die Beziehung zwischen der Temperatur und der Aktivität nach 10 min langer Behandlung des erfindungsgemäßen Enzyms bei einem pH-Wert von 7,0 und bei verschiedenen Temperaturen,

F i g. 5 ein sichtbares Asorptionsspektrum des erfindungsgemäßen Enzyms (Enzymkonzentration 0,45%; pH-Wert 7,0),

F i g. 6 eine gemäß Beispiel 3 erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen der GSH-Konzentration und der Absorption (optischen Dichte) wiedergibt und

F i g. 7 eine gemäß Beispiel 4 erhaltene Eichkurve, die die Beziehung zwischen der GSH-Konzentration und der Absorption (optischen Dichte) wiedergibt

Bei dem erfindungsgemäß eingesetzten Stamm der Klasse Basidiomyceten handelt es sich um einen, der zum Genus Calodon der Familie Phylactericeae gehört, nämlich um Calodon suaveolens K-1671, jetzt FERM BP-398, sowie um einen, der zum Genus Cortinarius der Familie Cortinariaceae gehört nämlich um Cortinarius Lovinus K-946, ietzt FERM BP-399. Calodon suaveolens FERM BP-398 wurde aus dem Fruchtkörper isoliert der büschelweise wachsend auf dem Boden in Koniferenwäldern am Mt Fuji wächst, und Cortinarium bovinus FERM BP-399 wurde aus dem Fruchtkörper isoliert, der büschelartig wachsend auf dem Boden in Pinienwäldern am Mt Kasuga in Nara Prefecture, Japan, wächst
Die formellen Charakteristika der Fruchtkörper und Sporen der angegebenen Stämme sind wie fol^t:

45 (a) Calodon suaveolens K-1671

Höhe: etwa 3—5 cm,
Kappe:

5 — 12 cm Durchmesser, dick, abgeflacht und fast rund; 2 bis 3 Stücke der Kappe sind seitenweise aneinander gebunden; die Oberfläche ist konkav-konvex, hat grobe Falten und Verdickungen und ist zuerst fast weiß und später hellbraun und bläulich; und das Fleisch ist lederartig, etwa 5 mm dick, weich am oberen Teil urd zäh am unteren Teil und weist ein tiefblaues kreisförmiges Muster auf,
, Nadeln:

1 etwa 3—6 mm lang, zuerst dunkelgrau und später graubraun, weiß an der Spitze und vertikal bis zum St^:«l,

^p Stiel:

dick, kurz, hart und korkenartig, 1—3 cm lang χ 0,6—1 cm dick, dunkelblau und hat ein kreisförmiges Muster der gleichen Farbe im Inneren,
Sporen: fast rund, fast farblos und 4—6 μπι χ 4—5 μΐη groß.

Ein Vergleich der obigen Charakteristika mit der Beschreibung in Rokuya Imazeki and Tsugio Hongo »Colored Illustrations of Fungi of Japan« (Verlag Hoiku-sha, Co, Osaka, Japan) zeigt, daß es sich bei diesem Stamm um Calodon suaveolens handelt. Dieser Stamm ist hinterlegt im Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-398.

34 47 41U

(b) Cortinarius bovinus K.-946

Kappe:

4—7 cm Durchmesser und fast nach in einem offenen Stadium; Oberfläche ist nicht-viskos, dunkelbraun oder zimtbraun, und zuerst weiß und faserig am Umfangsbereich; die Lamellen sind etwas grob, am Stiel

befestigt und zuerst graubraun und später zimtbraun, Stiel:

5—8 cm hoch, 1,5—3,5 cm dick im Durchmesser an der Wurzel, nahe dem Mittelabschnitt von einem zeitig abfallenden weißen krempenartigen Ring umgeben, und weiß oberhalb des Ringes und er hat die gleiche to Farbe wie die Kappe unter dem Ring,

Sporen: 7,5—10,5 μιη χ 5—6,5 μίτι groß.

Ein Vergleich der obigen Charakteristika mit der Beschreibung in Rokuya Imazeki and Tsugio Hongo »Colored Illustrations of Fungi of Japan (Verlag Hoiku-sha Co_n Osaka, Japan) zeigt, daß es sich bei diesem Stamm um Cortinarius bovinus handelt. Dieser Stamm ist am Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Japan unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-399 hinterlegt

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann jede Nährstoffquelle üblichen bekannten Typs dem Kulturmedium zugesetzt werden, wenn sie durch den eingesetzten Stamm verwertet werden kann. Als Kohlenstoffquelle sind z. B. Glyzerin, Glukose. Stärke, Saccharose, Maltose, Laktose, Dextrin, öl und Fette und dgL verwwendbar. Als Stickstoffquelle sind Hefeextrakt, Pepton, entfettete Sojabohnen, Maisquellwasser,

Fleischextrakt und dgl. geeignet Ferner können anorganosche Substanzen und Metallsalze wie Phosphate, Kaliumsalze, Magnesiumsalze und dgl. zugesetzt werden. Außerdem können Vitamine und wachstumsfördernde Faktoren zugegeben werden. Bei der Kultivierung des zur Klasse Basidiomyceten gehörenden Stammes variiert die Ausbeute an erfin-

dungsgemäßer Glutathionoxidase T-I und hängt weitgehend von den Kultivierungsbedingungen ab. In der Regel beträgt jedoch die Kultivierungstemperatur vorzugsweise 20—35"C, der pH-Wert des Kulturmediums beträgt vorzugsweise 4—8 und die Erzeugung der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I erreicht ein Maximum durch Belüftungs/Rührkultivierung während 3—15 Ta/m Dabei ist es ganz natürlich, daß die Kultivierungsbedingungen so gewählt werden sollten, daß eine maximale Ausbeute an Glutathionoxidase T-1 je nach eingesetzten Mikroorganismusstämmen und Zusammensetzung des Kultivierungsmediums erzielt wird. Die vom erfindungsgemäß eingesetzten Stamm gebildete erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I liegt in der Kulturbrühe vor und sie kann daraus abgetrennt werden als Niederschlag durch Zugabe von 20—90% (G/V) eines löslichen Salzes (z. B. Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid) oder von 50—80% (V/V) eines hydrophilen organischen Lösungsmittels (z. B. Ethanol oder Aceton) zum Filtrat der Kulturbrühe. Der erhaltene Nieder-

sch'ag wird durch Dialyse oder Sephadex-Behandlung entsalzt unter Erzielung einer rohen Enzymlösung. Zur Reinigung der erhaltenen rohen Enzymlösung wird die Lösung an einer Säule von SP-Sephadex C-50, die zuvor mit 0,01 M-Acetatpuffer (pH 5,0) gepuffert wurde, adsorbiert und das adsorbierte Material wird mit 0.03 M-Acetatpuffer (pH 5,0) gewaschen und mit M-Acetatpuffer (pH 5,0) eluiert, um die aktive Fraktion zu sammein. Die erhaltene aktive Fraktion wird sodann konzentriert mit einer Kollodiummembran und gel-filtriert durch eine Säule von Sephacryl S-200, die zuvor mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert wurde, zur Erzielung der konzentrierten aktiven Fraktion. Die erhaltene aktive Fraktion wird erneut konzentriert mit einer Kollodiummembran und gel-filtriert durch eine Säule von Sepharose CL-6B, die zuvor mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7.0) gepuffert wurde, zur Erzielung einer weiter konzentrierten aktiven Fraktion. Die erhaltene aktive Fraktion wird gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert zur Erzielung eines gereinigten Enzympulvers. Das erhaltene Enzym-

pulver erweist sich bei der Analyse durch Polyacrylamidgel-Discelecrophorese als eine einfache Substanz.

Die enzymologischen und physikochemischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-1 sind wie folgt:

(1) Wirkung:

so Das Enzym bildet nach der unten angegebenen Reaktionsgleichung 1 mol oxidiertes Glutathion (im folgen-

den als GSSC bezeichnet) und 1 mol Wasserstoffperoxid aus 2 mol GSH und 1 mol Sauerstoff in Gegenwr t von Sauerstoff:

2 GSH + O₂—GSSG + H₂O₂

(2)Substratspezifität:

Diis Enzym wirkt einzig und allein auf GSH ein und überhaupt nicht auf andere Sulfhydrylverbindungen wie L-Cystein, N-Acetyl-L-cystein, L-Cystein-methylester, Cysteinamin, 2-MercaptoethanoL Dithiothreitol, Triiophenol, Thioapfelsäure, Thiosalicylsäure, Methylmercaptan, D-Cystein, DL-Homocystein, Coenzym A, 2-Mercaptobenzimidazol, 6-Mercaptopurin und dgL (gemessen bei pH-Werten von 5,0,7,0 und 9,0).

(3) Oplimal-pH und pH-Stabilität:

Das Enzym hat einen optimalen pH-Wert nahe 7,0, wie die in F i g. 1 wiedergegebene Kurve zeigt F ig. 3 zeigt die pH-Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms bei der Behandlung des Enzyms bei 37° C

während 60min bei verschiedenen pH-Werten. Wie aus Fig.3 ersichtlich, ist das erfindungsgemäße Enzym

zwischen pH 4,0 und pH 8,0 stabil. Bei den in den F i g. 1 und 3 graphisch ausgewerteten Ergebnissen handelte es

sich bei der verwendeten Pufferlösung um einen Glycin-hydrochloridpuffer für pH 3, um einen Acetatpuffer für pH 4 bis 5, um einen Phosphatpuffer für pH 6 bis 8 und um einen Boratpuffer für pH 9 bis 10.

(4) Optimaltemperatur und thermische Stabilität:

Das erfindungsgemäße Enzym hat eine Optimaltemperatur nahe 50°C, wie die in F i g. 2 wiedergegebene Kurve erkennen läßt. F i g. 4 zeigt die thermische Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms bei Behandlung des Enzj'ins bei pH 7,0 während 10 min, bei verschiedenen Temperaturen. Das erfindungsgemäße Enzym erwies sich bis zu 60° C als stabil. s

(5) Molekulargewicht:

Das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt etwa 450 000 bei Bestimmung nach der Gel-Filtrationsmethode mit Sepharose CL-6B, und etwa 55 000 bei Bestimmung nach der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese, woraus ersichtlich ist, daß das erfindungsgemäße Enzym aus acht Untereinheiten aufgebaut ist.

(6) Homogenität:

Die Discelektrophorese wurde unter Verwendung von 7,5prozentigem Polyacrylamidgel (pH 9,4) durchgeführt zur Bewirkung der Proteinfärbung. Es wurde eine farbige Bande von Protein festgestellt, woraus ersichtlich ist, daß es sich beim erfindungsgemäßen Enzym um eine einfache Substanz handelt. Eine einfache Bande wurde ebenfalls nach der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese festgestellt.

(7)Coenzym:

Das erfindungsgemäße Enzym wurde thermisch oder mit Trichloressigsäure (TCA) behandelt und zentrifugiert unter Gewinnung eine überstehenden Flüssigkeit. Wurde die erhaltene Flüssigkeit einer Dünnschichtchromatographie unterworfen, so zeigte sich, daß der Rr-Wert der gleiche war wie derjenige des Standard-Flavinadenindinucleotid (FAD). Es wurde ferner gefunden, daß diese überstehende Flüssigkeit die aktivierte Substanz des Apoenzyms von D-Aminosäureoxidase ist und daß FAD das Coenzym des erfindungsgemäßen Enzyms ist. Die Berechnung aus dem molekularen Extinktionskoeffizienten von FAD bei 450 nm ergibt, daß 4 Moleküle FAD in 1 Molekül des erfindungsgemäßen Enzyms vorliegen.

(8) Isoelektrischer Punkt:

Der isoelektrische Punkt des erfindungsgemäßen Enzyms beträgt 5,65 ± 0,05, bestimmt nach der isoelekirisehen Fokussiermethode mit Pharmalyte(pH 3—10).

(9) Wirkung von interferierenden Substanzen, Metallionen und chelatbildenden Mitteln:

Das erfindungsgemäße Enzym wird gehemmt durch PCMB (p-Chloromercuribenzoesäure), Natrium-L-ascorbat, Hg²⁺ und dgl. (vergleiche die folgende Tabelle 1).

30 Tabelle 1

Zusatzstoff (1 mM)	Relative
	Aktivität (%)
Ohne Zusatz	100
Natrium-L-ascorbat	75
L-Cystein	100
Dithiothreitol	100
2-Mercaptoethanol	100
Thioharnstoff	95
Kaliumcyanid	88
Natriumazid	93
PCMB	63
N-Ethylmaleinimid	90
*PMSF)**	83
«^-Dipyridyl	105
o-Phenanthrolin	105
EDTA	90
FeCl₂	100
BaCl₂	107
CoCl₂	90
ZnCl₂	77
Pb(NOs)₂	100
HeQ,	8

55 ·) Phenylmethylsulfonyl-fluorid.

(10) Zuckergehalt:

Das erfindungsgemäße Enzym ist ein zuckerhaltiges Glycoprotein. Sein Zuckergehalt beträgt etwa 40%, «> bestimmt nach der Phenol-Schwefelsäure-Methode.

(11) Bestimmung der enzymatischen Aktivität:

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I wurde bestimmt nach der Sauerstoffelektrodenmethode und durch Messung der Abnahme von GSH. Zur Durchführung dieser Methode wurde die Reaktion bei 37°C während 10 min durchgeführt unter Verwendung von 0,1 ml von 10 mM GSH, 1,0 ml von 03 M-Phosphat-Puffer (pH 7,0), 13 ml Wasser und 0,1 ml einer entsprechend verdünnten Enzymlösung, wobei das Gesamtvolumen 3,0 ml betrug, und die Sauerstoffverbrauchsrate wurde gemessen nach der Sauerstoffelektrodenmethode. Die Menge an Enzym, welche 1 umol Sauerstoff/min verbrauchte, wurde als

1 Einheit angenommen. Die Abnahme an GSH wurde nach der Methode von George L. Ellman bestimmt (Arch. Biochem. and Biophys., Vol. 82, S. 70 [1959]), und die Menge an Enzym, die zu einer Abnahme von

2 μπιοΙ GSH/min führte, wurde als 1 Einheit bezeichnet.

Ein Vergleich der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I mit der bekannten Sulfhydryloxidase oder Glutathionsulfhydryloxidase wird in der folgenden Tabelle 2 wiedergegeben.

Tabelle 2

	Glutathionoxidase T-1	Sulfhydryloxidase,	*Glutathionsulfhydryloxidase (2)**
	gemäß Erfindung	isoliert aus
		Rattensamenblasensekretion ("I)
Wirkung	2 GSH+ O₂	2 RSH+O₂	2 GSH+ O₂
	-GSSG+ H₂O₂	-RSSR + H₂O₂	—GSSG+ H₂O₂
Substrat-	wirkt nur auf GSH	Relative Aktivität	wirkt am GSH,
spezifität		(bei pH 7,4):	L-Cystein
		GSH, 100%	2-Mercaptoethanol,
		L-Cystein,56%	Dithiothreitol usw.
		Dithiothreitol,32°/o
		und wirkt auch auf
		andere SH-Verbindungen
Stabilität	Stabil bis zu 6O⁰C	50% verbleiben bei	stabil bis zu 55° C
	bei 10 Min.	3,5 Min. langer	bei 15 Min.
	langer Behandlung bei	Behandlung bei 60° C	langer Behandlung bei
	pH 7,0. Stabil im		pH 7,4. Stabil im
	pH-Bereich von 4 bis 8		pH-Bereich von 5 bis 9
	während 60 Min.		bei 15 Min. langer
	langer Behandlung bei		Behandlung bei 45° C
	37° C
Optimal	50⁰C		30° bis 50° C
temperatur
Optimal-pH	7,0	7,0	7,1 bis 7,8
Molekular	etwa 450 000 (Gelfiltra	etwa 66 000	etwa 94 000 (Gelfiltra
gewicht	tionsmethode),		tionsmethode)
	etwa 55 000 (SDS-		etwa 47 000 (SDS-
	Polyacrylamidgel-		Polyacrylamidgel-
	Eiektrophorese)		Eiektrophorese)
Iso	5.66 ±0.05	7,45	4.21
elektrischer
Punkt
Inter	Hg⁺²- p-Chloromercuri-		*Zn+**
ferierende	benzoesäure
Substanzen
Coenzyme	FAD	FAD	FAD
Zuckergehalt	etwa 40%

Fußnoten:

(M) Enzym, das in Biochemistry, VoL 19, S. 2639 (1980), beschrieben wird.

(*2) Enzym, das in der J P-OS 1 32 879/1982 beschrieben wird.

Das die erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I enthaltende Reagenz kann die üblichen bekannten zusätzlichen Komponenten enthalten. Die in dem Reagenz vorliegende Menge an Enzym ist zumindest nicht geringer als 0,001 Einheiten und beträgt vorzugsweise 10 bis 0,01 Einheiten und sie wird entsprechend eingestellt je nach Meßzeit und Verwendungszweck. Außerdem können die üblichen bekannten Pufferlösungen, Enzymstabilisaioren und dgL erforderlichenfalls zugegeben werden. Die Herstellung des Reagenz erfolgt nach üblichen bekannten Methoden, z. B. durch Auflösen der Komponenten, Lyophilisation, Imprägnierung in Trägerfolien und dgl. Ferner kann das Enzym in einer an einen unlöslichen Träger gebundenen Form, dessen Herstellung nach üblichen bekannten Methoden erfolgt, verwendet werden.

Quantitative Bestimmung von GSH

Erfindungsgemäß kann der GSH-Gehalt von biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blutserum oder Urin) und Nahrungsmitteln quantitativ bestimmt werden unter Ausnutzung der oben unter »(1) Wirkung« angegebenen Eigenschaft der erfindungsgemäßen GlutathionoÄddase T-I-Da die erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I I moi GSSG und 1 mol Wasserstoffperoxid aus 2 mol GSH und 1 moi Sauerstoff in Gegenwart von Sauerstoff bildet, kann die quantitative Bestimmung von GSH in biologischen Flüssigkeiten und Nahrungsmitteln leicht dadurch erfolgen, daß die erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I auf GSH einwirken gelassen und die Menge

a« gebildetem Wasserstoffperoxid oder verbrauchtem Sauerstoff gemessen wird.

Die Meßmethoden für Wasserstoffperoxid lassen sich grob einteilen in spektroskopische Methoden, Fluoreszenzmethoden und elektrochemische Methoden, von denen die spektroskopische Methode unten¹ Verwendung der ob-ϊπ angegebenen Wasserstoffperoxid-Peroxidase-Wasserstoff-donativen Chromogenreaktion die am weitesten verbreitete Anwendung findet. Da GSH, bei dem es sich um das Substrat des erfindungsgernäßen Enzyms handelt, mit der obigen Farbentwicklungs, eaktion interferiert, wird vorzugsweise wie folgt vorgegangen: Die erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I wird ausgiebig auf Testproben, z. B. GSH-enthaltenile biologische Flüssigkeiten oder Nahrungsmittel, einwirken gelassen, ein SH-Gruppen-komp!exierendes Mittel (z. B. N-Ethylmaleinimid) wird zugesetzt, so daß andere, in der Testprobe vorliegende SH-Verbindungen mit der Peroxidase-Wasserstoffdonator-Farbentwicklungsreaktion nicht interferieren, und anschließend wird das System dem Peroxidase-Wasserstoffdonator-Farbentwicklungssystem zugeführt.

Die Reaktion zwischen der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-1 und der Testprobe kann unter geeigneten Bedingungen je nach den in den biologischen Flüssigkeiten oder Nahrungsmitteln zu bestimmenden Komponenten, den angewandten Bestimmungsmethoden und dgl. duchgeführt werden. In der Regel wird jedoch die folgende Bestimmungsmethode angewandt: 0,05 bis 1 Feinheiten der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I und eine Pufferlösung (pH 6 bis 8), werden zu 10 bis 1G9 μΙ der Testprobe (z. B. einer biologischen Flüssigkeit, eines Nahrungsmittels) zugesetzt; nach Durchführung der Reaktion bei 20°—5O⁰C, vorzugsweise bei 37⁰C während 1 bis 30 min, vorzugsweise während 5 bis 10 min, wird N-Ethylmaleimid in solcher Menj;e zugegeben, daß dessen Endkonzentration 1 bis 10 μπΊθΙ/ml beträgt; nach 5 bis 10 min langem Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Percxidase-Wssserstcffdcnativc Chrcmogen, z. B. 4 Arnir.oantipyrir. und Phenol, zugegeben, und 2c der gebildete rote Chinonfarbstoff wird bei 500 nm gemessen, wodurch der GSH-Gehalt der Testprobe erhalten wird.

Andere spektroskopische Meethoden zur Bestimmung des Wasserstoffperoxids sind z. B. ein Verfahren, bei dem Formaldehyd aus Wasserstoffperoxid in Gegenwart von Methanol und Katalase gebildet wird; der erhaltene Formaldehyd wird mit Nicotinamidadenindinucleotid (im folgenden als NAD bezeichnet) in Gegenwart von Formaldehyddehydrogenase umgesetzt zur Bildung von reduziertem Nicotinamidadenindinucieotid (im folgenden als NADH bezeichnet); dadurch wird der GSH-Gehalt der Testprobe bestimmt basierend auf einer Zunahme der Absorption bei 340 nm aufgrund von NADH. In der Regel wird diese Methode wie folgt durchgeführt: Überschußmengen von Methanol und Katalase werden zur 10 bis 100 μΐ der Testprobe (z. B. einer biologischen Flüssigkeit oder eines Nab-ungsmittels) zugesetzt und dann werden NAD und Formaldehyddehydrogenase in solcher Menge zugegeben, drJJ deren Endkonzentrationen 0,1 bis Ι,ΟμΐηοΙ/ml bzw. 0,2 bis 1.0 Einheiten/ml betragen; zu der erhaltenen Lösung werden 0,05 bis 0,5 Einheiten der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I und einer Pufferlösung (pH 7 bis 8) zugegeben und die Reaktion wird bei 25° bis 50⁰C, vorzugsweise bei 37°C, während 1 bis 30 min, vorzugsweise während 5 bis 10 min, durchgeführt zur Bildung von NADH; und anschlie-Bend wird der GSH-Gehalt der Testprobe bestimmt basierend auf einer Zunahme der Absorption bei 340 nm

aufgrund von NADH.

Zur Messung der Menge an verbrauchtem Sauerstoff sind ferner die Druckbestimmungsmethode nach

S Warburg und die Sauerstoffelektrodenmethode weitgehend bekannt (vgl. Biochemical Experiment Course, Band

[j 5, Enzyme Research Technique (No. 1), Seiten 35—52, Verlag Tokyo Kagaku-dojin Co, Japan, 1975). Anwendbar

f, ist ferner eine Sauerstoffelektrodenmethode, bei der der die Bestimmung bewirken ^e Teil der Sauerstoffelektro-

IiJ de immobilisierte erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-1 aufweist

>| Selbstverständlich kann das erfindungsgemäße Enzym auch bei einer GSH-Wirkung-eliminiercnden Methode

bei der Analyse von Komponenten biologischer Flüssigkeiten und Nahrungsmittel eingesetzt werden:

:| Bei der Analyse verschiedener Komponenten in biologischen Flüssigkeiten (z. B. Blutserum und Uph) oder

;1 Nahrungsmitteln unter Verwendung der Oxidase-Peroxidase-Wasserstoff-donativen Chromogenreaktion wird

$ nachfolgend ein Verfahren zur Entfernung von gleichzeitig vorliegendem GSH mit Hilfe der erfindungsgemäßen Glutathionoxidase T-I erläutert Wie bei der oben angegebenen Aufzählung von Eigenschaften (vgl. »(1) ν Wirkung«) beschrieben, bildet das erfindungsgemäße Enzym Wasserstoffperoxid, was auch bei der Oxidase-Per-

j oxidase-Wasserstoff-donativen Chromogenreaktion der Fall ist Um daher das erfindunsgemäße Enzym bei der

Analyse verschiedener Komponenten in biologischen Flüssigkeiten und Nahrungsmitteln einsetzen zu können, r- £ ist es erforderlich, das zuvor durch die Enzymreaktion gebildete Wasserstoffperoxid mit Katalase zu zersetzen,

' weshalb ein interferierendes Mittel für Katalase, z. B. Natriumazid, der Reaktionslösung zugesetzt wird, um die

Wirkung der Katalase vollständig zu hemmen, worauf das System in ein solches überführt wird, in dem die a Messung verschiedener Komponenten durchgeführt wird Die Reaktion zwischen der erfindungsgemäßen GIu-

h tathionoxidase Τ-ϊ und der Testprobe wird unter geeignete Bedingungen je nach den in den biologischen

|2 Flüssigkeiten oder Nahrungsmitteln vorliegenden, zu bestimmenden Komponenten und den angewandten Be-

M Stimmungsmethoden durchgeführt In der Regel werden 0,05 bis 1 Einheit der erfindungsgemäßen Glutathion-

^ oxidase T-1,50 bis 200 Einheiten Katalase und eine Pufferlösung (pH 6 bis 8) zu 10 bis 100 μΐ der Testprobe (z. B.

£ einer biologischen Flüssigkeit oder eines Nahrungsmittels) zugegeben und nach Durchführung der Reaktion bei

20° bis 50⁰C vorzugsweise bei 37⁰C, während 1 bis 30 min, vorzugsweise während 5 bis 10 min, wird Natrium-

azid in solcher Menge zugesetzt, daß dessen Endkonzentration 1 bis 10 umol/ml beträgt Die nachfolgende

*J Behandlung kann nach üblicher bekannter Meßmethode für jede zu bestimmende Komponente erfolgen unter

],? Verwendung von Peroxidase und einem Wasserstoff-donativen Chromogen. Gemäß dem obigen Behandlungs-

verfahren kann auch eine Methode zur Anwendung gelangen, nach der Natriumazid zuerst zu einem Reagenz

zur Messung jeder Komponente zugegeben und anschließend das erhaltene Gemisch zu der mit der erfindungs-

i| gemäßen Glutathionoxidase T-I behandelten Testprobe zugesetzt wird.

j§ Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 Herstellung der erftndungsgemäßen Glutathionoxidase T-I

Ein Schrägkultur .nedium mit einem Gehalt an 2% Glukose, 0,5% Ebios und 1,5% Agar (Ebios-medium) wurde mit Calodon suaveolens K-1671 geimpft und die Kultivierung erfolgte durch Stehenlassen des Mediums bei 25°C während 1 Woche unter Erzielung eines für die Beimpfung geeigneten Fungas. Separat wurden IOC ml eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 2,0% Glukose. 03% Hefeextrakt, 1% Pepton, 03% KH₂PO* und 0,1% MgSO₄ - 7 H₂O in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben eingebracht und nach der Sterilisation bei 120° C während

ίο 20 min 'wurde gekühlt und mit dem obigen Beimpfüngs-Fungus inokuliert. Dann wurde die Kultivierung bei 25° C 4 Tage lang durchgeführt zur Herstellung einer Impfkulturlösung. Separat wurden 201 eines Kulturmediums mit einem Gehalt von 2% Glukose, 0,1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 03% KH₂PO₄,0,1% MgSO₄ - 7 H₂O und 0,02% (V/V) eines Antischaummittels (CB-442) in einen 30-1-SchütteIfennenter eingebracht und bei 120⁰C 20 min lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Kulturmedium mit 100 ml der obigen Impfkulturlösung inokuliert und die Kultivierung wurde bei 27°C 3 Tage lang unter solchen Bedingungen durchgeführt, daß die Bclüftungsrzie 20 l/min und die Ruhrgeschwindigkeit 250 UpM betrug. Nach beendeter Kultivierung wurde das Mycel durch Filtration entfernt unter Erzielung eines Kulturfiltrats. Die Aktivität dieses Kulturfiltrats an erfindungsgemäßer Glutathionoxidase T-I betrug 0,42 Einheiten/mL Nach Konzentrierung von 1161 dieses Kulturfiltrats auf einer Ultrafiltermembran mit einem Molekulargewicht von 15 000 wurde Ammoniumsulfat bis zu einer 9Q%igen Sättigung zugegeben. Nach Stehenlassen des Ganzen während eines ganzen Tages und einer Nacht wurde der gebildete Ammoniumsulfat-Niederschlag während eines ganzen Tags und einer Nacht gegen eine große Menge von 0,01 M-Acetatpuff er (pH 5,6/diaIysiert

Die auf diese Weise erhaltene rohe Enzymlösung wurde an einer Säule (Durchmesser 5,0 cm, Höhe 20 cm) von SP-Sephadex C-50, das zuvor mit 0,01 M-Acetatpuffer (pH 5,0) gepuffert worden war, adsorbiert und das adsorbierte Material wurde mit 0,03 M-Acetatpuffer (pH 5,0) gewaschen und mit 0,1 M-Acetatpuffer (pH 5,0) eluiert

Die in Form eines Eluats erhaltene aktive Fraktion wurde auf einer Kollodiummembran konzentriert und Ge.-filtriert durch eine Säule (Durchmesser 3,6 cm. Höhe 90 cm) von Sepacryl S-200, das zuvor mit 0.1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden war. Die erhaltene aktive Fraktion wurde erneut konzentriert auf einer Koliodiummebran und Gel-filtriert durch eine Säule (Durchmesser 2J5 cm. Höhe 105 cm) von Sepharose CL-6B. das zuvor mit 0,1 M-Phosphatpuffer (pH 7,0) gepuffert worden war. Die erhaltene aktive Fraktion wurde gegen Wasser dialysiert und sodann lyophilisiert unter Erzielung von 20 mg eines gereinigten Enzympulvers. Die spezifische Aktivität dieses Pulvers betrug 90 Einheiten/mg. Bei diesem Enzympulver handelte es sich um eine einfache Substanz, wie eine Analyse durch Polyacrylamidgel-Diskelektrophorese ergab. Die oben erläuterten

Reinigungsschritte sind in der folgenden Tabelle 3 zusammengestellt Tabelle 3 Beispiel 2 Herstellung von Glutathionoxidase T-I

Das Ebios-Kuhurmedium gemäß Beispiel 1 wurde mit Cortinarius bovinus K-946 geimpft und die Kultivierung erfolgte durch Stehenlassen des Mediums bei 25°C während 1 Woche unter Erzielung eines Animpffungus. Separat wurden 100 ml eines Kulturmediums, das 2,0% Glukose, 03% Hefeextrakt, 1% Pepton. 03% KH₂PO₄ und 0,1% MgSO₄ · 7 H₂O enthielt, in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben eingebracht und nach Sterilisation bei 120° C während 20 min wurde mit dem oben angegebenen Animpffungus geimpft Dann wurde eine Schüttelkultur bei 25° C während 7 d durchgeführt Die Aktivität der im erhaltenen Kulturfiltrat vorliegenden Glutathionoxidase T-1 betrug 0,15 Einheiten/ml (E/yml).

Beispiel 3 Quantitative Bestimmung von GSH

(1) Farbentwicklungsreagenz:

167 mg 4-Aminoantipyrin, 132 g Phenol und 80 mg (100 E/mg) Peroxidase aus Meerrettich (Typ I) wurden in 100 ml eines 0,1 M-Kaliumphosphatpuffers (pH 7,0) gelöst

	Gesamtprotein	Gesamt	Spezifische	Ausbeute (%)
	gehalt (mg)	aktivität	Aktivität
		(E)	(E/mg)
Kulturfiltrat	67100	6680	0,100	100
Ultrafiltration	30700	6500	0,212	973
Aussalzen mit Ammoniumsulfat	6600	4740	0.718	71,0
SP-Sephadex C-50	84	2230	26,5	33,4
Sephacryl S-200	21,2	1885	88.8	28,2
Sepharose CL-6B	20.0	1800	90.0	26.9

(2) GlutathionoxidaseT-1-Lösung:

5 mg (90 E/mg) gereinigtes Enzym wurden in 100 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst (4,5 E/ml).

(3) N-Ethylmaleinsäureeimid-Lösung:

500 mg N-Ethylmaleimid wurden in 100 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0)gelöst(40 umol/ml).

(4) Verfahrensweise: In ein Reagenzglas wurden 0,1 ml Glutathionoxidase T-I-Lösung, 1 ml 0,2 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) und 1,4 ml destilliertes Wasser eingegeben und das Reagenzglas wurde in einen bei konstanter Temperatur (37°C) gehaltenen Inkubator eingebracht Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml einer Standard-GSH-Lösung (2 bis 20 umol/ml) gegeben und die Reaktion wurde 10 min lang unter Schütteln durchgeführt Danach wurden 0,1 ml N-Ethylmaleimidlösung zugesetzt und nach 5 min langem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden 0,3 ml des Farbentwicklungsreagenz zugesetzt Die Absorption bei 500 nm der Lösung wurde mit einer Blindprobenlösung, die keine erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I enthielt als Vergleichsprobe gemessen, um eine Eichkurve zu erstellen (vgL F i g. 6).

Wie aus F i g. 6 ersichtlich, steigt die Absorption bei 500 nm direkt proportional zur Menge an GSH an und mit Hilfe dieser Eichkurve kann der GSH-Gehalt biologischer Flüssigkeiten (z. B. von Blutserum oder Urin) oder von Nahrungsmitteln genau bestimmt werden.

Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von GSH

(1) Katalase-Lösung:

10 mg Katalase aus Rinderleber (3000 E/mg) wurden in 3 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst

(2) NAD-Lösung:

4413 mg NAD wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst

(3) Formaldehyddehydrogenase-Lösung:

22 mg Formaldehyddehydrogenase (1,8 E/mg) wurden in 2 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst

(4) GlutathionoxidaseT-1-Lösung:

2 mg (90 E/mg) gereinigtes Enzym wurden in 100 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5) gelöst (1,8 E/ml).

(5) Verfahrenszweige: In ein Reagenzglas wurden 0,1 ml Glutathionoxidase T-I-Lösung, 1 ml 03 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,5), 0.1 ml 2,4%ige (V/V) Triton X-100-Lösuag, 0,1 ml der Katalaselösung, 0,1 ml der NAD-Lösung, 0,1 ml der Formaldehyddehydrogenase-Lösung, 0,9 ml destilliertes Wasser und 0,5 ml Methanol (2 mol/1) gegeben und das Reagenzglas wurde in einen bei konstanter Temperatur gehaltenen Inkubator (37° C) eingebracht Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml einer Standard-GSH-Lösung (1 bis ΙΟμπιοΙ/ml). zugegeben und die Reaktion wurde 10 min lang unter Rühren durchgeführt Danach wurde die auf das Vorliegen von NADH in der Lösung zurückzuführende Absorption bei 340 nm gemessen mit einer Blindprobenlösung, die keine erfindungsgemäße Giutathionoxidase T-I enthielt, als Vergleichsprobe zur Erstellung einer Eichkurve (F ig. η

Wie aus F i g. 7 ersichtlich, steigt die Absorption bei 340 nm proportional zur Menge an GSH an und daraus kann der GSH-Gehalt von Testproben bestimmt werden.

Beispiel 5 Eliminierung der interferierenden Wirkung von GSH in einem System zur Bestimmung von Gesamtcholesterin in Blutserum

(1) GlutathionoxidaseT-1-Lösung:

Es wurde die Enzymlösung gemäß Beispiel 4 verwendet

(2) Katalase-Lösung: 5 mg Katalase aus Rinderleber (3000 E/mg) wurden in 10 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst.

(3) Natriumazid-Lösung:

26 mg Natriumazid wurden in 10 ml destilliertem Wasser gelöst.

(4) Farbentwicklungsreagenz:

Es wurde das Farbentwicklungsreagenz gemäß Beispiel 3 verwendet

(5) Cholesterinesterase-Lösung:

5 mg eines authentischen Materials von gereinigter Cholesterinesterase (70 E/mg) wurden in 10 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0) gelöst (35 E/ml).

(6) Cholesierinoxidase-Lösung:

10 mg authentisches Material von gereinigter Cholesterinoxidase (15 E/mg) wurden in 5 ml 0,1-M-Kaliumphosphutpuffer(pH 7,0) gelöst (30 E/ml).

(7) Verfahrensweise:

In ein Reagenzglas wurden 0,1 ml Glutathionoxidase T-I-Lösung, 1 ml 0,3 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 03 ml 3%ige Triton X-100-Lösung, 0,1 ml Vergleichsserum und 0,1 ml der Katalase-Lösung gegeben und das Reagenzglas wurde in einen bei konstanter Temperatur gehaltenen Inkubator (37° C) eingebracht, es Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml einer Standard-GSH-Lösung (1 bis 6 μπιοΐ/ΐηΐ) zugesetzt und die Reaktion wurde 5 min lang unter Rühren durchgführt. Danach wurden 0,1 ml der Natriumazid-Lösung, 0,3 ml des Farbentwicklungsreagenz, 0,1 ml der Cholinesterase-Lösung, 0,1 ml der Cholesterinoxidase-Lösung und

0,7 ml destilliertes Wasser zugegeben und nachdem die Reaktion 10 min lang durchgeführt worden war, wurde die Absorption oder optische Dichte (OD) bei 500 mn gemessen. Separat wurde die Absorption einer Lösung, die keine erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I enthielt, als Vergleichsprobe gemessen. Mit Hilfe der angegebenen Verfahrensweise wurde der Einfluß des erfindungsgemäßen Enzyms zur Ausschaltung der Farbentwicklungsinterferenz von GSH in einem System zur Bestimmung des Gesamtcholesterins im Blutserum untersucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 aufgeführt

Tabelle 4 ίο OD 500 nm

Verfahren	GSH-Menge(iunol) 0 0,1	0,655 0^52	0,2	0,4	0.6
Erfindungsgemäß Kein Zusatz von Glutathionoxidase T-I	0,667 0,660	0,665 0,505	0,652 0,420	0,653 0378

Wie aus Tabelle 4 ersichtlich, ist es erfindungsgemäß möglich, die interferierende Wirkung von GSH zu eliminieren, soflaß genaue Werte des Gesamtcholesterins im Blutserum gefunden werden.

Beispiel 6

Eliminierung der Interferenz von GSH in einem System zur Bestimmung von Glukose in Blutserum

(1) Glutathionoxidase T-I-Lösung:

Es wurde die Enzymlösung gemäß Beispiel 4 verwendet

(2) Katalase-Lösung:

Es wurde die Katalase-Lösung gemäß Beispiel 5 verwendet (3) Natriumazic; Lösung:

Es wurde die Natrium?zid-Lö?>uig gemäß Beispiel 5 verwendet

(4) Farbentwicklungsreagenz:

Es wurde das Farbentwicklungs^r-?agenz gemäß Beispiel 3 verwendet

(5) Glukoseoxidase-Lösung:

20 RigG!ukoseoxidase(i00 E'sng) wurden in 2 ml 0,1 M-Kaliumphosphatpuffer(pH 7,0) gelöst (1000 E/m!).

(6) Verfahrensweise:

In ein Reagenzglas wurden 0,1 ml der Glutathionoxidase T-I-Lösung, 1 ml 03 M-Kaliumphosphatpuffer (pH 7,0), 0,1 ml Kontrollserum und 0,1 ml der Katalase-Lösung gegeben und das Ter.tröhivfren wurde in einen bei konstanter Temperatur gehaltenen Inkubator (37°C) eingebracht Zu dieser Lösung wurden 0,1 ml einer Standard-GSH-Lösung (1 bis 10 μπιοΐ/ml) gegeben und die Reaktion wurde 5 min lang unter Schütteln durchgeführt Danach wurden 0,1 ml der Nairiumazid-Lösung, 03 ml des Farbentwicklungsreagenz, 0,1 ml der Glukoseoxidase-Lösung und 1,1 ml destilliertes Wasser zugesetzt und nach 10 min langer Durchführung der Reaktion wurde die Absorption bei 500 nm gemessen. Separat wurde die Absorption einer Lösung, die keine erfindungsgemäße Glutathionoxidase T-I enthielt, als Vergleichsprobe gemessen. Mit

Hilfe der angegebenen Vefahrensweise wurde der Einfluß des erfindungsgemäßen Enzyms zur Ausschal

tung der Farbentwicklungsinterferenz von GSH in einem System zur Bestimmung von Glukose in Blutserum untersucht Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 5 aufgeführt

50	Tabelle 5 OD 500 nm	GSH-Menge^mol) 0 0,1	0,912 0,872	Oi	0,4	0.6	03	1.0
	Verfahren	0,900 0.905		0,910 0,795	0,895 0,680	0,898 0.638	0,905 0322	0,902 0,470
55	Erfindungsgemäß Kein Zusatz von

Glutathion-QxidaseT-1

Wie aus Tabelle 5 ersichtlich, ist es erfindungsgemäß möglich, den störenden Einfluß von GSH auszuschalten, so daß genaue Werte von Glukose im Blutserum erhalten werden.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Neue Glutathionoxidase mit der Bezeichnung T-I, g e k e η η ζ e ί c h η e t d u r c h die folgenden physikoctemischen Eigenschaften:

(1) Wirkung: Sie wirkt auf reduziertes Glutathion in Gegenwart von Sauerstoff unter Bildung von oxidiertem Glutathion und Wasserstoffperoxyd,

(2) Substratsspezifität: Sie wirkt nur auf reduziertes Glutathion und überhaupt nicht auf andere Sulfhydrylverbindungen,

ίο (3) Optimal-pH und pH-Stabilität: Ihr optimaler pH-Wert liegt in der Nähe von 7,0 und sie ist stabil zwischen pH 4,0 und 8.0 bei 60 min langer Behandlung bei 37° C,

(4) Optimaltemperatur und thermische Stabilität: Ihre optimale Temperatur liegt in der Nähe von 50°C und sie ist bis zu 60⁰C bei 10 min langer Behandlung bei einem pH-Wert von 7,0 stabil,

(5) Molekulargewicht: Ihr Molekulargewicht beträgt etwa 450 000 bei Bestimmung nach der Gelfiltrationsmethode und etwa 55 000 bei Bestimmung nach der Natrium-dodecyl-sulfat (SDS)-Polyacrylaniidgel-

Elektrophorese, wonach die neue Glutathionoxidas; T-I aus acht Untereinheiten aufgebaut ist,

(6) Coenzym: Sie enthält Flavinadenindinucleotid (FAD), ein Coenzym, und zwar 4 Moleküle/Molekül,

(7) Isoelektrischer Punkt: 5,76 ± 0,05,

(S) Interferierende Substanzen: Hg²⁺, p-Chloromercuribenzoesäure, Natrium-L-ascorbat, (9) Zuckergehalt: etwa 40%, bestimmt nach der Phenolschwefelsäure-Methode.