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Bereich der
Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft
eine neue Sorbitoldehydrogenase, einen Mikroorganismus zur Herstellung
dieses Enzyms und ein Verfahren zur Herstellung von Sorbitoldehydrogenase
unter Verwendung von diesen. Genauer betrifft die vorliegende Erfindung
eine Sorbitoldehydrogenase, die auf Sorbitol mit hoher Sensitivität und hoher
Selektivität
wirkt, einen Mikroorganismus zur Herstellung eines solchen Enzyms
und ein Verfahren zur Herstellung von Sorbitoldehydrogenase unter
Verwendung von diesen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin
auf ein Verfahren zur Messung von Sorbitol unter Verwendung der
vorgenannten Sorbitoldehydrogenase und ein Reagenz zur quantitativen
Bestimmung davon.
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Hintergrund
der Erfindung
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D-Sorbitol ist eine Verbindung, die
in geringer Menge in humanen Erythrozyten und im Serum vorkommt.
Es ist bekannt, dass der Gehalt an D-Sorbitol ein wichtiger Indikator
für bestimmte
Erkrankungen ist, insbesondere für
Diabetes. Es wird berichtet, dass D-Sorbitol ein nützlicher
diagnostischer Marker für
Diabetes ist.
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D-Sorbitol und D-Fructose wurden
lange in der Nahrungsindustrie als Süßstoffe verwendet.
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Beispiele für Verfahren zur Messung von
Sorbitol schließen
ein Verfahren ein, das eine Gaschromatographie beinhaltet, ein Verfahren,
das eine Flüssigkeitschromatographie
beinhaltet und ein Verfahren, das die Verwendung eines Enzyms beinhaltet.
Allerdings benötigen
die beiden Verfahren, die Gaschromatographie bzw. Flüssigkeitschromatographie
beinhalten, komplizierte Arbeitsschritte, so dass es schwierig ist,
große Mengen
von Testproben zu behandeln.
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Das die Verwendung eines Enzyms beinhaltende
Verfahren, umfasst die Oxidation von D-Sorbitol mit einer Sorbitoldehydrogenase
(EC 1.1.1.14) in Anwesenheit von NAD+, wobei
die Menge an zu NADH reduziertem NAD+ aufgrund
der Fluoreszenzintensität
gemessen wird. Dieses Verfahren kann einfach mit automatischen Analysatoren
verwendet werden und findet derzeit die breiteste Anwendung.
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Beispiele von Sorbitoldehydrogenasen,
die bisher bekannt sind, schließen
solche ein, die aus Tierleber stammt, wie Sorbitoldehydrogenase
aus Schafleber, erhältlich
von Roche Inc., und solche, die aus Mikroorganismen stammt, wie
ein von Pseudomonas sp. stammendes Enzym, beschrieben in Enzyme
Microb. Technol., Band 13, Seiten 332 bis 337, April 1991, ein von
Bacillus subtilis stammendes Enzym, beschrieben in Journal of Biological
Chemistry, Band 267, Nr. 35, Seite 24.989 bis 24.994, 1992, und
ein von Pseudomonas sp. stammendes Enzym, beschrieben in Journal
of Fermentation and Bioengineering, Band 84, Nr. 3, Seiten 254 bis
256, 1997 und JP-08-033482, und ein von Bacillus fructosus stammendes
Enzym, beschrieben in Biosci. Biotechnol. Biochem., Band 63, Nr.
3, Seiten 573–574,
1999.
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Die vorgenannten Sorbitoldehydrogenasen
sind aber insoweit unvorteilhaft, dass sie in Bezug auf Sorbitol
eine geringe Substratspezifität
und einen hohen Km-Wert aufzeigen. Mit anderen Worten, die vorgenannten
Sorbitoldehydrogenasen, die aus Tierleber stammen, Sorbitoldehydrogenasen,
die aus Bacillus subtilis stammen und Sorbitoldehydrogenasen, die
aus Pseudomonas sp. stammen, zeigten fast die gleiche Reaktivität zu Iditol,
Xylitol bzw. Galactitol wie zu Sorbitol. Weiterhin zeigten alle
vorgenannten Sorbitoldehydrogenasen einen Km-Wert von ca. 10 mM
oder größer in Bezug
auf Sorbitol, dies führt
bei der Messung von Sorbitol zu Schwierigkeiten.
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Andererseits sind die Sorbitoldehydrogenasen,
offenbart in JP-56-029994, US-Patent 5,747,301, EP-728840, WO 99/20763,
EP-897984 und KR-98069057, Enzyme, die Sorbose mit Sorbitol als
Substrat herstellen und somit unterscheiden sie sich vom erfindungsgemäßen Enzym.
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Weiterhin offenbaren JP-06-209793,
JP-06-189790, JP-10-108692, US-Patent 5,250,420, WO 92/21775, JP-07-322897
und JP-06-109726 ein Verfahren zur Messung von Sorbitol mit Hilfe
einer Sorbitoldehydrogenase. Allerdings betreffen JP-06-209793 und
JP-06-189790 ein Verfahren zur Messung von Sorbitol unter Verwendung
des in der o. g. JP-56-029994 offenbarten Enzyms; JP-10-108692 offenbart
ein Verfahren zur Messung von Sorbitol unter Verwendung des in der
o. g. JP-08-033482 beschriebenen Enzyms und US-Patent 5,250,420,
WO 92/21775, JP-07-322897 und JP-06-109726 betreffen ein Verfahren
zur Messung von Sorbitol unter Verwendung von kommerziell erhältlichen
Enzymen. Keine dieser Referenzen beschreibt das offenbarte Enzym.
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Weiterhin beschreiben die folgenden
Referenzen Sorbitoldehydrogenasen, keine von diesen beschreibt das
offenbarte Enzym. D. h., EP-524517, EP-791355, WO 94/07867, US-Patent
5,998,463, SU-1553897, WO 98/33936 und SU-1567626 beziehen sich
auf Sorbitoldehydrogenasen, die vom menschlichen Körper stammen
und die Behandlung von Diabetes betreffen. Die zu verwendenden Sorbitoldehydrogenasen
in den in JP-09-037796, JP-63-146800, JP-61-005091, JP-9-2066875
und DE-3326546 offenbarten Verfahren sind Enzyme, deren Ursprung
nicht ausgeführt
ist, oder die kommerziell erhältlich
sind. SU-1303937 bezieht sich auf eine von Teeblättern stammende Sorbitoldehydrogenase.
WO 94/15942 bezieht sich auf eine von Hefe stammende Sorbitoldehydrogenase,
die. DE-2022280 offenbart ein Verfahren zur Messung von Xylitol.
Diese unterscheiden sich alle von dem erfindungsgemäßen Enzym.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Es ist daher ein Ziel der vorliegenden
Erfindung, eine neue Sorbitoldehydrogenase mit hervorragender Substrataffinität und Substratspezifität bereitzustellen,
die zur Messung von D-Sorbitol, das in humanen Erythrozyten und
Serum in geringer Menge vorkommt, oder von in Nahrung enthaltener
D-Sorbitol oder D-Fructose, verwendet werden kann, und ein Verfahren
zur einfachen Herstellung des Enzyms mit Hilfe des Mikroorganismus.
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Die Autoren haben umfangreiche Untersuchungen
zur Lösung
dieser Probleme gemacht. Als Ergebnis haben sie gefunden, dass ein
Mikroorganismus, der zu Flavimonas und Pseudomonas gehört und aus
dem Boden isoliert wurde, eine Sorbitoldehydrogenase mit hervorragender
Substrataffinität
und Substratspezifität herstellt.
Somit wurde die vorliegende Erfindung erreicht.
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Ein erster Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist gerichtet auf eine Sorbitoldehydrogenase mit den folgenden
physikochemischen Eigenschaften.
- (1) Aktivität: die Sorbitoldehydrogenase
katalysiert die Dehydrierungsoxidation von D-Sorbitol in Anwesenheit
von NAD+ zur Herstellung von D-Fructose
und katalysiert eine Umkehrreaktion, die D-Fructose in Anwesenheit
von NADH reduziert, um D-Sorbitol und NAD+ herzustellen;
- (2) Substratspezifität:
die Sorbitoldehydrogenase zeigt einen Vmax/Km-Wert von ca. 40 oder
weniger für Galactitol
und ca. 3 oder weniger für
L-Iditol, wenn der Vmax/Km-Wert für D-Sorbitol als 100 genommen wird,
und 0 für
D-Arabitol, D-Mannitol, Xylitol und D-Glucose; und
- (3) zeigt einen Km-Wert von ca. 6 mM oder weniger (bevorzugt
4 mM oder weniger) in Bezug auf D-Sorbitol auf.
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Ein zweiter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist gerichtet auf einen Mikroorganismus, der zu Flavimonas
oder Pseudomonas gehört
und in der Lage ist, die vorgenannte Sorbitoldehydrogenase herzustellen.
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Ein dritter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zur Herstellung von Sorbitoldehydrogenase,
dieses umfasst das Kultivieren des vorgenannten Mikroorganismus,
der die Sorbitoldehydrogenase in einem Kulturmedium herstellen kann
und anschließend
das Sammeln dieser Sorbitoldehydrogenase aus der Kultur.
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Ein vierter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist gerichtet auf ein Verfahren zur Messung von Sorbitol, dies
umfasst die Zugabe einer die vorgenannte Sorbitoldehydrogenase enthaltenden
Zusammensetzung zu einer Probe, um eine Reaktion hervorzurufen und
anschließend
Messen des Sorbitolgehalts in dieser Probe.
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Ein fünfter Aspekt der vorliegenden
Erfindung ist gerichtet auf ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung
von Sorbitol, umfassend die vorgenannte Sorbitoldehydrogenase, NAD+ und einen Puffer.
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Die erfindungsgemäße Sorbitoldehydrogenase hat
eine hervorragende Substratspezifität und Substrataffinität und ist
daher zur Messung von Sorbitol nützlich.
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Kurze Beschreibung
der Abbildungen
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1 ist
eine Graphik, die den optimalen pH-Wert der vom A-520-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 30°C
zeigt;
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2 ist
eine Graphik, die den optimalen pH-Wert einer vom A-654-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 30°C
zeigt;
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3 ist
eine Graphik, die den optimalen pH-Wert einer vom A-989-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 30°C
zeigt;
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4 ist
eine Graphik, die den stabilen pH-Wert der vom A-520-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 4°C
zeigt;
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5 ist
eine Graphik, die den stabilen pH-Wert der vom A-654-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 4°C
zeigt;
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6 ist
eine Graphik, die den stabilen pH-Wert der vom A-989-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei 4°C
zeigt;
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7 ist
eine Graphik, die die optimale Arbeitstemperatur für die vom
A-520-Stamm stammenden Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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8 ist
eine Graphik, die die optimale Arbeitstemperatur für die vom
A-654-Stamm stammenden Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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9 ist
eine Graphik, die die optimale Arbeitstemperatur für die vom
A-989-Stamm stammenden Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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10 ist
eine Graphik, die die thermische Stabilität der vom A-520-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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11 ist
eine Graphik, die die thermische Stabilität der vom A-654-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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12 ist
eine Graphik, die die thermische Stabilität der vom A-989-Stamm stammenden
Sorbitoldehydrogenase bei pH 8,0 zeigt;
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13 ist
eine Graphik, die die Ergebnisse zur Messung der D-Sorbitol-Konzentration
mit Hilfe eines mit der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenase hergestellten
Reagenzes zur quantitativen Bestimmung von D-Sorbitol zeigt;
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14 ist
eine Graphik, die den Verlauf der Reaktion mit einem mit der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenase
hergestellten Reagenz zur quantitativen Bestimmung von D-Sorbitol
zeigt; und
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15 ist
eine Graphik, die Ergebnisse zur Messung der D-Sorbitol-Konzentration
unter Verwendung eines mit der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenase hergestellten
Reagenzes zur quantitativen Bestimmung von D-Sorbitol zeigt.
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Ausführliche
Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung wird im
Weiteren beschreiben.
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Die erfindungsgemäße Sorbitoldehydrogenase hat
die vorgenannten physikochemischen Eigenschaften. In der vorliegenden
Erfindung wurde die Messung der Aktivität der Sorbitoldehydrogenase
durch Zugabe einer Enzymlösung
zu einem 80 mM Tris-HCl-Puffer (pH 9,0), der 50 mM D-Sorbitol und
2 mM NAD+ enthält, langsamem
Mixen dieser Mischung und anschließendem Messen der Absorptionsänderung
bei 340 nm mit Hilfe eines Spektrophotometers durchgeführt. Die
Messung wurde bei einer Temperatur von 30°C durchgeführt. Die Enzymmenge, die zur
Herstellung von 1 μmol
NADH pro Minute notwendig ist, wurde als eine Einheit (U) definiert.
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Aus natürlichen Quellen isolierten
die Autoren drei Stämme,
die in der Lage sind, das erfindungsgemäße Enzym zu bilden und haben
ihre mycologischen Eigenschaften gemessen, diese sind unten dargestellt.
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Unter Nutzung der o. g. mycologischen
Eigenschaften wurde eine Recherche in Bargey's Manual of Systematic Bacteriology
durchgeführt.
Als Ergebnis wurde gefunden, dass die Stämme A-520, A-989 und A-654
zu einem Flavimonasoryzihabitans, Pseudomonas fluorescens bzw. Pseudomonas
fluorescens Bakterium gehören.
Die Stämme
Flavimonas oryzihabitans A-520 Pseudomonas fluorescens A-989 bzw.
Pseudomonas fluorescens A-654 wurden beim Nationals Institute of
Bioscience and Human Technology, Ministry of International Trade
and Industry am 13. Juli 1999 mit den Hinterlegungsnummern FERM
P-17641, FERM P-17462 und FERM P-17463 hinterlegt (Stamm Flavimonas
oryzihabitans A-520 wurde in eine internationale Hinterlegung am
26. Juni 2000 umgewandelt; FERM BP-7195).
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Der Mikroorganismus, der eine solche
Sorbitoldehydrogenase herstellt, ist nicht besonders eingeschränkt und
bevorzugt schließt
er solche ein, die zur Gattung Flavimonas und der Gattung Pseudomonas
gehören.
Bevorzugte Mikroorganismen schließen Mikroorganismen ein, die
zu Flavimonas oryzihabitans und Pseudomonas fluorescens gehören, insbesondere
die Stämme
Flavimonas oryzihabitans A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und
Pseudomonas fluorescens A-654 und am meisten bevorzugt ist der Stamm
Flavimonas oryzihabitans A-520.
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Für
den Fachmann ist es ebenfalls möglich,
andere Mikroorganismen, die das erfindungsgemäße Enzym herstellen können, zu
screenen und zu isolieren, einschließlich allelischen Varianten
der Sorbitoldehydrogenasen, die von den Stämmen Flavimonas oryzihabitans
A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und Pseudomonas fluorescens
A-654 mit ähnlichen
physikochemischen Eigenschaften stammen.
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Ein Mikroorganismus, der das erfindungsgemäße Enzym
herstellen kann, wird z. B. in folgender Weise gescreent. Eine natürliche Quelle,
wie Erde, wird auf einem Agarplattenmedium, enthaltend Sorbitol
als einzige Kohlenstoffquelle, verteilt und kultiviert. Eine auf
dem Medium gebildete Kolonie wird isoliert und einer weiteren Kultivierung
zur Herstellung des Enzyms unterworfen. Anschließend wird die Sorbitoldehydrogenase
von dem Stamm isoliert und physikochemischen Eigenschaften werden
durch das oben beschriebene Verfahren bestimmt. Der Stamm, der eine
Sorbitoldehydrogenase herstellen kann, die die physikochemischen
Eigenschaften der vorliegenden Erfindung erfüllt, wird ausgewählt.
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Die erfindungsgemäße Sorbitoldehydrogenase kann
von diesen Mikroorganismen wie folgt gewonnen werden. Der Mikroorganismus
wird in einem Kulturmedium kultiviert. Das Kulturmedium wird dann
einer Zentrifugaltrennung unterworfen oder einer Filtration, um
Bakterienzellen zu sammeln. Anschließend wird das Bakterium extrahiert,
um eine Rohenzymlösung
zu erhalten, diese wird dann auf gereinigt.
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Die Kohlenstoffquelle, die in das
Kulturmedium zur Verwendung in der Kultur eines solchen Mikroorganismus
zugegeben wird, kann irgendeine Kohlenstoffquelle sein, die durch
den Mikroorganismus aufgenommen wird. In der Praxis können D-Sorbitol,
Glucose, Fructose, Maltose, Sucrose, Glycerol, Bernsteinsäure, Lactose
usw. verwendet werden. Die Stickstoffquelle zur Verwendung in dem
Kulturmedium kann eine anorganische Stickstoffverbindung sein, wie
Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid oder eine organische Stickstoffverbindung,
wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Casaminosäure und
Corn Steep Lösung.
Ein zu dem Kulturmedium zufügbares
organisches Salz kann ein Salz von Kalium, Natrium, Zink, Eisen,
Magnesium oder Mangan sein. Wenn notwendig, kann eine geringe Menge
von Metallsalz, Vitamine, Antischaummittel usw. zugefügt werden.
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In der vorliegenden Erfindung wird
Sorbitol, das ein Substrat ist, bevorzugt zu dem Kulturmedium als Beschleuniger
für die
Enzymproduktion zu irgendeinem Zeitpunkt während der Kultur zugegeben,
um eine effizientere Herstellung von Sorbitoldehydrogenase zu erreichen.
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Irgendeine Festkultur oder Flüssigkultur
kann genutzt werden. In der Praxis ist eine belüftete Schüttelkultur oder Rührkultur
wünschenswert.
Das Kulturmedium ist bevorzugt eingestellt auf einen pH von ca.
6 bis 8. Die Kultur wird bei einer Temperatur von 18°C bis 42°C, bevorzugt
von 25°C
bis 35°C
durchgeführt.
Die Kultivierungszeit kann so sein, dass das Enzym maximal hergestellt
wird. In der Praxis ist sie allerdings von 10 bis 100 Stunden, bevorzugt
von 20 bis 70 Stunden. In dieser Weise wird Sorbitoldehydrogenase
hergestellt und in dem Bakterium angereichert.
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Die Extraktion des Enzyms aus dem
so erhaltenen Bakterium kann durch Selbstverdau, Ultraschallzerstörung, French-Presse, Behandlung
mit oberflächenaktivem
Mittel, Behandlung mit Lysozym usw. erreicht werden. Das so behandelte
Bakterium wird dann einer zentrifugalen Abtrennung oder dgl. unterworfen,
um Zellfragmente abzutrennen. Somit kann eine Rohenzymlösung erhalten
werden.
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Die so erhaltene Rohenzymlösung wird
dann einer geeigneten Kombination von Chromatographietechniken,
wie Ionenaustausch-Chromatographie,
Affinitätschromatographie,
Hydrophobiechromatographie und Gelpermeationschromatographie in
Kombination unterworfen, so dass die erfindungsgemäße Sorbitoldehydrogenase
aufgereinigt wird. Beispiele für
das verwendbare Ionenaustauschharz schließen ein Q-Sepharose FF (hergestellt
von Pharmacia Corporation) und DEAE-Sepharose (hergestellt von Pharmacia
Corporation). Beispiele des verwendbaren Harzes für Affinitätschromatographie
schließen
Harze ein, hergestellt aus Triazinfarbstoff, wie Blue Sepharose
Cl-6B und Red Sepharose CL-6B (hergestellt von Pharmacia Corporation),
Prussian Blue H-ERD (hergestellt von ICI Inc.) und Chiba Chrome
Yellow HE-3G (hergestellt von Ciba Geigy Inc.). Beispiele, verwendbar
für das
Harz für
hydrophobe Chromatographie schließt ein Octylsepharose CL-4B
(hergestellt von Pharmacia Corporation). Beispiele für den Träger oder
für das
Harz für
die verwendbare Gelpermeationschromatographie schließt ein Sephadex
G-100. Zusätzlich
zu diesen Säulenchromatographien
kann ein Entfernen der Nukleinsäure,
wie eine Behandlung mit Streptomycinsulfat oder Protaminsulfat durchgeführt werden,
oder ein aussalzen des Protein, das die Behandlung mit Ammoniumsulfat
einschließt.
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Die physikochemischen Eigenschaften
der so hergestellten erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenase wird
unten dargelegt.
- (1) Aktivität: Die erfinderische
Sorbitoldehydrogenase katalysiert die Dehydrierungsoxidation von
D-Sorbitol in Anwesenheit vom NAD+, um D-Fructose
herzustellen und katalysiert ebenfalls die Umkehrreaktion, die D-Fructose
in Anwesenheit von NADH reduziert, um D-Sorbitol und NAD+ herzustellen.
- (2) Substratspezifität:
Der Vmax/Km der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenase
in Bezug auf verschiedene Substrate (relativ zu dem in Bezug auf
D-Sorbitol, der als 100 genommen wird) ist ca. 40 oder weniger für Galactitol
und ca. 3 oder weniger für
Iditol, bevorzugt ca. 30 oder kleiner für Galactitol und ca. 2 oder
kleiner für
Iditol. Der Km für
D-Sorbitol ist ca. 6 mM oder kleiner, bevorzugt ca. 4 mM oder kleiner. Von
den erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
sind die Substratspezifitäten
der von den Stämmen Flavimonas
oryzihabitans A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und Pseudomonas
fluorescens A-654 stammenden in der Tabelle unten dargestellt.
Definition
von Vmax und Km:
Vmax bedeutet die maximale Reaktionsgeschwindigkeit
bei gesättigter
Substratkonzentration und Km bedeutet die Michaelis-Konstante. Der
Vmax/Km-Wert zeigt die apparente Bindungskonstante der Enzymreaktion
insgesamt an, dieser wird im allgemeinen als ein Index verwendet,
um die Substratspezifität
anzuzeigen. Diese Werte können
gemessen und berechnet werden gemäß den Verfahren, beschrieben
in Kapitel 8 von Biochemistry, 2. Ausgabe, Albert Lehninger, 1975,
Worth Publishers, Inc. oder in Enzyme Structure and Mechanism, 2.
Auflage, Alan Fersht, 1984, W. H. Freeman & Co. Tabelle
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- (3) Optimum pH: Das erfindungsgemäße Enzym hat einen optimalen
pH-Bereich von ca. 9,5 bis ca. 11, bevorzugt von ca. 10 bis ca.
11. Von den erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
sind die optimalen pH-Werte der Sorbitoldehydrogenasen, die von
den Stämmen
Flavimonas oryzihabitans A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und
Pseudomonas fluorescens A-654 stammen, von 10 bis 11, von 10 bis
11 bzw. von 9,5 bis 10,5. Die 1 bis 3 sind Graphiken, die die
Wirkung des pH's
auf die Aktivität
des erfindungsgemäßen Enzyms
darstellen, wobei die Ordinate die Enzymaktivität anzeigt und die Abszisse
den pH-Wert. Die Aktivität
des Enzyms ist relativ dargestellt zum maximalen gemessenen Wert,
der als 100 genommen wurde. Die für die Messungen verwendeten
Puffer waren 100 mM Acetatpuffer für den pH-Bereich von 4 bis
6, 100 mM Kaliumphosphatpuffer für
den pH-Bereich von 6 bis 8, 100 mM Tris-HCl-Puffer für den pH-Bereich
von 8 bis 9, 100 mM Glycin-Kaliumhydroxid-Puffer für den pH-Bereich
von 9 bis 12 und 100 mM Dinatriumphosphat-Natriumhydroxid-Puffer für den pH-Bereich
von 10,5 bis 12.
- (4) pH-Stabilität:
Wenn das erfindungsgemäße Enzym
eine Temperatur von 4°C
in den Puffer mit verschiedenen pH-Werten für 24 Stunden stehen konnte,
wurde eine verbleibende 60%ige Aktivität in einem pH-Bereich von ca.
5 bis ca. 10,5 erreicht. Von den erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
waren die pH-Bereiche der Sorbitoldehydrogenasen, die von den Stämmen Flavimonas
oryzihabitans A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und Pseudomonas
fluorescens A-654 stammten, in einem Bereich von 60% oder größer des
anfänglichen
Werts aktiv bei 5 bis 10,5, 7 bis 10 bzw. 5 bis 10.
Die 4 bis 6 sind Graphiken, die die Wirkung des
pH's auf die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms aufzeigen,
wobei die Ordinate die verbleibende Aktivität und die Abszisse den pH anzeigen.
Die verbleibende Aktivität
ist relativ zum maximal gemessenen Wert, der als 100 genommen wurde,
dargestellt. Die für die
Messungen verwendeten Puffer waren 100 mM Acetatpuffer für den pH-Bereich
von 4 bis 6, 100 mM Kaliumphosphatpuffer für den pH-Bereich von 6 bis
8, 100 mM Tris-HCl-Puffer für
den pH-Bereich von 8 bis 9, 100 mM Glycin-Kaliumhydroxid-Puffer
für den
pH-Bereich von 9 bis 11 und 100 mM Dinatriumphosphat-Natriumhydroxid-Puffer
für den
pH-Bereich von 10,5 bis 12.
- (5) Optimale Temperatur und Thermostabilität: Die optimale Temperatur
der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
ist um 40°C
und die Aktivität
wird selbst nach einstündiger
Behandlung bei pH 8,0 und 35°C
aufrechterhalten. Von den erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
zeigten die Sorbitoldehydrogenasen der Stämme Flavimonas oryzihabitans
A-520 und Pseudomonas fluorescens A-989 eine verbleibende Aktivität in einem
Bereich von 80% oder größer des
anfänglichen
Werts, selbst nach einstündiger Behandlung
bei pH 8,0 und 35°C.
Die
vom Pseudomonas fluorescens A-654-Stamm stammende Sorbitoldehydrogenase
zeigt eine verbleibende Aktivität
in einem Bereich von 60% oder größer des
anfänglichen
Werts, selbst nach einstündiger Behandlung
bei pH 8,0 und 30°C.
Die 7 bis 9 sind Graphiken, die die Wirkung der
Temperatur auf die Aktivität
des erfindungsgemäßen Enzyms
darstellen, wobei die Ordinate die Enzymaktivität und die Abszisse die Temperatur
darstellt. Die Enzymaktivität
ist dargestellt relativ zum maximal gemessenen Wert, der als 100
genommen wurde. Die 10 bis 12 sind Graphiken, die die
Wirkung der Temperatur auf die Stabilität des erfindungsgemäßen Enzyms
darstellen, wobei die Ordinate die verbleibende Aktivität und die
Abszisse die abgelaufene Zeit darstellen. Die verbleibende Aktivität ist relativ
dargestellt zur gemessenen Aktivität zu Beginn der Inkubation, diese
wurde als 100 genommen.
- (6) Molekulargewicht: Die Molekulargewichte der erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
sind im Bereich von ca. 68.000 bis ca. 38.000 und die Molekulargewichte
der Untereinheiten sind in einem Bereich von ca. 26.000 bis ca.
28.000. Von den erfindungsgemäßen Sorbitoldehydrogenasen
sind die Molekulargewichte derer, die von den Stämmen Flavimonas oryzihabitans
A-520, Pseudomonas fluorescens A-989 und Pseudomonas fluorescens
A-654 stammen, bestimmt mittels Gelpermeations-Chromatographie mit Superose (hergestellt
von Pharmacia Corporation) ca. 68.000, ca. 38.000 bzw. ca. 52.000.
die Molekulargewichte der Untereinheiten, bestimmt mittels SDS-PAGE-Verfahren
sind ca. 26.000, ca. 26.000 bzw. ca. 28.000.
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Das erfindungsgemäße Enzym ist besonders für die quantitative
Bestimmung von D-Sorbitol nützlich und
Spurenmengen von D-Sorbitol können
präzise
unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms bestimmt werden.
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Diabetes ist eine Erkrankung, bei
der ein hoher Blutzuckerspiegel aufrechterhalten bleibt, ohne subjektive
Symptome, aufgrund von verschiedenen Faktoren und dies führt zu diabetischen
Komplikationen, die schwere Symptome aufzeigen. Andererseits haben
die Zellen, wie die Mesangialzellen der Niere, die Retinalzellen,
Neuronalzellen, Erythrozyten usw., die einen passiven Einfluß von Glucose
in die Zellen ohne Teilnahme von Insulin aufzeigen, einen Sorbitol-Stoffwechsel,
dieser metabolisiert Glucose zu Sorbitol und anschließend zu
Fructose, dieses fließt
aus der Zelle heraus. Wenn die Menge an Glucoseeinfluss in die Zellen
bei erhöhtem
Blutzuckerspiegel durch Diabetes erhöht ist, ist die Aktivität der Aldose-Reduktase,
die Glucose zu Sorbitol reduziert, gesteigert und der intrazelluläre Sorbitolgehalt
erhöht.
Die Aktivität
der Sorbitol-Dehydrogenase, die Sorbitol zu Fructose reduziert,
ist allerdings nicht erhöht,
Sorbitol wird nicht schnell verstoffwechselt und reichert sich daher
in den Zellen an. Ein solcher Zustand wird als "Polyol-Metabolismus-Erkrankung" (engl.: polyol metabolism
disorder) bezeichnet.
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Aufgrund der intrazellulären Sorbitolanreicherung
bei der Polyol-Metabolismus-Erkrankung nimmt der intrazelluläre osmotische
Druck zu. Als Ergebnis fließt
Flüssigkeit
in die Zellen und die Zellen schwellen an, dies führt zur
funktionellen Veränderung
der Zellen und stellt einen Faktor der diabetischen Komplekationen dar,
wie diabetische Retinopathie, diabetische Nephropathie und diabetische
Neuropathie. Die Polyol-Metabolismus-Erkrankung wird mit einem Arzneimittel,
wie Aldose-Reduktase-Inhibitor (ARI), der den Stoffwechsel von Glucose
zu Sorbitol hemmt, behandelt.
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Daher ist eine in vivo Messung der
Sorbitol-Konzentration in Erythrozyten zur Überwachung der Zustände bei
Prävention
und/oder Behandlung dieser Komplikationen wirksam.
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Sorbitol kommt in vivo in extrem
geringer Menge vor und verschiedene zu Sorbitol analoge Substanzen
existieren. Entsprechend ist die Verwendung eines Enzyms mit hoher
Spezifitität
und einer hohen Affinität für Sorbitol
für die
Messungen von Spuren von Sorbitol in einem kurzen Zeitraum notwendig.
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Die Sorbitol-Konzentration in Erythrozyten
ist ca. 4 μM
beim normalen Menschen, dieser kann auf ca. 17 μM bei hohem Blutzuckerzuständen ansteigen.
Da die Testprobe im allgemeinen in einer Menge von ca. 10% der Messlösung verwendet
wird, ist es notwendig, dass mindestens ein Bereich von 0,4 μM bis 1,7 μM Sorbitol
in der Messlösung
bestimmt werden soll.
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Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms
ist es möglich,
quantitativ von 0,025 μM
bis 8 μM D-Sorbitol
in einer Reaktionslösung
innerhalb von 3 Minuten zu bestimmen, dies ist sehr nützlich zur Überwachung
von Zuständen
bei diabetischen Komplikationen.
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Das erfindungsgemäße Reagenz zur quantitativen
Bestimmung von D-Sorbitol umfasst das erfindungsgemäße Enzym
und einen Elektronenakzeptor als wesentliche Komponenten. Der verwendbare
Elektronenakzeptor ist nicht besonders beschränkt, solange er eine Dehydrierungsoxidation
von D-Sorbitol bewirken kann. NAD+, Sauerstoff,
Phenanzinmethoxysulfat, Dichlorphenolindophenol, Kaliumferricyanat
und Natriumferricyanat, Cytochrom C, NADP+,
FMN und ähnliche
Coenzyme können
verwendet werden. Die Konzentration an D-Sorbitol in einer Gruppe
kann bestimmt werden durch Messen der Menge an reduziertem Coenzym,
gebildet durch die Reaktion unter Verwendung des erfindungsgemäßen Enzyms,
basierend auf der Veränderung
der Absorptions- oder Fluoreszenzintensität als Index. Wenn NAD+ oder NADP+ als
Elektronenakzeptor verwendet wird, kann eine quantitative Bestimmung
ebenfalls durchgeführt
werden unter Verwendung eines Farbstoffs (z. B. ein Tetrazoliumsalz,
wie Nitroblau-Tetrazolium oder 2,6-Dichlorphenolindophenol) und einem
Enzym, das die Reduktion des Farbstoffes unter Verwendung von NADH
oder NADPH als Substrat katalysiert, zusätzlich zu den oben beschriebenen
wesentlichen Komponenten, dies erlaubt die Messung von farbigem
reduziertem Farbstoff im sichtbaren Bereich.
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Die für das erfindungsgemäße Reagenz
zur quantitativen Bestimmung von D-Sorbitol verwendeten Puffer sind
nicht besonders eingeschränkt,
solange die Puffer eine ausreichende Pufferfähigkeit beim pH aufzeigen,
bei dem das erfindungsgemäße Enzym
stabil ist und eine gute Aktivität
aufzeigt. Beispiele für
den Puffer schließen
Kaliumphosphat, Tris usw. ein.
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Das Reagenz zur quantitativen Bestimmung
von D-Sorbitol kann weiterhin verschiedene andere Zusatzstoffe enthalten,
solange das Ziel der vorliegenden Erfindung nicht verschlechtert
wird. Beispiele von Zusatzstoffen schließen ein Metall chelatierende
Mittel, Tenside, reduzierende Mittel, Stabilisatoren, Lösungshelfer,
diese können
entweder allein oder in Kombination verwendet werden.
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Bevorzugte Beispiele des Reagenz
zur quantitativen Bestimmung von Sorbitol schließt eine Lösung (pH 8,5 bis 10,5), enthaltend
0,5 bis 10 Einheiten/ml des erfindungsgemäßen Enzyms, 1 bis 5 mM NAD+ und 10 bis 200 mM Puffer ein. Ein weiteres
bevorzugtes Beispiel für
das Reagenz schließt
die gleiche Lösung
ein, diese enthält
weiterhin 1 bis 10 Einheiten/ml Diaphorase-I (Unitika Ltd.) und
0,5 bis 5 mM WST-8 (Dojindo).
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Das erfindungsgemäße Reagenz kann in irgendeiner
Form bereitgestellt werden, wie in getrockneter Form, gelöster Form,
aufgetragen oder in imprägnierter
Form auf einem Träger,
usw.
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Das Verfahren zur Messung von D-Sorbitol
unter Verwendung des erfindungsgemäßen Reagenz zur Messung von
D-Sorbitol wird durchgeführt
durch Zugabe einer Probe, enthaltend D-Sorbitol zum Reagenz und Messen
der Veränderung
der Absorption oder Fluoreszenzintensität. Die Reaktion kann durch
Zugabe von einer oder mehreren Komponenten, wie der Probe, Sorbitoldehydrogenase
oder dem Coenzym initiiert werden und die Messung der Absorption
oder Fluoreszenzintensität
kann bei Beendigung der Reaktion oder zur irgendeinem Zeitpunkt
während
der Reaktion durchgeführt
werden. Die Probe, die D-Sorbitol enthält, ist nicht besonders eingeschränkt und
Beispiele davon schließen
verschiedene klinische Proben, wie Blut, Urin usw. und verschiedene
Nahrung, usw. ein.
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Eine D-Sorbitol enthaltende Probe
wird zu dem oben beschriebenen Reagenz zur Bestimmung von D-Sorbitol
zugegeben, bevorzugt bei einer Temperatur von 25°C bis 40°C. Die Reaktionszeit kann entsprechend
eingestellt werden in Abhängigkeit
von der Reaktionstemperatur, der Menge an Sorbitol in der Probe und/oder
der Menge von im Reagenz enthaltenen Enzym, usw. und ist üblicherweise
in einem Bereich von 10 Minuten, bevorzugt innerhalb von 3 Minuten.
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Die vorliegende Erfindung wird mit
Hilfe der folgenden Beispiele weiter beschrieben, die vorliegende Erfindung
soll aber nicht auf diese begrenzt sein.
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Alle Teile, Prozente, Verhältnisse
usw. sind auf das Gewicht bezogen.
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Beispiel 1
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In einen 30 l Gefäßfermenter wurden 18 l eines
Kulturmediums mit einem pH von 7,0, das 2,0% (bezogen auf das Gewicht,
das gleiche gilt im folgenden) D-Sorbitol, 0,5% Pepton, 0,5% Hefeextrakt
und 0,1% Dikaliumhydrogenphosphat enthielt, gefüllt. Das Kulturmedium wurde
dann bei einer Temperatur von 121°C für 15 Minuten
sterilisiert. Flavimonas oryzihabitans A-520-Stamm (FERM BP-7195)
wurde dann an das Kulturmedium angeimpft. Die Inkubation wurde bei
einer Temperatur von 30°C
unter Rühren
bei 200 Upm unter Belüftung
mit 1 vvm für
70 Stunden durchgeführt.
Das Kulturmedium wurde dann einer Zentrifugaltrennung unterworfen,
um 300 g Naß-Bakterienzellen
zu erhalten. Die so erhaltenen Bakterien wurden gefroren gelagert. Anschließend wurden
die gefrorenen Bakterien in 2 l 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5),
der 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF), 2 mM EDTA und 2 mM
2-Mercaptoethanol enthielt, suspendiert. Die Bakterien wurden dann
mit einer French-Presse aufgebrochen. Die so aufgebrochenen Bakterien
wurden dann einer Zentrifugaltrennung unterworfen, um Zelltrümmer zu
entfernen. Somit konnte eine Rohenzymlösung, die Sorbitoldehydrogenase
enthält,
erhalten werden. Die Rohenzymlösung
wurde anschließend über eine
DEAE-Sepharose-FF-Säule
(hergestellt von Pharmacia Corporation), die vorher mit 25 mM Phosphatpuffer
(pH 8,0), enthaltend 2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert
wurde, gegeben und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,65
M KCl eluiert. So wurde eine Sorbitoldehydrogenase aktive Fraktion
bei einer KCl-Konzentration von
ca. 0,20 bis 0,25 M erhalten. Anschließend wurde Ammoniumsulfat zu
der so erhaltenen Fraktion in einer Konzentration von 20% gegeben.
Die Fraktion wurde dann über
eine Butyl Toyopearl Säule
(hergestellt von TOSOH CORP.), äquilibriert
mit 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 20% Ammoniumsulfat,
2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol, gegeben. Die Eluierung wurde
durchgeführt,
während
die Konzentration an Ammoniumsulfat im Puffer schrittweise erniedrigt
wurde. Als Ergebnis wurde eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion
bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von ca. 4% bis 7% erhalten.
Die so erhaltene aktive Fraktion wurde einer Dialyse unterworfen
und anschließend über eine
DEAE-Trisacrylsäule
(hergestellt von Pharmacia Corporation) gegeben, die vorher äquilibriert
wurde mit einem 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 2 mM EDTA
und 2 mM 2-Mercaptoethanol, dann wurde diese mit einem linearen
Gradienten von 0 bis 0,25 M KCl eluiert. So konnte eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion
bei einer KCl-Konzentration von ca. 0,15 bis 0,2 M erhalten werden.
Anschließend
wurde zu der so erhaltenen Fraktion Ammoniumsulfat mit einer Konzentration
von 5% zugegeben. Die Fraktion wurde dann über eine Phenylcellulofinesäule (hergestellt
von Pharmacia Corporation), äquilibriert
mit einem 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 2 mM 5% Ammoniumsulfat,
2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol, gegeben. Die Eluierung wurde
durchgeführt,
während die
Konzentration an Ammoniumsulfat im Puffer schrittweise erniedrigt
wurde. Als Ergebnis wurde eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion
erhalten bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von ca. 2% bis 1%.
Die Ausbeute an so erhaltener Sorbitoldehydrogenase war ca. 40%.
Die so erhaltene Sorbitoldehydrogenase zeigte eine spezifische Aktivität von ca.
33 Einheiten pro mg Enzymprotein auf. Der Reinheitsgrad der so erhaltenen Sorbitoldehydrogenase
war ca. 370fach zu der Rohenzymlösung.
Die so erhaltene Sorbitoldehydrogenase hatte die vorgenannten physikochemischen
Eigenschaften.
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Beispiel 2
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Mit einem ähnlichen Verfahren wie in Beispiel
1 beschrieben, wurde Pseudomonas fluorescens A-989-Stamm kultiviert,
um ca. 210 g nasse Bakterienzellen zu erhalten. Die so erhaltenen
Bakterien wurden gefroren gelagert. Anschließend wurde eine Rohenzymlösung, die
eine Sorbitoldehydrogenase enthält,
durch ein ähnliches
Verfahren wie das in Beispiel 1 beschriebene, erhalten. Die Rohenzymlösung wurde
dann über eine
DEAE-Sepharose-FF-Säule (hergestellt
von Pharmacia Corporation), die vorher mit einem 25 mM Phosphatpuffer
(pH 8,0), enthaltend 2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert
wurde, gegeben. Als ein Ergebnis zeigte es sich, dass kaum Sorbitoldehydrogenase
durch die Säule
absorbiert wurde. Die Sorbitoldehydrogenase in den nicht absorbierten
Fraktionen wurde gewonnen und Ammoniumsulfat wurde in einer Konzentration
von 10% zugegeben. Die Fraktion wurde dann durch eine Butyl Toyopearl
Säule (hergestellt
von TOSOH CORP.), äquilibriert
mit 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 10% Ammoniumsulfat,
2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol, geleitet. Die Eluierung wurde
durchgeführt,
während
die Konzentration an Ammoniumsulfat im Puffer schrittweise erniedrigt
wurde. Als ein Ergebnis wurde eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion
erhalten bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von ca. 4% bis 3%.
Die Ausbeute an so erhaltener Sorbitoldehydrogenase war ca. 56%.
Die so erhaltene Sorbitoldehydrogenase zeigte eine spezifische Aktivität von ca.
4 Einheiten pro mg Enzymprotein auf. Der Reinheitsgrad der so erhaltenen
Sorbitoldehydrogenase war ca. 110fach zu der der Rohenzymlösung. Die
so erhaltene Sorbitoldehydrogenase hatte die vorgenannten physikochemischen
Eigenschaften.
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Beispiel 3
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Durch ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel
1 beschrieben, wurde Pseudomonas fluorescens A-654-Stamm kultiviert,
um ca. 300 g Nassbakterienzellen zu erhalten. Die so erhaltenen
Bakterien wurden dann gefroren gelagert. Anschließend wurde
eine Rohenzymlösung,
die Sorbitoldehydrogenase enthielt, durch ein ähnliches Verfahren wie in Beispiel
1 beschrieben, erhalten. Die Rohenzymlösung wurde dann über eine
DEAE-Sepharose-FF-Säule (hergestellt
von Pharmacia Corporation), die vorher mit 25 mM Phosphatpuffer
(pH 8,0), enthaltend 2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol äquilibriert
wurde, gegeben und ein Eluieren wurde mit einem linearen Gradienten
von 0 bis 0,6 M KCl durchgeführt.
So wurde eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion bei einer KCl-Konzentration
von ca. 0,20 bis 0,25 M erhalten. Anschließend wurde zu der so erhaltene
Fraktion Ammoniumsulfat mit einer Konzentration von 20% zugegeben.
Die Fraktion wurde dann über
eine Butyl Toyopearl Säule
(hergestellt von TOSOH CORP.), die mit 25 mM Phosphatpuffer (pH
8,0), enthaltend 20% Ammoniumsulfat, 2 mM EDTA und 2 mM 2-Mercaptoethanol äquilibriert
wurde, gegeben. Das Eluieren wurde durchgeführt, während die Konzentration an
Ammoniumsulfat im Puffer schrittweise erniedrigt wurde. Als Ergebnis
wurde eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von
2% bis 1% erhalten. Die Fraktion wurde dann über eine Red Sepharosesäule (hergestellt
von Pharmacia Corporation), äquilibriert
mit 25 mM Phosphatpuffer (pH 8,0), enthaltend 2 mM EDTA und 2 mM
2-Mercaptoethanol, geleitet. Ein Eluieren wurde mit 2 mM NADH durchgeführt, um
eine aktive Sorbitoldehydrogenasefraktion zu erhalten. Die Ausbeute
an so erhaltenem Sorbitoldehydrogenase war ca. 17%. Die so erhaltene
Sorbitoldehydrogenase zeigte eine spezifische Aktivität von ca.
25 Einheiten pro mg Enzymprotein. Der Aufreinigungsgrad an so erhaltener
Sorbitoldehydrogenase war ca. 1.130fach zu der Rohenzymlösung. Die
so erhaltene Sorbitoldehydrogenase zeigte die vorgenannten physikochemischen
Eigenschaften.
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Beispiel 4
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Unter Verwendung der von Stamm Flavimonas
oryzihabitans A-520 stammenden Sorbitoldehydrogenase, aufgereinigt
in Beispiel 1, wurde ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung von
Sorbitol mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.
| Tris-HCl-Puffer
(pH 8,0) | 100
mM |
| NAD+ (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd. | 2,5
mM |
| Oben
beschriebenes Enzym | 2,5
Einheiten/ml |
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0,8 ml Reagenz zur quantitativen
Bestimmung von Sorbitol wurde dann einer Vorinkubation bei einer Raumtemperatur
von 37°C
für 5 Minuten
unterworfen. Zu dem Reagenz wurden jeweils anschließend 0,2
ml verschiedener Proben an D-Sorbitol-Standardprodukt (erste Wahl, hergestellt
von NACALAI TESQUE, INC.), die vorher auf 5 μM, 25 μM, 40 μM, 125 μM, 250 μM, 400 μM bzw. 750 μM eingestellt wurden, gegeben.
Jede dieser Proben konnte dann bei einer Temperatur von 37°C in einem
UV-265-Spektrophotometer, hergestellt von Shimadzu Corp. für 30 Minuten
reagieren. Die Absorption wurde dann bei 340 nm bestimmt. Der Nullwert von
destilliertem Wasser anstelle der vorgenannten Probe wurde dann
von dem erhaltenen Wert abgezogen, um die Veränderung an Absorption (ΔOD) zu bestimmen.
Es gab eine lineare Beziehung zwischen der berechneten Konzentration
aus der Veränderung
der Absorption und der molekularen Absorptionsgrad von NAD+ (6.220 M–1cm–1)
und dem Gehalt an D-Sorbitol. 13 ist
ein Streudiagramm, das die Beziehung zwischen der tatsächlichen
D-Sorbitolkonzentration
und der mit dem vorgenannten Reagenz gemessenen D-Sorbitolkonzentration
darstellt. Die Gleichung der Regressionslinie, erhalten durch lineare
Näherung
unter Verwendung der Methode der kleinsten Quadrate ist y = –0,98x +
2,1 (r = 0,998). Der Koeffizient von x und der des Korrelationskoeffizienten
war fast gleich 1. Entsprechend wird deutlich, dass D-Sorbitol in
der Probe mit Hilfe des vorgenannten Reagenz akkurat bestimmt werden
kann.
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Beispiel 5
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Unter Verwendung der Sorbitoldehydrogenase,
die von Flavimonas oryzihabitans A-520-Stamm stammt, aufgereinigt
in Beispiel 1, wurde ein Reagenz zur quantitativen Bestimmung von
Sorbitol mit der folgenden Zusammensetzung hergestellt.
| Tris-HCl-Puffer
(pH 9,0) | 80
mM |
| NAD+ (hergestellt von Oriental Yeast Co., Ltd. | 2,0
mM |
| Oben
beschriebenes Enzym | 5
Einheiten/ml |
| WST-8 | 1
mM |
| Diaphorase | 2
Einheiten/ml |
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0,72 ml des Reagenz zur quantitativen
Bestimmung von Sorbitol wurden anschließend einer Vorinkubation bei
einer Temperatur von 30°C
für 5 Minuten
unterworfen. Zu dem Reagenz wurden dann jeweils 0,08 ml verschiedener
Proben von D-Sorbitol-Standardprodukt
(first grade, hergestellt von NACALAI RESQUE, INC.), die vorher
auf 1 μM,
5 μM, 20 μM, 80 μM bzw. 320 μM eingestellt
wurden, gegeben. Diese Proben konnten dann bei einer Temperatur
von 30°C
in einem UV-265-Spektrophotometer, hergestellt von Shimadzu Corp., für 6 Minuten
reagieren. Die Absorption wurde dann bei 460 nm bestimmt. Der Nullwert
von destilliertem Wasser anstelle der o. g. Probe wurde dann von
dem so bestimmten Wert abgezogen, um die Veränderung der Absorption (ΔOD) zu bestimmen.
Es gab nur wenig oder gar keine ΔOD
Veränderung
nach 3 Minuten nach Beginn der Reaktion, dies zeigt, dass die Reaktion
nach 3 Minuten beendet war. Es gibt eine lineare Beziehung zwischen
der Konzentration, berechnet aus dem molekularen Absorptionsgrad-Koeffizienten von
WST-8 (30.000 M–1cm–1)
auf Basis von ΔOD
bestimmt 30 Minuten nach Beginn der Reaktion und der Konzentration an
zu der Reaktionslösung
zugegebenem D-Sorbitol.
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14 ist
eine Graphik, die die Beziehung zwischen der Reaktionszeit und ΔOD darstellt.
Wie man aus der 14 erkennen
kann, endet die Reaktion nach 3 Minuten.
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15 ist
ein Streudiagramm, das die Beziehung zwischen der Konzentration
von D-Sorbitol an zu der Reaktionslösung zugegebenem D-Sorbitol
und der D-Sorbitol-Konzentration, gemessen mit dem vorgenannten
Reagenz darstellt. Die Gleichung der Regressionslinie, erhalten
durch lineare Annäherung
unter Verwendung des Verfahrens der kleinsten Quadrate ist y = 1,45x
+ 0,2 (r = 1.000). Der Koeffizient von x und der Korrelationskoeffizient
sind fast gleich 1. Entsprechend ist deutlich, dass D-Sorbitol in
der Probe akkurat bis auf 1 μm
mit Hilfe des vorgenannten Reagenz bestimmt werden kann.
