CN107849589A - 用于酶促制备混合糖的氧化产物和还原产物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从选自由C5糖和C6糖组成的组的n种糖的混合物中获得n+a种氧化产物和还原产物的方法，其中n至少为2，a至少为1，其中所述混合物中的至少两种糖以彼此非等摩尔比例存在，其中在第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种被酶促氧化，并且同时相互以非等摩尔比存在的其他糖中的至少一种被酶促还原，和其中在第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种的一部分未被转化，其特征在于，在至少一个第二阶段中，第一阶段中未被转化的糖中的至少一部分中的一半被酶促氧化，并且剩余的一半被酶促还原。

Description

用于酶促制备混合糖的氧化产物和还原产物的方法
技术领域
本发明涉及用于从选自由C5糖和C6糖组成的组的n种糖的混合物获得n+a种氧化产物和还原产物的方法。
背景技术
文献中已经公开了用于分级糖的混合物的许多方法。其中许多方法是基于层析法。
在US 2004/0173533A1中，已经描述了用于层析分离由糖(优选木糖和葡萄糖)组成的混合物的方法。分离产生单独的流：其中一个流富含木糖，另一个流富含葡萄糖。糖的混合物优选通过生物质的水解来生产。
在EP 1 490 521B1中描述了糖、糖醇、碳水化合物及其混合物的分离，其中在至少一个步骤中，弱碱性阴离子交换树脂(交联聚丙烯酸聚合物或表氯醇-三亚乙基四胺树脂)用于层析分离。
从CA 2 359 337中已知分离糖的方法，其中通过由具有相对低含量的羟基的阴离子交换器生产的离子交换器进行层析分析，进行木糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、葡萄糖、木糖醇、阿拉伯糖醇、山梨糖醇、半乳糖醇或甘露醇(或其他单糖)与其他糖或糖醇的分离。
层析法的糖分级的主要缺点是组分分离不完全。因此，要提及的缺点是低产量和主糖级分中其他糖份额的增加。
另一种分级糖的方法是(任选地)选择性糖转化成由于不同的物理或化学性质(极性、溶解度等)而可以容易地从彼此分离的组分。
US 7 498 430中描述了这种分级的示例，其中由糖的混合物进行木糖和阿拉伯糖的分级。通过将糖转化为木糖单缩醛和阿拉伯糖二缩醛的混合物而发生分级。随后，通过液-液萃取将阿拉伯糖二缩醛与木糖单缩醛分离。
在WO 2011/133536A1中描述了一种方法，其中糖水解产物中的C5和/或C6醛糖与催化剂接触以将糖转化为酮糖异构体。此外，异构化的C5和/或C6酮糖已经与络合剂(CA)接触，由此酮糖与CA结合并出现酮糖-CA缀合物。酮糖-CA缀合物可以从糖的混合物中选择地分离。
在本发明中，作为糖分级的第一步，糖的混合物中的一部分糖被选择性地转化为糖酸。文献中已经描述了多种生产糖酸的方法。
由US 2 651 592已知生产葡糖酸的方法。将葡萄糖溶液添加到呈现过氧化氢酶和葡萄糖氧化酶活性的酶体系中，其中以化学计量的量加入过氧化氢以氧化整个葡萄糖。
在US 3 619 396中描述了一种方法，其中葡糖酸是通过葡萄糖氧化酶从含葡萄糖的物质中酶促产生的。对已知方法的改进在于，对反应介质进行电渗析以从培养基中分离葡糖酸并回收葡萄糖氧化酶。
在US 3 935 071中，将葡萄糖转化为葡糖酸，其中葡萄糖在水溶液中用氧气氧化。使葡萄糖溶液经过含有葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的催化剂并牢固地结合到适当的载体上。在示例中，描述了在果糖存在下葡萄糖的选择性氧化，其中新生葡糖酸随后通过离子交换器分离。
由CA 2 194 859已知生产葡糖酸及其盐的方法，其中在葡萄糖氧化酶和过氧化氢酶的存在下，在10℃或更高的温度下将浓度为15％或更高的葡萄糖转化成葡糖酸。进行转化使得相对于氧化酶活性使用过量的过氧化氢酶活性。
在US 7 923 226B2中，描述了生产1,2,4-丁三醇的方法，其中木糖也被氧化为木糖酸内酯(xylonolactone)/木糖酸。然而，该专利没有公开用于反应中还原的氧化还原辅因子的再循环系统。
此外，对于糖酸的生产，已经采用了发酵方法(例如，Buchert等，1988；Toivari等，2012b)。
在US 2 351 500中描述了一种方法，其中通过发酵将葡萄糖转化成葡糖酸。为了防止葡糖酸盐的沉淀，相对于新生葡糖酸，以0.25至1.5的量加入硼酸。
在文献中，也有多种发酵方法的示例，其中木糖酸和木糖醇都是由木糖形成的。Nygard等人(2011)使用乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株以将木糖转化为木糖酸和木糖醇。然而，在该方法中产生大量生物质(相对于木糖酸和木糖醇产物的总和，约50％)。在另外的现有技术方法中，酿酒酵母(S.cerevisiae)菌株(Toivari等，2012b)或修饰的大肠杆菌(E.coli)(Cao等，2013)用于从木糖生产木糖酸和木糖醇。同样，在这种情况下，生产出非常大量的生物质，由此也消耗除木糖之外还被添加到培养基中的物质，例如葡萄糖。
在所述方法和根据现有技术的用于生产木糖酸的另外的发酵方法中，以下困难变得明显：由于生成生物质的结果，损失了乙酸盐或其它糖酸、较低的底物浓度和/或较长的反应时间。
已知使用隔离酶生产糖醇木糖醇的多种酶方法(例如，Zhang等(2011))。在那些方法中，使用的氧化还原辅因子通过另外的酶促氧化还原反应而再生。但是，为了这个目的，必须在每种情况下以至少化学计量的量添加另外的底物。Nidetzky等人(1996)描述了一种方法，其中由木糖生产木糖醇，其中还原当量由同时氧化葡萄糖或木糖来提供。
生产糖醇木糖醇的另一众所周知的可能性是发酵。在Ko等人(2006)中描述了例如从木糖获得木糖醇的发酵方法。因此，使用热带假丝酵母(Candida tropicalis)的基因工程菌株。木糖还原酶的辅因子的再生没有进一步规定，并被细胞的总体代谢所接管。显而易见的缺点是葡萄糖被另外添加到培养物中。所使用的大部分糖被转化成生物质并且不用于形成产物。最特别地，相对于所用的木糖没有获得化学计量上可能的量的木糖醇。
在文献中描述了能够经由L-2-酮-3-脱氧阿拉伯糖酸和α-酮戊二酸半醛将L-阿拉伯糖酸转化为α-酮戊二酸的酶(Watanabe等，2006)。此外，描述了能够经由D-2-酮-3-脱氧木糖酸和α-酮戊二酸半醛将D-木糖酸转化为α-酮戊二酸的酶(Stephens等，2006；Johnsen等，2009)。
在WO 2014/076012A1中，描述了一种方法，其中从阿拉伯糖和木糖的混合物(摩尔比为约10至90)，阿拉伯糖分别被大量地酶促氧化成阿拉伯糖酸内酯或阿拉伯糖酸，并且木糖以基本上等摩尔的比例酶促还原为木糖醇。
所述摩尔比的阿拉伯糖和木糖是典型的糖的混合物，其可以通过将含木质纤维素的生物质制浆并随后酶促降解通过制浆所获得的含半纤维素的材料来获得。
从WO 2010/106230A1中已知另外的现有技术。
发明内容
本发明的目的是无论糖的种数和结构如何，以高纯度和高收率分级通常出现在生物质中的非常复杂的糖的混合物。此外，本发明的目的是提供将所分级的糖/糖酸(特别是木糖、木糖酸、阿拉伯糖、阿拉伯糖酸)进一步转化为其它产物(特别是木糖醇和α-酮戊二酸)的可能性。
本发明的目的通过根据权利要求1的方法来实现。
在从属权利要求中指出了本发明的优选实施方案。
首先，本发明提供了从选自由C5糖和C6糖组成的组的n种糖的混合物中获得n+a种氧化产物和还原产物的方法，
其中n至少为2，a至少为1，
其中所述混合物中的至少两种糖以彼此非等摩尔比例存在，
其中在第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种被酶促氧化，并且同时相互以非等摩尔比存在的其他糖中的至少一种被酶促还原，和
其中在第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种的一部分未被转化，
其特征在于，在至少第二阶段中，第一阶段中未被转化的糖中的至少一部分中的一半被酶促氧化，并且剩余的一半分别被酶促还原。
优选地，在第二阶段中，第一阶段中未被转化的糖中的基本上全部的量的一半被酶促氧化，并且剩余的一半分别被酶促还原。
此外，在第一阶段分别已被氧化和还原的两种糖优选以基本等摩尔量被转化。
根据本发明的方法是基于酶促氧化和还原反应在糖上的偶联，使得从糖的混合物获得彼此可分离的糖氧化产物(例如糖酸)和糖还原产物(例如糖醇)。
在许多尤其由生物质获得的糖的混合物中，其中包含的糖不以等摩尔比存在。如例如在WO 2014/076012A1中所述，如果一种糖的酶促氧化和另一种糖的酶促还原以基本等摩尔比在第一阶段中发生，则大量存在于初始混合物中的糖的一部分将以未反应的形式保留在混合物中。
根据本发明，所述糖的该未反应的部分现在也将进行酶促氧化和酶促还原。结果，所述糖的可彼此分离的氧化产物(例如糖酸)以及还原产物(例如糖醇)将再次以基本上等摩尔比出现。
如果在第一阶段还未被转化的所述糖的全部被氧化和还原，则产生仅由那些氧化产物和还原产物组成的混合物，因此产物的完全分离是可能的。
因此，例如，在两种糖(n＝2)的混合物中，根据所述方法将出现三种(a＝1)产物，即在第一阶段氧化的糖的氧化产物以及其他糖的氧化和还原产物。
特别是如果存在多于两种糖的混合物，则第一阶段可以包括多个子步骤：
例如，在糖C以摩尔过量存在的三种糖A、B和C的混合物中，糖A可以在第一阶段的第一子步骤中被完全氧化或还原，相应地，糖C可以被以等摩尔比部分地还原或氧化。在第二个子步骤中，例如，糖B可以被完全氧化或还原，同样，糖C的一部分可以相应地被还原或氧化。然后，在第二阶段，糖C的全部未反应部分优选地一半被还原且一半被氧化。
第一阶段的子步骤可以同时进行，也可以连续地进行。
根据本发明，糖酸和糖酸内酯分别优选作为氧化产物获得，以及糖醇作为还原产物获得。
在根据本发明的方法中，优选地，含有木糖和至少一种另外的糖的物质的混合物被转化，所述另外的糖优选选自由C5糖(例如阿拉伯糖、来苏糖、核糖)和C6糖(例如阿洛糖、阿卓糖、葡萄糖、甘露糖、艾杜糖、半乳糖和塔罗糖)组成的组。
在特别优选的实施方案中，糖的混合物含有木糖和阿拉伯糖，其中木糖以过量存在。
特别是在通过将木质纤维素材料制浆已经获得的含半纤维素材料的分解期间积聚这样的混合物，特别是如果木质纤维素材料是选自由秸秆、甘蔗渣、能源草、柳枝稷和/或壳组成的组的材料，所述秸秆特别是小麦秸秆，所述能源草特别是象草，所述壳特别是外稃。
典型地，以这种方式获得的混合物中的木糖和阿拉伯糖的摩尔比可以达到约9:1。
在其中存在具有过量的木糖和阿拉伯糖的糖的混合物的实施方案中，阿拉伯糖优选分别氧化成阿拉伯糖酸或阿拉伯糖酸内酯，并且在第一阶段中木糖的一部分被还原成木糖醇，以及在第二阶段中，未反应的木糖完全或部分地被氧化成木糖酸，或者一半被氧化成木糖酸内酯，剩余的一半分别被还原成木糖醇。
在本发明的所述方面中，例如由于通过同时氧化生产阿拉伯糖酸来提供所需的氧化当量，所以不必向混合物中添加另外的糖以生产木糖醇。
从混合物中木糖与阿拉伯糖的示例性比例9:1开始，例如，以下次序由此确保了：
如果在这样的混合物中，基本上全部量的阿拉伯糖被氧化成阿拉伯糖酸以及基本上等摩尔量的木糖在第一阶段被还原成木糖醇，则获得1份阿拉伯糖酸、1份木糖醇和8份未反应的木糖的混合物。
如果在第二阶段中，优选地全部未反应的木糖现在一半被酶促还原成木糖酸以及另一半被还原成木糖醇，则将确保1份阿拉伯糖酸、4份木糖酸和5份木糖醇的混合物(条件是阿拉伯糖酸还没有提前被分离出)。
因此，从初始的糖的混合物中，以简单的方式产生可易于分离的氧化产物和还原产物的混合物，所述产物已经本身构成有价值的物质(例如木糖醇)或可以进一步加工成有价值的产物。
因此，在本发明的该实施方案中，已经形成的阿拉伯糖酸和/或已经形成的木糖酸优选进一步加工成α-酮戊二酸。
此外，这种进一步的处理可以优选地酶促发生：
为了将糖酸(阿拉伯糖酸和木糖酸)酶促转化为α-酮戊二酸，在阿拉伯糖酸的情况下，所述酸可以通过阿拉伯糖酸脱水酶首先被转化成L-2-酮-3-脱氧阿拉伯糖酸，然后通过L-2-酮-3-脱氧阿拉伯糖酸脱水酶转化成α-酮戊二酸半醛(α-KGSA)，然后通过α-KGSA脱氢酶进一步转化为α-酮戊二酸。在木糖酸的情况下，所述酸可以通过木糖酸脱水酶首先转化为D-2-酮-3-脱氧木糖酸，然后通过D-2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶转化为α-酮戊二酸半醛(α-KGSA)，并进一步通过α-KGSA脱氢酶转化成α-酮戊二酸。
酶类L-阿拉伯糖酸脱水酶和L-2-酮-3-脱氧阿拉伯糖酸脱水酶的合适的代表例如可以从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasiliense)获得。酶类木糖酸脱水酶和D-2-酮-3-脱氧木糖酸脱水酶的合适的代表例如可以从新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)获得。
合适的α-酮戊二酸半醛脱氢酶例如可从巴西固氮螺菌或新月柄杆菌获得。
本发明方法的另一个优选实施方案的特征在于含有木糖和阿拉伯糖的混合物还含有葡萄糖。
特别是在该方法的所述实施方案中，混合物中所含的葡萄糖被氧化成葡糖酸。
在所述方法的实施方案中，优选在分离出葡糖酸之后，优选将阿拉伯糖酶促氧化成阿拉伯糖酸。
从比例为9:1:0.4的木糖/阿拉伯糖/葡萄糖的示例性混合物开始(可以例如在秸秆制浆和随后的酶促分解期间获得在该范围内的混合物)，以下顺序例如由此确保：
如果在这样的混合物中在第一阶段基本上全部量的葡萄糖被氧化成葡糖酸并且基本上等摩尔量的木糖被还原成木糖醇，则获得1份阿拉伯糖、0.4份葡糖酸、0.4份木糖醇和8.6份未反应的木糖的混合物。
如果在第一阶段的进一步反应中基本上将全部量的阿拉伯糖氧化成阿拉伯糖酸并且再次将基本上等摩尔量的木糖还原成木糖醇，则获得1份阿拉伯糖酸、0.4份葡糖酸、1.4份木糖醇和7.6份未反应的木糖的混合物。
如果在第二阶段中，优选地全部未反应的木糖现在一半被酶促氧化为木糖酸，并分别将一半还原成木糖醇，则获得1份阿拉伯糖酸、0.4份葡糖酸、3.8份木糖酸和5.2份木糖醇的混合物(条件是预先还没有分离出阿拉伯糖酸和/或葡糖酸)。
如上所述，将得到的阿拉伯糖酸和/或木糖酸进一步加工成α-酮戊二酸是可行的。
在另一个优选的实施方案中，相对于其他存在的糖，糖的混合物含有过量的葡萄糖，并且至少部分从葡萄糖获得山梨糖醇。
出发点应该是以比例为7:1.4:0.7:0.7:0.4的葡萄糖/甘露糖/半乳糖/木糖/阿拉伯糖的示例性混合物。可以例如在木材制浆和随后的酶促降解期间获得在此范围内的混合物(Berrocal等，2004)。具有高含量葡萄糖的糖的混合物也可以在从其他含木质纤维素的生物质(例如秸秆、玉米秸秆、稻秆、甘蔗渣、能量草)的糖聚合物的完全水解期间获得。例如，以下顺序由此确保：
如果在这样的混合物中在第一阶段基本上全部量的甘露糖被氧化成甘露糖酸并且基本上等摩尔量的葡萄糖被还原成山梨糖醇，则获得1.4份甘露糖酸、0.7份半乳糖、0.7份木糖、0.4份阿拉伯糖、1.4份山梨糖醇以及5.6份未反应的葡萄糖的混合物。
如果在第一阶段的进一步反应中基本上全部量的半乳糖被氧化成半乳糖酸，并且基本上等摩尔量的葡萄糖被还原成山梨糖醇，则获得1.4份甘露糖酸、0.7份半乳糖酸、0.7份木糖、0.4份阿拉伯糖、2.1份山梨糖醇以及4.9份未反应的葡萄糖的混合物。
如果在第一阶段的进一步反应中基本上全部量的木糖被氧化成木糖酸，并且基本上等摩尔量的葡萄糖被还原成山梨糖醇，则获得1.4份甘露糖酸、0.7份半乳糖酸、0.7份木糖酸、0.4份阿拉伯糖、2.8份山梨糖醇以及4.2份未反应的葡萄糖的混合物。
如果在第一阶段的进一步反应中，基本上全部量的阿拉伯糖被氧化成阿拉伯糖酸，并且基本上等摩尔量的葡萄糖被还原成山梨糖醇，则获得1.4份甘露糖酸、0.7份半乳糖酸、0.7份木糖酸、0.4份阿拉伯糖酸、3.2份山梨糖醇以及3.8份未反应的葡萄糖的混合物。
第一阶段的步骤可以连续进行或(部分)同时进行。另外，在各个步骤之后可发生糖酸的分离。
如果在第二阶段，优选地全部未反应的葡萄糖的现在一半被酶促氧化成葡糖酸，并分别一半还原成山梨糖醇，则获得1.4份甘露糖酸、0.7份半乳糖酸、0.7份木糖酸、0.4份阿拉伯糖酸、1.9份葡糖酸和5.1份山梨糖醇的混合物(条件是糖酸还没有预先被分离出)。
糖酸分离(也)可在第二阶段之后发生。如上所述将得到的阿拉伯糖酸和/或木糖酸进一步加工成α-酮戊二酸是可行的。
在可能的任选的另外的阶段中，所获得的D-山梨糖醇可以例如用D-山梨糖醇脱氢酶或用具有D-山梨糖醇脱氢酶活性的酶进行酶促氧化或者非酶促氧化成D-果糖，优选进行酶促氧化成D-果糖。可能已经被酶还原的氧化还原辅因子NAD(P)可以通过至少一种另外的氧化还原酶再生。结果，氧化还原辅因子可以以亚化学计量的量使用。
在所述具体实施方案中，根据本发明的方法可以用于例如从具有葡萄糖含量的生物质水解产物获得非常纯的D-果糖。通过转化成糖酸，可以更容易地从混合物中分离出其他糖。此外，氧化成糖酸提供了将葡萄糖还原成山梨糖醇的氧化还原当量。在上述示例性混合物中，可以将混合物中较高比例的葡萄糖转化为山梨糖醇，而不向氧化还原辅因子再循环添加外部物质。由此获得的山梨糖醇可用于制备有价值的产物果糖。
通过各种酶类可以实现如在本发明的方法中进行的糖的酶促氧化。例如，氧化酶(使用氧)或脱氢酶(使用氧化的氧化还原辅因子NAD(P)+)适合于此目的。优选地，使用依赖于氧化还原辅因子的酶。特别优选地，使用仅依赖于氧化还原辅因子的酶。因此，分别以等摩尔比进行的受影响的糖的氧化和还原可以以简单的方式实现。因此，根据本发明方法的另一优选实施方案的特征在于，至少在两个阶段中的一个阶段中，优选至少在所述第二阶段中，特别优选在所述第一阶段和所述第二阶段两者中，至少一种氧化还原辅因子和依赖于所述氧化还原辅因子的至少一种酶存在于反应混合物中。
在根据本发明的方法中，优选地，特别是在第一阶段中，阿拉伯糖被氧化成阿拉伯糖酸。例如，L-阿拉伯糖脱氢酶可以用于L-阿拉伯糖的氧化。合适的L-阿拉伯糖脱氢酶例如可从巴西固氮螺菌(Azospirillum brasiliense)或越南伯克霍尔德氏菌(Burkholderiavietnamiensis)获得。
在根据本发明的方法中，优选地，木糖，特别是在第一阶段之后留在溶液中的木糖的一部分被氧化成木糖酸。D-木糖的氧化可以例如通过D-木糖脱氢酶实现。合适的木糖脱氢酶例如可从新月柄杆菌获得。可选地，也可以使用具有更宽的底物光谱并标注为阿拉伯糖脱氢酶的酶。
在根据本发明的方法中，优选地，特别是在第一阶段中，葡萄糖被氧化成葡糖酸。例如，D-葡萄糖-1-脱氢酶可以用于葡萄糖的氧化。合适的D-葡萄糖-1-脱氢酶可从例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)获得。
而且，葡萄糖氧化酶可以用于葡萄糖的氧化。合适的D-葡萄糖氧化酶可从例如黑曲霉(Aspergillus niger)获得。
在根据本发明的方法中，优选地，木糖，特别是在第一阶段之后保留在溶液中的木糖的一部分被还原成木糖醇。
例如，D-木糖的还原可以由D-木糖还原酶进行催化。合适的木糖还原酶可从例如热带假丝酵母(Candida tropicalis)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)获得。
在根据本发明的方法中，可以在具体实施方案中使用辅因子NADH、NADPH、NAD+和/或NADP+。因此，NAD+表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的氧化形式，NADH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原形式，而NADP+表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的氧化形式，NADPH表示烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的还原形式。辅因子可以单独添加到反应中，或者它们是反应的其他组分的一部分，例如所使用的酶的组分，或者使用这两种来源的组合。如果使用氧化还原辅因子，则在根据本发明的方法中，它们相对于底物以亚化学计量的量存在。在还原反应或氧化反应中氧化或还原的氧化还原辅因子可以经由合适的酶促反应(氧化还原辅因子再循环)返回其初始的氧化还原状态，因此可以经过多个反应循环。
酶辅因子再生系统特别选自由醇脱氢酶、糖脱氢酶、NAD(P)H氧化酶、氢化酶或乳酸脱氢酶组成的组，其中共底物，特别是酮、醛、糖、丙酮酸及其盐和/或氧气被消耗，并且分别产生氢气。
在由木糖生产木糖酸(内酯)时，通过另外的氧化还原酶(例如，通过醇脱氢酶，NAD(P)H氧化酶或糖还原酶，例如木糖还原酶)可以实现氧化还原辅因子再循环。优选地，使用糖还原酶。
在木糖醇的生产中，通过另外的氧化还原酶(例如，通过醇脱氢酶或糖脱氢酶，例如葡萄糖脱氢酶或阿拉伯糖脱氢酶)可以实现氧化还原辅因子再循环。优选地，使用糖脱氢酶。
合适的NADH氧化酶可从例如氨基戊酸梭菌(Clostridium aminovalericum)或变异链球菌(Streptococcus mutans)获得。
合适的醇脱氢酶可以从例如开菲尔乳杆菌(Lactobacillus kefir)或布氏热厌氧杆菌(Thermoanaerobium brockii)获得。
在本发明方法的具体实施方案中，用葡萄糖脱氢酶将葡萄糖转化成葡糖酸(内酯)，其中通过木糖还原酶实现氧化还原辅因子再循环。在根据本发明的方法的另一个具体实施方案中，将新生葡糖酸从物质的混合物中分离出。
在根据本发明的方法的另一个具体实施方案中，用阿拉伯糖脱氢酶将阿拉伯糖转化为阿拉伯糖酸(内酯)，其中利用木糖还原酶进行氧化还原辅因子再循环。在根据本发明的方法的另一个具体实施方案中，从物质的混合物分离出所获得的阿拉伯糖酸。在本发明方法的另一个优选实施方案中，不从物质混合物中分离出阿拉伯糖酸(内酯)，因此剩余的木糖被氧化为木糖酸(内酯)。
在本发明的一个方面中，第一阶段之后剩余的木糖在形成的糖酸的存在下并且任选地也在分离出糖酸后被还原为木糖醇，即，采用酶，优选采用木糖还原酶，更优选采用NAD(P)-依赖性木糖还原酶。在另一方面中，剩余的木糖用NAD(P)-依赖性木糖还原酶还原成木糖醇，其中通过木糖脱氢酶进行氧化还原辅因子再循环，使得剩余的木糖同时被氧化为木糖酸。
因此，在根据本发明的方法中，在第一阶段和第二阶段中，至少一种氧化还原辅因子和依赖于所述氧化还原辅因子的至少一种酶优选存在于反应混合物中。通常，在两个阶段中都存在两种酶，一种是还原酶，另一种是脱氢酶。然而，还可以构思，单一酶对还原和氧化的催化作用。
如上所述，特别优选使用的所有酶都依赖于也存在于混合物中的氧化还原辅因子。
可选地，氧化还原辅因子已经以足够的量包含在酶制剂中，或者另外地，将氧化还原辅因子添加到反应中。
此外，用于第一阶段和/或第二阶段的氧化还原辅因子优选在本发明的方法中通过还原反应和氧化反应进行再生，所述还原反应和氧化反应在每种情况下并行进行。
该方法中使用的酶可以通过重组表达而获得。就这一点而言，本领域技术人员已知各种系统，例如大肠杆菌、酿酒酵母或巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。优选使用大肠杆菌；为此目的，本领域技术人员熟悉常见的实验方案。酶可以用于完整细胞、透化细胞中或是细胞溶解产物的形式。在细胞溶解产物的情况下，可以直接使用酶，或者可以发生进一步的纯化，例如通过蛋白质纯化的层析方法，其可以在文献中找到和/或对于本领域技术人员是已知的。如果使用细胞溶解产物，则优选不进一步纯化或仅进行简单的纯化步骤(例如离心或过滤)。
如从前面的解释可以清楚，根据本发明的方法中的第一阶段和第二阶段可以以一锅反应进行。
因此，在仅一个反应容器中可实现糖的混合物的完全分离。
在根据本发明的方法的另一个优选实施方案中，两个阶段可以至少部分地同时进行。基于所述酶促反应，两个阶段的同时反应控制是可能的。
根据本发明的方法的另一个实施方案包括从混合物中去除积聚的糖酸。在这样做时，可以在根据本发明的方法的第一阶段和第二阶段之间，或者仅在第二阶段之后，去除积聚的糖酸(例如，阿拉伯糖酸、葡糖酸或木糖酸)。
如上所述，在多于两种糖的混合物的情况下，在根据本发明的方法的第一阶段中，即在并行或连续地进行的第一阶段的子步骤中，可氧化多种糖。如果子步骤连续进行，则在本发明方法的具体实施方案中可以在每个子步骤之后分离相应的糖酸。任选地，糖酸也可以在第一阶段之后联合分离，或者可选地，它们可以留在溶液中。
现有技术中的分离有机酸的多种方法对于本领域技术人员是已知的。所述方法包括但不限于离子交换层析、电渗析、结晶/沉淀和萃取。
如上所述，含有糖的混合物可以从含半纤维素的材料获得。
优选地，通过将木质纤维素材料制浆，获得含半纤维素的材料。就这一点而言，各种化学、物理、机械和/或酶促方法对于本领域技术人员是已知的。Brodeur等(2011年)也发现含木质纤维素的材料的制浆方法。此外，例如在WO 2010/124312A2(Ertl等，2010)中可以找到分别用于含木质纤维素的材料的制浆或去木质素的方法。
在根据本发明的方法中，“含木质纤维素的材料”特别包括含木质纤维素的生物质，例如一年生或多年生植物或一年生或多年生植物的部分，例如木材，例如，软木或硬木，或(干)草，或草的部分，优选草，秸秆(例如小麦秸秆、黑麦秸秆或玉米秸秆)，能源草，例如柳枝黍(Panicum virgatum)，芒草/中国银草，蕉麻，剑麻，甘蔗渣，或非典型的木质纤维素底物，例如玉米芯，壳(例如外稃，如小麦壳、稻壳)，特别优选秸秆(尤其是小麦秸秆)，甘蔗渣，能源草(特别是象草)，柳枝稷/或壳(特别是外稃)。
优选地，通过用醇(特别是C1-4醇)、水和碱制浆，可以获得木质纤维素材料。例如从WO 2010/124312A2(Ertl等，2010)已知合适的方法。
在根据本发明的方法中，如果指出酸，则包括那些酸的相应的盐，反之亦然。此外，具体地，如果指出酶促生产的糖酸，则也包括相应的糖酸内酯，反之亦然。在糖向糖酸/糖酸内酯的酶促氧化中，这两种产物的比例强烈依赖于所使用的糖和反应条件(例如反应时间或尤其是pH值)。
具体实施方式
实施例：
实施例1：用于从生物质获得糖的混合物的木聚糖酶处理。
使用由秸秆生产的去木质素纸浆。纸浆的制备的描述可以在WO 2010/124312A2(实施例1)中找到。将10g(干重)的纸浆用蒸馏水重新悬浮至10％的稠度，用H2SO4调节pH值为4.9。加入1000μl的Xylanase Ecopulp TX800A(Ecopulp Finland Oy)，并在50℃下进行温育16小时。获得1.5％的糖溶液(w/v)，其主要含有约2:10:1比例的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖。
以下实施例2至5分别用于说明从糖的混合物中选择性地酶促氧化或还原糖的可能性。
实施例2：用葡萄糖脱氢酶(用于辅因子再循环的NADH-氧化酶)进行葡萄糖氧化。
向含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖(糖浓度：约1％)的糖的混合物(约500μl)中加入18.5mg的NaHCO3。随后加入30μl的葡萄糖脱氢酶(活性约300U/ml)、10μl的NADH-氧化酶(活性约1140U/ml)和2.5μl的NADH(浓度：100mM)。混合物在25℃下温育约17小时。86％的葡萄糖反应生成葡糖酸。使获得的溶液经过强离子交换器(Amberlyst A-26(OH)，Alfa Aesar)。因此，将得到的葡糖酸从混合物中完全被分离出。
实施例3：用阿拉伯糖脱氢酶(用于辅因子再循环的NADH-氧化酶)进行阿拉伯糖氧 化。
向含有葡萄糖、木糖和阿拉伯糖(糖浓度：约1％)的糖的混合物(约500μl)中加入6.2mg的NaHCO3。随后加入30μl的葡萄糖脱氢酶(活性约300U/ml)、20μl的NADH-氧化酶(活性约1140U/ml)和2.5μl的NADH(浓度：100mM)。混合物在25℃下温育约17小时。100％的阿拉伯糖反应生成阿拉伯糖酸。使获得的溶液经过强离子交换器(Amberlyst A-26(OH)，AlfaAesar)。因此，将得到的阿拉伯糖酸从混合物中完全被分离出。
实施例4：用阿拉伯糖脱氢酶(用于辅因子再循环的木糖还原酶)进行阿拉伯糖氧 化。
向含有木糖和阿拉伯糖(木糖：约10％，阿拉伯糖：约1％)的糖的混合物(约500μl)中加入16.9mg的NaHCO3。随后加入30μl的葡萄糖脱氢酶(活性约300U/ml)、30μl的木糖还原酶(活性约103U/ml)和2.5μl的NADH(浓度：100mM)。混合物在30℃下温育约20分钟。100％的阿拉伯糖反应生成阿拉伯糖酸。由此，混合物中所含的木糖的10％被转化为木糖醇。使获得的溶液经过强离子交换器(Amberlyst A-26(OH)，Alfa Aesar)。由此，所得到的阿拉伯糖酸从糖的混合物中完全被分离出。
实施例5：用阿拉伯糖脱氢酶(用于辅因子再循环的木糖还原酶)进行阿拉伯糖氧 化，用木糖还原酶(用于辅因子再循环的醇脱氢酶)进行木糖还原。
将从生物质(＝木聚糖水解产物)获得的糖溶液通过蒸发被浓缩至约63g/l的D-木糖和7g/l的L-阿拉伯糖的糖浓度，并用NaOH调节pH＝8.0。向80ml的所述溶液中加入2.5ml的500mM的Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)、200U的木糖还原酶和160U的阿拉伯糖脱氢酶。在200ml圆底烧瓶中，将溶液在35℃(水浴)下用磁力搅拌器(200rpm)搅拌20分钟。阿拉伯糖已被完全转化，现在溶液包含约56g/l的D-木糖、约7g/l的木糖醇和约7g/l的L-阿拉伯糖-1,4-内酯/L-阿拉伯糖酸。
在所述实施例中，所采用的辅因子以已经足够的程度存在于所采用的酶溶解产物中，并且不必分开加入。
实施例6：木糖和阿拉伯糖的混合物的转化(根据本发明)
向含有木糖和阿拉伯糖(木糖：约10％，阿拉伯糖：约1％)的糖的混合物(约500μl)中加入16.9mg的NaHCO3。随后加入30μl的阿拉伯糖脱氢酶(用阿拉伯糖约300U/ml的活性；该酶也表现出一定的木糖脱氢酶活性)，30μl木糖还原酶(活性约103U/ml)和2.5μl NADH(浓度：100mM)。混合物在30℃下温育约72小时。100％的阿拉伯糖反应生成阿拉伯糖酸，45％的木糖反应生成木糖酸，并且55％的木糖反应生成木糖醇。使获得的溶液经过强离子交换器(Amberlyst A-26(OH)，Alfa Aesar)。由此，所得到的阿拉伯糖酸和木糖酸从混合物中完全被分离出。
该实施例证明了根据本发明的方法的第一阶段和第二阶段的至少部分并行的过程：第一阶段是阿拉伯糖的氧化和等摩尔份的木糖的还原。至少部分并行进行的第二阶段包括通过阿拉伯糖脱氢酶的活性进行将一半未反应的木糖氧化以及将另一半剩余的木糖进行还原。
实施例7：木糖和葡萄糖的混合物的转化(根据本发明)：
间歇反应包括以下组分：364μl的dH2O，2.5μl的NADPH溶液(100mM)，10μl的D-葡萄糖溶液(50％的w/v)，100μl的D-木糖溶液(50％w/v)，5μl的葡萄糖脱氢酶(300U/ml，用葡萄糖测量)，19μl的木糖还原酶(160U/ml)和5.6mg的CaCO3。所用的葡萄糖脱氢酶也表现出一定的木糖脱氢酶活性。反应在35℃下轻微搅拌，并在不同的时间点取样。通过GC/MS，测定糖的含量和反应产物的含量。1小时后，葡萄糖大部分已转化成葡糖酸。同样，在该时间点，一小部分所采用的木糖(约10％)已被氧化为木糖酸。对于形成的糖酸进行化学计量，1小时后木糖已被还原成木糖醇。1小时后反应的近似组成：10mg/ml的葡糖酸，10mg/ml的木糖酸，20mg/ml的木糖醇，70mg/ml的木糖。
6小时后，木糖已被转化大约90％。与1小时后的时间点相比，由此化学计量地形成产物木糖酸和木糖醇。6小时后反应的近似组成：10mg/ml的葡糖酸，40mg/ml的木糖酸，50mg/ml的木糖醇，10mg/ml的木糖。
实施例8：通过GC/MS来分析反应
为了分析GC/MS上的氧化反应，将底物和产物衍生化。为此目的，将4μl样品转移到玻璃瓶中并在Speedvac中干燥。为了衍生化，然后加入150μl吡啶和50μl的99:1的N，O-双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺和三甲基氯硅烷的混合物。在60℃下进行衍生化16小时。随后，通过GC-MS分析样品。这样做时，通过气相层析仪中的分离柱HP-5ms(5％苯基)甲基聚硅氧烷将样品分离，并在Shimadzu公司的质谱仪GCMS QP2010Plus中进行分析。
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Claims (16)

1.一种从选自由C5糖和C6糖组成的组的n种糖的混合物中获得n+a种氧化产物和还原产物的方法，
其中n至少为2，a至少为1，
其中所述混合物中的至少两种糖以彼此非等摩尔比例存在，
其中在第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种被酶促氧化，并且同时相互以非等摩尔比存在的其他糖中的至少一种被酶促还原，和
其中在所述第一阶段中，相互以非等摩尔比存在的糖中的至少一种的一部分未被转化，
其特征在于，在至少第二阶段中，在所述第一阶段中未被转化的糖中的至少一部分中的一半被酶促氧化，并且剩余的一半分别被酶促还原。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，糖酸和糖酸内酯分别作为氧化产物获得，以及糖醇作为还原产物获得。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述糖的混合物含有木糖和阿拉伯糖，且木糖以过量存在。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，阿拉伯糖分别被氧化成阿拉伯糖酸或阿拉伯糖酸内酯，以及所述木糖的一部分在第一阶段被还原成木糖醇，以及在第二阶段，未反应的木糖中的一半被完全或部分地氧化成木糖酸或被氧化成木糖酸内酯，剩余的一半分别被还原成木糖醇。
5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，已形成的阿拉伯糖酸和/或已经形成的木糖酸进一步加工成α-酮戊二酸。
6.根据权利要求3至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述混合物还含有葡萄糖。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，相对于其他存在的糖，所述混合物含有过量的葡萄糖，以及从所述葡萄糖至少部分地获得山梨糖醇。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，至少在两个阶段中的一个阶段中，优选至少在所述第二阶段中，特别优选在所述第一阶段和所述第二阶段两者中，至少一种氧化还原辅因子和依赖于所述氧化还原辅因子的至少一种酶存在于反应混合物中。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述氧化还原辅因子通过优选在第一阶段和第二阶段两者中并行进行的酶促反应而再生。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，所述第一阶段和所述第二阶段以一锅反应进行。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述两个阶段至少部分地同时进行。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，包括从所述混合物中去除积聚的糖酸。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其特征在于，已经从含半纤维素的材料获得所述含有糖的混合物。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述含半纤维素材料是通过对木质纤维素材料进行制浆获得的。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素材料是选自由秸秆、甘蔗渣、能源草、柳枝稷和/或壳组成的组的材料，所述秸秆特别是小麦秸秆，所述能源草特别是象草，所述壳特别是外稃。
16.根据权利要求14或15所述的方法，其特征在于，所述木质纤维素材料已经通过用醇、水和碱制浆而获得，所述醇特别是C1-4醇。
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