WO2014154676A1 - Verfahren zur isomerisierung von glucose - Google Patents

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    • C12Y106/01—Oxidoreductases acting on NADH or NADPH (1.6) with NAD+ or NADP+ as acceptor (1.6.1)

Definitions

  • Sugar redox enzymes e.g. Sorbitol dehydrogenase is also used for diagnostic purposes (e.g., DE60006330).
  • Isolation of fructose from aqueous solutions is e.g. according to a method described in US4895601 or US5047088.
  • one-pot reaction herein is meant a process wherein two or more enzymatic redox reactions involved in product formation and two enzymatic systems for cofactor regeneration occur in a reaction batch without isolating an intermediate.
  • a process according to the present invention is characterized in that the oxidation reaction and
  • 2-propanol isopropyl alcohol, IPA
  • cosubstrate is used, which is oxidized by means of an alcohol dehydrogenase to acetone, that is, in the regeneration reaction, the oxidized cofactor NAD (P) + back to its original reduced form NAD (P) H converted by means of an alcohol dehydrogenase 2-propanol is oxidized to acetone.
  • Invention at a temperature of 10 ° C to 70 ° C, preferably from 20 ° C to 45 ° C are performed.
  • Enzymes can be used as such in a process according to the present invention.
  • Particularly suitable enzymes are enzymes which can oxidize glucose in sorbitol, those which reduce sorbitol to fructose and those which reduce NADH or NADPH, or those which can oxidize NAD + or NADP + .
  • Aldose reductases simultaneously oxidize the redox factors NAD (P) H to NAD (P) + in the reduction of glucose.
  • Sorbitol dehydrogenases simultaneously reduce the redox cofactors NAD (P) + to NAD (P) H in the oxidation of sorbitol.
  • step a) in a process according to the present invention namely the conversion of glucose into sorbitol, at least 80% of the glucose present can be reduced to sorbitol, for example at least 90%, in particular at least 95%.
  • 80% to 99.99%, such as 90% to 99.95%, eg 95% to 99.9% of the glucose present in the starting mixture can be reacted.
  • a material having a high content of D-fructose in the total sugar content provides a suitable starting material for further conversion
  • Fructose prepared according to a method of the present invention may be further converted to furan derivatives.
  • the amount of a required catalyst in stage B) can be easily found out by a person skilled in the art by simple preliminary experiments. The amount depends on the type of catalyst used.
  • the present invention is characterized in that furan derivatives prepared are further reacted, e.g. that hydroxymethylfurfural is further oxidized to 2,5-furandicarboxylic acid, optionally polymerized
  • polymers such as polyethylene furanoate (PEF) is used.
  • NMP as the solvent in the reaction compared to previously known systems in combination with homogeneous or heterogeneous catalysts provides higher conversions both in the microwave assisted process and under "continuous flow” conditions.
  • the process was conducted using a ThalesNano® X-Cube cartridge-based reactor equipped with a Gilson® GX-271 auto-sampler auto-sampler. Two quartz sand cartridges (CatCart®, 70 x 4 mm) were used as
  • Aluminum cylinder was wound.
  • the substrates were added using a Shimadzu LC-10AD HPLC pump at the desired flow rate.
  • Exact volumes (column 16.0 mL, dead volume before and after the column, 1.0 mL each) were determined by monitoring defined flow rates of the pure solvent with a digital stopwatch.
  • Microwave vessel filled and provided with a stirring magnet After sealing the vial by snap-cap, the solution was heated to the desired temperature for the desired time. In order to bring about the fastest possible heating, the energy supplied was set as shown in Table 1 below.
  • several preliminary samples were taken to monitor a stable temperature and a stable flow rate.
  • the reaction temperature selected was 150 ° C., 180 ° C. and 200 ° C., the reaction pressure being regulated to 40 bar. For this, flow rates between 0.2 and 0.6 ml / min were chosen. Reaction samples were collected in 2.5 mL quantities and analyzed.

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Abstract

Verfahren zur Isomerisierung von Glucose durch Reduktion zu Sorbitol und nachfolgende Oxidation zu Fructose, in dem die Redoxkofaktoren NAD+/NADH und NADP+/NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion regeneriert werden, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel R1C(O)COOH reduziert wird, und b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form überführt, eine Verbindung der allgemeinen Formel R2CH(OH)R3 oxidiert wird wobei in den Verbindungen R1, R2 und R3 verschiedene Bedeutungen haben, das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Ausgangsmaterial eine Mischung aus Glucose und Fructose eingesetzt wird und die Verwendung derart hergestellter Fructose in einem Verfahren zur Herstellung von Furanderivaten.

Description

Verfahren zur Isomerisierung von Glucose
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose und zur Anreicherung von Fructose in einem Gemisch aus Fructose und Glucose.
D-Glucose liegt in großer Menge in verschiedensten Biopolymeren vor, welche Bestandteile von nachwachsenden Rohstoffen sind. Beispiele dafür sind Stärke (z.B. Maisstärke) oder Cellulose (z.B. aus lignocellulosischer Biomasse).
Eine gängige Möglichkeit zur Umwandlung von D-Glucose zu D-Fructose erfolgt unter Verwendung einer geeigneten D-Glucoseisomerase, z.B. D-Xylose-Isomerase, die D- Glucose als Substrat akzeptiert. Solche Verfahren sind schon lange bekannt, z.B. aus US2950228 und auch für den industriellen Einsatz geeignet, wie etwa in US3616221 oder US3868304 beschrieben.
Ein Problem dabei ist, dass üblicherweise maximal ca. 42 % der D-Glucose zu D-Fructose umgewandelt werden können. Eine weitere Anreicherung von D-Fructose gegenüber D- Glucose kann durch Trennverfahren erreicht werden. Eine Möglichkeit dazu ist die
Verwendung von chromatographischen Methoden, wie z.B. in US5221478 beschrieben. Für den Nahrungsmittelsektor wird dabei oft lediglich eine teilweise Anreicherung von D- Fructose angestrebt. Vor allem zur Produktion relativ reiner bis hoch reiner D-Fructose sind chromatographische Verfahren aber sehr aufwändig.
Neben der Verwendung von Isomerasen wurden in der Literatur auch enzymatische Redoxreaktionen an Kohlenhydraten beschrieben.
So wird beispielsweise in DE69839381 eine Sorbitoldehydrogenase beschrieben, die zur Umwandlung von D-Sorbitol zu L-Sorbose eingesetzt werden und bei der Herstellung von Ascorbinsäure Anwendung finden kann. In DE10247147 ist ein Verfahren beschrieben, bei dem unter Verwendung von D-Mannitol- 2-Dehydro genäse D-Fructose zu D-Mannitol reduziert wird.
In US4467033 ist die enzymatische Oxidation von L-Sorbitol zu L-Fructose beschrieben.
Beispiele für die Reduktion von D-Xylose zu Xylitol sind etwa in US20060035353 oder in Woodyer R. et al., FEBS J., 2005, Volume 272, p 3816- 3827 offengelegt.
Es wurde bereits gezeigt, dass geeignete Xylose-Reduktasen verwendet werden können, um D-Glucose zu D-Sorbitol zu reduzieren (z.B. Wang X. et al., Biotechnol. Lett, 2007, Volume 29, p 1409-1412).
Zucker-Redoxenzyme wie z.B. Sorbitol-Dehydrogenase werden auch für diagnostische Zwecke eingesetzt (z.B. DE60006330).
Bei diesen Verfahren handelt es sich um einzelne Redoxreaktionen, bei denen zur
Produktbildung jeweils entweder eine Reduktion oder eine Oxidation erfolgt.
Enzymkatalysierte Redoxreaktionen werden in industriellen Prozessen beispielsweise in der Herstellung von chiralen Alkoholen, α-Aminosäuren und α-Hydroxysäuren verwendet. Die bisher bekannten industriellen Prozesse verwenden in der Regel ein Redoxenzym zur Produktsynthese, sowie gegebenenfalls ein weiteres Enzym zur Kofaktor-Regenerierung. Davon zu unterscheiden sind Verfahren, bei denen zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen sowie die gegebenenfalls notwendigen
enzymatischen Reaktionen zur Kofaktor-Regenerierung (zeitgleich oder sequentiell) in einem Reaktionsansatz durchgeführt werden, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird. In letzter Zeit haben solche enzymatischen Kaskadenreaktionen - hier als Ein-Topf- Reaktionen bezeichnet - signifikante Aufmerksamkeit erlangt, da sie effektiv
Betriebskosten, Betriebszeit und Umweltauswirkungen reduzieren. Zusätzlich ermöglichen enzymatische Kaskaden von Redoxreaktionen Transformationen, die durch klassische chemische Verfahren nicht einfach umzusetzen sind. So wurde ein Versuch beschrieben, die Deracemisierung von Racematen sekundärer Alkohole über ein prochirales Keton als Zwischenprodukt unter Verwendung eines EinTopf-Systems durchzuführen (J. Am. Chem. Soc, 2008, Volume 130, p. 13969-13972). Die Deracemisierung von sekundären Alkoholen wurde über zwei Alkoholdehydrogenasen (S- und R-spezifisch) mit unterschiedlicher Kofaktor-Spezifizität erreicht. Ein Nachteil des Verfahren ist die sehr geringe Konzentration des eingesetzten Substrats von 0,2-0,5%, was für industrielle Zwecke nicht geeignet ist.
Ein weiteres Ein-Topf-System wurde in WO 2009/121785 beschrieben, wobei ein
Stereoisomer eines optisch aktiven sekundären Alkohols zum Keton oxidiert und dann zum entsprechenden optischen Antipoden reduziert wurde und wobei zwei
Alkoholdehydrogenasen mit entgegengesetzten Stereoselektivitäten und unterschiedlichen Kofaktor- Spezifitäten verwendet wurden. Die Kofaktoren wurde mittels eines sogenannten „Hydrid-Transfer-Systems" unter Verwendung nur eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Um die Kofaktoren zu regenerieren, wurden verschiedene Enzyme wie z.B.
Formatdehydrogenase, Glucosedehydrogenase, Lactatdehydrogenase verwendet. Ein Nachteil dieses Verfahrens ist die geringe Konzentration der verwendeten Substrate.
Im Gegensatz dazu sind bereits viele einzelne enzymatische Redoxreaktionen bekannt. Ein Anwendungsbeispiel ist die Herstellung chiraler Hydroxyverbindungen ausgehend von entsprechenden prochiralen Keto Verbindungen. In diesen Verfahren wird der Kofaktor mittels eines zusätzlichen Enzyms regeneriert. Diesen Verfahren gemeinsam ist, dass sie eine isolierte Reduktionreaktion darstellen und NAD(P)H regenerieren (siehe z.B.
EP1152054).
Weitere Beispiele einer enzymatischen Herstellung von chiralen,
enantiomerenangereicherten, organischen Verbindungen, wie zum Beispiel Alkoholen oder Aminosäuren, wurden beschrieben (Organic Letters, 2003, Volume 5, p. 3649-3650;
US7163815; Biochem. Eng. J., 2008, Volume 39(2) p. 319-327; EP1285962). In den Systemen wurde als Kofaktor-Regenerierungsenzym eine NAD(P)H-abhängige Oxidase aus Lactobacillus brevis oder Lactobacillus sanfranciscensis verwendet. Bei den Versuchen handelt es sich auch um Einzelreaktionen zur Produktbildung. Es entfallen bei den genannten einzeln ablaufenden Oxidations- oder Reduktionsreaktionen die Vorteile einer Ein-Topf-Reaktion, wie z.B. Wirtschaftlichkeit durch Zeit- und
Materialersparnis .
Eine Isolierung von Fructose aus wässrigen Lösungen ist z.B. gemäß einer Methode, die in US4895601 oder US5047088 beschrieben ist, möglich.
Alle bis heute bekannten Prozesse weisen verschiedene Nachteile auf, beispielsweise geringe Anfangskonzentration des Substrates, niedrige Gesamtausbeuten.
Es wurde nun überraschenderweise eine Möglichkeit gefunden, eine höhere Anreichung von Fructose bei der Isomerisierung von Glucose zu Fructose zu erreichen.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Isomerisierung von Glucose durch Reduktion zu Sorbitol und nachfolgende Oxidation zu Fructose zur
Verfügung, in dem die Redoxkofaktoren NAD+/NADH und NADP+/NADPH in einer EinTopf-Reaktion regeneriert werden, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen
(Produktbildungsreaktionen) einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei
a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine
ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der
allgemeinen Formel
Figure imgf000005_0001
worin Ri für eine geradkettige oder verzweigtkettige (C1-4)-Alkylgruppe oder für eine (C1-4)-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und
b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine
ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C4-8)-Cycloalkanol oder eine Verbindung der allgemeinen Formel
Figure imgf000006_0001
worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (Ci-6)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C2-6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-12)-Aryl, Carboxyl, oder (C1-4)-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. (C3-8)-Cycloalkyl,
oxidiert wird,
das dadurch gekennzeichnet ist, dass als Ausgangsmaterial eine Mischung aus Glucose und Fructose eingesetzt wird.
Ein Verfahren, das gemäß vorliegender Erfindung bereitgestellt wird, wird hierin auch als „Verfahren gemäß (nach) vorliegender Erfindung" bezeichnet.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung zur Verfügung, worin in a) eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R eine substituierte oder unsubstituierte (C1-4)- Alkyl gruppe bedeutet, reduziert wird, und in b) eine Verbindung der allgemeinen Formel II, worin R2 und R unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, (C1-6)- Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigtkettig ist, (C2-6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigtkettig ist und gegebenenfalls bis zu drei Doppelbindungen enthält, Cycloalkyl, insbesondere (C3-8)-Cycloalkyl, Aryl, insbesondere (C6-12)-Aryl, (C1-4)-Carboxyalkyl, falls es sich bei Verbindung I um Pyruvat handelt, gegebenenfalls auch Carboxyl,
oxidiert wird.
In einem weiteren Aspekt sind in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung R2 und R unabhängig voneinander ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus H, (C ö)- Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C2-6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-12)-Aryl, Carboxyl, oder (C1-4)-Carboxyalkyl. In einem besonderen Aspekt läuft die Reaktion gemäß vorliegender Erfindung nach nachfolgendem, Reaktions Schema 1 ab:
Reaktions Schema 1
Figure imgf000007_0001
Alkohol Dehydrogenase
Gegenüber dem Stand der Technik stellt ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eine wesentliche Verbesserung von Verfahren dar, bei denen Verbindungen sowohl enzymatisch oxidiert als auch reduziert werden, da es damit ermöglicht wird, die nötigen Oxidations- und Reduktionsreaktionen sowie die zugehörigen Reaktionen zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen zu lassen und gleichzeitig wesentlich höhere
Substratkonzentrationen einzusetzen als dies im Stand der Technik der Fall ist.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung werden die Kofaktoren NADH und NADPH eingesetzt. Dabei bezeichnet NAD+ die oxidierte Form und NADH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid während NADP+ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat bezeichnen.
Als„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" werden hier diejenigen enzymkatalysierten Redoxreaktionen bezeichnet, die nicht Teil der Kofaktor-Regenerierung sind und in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung an der Bildung des Produkts beteiligt sind.„Oxidationsreaktion(en)" und„Reduktionsreaktion(en)" sind unter dem Begriff„Produktbildungsreaktionen" zusammengefasst. Die Produktbildungsreaktionen in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung beinhalten jeweils mindestens eine Oxidationsreaktion sowie mindestens eine Reduktionsreaktion. Wird NAD+ als Kofaktor für die Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADPH der Kofaktor für die Reduktionsreaktion(en). Wird NADP+ als Kofaktor für die
Oxidationsreaktion(en) verwendet so ist NADH der Kofaktor für die
Reduktionsreaktion(en) .
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) entweder zeitlich parallel oder zeitlich nicht parallel, sondern nacheinander im selben Reaktionsansatz durchgeführt werden.
Als Substrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die mit dem Ziel der Produktbildung eingesetzt werden. Als Kosubstrate werden hier diejenigen Verbindungen bezeichnet, die bei der Kofaktor-Regenerierung umgesetzt werden.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung werden mehrere Substrate, nämlich Glucose und Sorbitol eingesetzt. Dabei erfolgen Reduktions- und/oder
Oxidationsreaktion(en) am selben Substrat (Molekülgrundgerüst). Weiterhin finden in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung Reduktions- und Oxidationsreaktion an zwei verschiedenen funktionellen Gruppen, die sich jeweils an verschiedenen Stellen im
Molekülgerüst befinden, statt.
Unter„Ein-Topf-Reaktion" wird hier ein Verfahren bezeichnet, bei dem zwei oder mehr an der Produktbildung beteiligte enzymatische Redoxreaktionen und zwei enzymatische Systeme zur Kofaktor-Regenerierung in einem Reaktionsansatz ablaufen, ohne dass ein Zwischenprodukt isoliert wird.
Die Nennung einer Säure oder des Salzes einer Säure schließt hier den jeweils nicht genannten Begriff ein. Ebenfalls schließt die Nennung von Säuren hier alle davon abgeleiteten Ester mit ein. Weiter sind hier (partiell) mit Schutzgruppen versehene
Verbindungen bei der Nennung der zugrundeliegenden Substanzen mit eingeschlossen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Oxidationsreaktion und
Reduktionsreaktion zeitlich parallel ablaufen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass sowohl Oxidationsreaktion als auch Reduktionsreaktion am selben Molekülgrundgerüst stattfinden.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass als Verbindung der Formel II
(sekundärer Alkohol) 2-Propanol (Isopropylalkohol, IPA) (Kosubstrat) eingesetzt wird, welches mittels einer Alkoholdehydrogenase zu Aceton oxidiert wird, das heißt, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor NAD(P)+ wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form NAD(P)H überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor NAD(P)H wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form NAD(P)+ überführt, mittels einer NADH Oxidase Sauerstoff zu Wasser reduziert wird.
Ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt in einem wässrigen System durchgeführt.
In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass Fructose als Substrat in einer Konzentration von mindestens 5% (w/v) und mehr, bevorzugt 7% (w/v) und mehr, insbesondere bevorzugt 9% (w/v) und mehr im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen, z.B. 5% (w/v) bis 20% (w/v), wie 5% (w/v) bis 15% (w/v), z.B. 5% (w/v) bis 12% (w/v), wie 5% (w/v) bis 10% (w/v). In einer besonderen Ausführungsform ist ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei den Produktbildungsreaktionen insgesamt ein Umsatz von >70 , insbesondere >90 erreicht wird.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann dem wässrigen System ein Puffer zugesetzt werden. Geeignete Puffer sind zum Beispiel Kaliumphosphat, Tris-HCl und Glycin mit einem pH- Wert von 5 bis 10, vorzugsweise von 6 bis 9. Weiters, oder alternativ können dem System Ionen zur Stabilisierung der Enzyme, wie zum Beispiel Mg2+ oder sonstige Zusätze, wie zum Beispiel Glycerin zugesetzt werden. Die Konzentration der zugesetzten Kofaktoren NAD(P)+ und NAD(P)H beträgt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung üblicherweise zwischen 0,001 mM und 10 mM, vorzugsweise zwischen 0,01 mM und 1 mM.
Abhängig von den verwendeten Enzymen kann das Verfahren gemäß vorliegender
Erfindung bei einer Temperatur von 10°C bis 70°C, vorzugsweise von 20°C bis 45°C durchgeführt werden.
Enzyme können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung als solche,
gegebenenfalls in der Form von Zell-Lysaten, gegebenenfalls als rekombinant
überexprimierte Proteine, beispielsweise als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet werden, wobei weiterhin bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden können. Je nach dem zu produzierenden Enzym können auch andere Mikroorganismen zur Expression eingesetzt werden, z.B. Mikroorganismen, die dem Fachmann bekannt sind. Feste Bestandteile der jeweiligen Mikroorganismen können in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung entweder abgetrennt werden oder in der Reaktion mit eingesetzt werden (z.B. Ganzzell-Biokatalysatoren). Es können auch
Kulturüberstände oder Lysate von Mikroorganismen eingesetzt werden, die ohne
rekombinante DNA-Technologie bereits ausreichende Enzym- Aktivitäten aufweisen. In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung können sowohl Enzyme als auch
Redoxkofaktoren entweder in löslicher Form oder an Feststoffe immobilisiert zum Einsatz kommen. Die Enzym-Einheit 1 U entspricht dabei derjenigen Enzymmenge, die benötigt wird, um 1 μιηοΐ Substrat pro min umzusetzen. Enzyme werden in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung bevorzugt als in E. coli rekombinant überexprimierte Proteine verwendet, wobei weiterhin bevorzugt die entsprechenden Zell-Lysate ohne weitere Aufreinigung eingesetzt werden.
Als Enzyme kommen insbesondere solche Enzyme, die Glucose in Sorbitol, solche die Sorbitol in Fructose und solche die NADH oder NADPH reduzieren, bzw. solche die NAD+ oder NADP+ oxidieren können, in Frage.
Enzyme, die Glucose in Sorbitol umsetzen können schließen z.B. Aldosereduktasen, wie Xylosereduktasen ein. Eine geeignete Xylosereduktase ist zum Beispiel erhältlich aus Candida tropicalis.
Enzyme, die Sorbitol in Fructose umsetzen können schließen z.B.
Sorbitoldehydrogenasen(Sorbitdehydrogenasen), ein. Geeignete Sorbitoldehydro genasen sind zum Beispiel erhältlich aus Schafsleber, Bacillus subtilis oder Malus domestica.
Aldosereduktasen oxidieren bei der Reduktion der Glucose gleichzeitig die Redoxfaktoren NAD(P)H zu NAD(P)+. Sorbitoldehydrogenasen reduzieren bei der Oxidation des Sorbitols gleichzeitig die Redoxkofaktoren NAD(P)+zu NAD(P)H.
Zur Regenerierung der Redoxkofaktoren NAD(P)H , bzw. NAD(P)+ kommen
Dehydrogenasen, wie Alkoholdehydrogenasen, Laktatdehydrogenasen, oder Oxidasen, insbesondere NAD(P)H Oxidasen in Betracht.
Geeignete Alkoholdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Lactobacillus kefir. Geeignete Laktatdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Oryctolagus cuniculus. Geeignete NADH Oxidasen sind zum Beispiel erhältlich aus Leuconostoc mesenteroides, Streptococcus mutans, Clostridium aminovalericum.
Als Ausgangsmaterial in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung dient eine Mischung aus Glucose und Fructose, vorzugsweise D-Glucose und D-Fructose. Eine solche Mischung kann auf verschiedene Weise hergestellt werden. Beispielsweise kann Glucose als Startmaterial eingesetzt und teilweise zu Fructose isomerisiert werden. Die Isomerisierung kann dabei durch bekannte Methoden erfolgen, beispielweise unter Einsatz von homogener Säure-Katalyse Ionenaustauscherharzen, oder enzymatisch, etwa mit Hilfe einer, z.B. immobilisierten, Isomerase, wie einer Glucose- Isomerase, beispielsweise Xylose-Isomerase aus Streptomyces murinus.
Bevorzugt wird eine Mischung aus Glucose und Fructose aus Glucose unter Einsatz einer immobilisierten Glucose-Isomerase hergestellt.
Bei der Isomerisierung der Glucose handelt es sich um Gleichgewichtsreaktionen, wobei das chemische Gleichgewicht zwischen Glucose und Fructose bei der enzymatischen Reaktion temperaturabhängig ist. Bisher konnte als maximaler Literaturwert je nach Quelle 55% bis 58,9% Fructose in der Mischung gefunden werden. Im optimierten technischen Prozess wird allerdings aufgrund einer geringeren Enzymmenge und kürzerer Reaktionszeiten momentan mit einem Wert von ca. 42% gearbeitet. Höhere Werte werden können bisher nur mit höheren Temperaturen erreicht werden. Es sind allerdings auch Isomerisierungen in 90% Aceton beschreiben. Dabei kann eine Fructose-Umwandlung von bis zu 60% erreicht werden. Die dafür benötigten Enzyme sind aber unter diesen Reaktionsbedingungen nicht sehr stabil.
Demgegenüber können die beiden Redoxreaktionen zur Umwandlung von Fructose über Sorbitol zu Glucose gemäß vorliegender Erfindung durch geeignete Kofaktor- Recyclingsysteme sehr weit in Richtung Produkte getrieben werden.
Als Ausgangsmischung in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt eine Mischung eingesetzt, in der der Anteil der Fructose bis zu 55 Gew-% beträgt, beispielsweise 10 Gew-% bis 55 Gew-%, wie 20 Gew-% bis 50 Gew-%, z.B. 23 Gew-% bis 45 Gew-%, etwa 25 Gew-% bis 43 Gew-%.
Es hat sich gezeigt, dass in der Stufe a) in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, nämlich der Umsetzung von Glucose in Sorbitol, mindestens 80% der vorhandenen Glucose zu Sorbitol reduziert werden können, z.B. mindestens 90%, insbesondere mindestens 95%. Beispielsweise können 80% bis 99,99%, wie 90% bis 99,95%, z.B. 95% bis 99,9% der in der Ausgangsmischung vorhandenen Glucose umgesetzt werden.
Es hat sich weiterhin herausgestellt, dass nach Durchführung der Stufe b) in einem
Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, nämlich nach der Umsetzung von Sorbitol zu Fructose, ein Gesamtanteil der Fructose an allen Zuckern in der Mischung von mindestens 70%, 80%, 90%, 95% oder sogar bis zu 99,9% erreicht werden kann, beispielweise kann ein Gesamtanteil der Fructose an allen Zuckern in der Mischung von 60% bis 99,99%, z.B. 70% bis 99,95 %, wie 80% bis 99,9%, 90% bis 99,8%, ja sogar 95% bis 99,5% erhalten werden. Dazu kann beispielsweise eine Mischung, die aus einer Stufe b) in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung erhalten wurde, und in der die Fructose beispielweise bereits auf 60% angereichert ist, erneut in ein Verfahren gemäß vorliegender Erfindung eingesetzt werden.
Fructose hat eine höhere Süßkraft als Glucose und vor allem in den USA wird ein Süßstoff enzymatisch aus Maisstärke, praktisch reiner Glucose, hergestellt der eine Mischung aus Glucose und Fructose darstellt. Solche Glucose-Fructose Mischungen schließen
beispielsweise Glucose-Fructose-Sirup (High Fructose Com Syrup - HFCS) ein. Maissirup wird z.B. bei deutschen Lebensmitteln auf der Zutatenliste ab einem Gehalt von 5 %
Fructose als Glucose-Fructose-Sirup deklariert und als Zuckerkonzentrat verwendet. Enthält der Sirup einen Fructoseanteil von mehr als 50 %, wird er dann entsprechend als„Fructose- Glucose-Sirup" bezeichnet.
Mit Hilfe eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung kann in solchen Glucose- Fructose-Sirupen ohne aufwändigen Trennungsverfahren beispielsweise ein gewünschter Fructose Gehalt von 60% und mehr eingestellt werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung zur Herstellung von Fructose-Glucose-Sirup mit einem gewünschten Fructose Gehalt, insbesondere von 60% und mehr, zur Verfügung. Die D-Fructose, die gemäß Stufe a) der vorliegenden Erfindung gewonnen werden kann, kann, z.B. mit Hilfe einer Kristallisation, isoliert werden.
Ein Material, das einen hohen Anteil von D-Fructose am Gesamt-Zuckergehalt aufweist, stellt beispielsweise ein geeignetes Ausgangsmaterial zur weiteren Umwandlung in
Furanderivate dar
Die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung kann nach einer geeigneten Methode erfolgen, z.B. nach einer üblichen Methode, oder wie hierin beschrieben.
Fructose, die gemäß einem Verfahren nach vorliegender Erfindung hergestellt ist, kann weiter zu Furanderivaten umgesetzt werden.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Gewinnung von Furanderivaten aus einer Mischung aus Glucose und Fructose zur Verfügung, das dadurch gekennzeichnet, dass
A) eine Mischung aus Glucose und Fructose in einem enzymatischen Verfahren unter
Verwendung und Regenerierung von Redoxkofaktoren in Fructose übergeführt wird, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen einer der beiden Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei D- Glucose unter Beteiligung von zwei oder mehr Oxidoreduktasen in D-Fructose übergeführt wird, und
B) die in A) erhaltene Fructose zu Furanderivaten umgesetzt wird.
Ein Verfahren zur Gewinnung von Furanderivaten aus einer Mischung aus Glucose und Fructose, das gemäß vorliegender Erfindung zur Verfügung gestellt wird, wird hierin auch als„Furanverfahren gemäß (nach) vorliegender Erfindung" bezeichnet.
Gemäß üblicher Methoden kann die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in einem Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung in Gegenwart eines Katalysators, z.B. eines sauren Katalysators, wie einer anorganischen Säure, organische Säure, z. B. Oxalsäure, eines Zeolith (H-Form), von Übergangsmetallionen, eines heterogen gelösten Metallphosphats, eines stark sauren Kationenaustauschers, erfolgen.
Als Lösungsmittel in einem Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung kann Wasser oder ein organisches Lösungsmittel Verwendung finden, z.B. Dimethylsulfoxid (DMSO), Dimethylformamid (DMF), N-Methylpyrrolidon; bevorzugt erfolgt die Umsetzung der D- Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung in Gegenwart eines sauren Katalysators und in Gegenwart von N-Methyl-pyrrolidon (N-Methyl-2-pyrrolidon, NMP) der Formel
Figure imgf000015_0001
Die Umsetzung der D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) in einem Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung kann entweder als Batch-Prozess oder als kontinuierlicher Prozess durchgeführt werden; in einer bevorzugten Ausführungsform wird die Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung unter Mikrowellen-Erhitzung durchgeführt.
Besondere Ausführungsformen des Furanverfahrens nach vorliegender Erfindung sind dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten N- Methyl-2-pyrrolidon (NMP) entweder als Reaktions-Lösungsmittel, oder als Co- Lösungsmittel, nämlich als Beimischung zu einem anderen Lösungsmittel, verwendet wird.
In einer besonderen Ausführungsform eines Furanerfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird in Stufe b) NMP als (Co)-Lösungsmittel, z.B. als Reaktionslösungsmittel oder als Beimischung zu einem anderen Lösungsmittel, verwendet.
In einem Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung kann, wenn NMP als Lösungsmittel eingesetzt wird, NMP als einziges Lösungsmittel eingesetzt werden, oder NMP wird zusammen mit einem Co-Lösungsmittel verwendet, wobei im Falle der Verwendung eines Co-Lösungsmittels eine NMP-Konzentration von bis zu 70% (v/v), beispielsweise bis zu 60% (v/v) bezogen auf die Gesamtlösungsmittelmenge eingesetzt werden kann. Als Co- Lösungsmittel kommen z.B. Wasser oder organische Lösungsmittel, z.B. solche, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, wie Ν,Ν-Dimethylsulfoxid (DMSO) oder N,N- Dimethylformamid (DMF) in Betracht.
In einem Furanverfahren gemäß Stufe B) der vorliegenden Erfindung kann die D-Fructose in einer Menge von bis zu 40% (w/v) eingesetzt werden und wird im allgemeinen in einer Menge von 5 bis 20% eingesetzt, obwohl die Reaktion auch in niedrigerer Konzentration abläuft, beispielsweise in einer D-Fructose Konzentration von (etwa) 1% (w/v). Der Minimalwert ist dabei eher durch die Wirtschaftlichkeit und nicht chemisch definiert.
Saure Katalysatoren in Stufe B) in einem Furanverfahren nach vorliegender Erfindung schließen übliche saure Katalysatoren, die bei der Umwandlung von Fructose in
Furanderivate eingesetzt werden können, ein. Bevorzugt ist der Katalysator eine Br0nsted- Säure.
Dabei können homogene Säurekatalysatoren, z.B. Schwefelsäure oder Salzsäure, oder heterogene Säurekatalysatoren, beispielsweise Kationenaustauscherharze wie
Montmorillonite, bevorzugt Montmorillonit KSF® oder Amberlite, z.B. Amberlite®, bevorzugt Amberlite 15®, verwendet werden. Außerdem können in einem Verfahren nach vorliegender Erfindung Lewis-Säure-Katalysatoren, wie CrCl2, A1C13, Si02-MgCl2 oder ein SILP(silica supported ionic
Figure imgf000016_0001
eingesetzt werden. Im Allgemeinen liefern diese jedoch nicht so gute Ergebnisse, wie die oben genannten Katalysatoren.
In einem weiteren Aspekt ist ein Furanverfahren nach vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) als saurer Katalysator
ein homogener Säurekatalysator, bevorzugt Schwefelsäure oder Salzsäure;
ein heterogener Säurekatalysator, bevorzugt ein Ionenaustauscher, z.B. ein
Montmorillonit, wie Montmorillonit KSF® oder ein Amberlit, wie Amberlite®, bevorzugt Amberlite 15®
ein Lewis-Säurekatalysator wie z.B. CrCl2, AICI3 oder Si02-MgCl2
ein SILP-Katalysator, bevorzugt ein homogener oder heterogener Säurekatalysator,
eingesetzt wird.
Die Menge eines benötigten Katalysators in Stufe B) kann der Fachmann problemlos durch einfache Vorversuche herausfinden. Die Menge hängt dabei von der Art des verwendeten Katalysators ab.
Beispielhaft sind nachfolgend Katalysator- Mengen bezogen auf die eingesetzte Fructose- Menge angegeben, insbesondere für den Fall, dass NMP als Lösungsmittel verwendet wird:
Katalysator Menge
IN HCl 20 bis 200% (v/w)
HCl (37%) 2 bis 25% (v/w)
IN H2S04 20 bis 200% (v/w)
H2SO4 conc 2 bis 25% (v/w)
Montmorillonite KSF® 1 bis 50% (w/w)
Amberlite 15® 1 bis 50% (w/w)
CrCl2, AICI3 1 bis 20% (w/w)
Si02-MgCl2 20 bis 200% (w/w)
SILP 10-200% (w/w)
Dabei sind bei einer Konzentration von etwa 10% (w/v) D-Fructose die angegebenen Werte unproblematisch, bei höheren Fructose-Konzentrationen ist die Menge der Katalysatoren so zu begrenzen, dass die Fructose in der verbleibenden Lösungsmittelmenge noch gelöst werden kann.
Das Furan verfahren in Stufe B) gemäß vorliegender Erfindung wird bei geeigneten
Temperaturen durchgeführt. Geeignete Temperaturen schließen, insbesondere wenn NMP als Lösungsmittel verwendet wird, Temperaturen von 100 bis 220°C, bevorzugt von 115 bis 200°C, insbesondere bevorzugt 135 bis 185°C ein. Die Reaktionen in Stufe B) unter Verwendung von NMP als Lösungsmittel wurden experimentell durchgehend in geschlossenen Gefäßen (Batch, Mikrowelle) durchgeführt, ohne aktive Druckkontrolle. Aus den Mikrowellenläufen kann man als Maximaldruck bei NMP etwa 2-4 bar ansetzen, stark abhängig von den Additiven. Wird z.B. HCl als
Katalysator eingesetzt, so steigt der entstehende Druck auf bis zu 15 bar an. Im
kontinuierlichen Betrieb wurde ein konstanter Rückdruck zur Vermeidung des Siedens des Lösemittels, etwa bis zu 40 bar angelegt. Druck entsteht entweder als Dampfdruck von Lösungsmittel(n) oder Additiven oder es wird ein systembedingter (Pump-)Druck angelegt. Für den Reaktionsmechanismus erscheint der Druck aber nicht entscheidend.
Es hat sich herausgestellt, dass das hauptsächlich entstehende Furanderivat in einem
Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung Hydroxymethylfurfural (HMF) der Formel
Figure imgf000018_0001
Hydroxymethylfurfural (HMF)
ist.
In einem weiteren Aspekt ist ein Furanverfahren gemäß vorliegender Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass das Furanderivat Hydroxymethylfurfural ist.
In einem Furanverfahren nach vorliegender Erfindung soll unter„HMF-Selektivität" jener Anteil der verbrauchten D-Fructose verstanden werden, der zu HMF umgesetzt wird.
Furanderivate, die mit einem Furanverfahren nach vorliegender Erfindung hergestellt werden, können entweder direkt verwendet werden oder in weiteren chemischen Reaktionen zu Folgeprodukten umgesetzt werden. Beispielsweise kann Hydroxymethylfurfural weiter zu 2,5-Furandicarbonsäure (FDCA) der Formel
Figure imgf000019_0001
2,5-Furandicarbonsäure (FDCA) oxidiert werden. FDCA eignet sich bekanntlich als Monomer zur Herstellung von Polymeren wie zum Beispiel Polyethylenfuranoat (PEF), das ähnlich eingesetzt werden kann wie Polyethylenterephthalat (PET), zum Beispiel für Hohlkörper, insbesondere Flaschen wie z.B. Getränke-Flaschen, Flaschen für Kosmetika oder Flaschen für Reinigungsmittel. Bei gleichzeitiger Verwendung von Ethylenglycol aus regenerativen Quellen und FDCA, welches zugänglich ist aus HMF, hergestellt in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung, kann PEF gewonnen werden, das praktisch vollständig aus nachwachsenden Rohstoffen besteht.
In einem weiteren Aspekt ist die vorliegende Erfindung dadurch gekennzeichnet, dass hergestellte Furanderivate weiter umgesetzt werden, z.B. dass Hydroxymethylfurfural weiter zu 2,5-Furandicarbonsäure oxidiert wird, das gegebenenfalls einer Polymerisation
unterworfen wird, z.B. zur Herstellung von Polymeren, wie etwa Polyethylenfuranoat (PEF) eingesetzt wird.
Beispiel 1
Herstellung von Fructose aus Glucose-Fructose-Sirup durch Glucose-Isomerase gefolgt vom einem zweistufigen Redoxprozess
750 mg D-Glucose wurden in 50 mM Tris-Puffer (pH = 8.0 bei 25°C) zu einem
Gesamtvolumen von 5 ml gelöst. Zu der Mischung wurden 250 mg immobilisierte Glucose- Isomerase aus Streptomyces murinus (Sigma-Aldrich, Novozymes Sweetzyme IT®) zugegeben und die Suspension bei 50°C für 6 h vorsichtig geschüttelt. Es wurde hierbei ca. 33 % der Glucose zu Fructose umgesetzt. Die Glucose-Isomerase wurde durch
Zentrifugation (5000 g, 1 min) entfernt. Anschließend wurden in einem 2 ml Glasgefäß 400 μΐ der Lösung mit 10 μΐ Tris-HCl (0,5 M, pH = 8.0), 20 μΐ Xylose-Reduktase aus Candida tropicalis (überexprimiert in E. coli BL21 (DE3), 280 U/ml), 30 μΐ Alkohol- Dehydrogenase aus Lactobacillus kefir (überexprimiert in E. coli BL21 (DE3), 130 U/ml) sowie 35 μΐ 2-Propanol versetzt. Die Reaktion wurde in einem offenen System durchgeführt, wobei das Glasgefäß für 24 h bei 40°C geschüttelt wurde (Eppendorf Thermomix®, 850 rpm). Durch das offene System wird die Verdampfung des Reaktionsprodukts Aceton ermöglicht, was die Reaktion in Richtung Sorbitol-Bildung treibt. Folgende
Nachdosierungen wurden vorgenommen: 15 μΐ 2-Propanol nach 4 h, 25 μΐ 2-Propanol nach 18 h sowie 50 μΐ Wasser nach 18 h. Es wurde 98,5 % der noch vorhandenen Glucose zu Sorbitol umgesetzt. Die Mischung enthielt insgesamt ca. 71 % Sorbitol, 28 % Fructose und 1 % Glucose. In einem weiteren Reaktionsschritt wurden 60 μΐ NADH-Oxidase aus
Leuconostoc mesenteroides (überexprimiert in E. coli BL21 (DE3), 350 U/ml) und 40 μΐ Sorbitol-Dehydrogenase aus Bacillus subtilis (überexprimiert in E. coli BL21 (DE3), 50 U/ml) zugegeben. Die Reaktion fand wieder in einem offenen System statt, um die Sauerstoff- Versorgung für die NADH-Oxidase Reaktion zu gewährleisten. Das
Reaktionsgefäß wurde für 48 h bei 25°C geschüttelt (Eppendorf Thermomix®, 850 rpm). Es wurde eine Mischung aus 60 % D-Fructose, 35,2 % D-Sorbitol und 4,7 % D-Glucose erhalten.
Beispiel 2
Materialien und Methoden für die Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten
Es wurden Dehydratationsreaktionen von D-Fructose zu HMF unter verschiedenen
Reaktionsbedingungen durchgeführt, wahlweise als Standard-B atch-Prozess, unter Mikrowellen-assistierter Erhitzung oder mittels "continuous flow"-Bedingungen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass NMP als Lösungsmittel bei der Reaktion im Vergleich zu bisher bekannten Systemen in Kombination mit homogenen oder heterogenen Katalysatoren sowohl im Mikrowellen-assistierten-Verfahren als auch unter "continuous flow"-Bedingungen höhere Umsätze liefert.
Synthese von SiÖ2-MgCl2
Si02-MgCl2 wurde hergestellt in Anlehnung an eine Vorschrift von Yasuda et al. (Yasuda, M.; Nakamura, Y.; Matsumoto, J.; Yokoi, H. Shiragami, T. Bull. Chem. Soc. Jpn. 2011, 84, 416-418).
Synthese von SILPs
Der SILP Katalysator wurde entsprechend bekannter Vorschriften (Fu, S.-K.; Liu, S.-T. Synth. Commun. 2006, 36, 2059-2067) unter Verwendung von N-Methylimidazol hergestellt. Zur Immobilisierung wurde die erhaltene ionische Flüssigkeit mit 200 Gew.- Silica-Gel in trockenem Chloroform (100 mL pro 10 g Si02) vermischt und 24 h auf 70 °C erhitzt. Der erhaltene Feststoff wurde abfiltriert, mit Chloroform gewaschen und unter reduziertem Druck getrocknet. Das erhaltene Silica-Gel wies eine Beladung von ca. 16 Gew.- an Katalysator auf.
Allgemeine Bedingungen Batch Reaktionen
Falls nicht anders beschrieben wurden alle Batch-Reaktionen im 4 mL Schraubdeckelglas durchgeführt. Die Erwärmung wurde in geeigneten Aluminiumblöcken bis zur gewünschten Temperatur durchgeführt.
Mikrowellenreaktionen im Batch-V erfahren
Mikrowellen-Reaktionen wurden im Batch- Verfahren an einer Biotage-Initiator Sixty laboratory Mikrowelle durchgeführt, die mit einem Autosampier ausgerüstet war, um sequentielle Reaktionsführungen zu ermöglichen. Das Absorptionslevel wurde auf
Maximalwert eingestellt, wodurch die maximale Energiezufuhr automatisch auf 400 W geregelt wurde. Stopped flow Mikrowellenreaktionen und continuous-flow Reaktionen
Stopped flow Reaktionen zur Optimierung einer semi-kontinuierlichen Prozessführung wurden an einem an einem CEM® Discover System mit CEM® Voyager Upgrade und mittels externem Drucksensor durchgeführt. Für Reaktionen in kontinuierlicher
Prozessführung wurde ein kartuschenbasiertes Reaktor System X-Cube von ThalesNano®, ausgerüstet mit einem Gilson® GX-271 Autosampier zur automatischen Produktsammlung, verwendet. Zwei Quarzsand Kartuschen (CatCart®, 70 x 4 mm) wurden hierbei als
Reaktionszone eingebaut.
Alternativ wurde eine Perfluoralkoxyalkan-Kapillare eingesetzt (PFA-Kapillare, 0.8 mm Innendurchmesser, 1.6 mm Außendurchmesser), welche um einen beheizbaren
Aluminiumzylinder gewickelt wurde. Die Substrate wurden mittels einer Shimadzu LC- 10AD HPLC Pumpe in der gewünschten Flussrate zugegeben. Exakte Volumina (Säule 16,0 mL; Totvolumen vor und nach der Säule jeweils 1,0 mL) wurden bestimmt, in dem definierte Flussraten des reinen Lösungsmittels mit einer Digitalstoppuhr verfolgt wurden.
Analyse der Reaktionen zur Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten
Zur quantitativen HPLC- Analyse wurden Proben der Reaktionssamples (22 μL· falls nicht anders angegeben) mit entionisiertem Wasser auf 1 mL verdünnt. Bei Reaktionsproben, die eine unterschiedliche Konzentration aufwiesen, wurde die Verdünnung so angepasst, dass die maximale Konzentration 2 mg/ml nicht überschritt.
Zu dieser Lösung wurden 100 μΐ^ 3-Hydroxybenzylalkohol als interner Standard
hinzugegeben, woraufhin die Probe gründlich durchmischt wurde. Feste Rückstände wurden mittels Zentrifugieren (5 min, 20000 G) oder Filtration (Phenex PTFE, 4 mm, 0.2 μιη) abgetrennt. Quantifizierung erfolgte ausgehend von den Flächen der Peaks im RI-Spektrum im Vergleich zum internen Standard.
Die Proben wurden mittels HPLC an einem Thermo Scientific® Surveyor Plus System oder einem Shimadzu® Nexera System jeweils ausgestattet mit PDA Plus- und RI Detektor analysiert. Für die Trennung wurde als stationäre Phase eine Ionenauschlusssäule von Phenomenex® (Rezex RHM-Monosaccharide H+ (8%), 150 x 7.8 mm, aufgebaut aus quervernetzter Matrix von sulfoniertem Styrol und Divinylbenzol, H+-Form) und ein
Laufmittelgemisch aus Wasser (HPLC-grade) und 0,1 % TFA (HPLC-grade) als Eluent verwendet. Die Säulentemperatur wurde konstant und auf 85 °C gehalten, wobei die Laufzeit auf 25 Minuten optimiert wurde. Produktquantifizierung wurde anhand eines internen Standards durch Integration des RI-Signals durchgeführt. Mittels PDA wurden zusätzlich die Wellenlängen 200 nm, 254 nm und 280 nm zur weiteren Reaktionsanalyse aufgezeichnet.
GP1 - D-Fructose-Dehydratisierung im Batch- 'erfahren
In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden 100 mg D-Fructose (0,56 mmol) und der jeweilige Katalysator in der gewünschten Menge in ein Glasvial gegeben und mit 1 mL frisch destilliertem NMP versetzt. Die erhaltenen Lösung/Suspension wurde auf die gewählte Temperatur erhitzt und für die gewünschte Zeit reagieren gelassen.
GP2 - D-Fructose-Dehydratisierung im Mikrowellen-Batch- 'erfahren
In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden 100 mg D-Fructose (0,56 mmol) und der jeweilige Katalysator in der gewünschten Menge in ein Mikrowellen-Gefäß (0,5 - 2,0 mL) gegeben. Das Gefäß wurde mit einem Rührmagneten ausgestattet und mit 1 mL NMP aufgefüllt. Die Strahlungsintensität der Mikrowelle wurde von einem
firmeneigenen Regulationsalgorithmus automatisch eingestellt, um die gewünschte
Temperatur zu erreichen. Eine schnelle Kühlung des Reaktionsgefäßes wurde mittels eingeblasener Druckluft von mindestens 6 bar realisiert.
GP3 - D-Fructose-Dehydratisierung im Mikrowellen stopped flow Verfahren
In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurden eine D-Fructose Standardlösung (1 mL; c = 100 mg/mL in NMP) und Salzsäure (100 μί; c = 1 mol/L) in ein
Mikrowellengefäß gefüllt und mit einem Rührmagneten versehen. Nach Versiegelung des Vials mittels Snap-Cap wurde die Lösung für die gewünschte Zeit auf die gewünschte Temperatur erhitzt. Um eine schnellstmögliche Erwärmung herbeizuführen wurde die zugeführte Energie entsprechend der nachfolgenden Tabelle 1 eingestellt.
Tabelle 1
Leistungseinstellung der Mikrowelle und zugehörige Temperaturen
Temperatur Leistungseinstellung Temperatur Leistungseinstellung
100°C 50 W 180°C 125 W
125°C 65 W 200°C 140 W Temperatur Leistungseinstellung Temperatur Leistungseinstellung
150°C 100 w 220°C 160 W
Eine schnelle Kühlung des Reaktionsgefäßes wurde mittels eingeblasener Druckluft von mindestens 6 bar realisiert.
GP4 - D-Fructose-Dehydratisierung im Kartuschen-basierten Reaktor sy stein
In einer Standardreaktion zur Reaktionsoptimierung wurde eine D-Fructose Standardlösung (1 mL; c = 100 mg/mL in NMP) mit Salzsäure (c = 1 mol/L) gemischt und durch eine Reagenzpumpe in das Reaktions System gepumpt. Während des Aufheizprozesses wurden mehrere Vorproben entnommen, um eine stabile Temperatur und eine stabile Flussrate zu überwachen. Als Reaktionstemperatur wurden 150°C, 180°C und 200°C gewählt, wobei der Reaktionsdruck auf 40 bar reguliert wurde. Hierfür wurden Flussraten zwischen 0,2 und 0,6 ml/min gewählt. Reaktionsproben wurden in 2,5 mL Mengen aufgefangen und analysiert.
Beispiel 3
Verwendung von Schwefelsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose
Es wurden verschiedene Temperaturen, Reaktionszeiten und Säurekonzentrationen verglichen. Die Reaktionen wurden nach„GP1" (Beispiel 4) durchgeführt. Als Katalysator wurde entweder 100 μΐ 1 N Schwefelsäure oder 10 μΐ konzentrierte Schwefelsäure verwendet. In Tabelle 1 sind die Ergebnisse zusammengefasst.
Tabelle 1
Schwefelsäure als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose
ReaktionsFructose- HMF HMF LS
Katalysator Temperatur
zeit Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute
IN H2S04 100°C 3 h 69% 45% 65% < 1%
IN H2S04 120°C 4 h 95% 77% 81% < 1%
IN H2S04 150°C 15 min 98% 88% 90% < 1%
IN H2S04 180°C 10 min 100% 85% 85% < 1%
H2S04 conc. 120°C 45 min 98% 85% 90% < 1%
H2S04 conc. 150°C 10 min 100% 90% 90% < 1% ReaktionsFructose- HMF HMF LS
Katalysator Temperatur
zeit Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute
H2SO4 conc. 180°C 5 min 100% 82% 82% < 1%
Die Bildung schwarzer unlöslicher Polymere und Humine wurde unter den verwendeten optimalen Bedingungen nicht beobachtet.
Beispiel 4
Verwendung von Schwefelsäure zur Katalyse der Umsetzung von D-Fructose zu
Furanderivaten (kontinuierlicher Prozess)
D-Fructose (10 % w/v) und konzentrierte Schwefelsäure (1 % v/v) wurden in N-Methyl-2- pyrrolidon gelöst. Die Mischung wurde mittels einer PFA-Kapillare unter kontinuierlichem Fluss durch den Reaktor gepumpt (Reaktionstemperatur 150°C). Nachdem die ersten 18 ml verworfen wurden, wurden weitere 10 ml zur Analyse gesammelt. Durch eine Reihe von Flussraten wurde der Effekt unterschiedlicher Verweilzeiten im Reaktor getestet (Tabelle 10).
Tabelle 10
Schwefelsäure zur Katalyse der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten
(kontinuierlicher Prozess)
Figure imgf000025_0001
Unter den untersuchten Bedingungen wurde keine Bildung von schwarzen unlöslichen Polymeren und Huminen beobachtet.
Beispiel 5
Verwendung von Amberlite 15® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung eines starken Ionenaustauschers mit Sulfonsäureresten basieren auf einem makro vernetzen Harz. 100 mg D-Fructose wurde in Gegenwart von 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon 3 h bei 100°C unter Rühren inkubiert (Vorschrift„GPl, Beispiel 2). Dabei wurde Amberlite 15® als Katalysator zugegeben. In Tabelle 2 ist das Ergebnis dieses Experiments gezeigt. Bei der relativ niedrigen Temperatur konnte eine hohe Ausbeute erreicht werden. Die Bildung von teerartigen Verbindungen wurde vermieden.
Tabelle 2
Amberlite 15® als Katalysator zur Dehydratisierung von D-Fructose
Menge ReaktionsFructose- HMF HMF LS
Temp.
Katalysator zeit Verbrauch Ausbeute Selektivität Ausbeute
10 mg 100°C 3 h 70% 50% 71% < 1%

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Isomerisierung von Glucose durch Reduktion zu Sorbitol und
nachfolgende Oxidation zu Fructose, in dem die Redoxkofaktoren NAD+/NADH und NADP+/NADPH in einer Ein-Topf-Reaktion regeneriert werden, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen (Produktbildungsreaktionen) einer der beiden
Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei
a) bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor wieder in seine
ursprüngliche oxidierte Form überführt, Sauerstoff oder eine Verbindung der allgemeinen Formel
Figure imgf000027_0001
worin Ri für eine geradkettige oder verzweigtkettige (C1-4)-Alkylgruppe oder für eine (C1-4)-Carboxyalkylgruppe steht, reduziert wird, und
b) bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor wieder in seine
ursprüngliche reduzierte Form überführt, ein (C4-8)-Cycloalkanol oder eine
Verbindung der allgemeinen Formel
Figure imgf000027_0002
worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (C1-ö)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C2-6)- Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-12)-Aryl, Carboxyl, oder (C1-4)-Carboxyalkyl, insbesondere auch Cycloalkyl, z.B. (C3-8)Cycloalkyl,
oxidiert wird, dadurch gekennzeichnet, dass als Ausgangsmaterial eine Mischung aus Glucose und Fructose eingesetzt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin in a) eine Verbindung der allgemeinen Formel I, worin R eine substituierte oder unsubstituierte (C1_4)-Alkylgruppe bedeutet, reduziert wird, und in b) eine Verbindung der allgemeinen Formel II, worin R2 und R3 unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus H, (C1-ö)-Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigtkettig ist, (C2-6)-Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigtkettig ist und gegebenenfalls bis zu drei Doppelbindungen enthält, Cycloalkyl, insbesondere C3-8 Cycloalkyl, Aryl, insbesondere (C6-i2)-Aryl, (C1-4)-Carboxyalkyl, falls es sich bei Verbindung I um Pyruvat handelt, gegebenenfalls auch Carboxyl,
oxidiert wird.
3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin in b) eine Verbindung der Formel II, worin R2 und R3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus H, (Ci-Cö)- Alkyl, worin Alkyl geradkettig oder verzweigt ist, (C2-6)- Alkenyl, worin Alkenyl geradkettig oder verzweigt ist und ein bis drei Doppelbindungen enthält, Aryl, insbesondere (C6-i2)-Aryl, Carboxyl, oder (C1-4)-Carboxyalkyl.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion nach nachfolgendem Reaktionsschema 1
Figure imgf000028_0001
o o e y rogenase abläuft.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) zeitlich parallel ablaufen.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass
Oxidationsreaktion(en) und Reduktionsreaktion(en) zeitlich nicht parallel ablaufen.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den oxidierten Kofaktor NAD(P)+ wieder in seine ursprüngliche reduzierte Form NAD(P)H überführt mittels einer Alkoholdehydrogenase 2-Propanol zu Aceton oxidiert wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Regenerierungsreaktion, die den reduzierten Kofaktor NAD(P)H wieder in seine ursprüngliche oxidierte Form NAD(P)+ überführt, mittels einer NADH Oxidase
Sauerstoff zu Wasser reduziert wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass das
Substrat/die Substrate für die an der Produktbildung beteiligte(n) Oxidationsreaktion(en) in einer Konzentration von 5% (w/v) und mehr, insbesondere von 7% (w/v) und mehr, insbesondere von 9% (w/v) und mehr im Reaktionsansatz vorliegt/vorliegen.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fructose, die gemäß der Ansprüche 1 bis 9 gewonnen wird, isoliert wird, insbesondere in kristallisierter Form.
11. Verfahren zur Gewinnung von Furanderivaten aus einer Mischung aus Glucose und Fructose, dadurch gekennzeichnet, dass
A) eine Mischung aus Glucose und Fructose in einem enzymatischen Verfahren unter Verwendung und Regenerierung von Redoxkofaktoren in Fructose übergeführt wird, wobei als Resultat mindestens zweier weiterer im selben Reaktionsansatz
ablaufender enzymatisch katalysierter Redoxreaktionen einer der beiden
Redoxkofaktoren in seiner reduzierten Form anfällt und der jeweils andere in seiner oxidierten Form, wobei D-Glucose unter Beteiligung von zwei oder mehr
Oxidoreduktasen in D-Fructose übergeführt wird, und
B) die in A) erhaltene Fructose zu Furanderivaten umgesetzt wird.
12. Verfahren gemäß Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe B) ein saurer Katalysator und ein Lösungsmittel, insbesondere N-Methyl-2-pyrrolidon der Formel
Figure imgf000030_0001
entweder als Reaktions-Lösungsmittel oder als Co-Lösungsmittel, eingesetzt werden.
13 Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Umwandlung von D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) als Batch-Prozess oder als kontinuierlicher Prozess, insbesondere unter Mikrowellen-Erhitzung durchgeführt wird.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Umsetzung von D-Fructose zu Furanderivaten in Stufe B) als saurer Katalysator
- ein homogener Säurekatalysator, insbesondere Schwefelsäure oder Salzsäure;
- ein heterogener Säurekatalysator, insbesondere ein Ionenaustauscher, insbesondere ein Montmorillonit oder ein Amberlit,
- ein Lewis-Säurekatalysator, insbesondere CrCl2, A1C13 oder Si02-MgCl2,
- ein SILP-Katalysator,
eingesetzt wird.
15. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Furanderivat Hydroxymethylfurfural der Formel
Figure imgf000030_0002
ist.
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