EP3325638A1 - Verfahren zur enzymatischen produktion von oxidations- und reduktionsprodukten von gemischten zuckern - Google Patents

Verfahren zur enzymatischen produktion von oxidations- und reduktionsprodukten von gemischten zuckern

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EP3325638A1
EP3325638A1 EP16741925.8A EP16741925A EP3325638A1 EP 3325638 A1 EP3325638 A1 EP 3325638A1 EP 16741925 A EP16741925 A EP 16741925A EP 3325638 A1 EP3325638 A1 EP 3325638A1
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EP
European Patent Office
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sugar
mixture
xylose
stage
acid
Prior art date
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Pending
Application number
EP16741925.8A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ortwin Ertl
Bernd Mayer
Alexander DYBOV
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Annikki GmbH
Original Assignee
Annikki GmbH
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Publication date
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    • C12Y101/01175—D-Xylose 1-dehydrogenase (1.1.1.175)
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    • C12Y101/01179—D-Xylose 1-dehydrogenase (NADP+) (1.1.1.179)
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    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y101/00—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1)
    • C12Y101/03—Oxidoreductases acting on the CH-OH group of donors (1.1) with a oxygen as acceptor (1.1.3)
    • C12Y101/03004—Glucose oxidase (1.1.3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a process for recovering n + a oxidation and reduction products from a mixture of n sugars selected from the group consisting of C5 and C6 sugars.
  • US 2004/0173533 A1 has described a process for the chromatographic separation of a mixture consisting of sugars, preferably of xylose and glucose.
  • the separation results in separate currents: one of them is enriched with xylose, the other with glucose.
  • the sugar mixture is preferably produced by hydrolysis of biomass.
  • a separation of sugars, sugar alcohols, carbohydrates and mixtures thereof is described in EP 1 490 521 Bl, wherein in at least one step a weakly basic anion exchange resin (crosslinked polyacrylic acid polymer or epichlorohydrin-triethylenetetramine resin) is used in the chromatographic separation ,
  • a weakly basic anion exchange resin crosslinked polyacrylic acid polymer or epichlorohydrin-triethylenetetramine resin
  • Another approach to sugar fractionation is an (optional) selective conversion of sugar into components that can be easily separated due to different physical or chemical properties (polarity, solubility, etc.).
  • Fractionation of xylose and arabinose takes place from a mixture of sugars.
  • the Fractionation occurs by conversion of the sugars to the mixture of xylose monoacetal and arabinose diacetal. Subsequently, xylose monoacetal is separated from arabinose diacetal by liquid-liquid extraction.
  • WO 2011/133536 A1 describes a process in which C5 and / or C6 aldose sugar in sugar hydrolyzate is brought into contact with a catalyst in order to convert the sugars into ketose isomers. Furthermore, the isomerized C5 and / or C6 ketoses were brought into contact with a complexing agent (CA), with the ketoses binding to the CA and producing a ketose-CA conjugate. Ketose-CA conjugate could be selectively separated from the sugar mixture.
  • CA complexing agent
  • a portion of the sugars in the sugar mixture are selectively converted to sugar acids.
  • glucose solution to an enzymatic system having catalase and glucose oxidase activity, wherein hydrogen peroxide is added in stoichiometric amount to oxidize all of the glucose.
  • Electrodialysis is performed to separate gluconic acid from the medium and to recover glucose oxidase.
  • glucose is converted to gluconic acid, whereby glucose in aqueous solution is oxidized with oxygen.
  • Glucose solution is passed through a glucose oxidase and catalase-containing catalyst fixedly attached to an appropriate support.
  • a selective oxidation of glucose in the presence of fructose is described, with the resulting gluconic acid then by means of
  • a method for producing gluconic acid and its salts is known from CA 2 194 859, wherein glucose at a concentration of 15% or more to gluconic acid at a temperature of 10 ° C or higher in the presence of glucose oxidase and catalase is implemented.
  • the reaction is carried out using an excess of catalase activity relative to the oxidase activity.
  • No. 7,923,226 B2 describes a process for the preparation of 1,2,4-butanetriol, wherein xylose is also oxidized to xylonolactone / xylonic acid.
  • this patent does not disclose a recycling system for the redox cofactor reduced in the reaction.
  • Fermentative processes are also used for the preparation of sugar acids (for example, Buchert et al., 1988, Toivari et al., 2012b).
  • xylitol Extraction of xylitol from xylose is described.
  • a genetically modified strain of Candida tropicalis is used.
  • the regeneration of the cofactor of xylose reductase is not specified and is taken from the total metabolism of the cells.
  • a disadvantage is that in addition glucose is added to the cultures.
  • a large part of the sugar used is converted into biomass and is not used for product formation. Above all, the stoichiometrically possible amount of xylitol is not obtained relative to the xylose used.
  • Enzymes are described in the literature which allow the conversion of L-arabonate via L-2-keto-3-deoxyarabonate and alpha-ketoglutarate semialdehyde to alpha-ketoglutarate (Watanabe et al., 2006). Furthermore, enzymes are described which the
  • WO 2014/076012 Al inter alia, a method is described in which the arabinose is oxidized enzymatically from a mixture of arabinose and xylose (in a molar ratio of about 10 to 90) to arabinolactone or arabic acid and the xylose is reduced enzymatically to xylitol in substantially equimolar ratio.
  • the described molar ratio of arabinose and xylose is typical of a mixture of sugars obtained by digestion of lignocellulosic biomass and
  • hemicellulose-containing material can be obtained.
  • the object of the present invention is to fractionate the very complex sugar mixtures, which are often produced from biomass, with high purity and high yield, irrespective of the number and structure of the sugars. Furthermore, the present invention has the object, a possibility for the further implementation of fractionated To provide sugar / sugar acids, in particular xylose, xylonic acid, arabinose, arabic acid, to other products, in particular to xylitol and ⁇ -ketoglutarate.
  • the object of the present invention is achieved by a method according to claim 1.
  • the present invention first provides a process for obtaining n + a
  • n is at least 2 and a is at least 1,
  • At least a portion of the unreacted in the first stage sugar is half enzymatically oxidized and the remaining half is enzymatically reduced.
  • substantially the entire amount of the sugar not reacted in the first stage is half oxidized enzymatically and the remaining half is enzymatically reduced.
  • the two sugars oxidized or reduced in the first stage are reacted in a substantially equimolar amount.
  • the inventive method is based on a coupling of enzymatic oxidation and reduction reactions of sugars such that from a sugar mixture separable sugar oxidation products (such as sugar acids) and sugar reduction products (such as sugar alcohols) are obtained.
  • a sugar mixture separable sugar oxidation products (such as sugar acids) and sugar reduction products (such as sugar alcohols) are obtained.
  • sugars contained therein are not present in an equimolar ratio. If - as in the
  • WO 2014/076012 A1 describes - in a first stage, an enzymatic oxidation of the one sugar and an enzymatic reduction of the other sugar takes place in substantially equimolar ratio, so remains a part of existing in the original mixture in a larger amount of sugar in unreacted form in the mixture.
  • this unreacted part of this sugar is now subjected to enzymatic oxidation and enzymatic reduction.
  • the first stage may comprise several substeps:
  • the sugar A in a first step of the first step the sugar A can be completely oxidized or reduced and the sugar C in equimolar ratio
  • the sugar B are completely oxidized or reduced and again a portion of the sugar C is correspondingly reduced or oxidized.
  • the entire unreacted portion of the sugar C would then preferably be reduced by half and oxidized.
  • oxidation products are sugar acids or
  • a mixture of substances containing xylose and at least one further sugar preferably selected from the group consisting of C5 sugars, such as e.g. Arabinose, lyxose, ribose and C6 sugars, e.g. Allose, altrose, glucose, mannose, idose, galactose and talose.
  • C5 sugars such as e.g. Arabinose, lyxose, ribose and C6 sugars, e.g. Allose, altrose, glucose, mannose, idose, galactose and talose.
  • the mixture of sugars contains xylose and arabinose, wherein xylose is in excess.
  • Such mixtures are obtained in particular by degradation of a hemicellulose-containing material which has been obtained by digesting a lignocellulosic material, in particular if the lignocellulosic material is a material selected from the group consisting of straw, in particular wheat straw, bagasse, energy grasses, in particular elephant grass, switch grass, and / or Husks, especially lemmas, is.
  • the molar ratio of xylose and arabinose in mixtures thus obtained may be about 9: 1.
  • Oxidation equivalents can be provided by the simultaneous oxidative production of the arabic acid.
  • the entire unreacted xylose is preferably reduced by half enzymatically to xylonic acid and half to xylitol, (unless the arabic acid has already been separated off) a mixture of 1 part of arabic acid, 4 parts of xylonic acid and 5 parts results xylitol.
  • the original sugar mixture elegantly produces a mixture of easily separable oxidation and reduction products which are either themselves valuable substances (such as xylitol) or can be further processed into value products.
  • resulting arabic acid and / or resulting xylonic acid is further processed to ⁇ -ketoglutaric acid.
  • This further processing can preferably be carried out enzymatically:
  • xylonic acid this can by means of a xylonic acid dehydratase first to D-2-keto-3-deoxyxylonat, then by means of a D-2-keto-3-deoxyxylonat dehydratase to alpha- Ketoglutarklaldehyd (alpha-KGSA) and by means of an alpha -KGSA dehydrogenase can be further converted to alpha-ketoglutarate.
  • Suitable representatives of the enzyme classes L-arabic acid dehydratase and L-2-keto-3-deoxyarabonate dehydratase are available, for example, from Azospirillum brasiliense.
  • Suitable representatives of the enzyme classes xylonic acid dehydratase and D-2-keto-3-deoxyxylonate dehydratase are obtainable, for example, from Caulobacter crescentus.
  • Suitable alpha-ketoglutaric semialdehyde dehydrogenases are available, for example, from Azospirillum brasiliense or from Caulobacter crescentus.
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that the mixture containing xylose and arabinose additionally contains glucose.
  • the glucose contained in the mixture is oxidized to gluconic acid.
  • arabinose preferably after separation of the gluconic acid, enzymatically oxidized to arabic acid.
  • the entire unreacted xylose is half oxidized enzymatically to xylonic acid and half reduced to xylitol, (unless the arabic acid and / or the gluconic acid have already been separated off) a mixture of 1 part of arabic acid results, 0.4 part of gluconic acid, 3.8 parts of xylonic acid and 5.2 parts of xylitol.
  • the sugar mixture contains glucose in excess of the other existing sugar (s) and is at least partially recovered from the glucose sorbitol. It's supposed to be from an exemplary mix of
  • a mixture of this order of magnitude can be obtained, for example, in the digestion of wood and subsequent enzymatic degradation (Berrocal et al., 2004)
  • energy grasses can be obtained a sugar mixture with high glucose content. This results in e.g. following procedure:
  • the steps of the first stage may be consecutive or (partly) simultaneous.
  • a separation of sugar acids can take place after individual steps. If, in the second stage, preferably half of the total unreacted glucose is enzymatically oxidized to gluconic acid and half reduced to sorbitol, (unless the sugar acids have already been separated off) a mixture of 1.4 parts of mannonic acid, 0.7 part of galactonic acid, 0 is obtained , 7 parts of xylonic acid, 0.4 parts of arabic acid, 1.9 parts of gluconic acid and 5.1 parts of sorbitol.
  • the resulting D-sorbitol may be enzymatically or non-enzymatically, preferably enzymatically, e.g. be oxidized with a D-sorbitol dehydrogenase or with an enzyme with D-sorbitol dehydrogenase activity to D-fructose.
  • Redox cofactors NAD (P) possibly reduced by the enzyme can be regenerated by at least one other redox enzyme. As a result, the redox cofactors can be used in a substoichiometric amount.
  • the process of the present invention may be e.g. be used to obtain very pure D-fructose from a biomass hydrolyzate with glucose content. An easier separation of the other sugars from the mixture is made possible by the conversion into sugar acids.
  • the process of the present invention may be e.g. be used to obtain very pure D-fructose from a biomass hydrolyzate with glucose content. An easier separation of the other sugars from the mixture is made possible by the conversion into sugar acids.
  • Oxidation to sugar acids ready for the reduction of glucose to sorbitol.
  • a relatively high proportion of the glucose in the mixture can be converted to sorbitol without adding external substances for redox cofactor recycling.
  • the sorbitol thus obtained is available for the preparation of the valuable product fructose.
  • the enzymatic oxidation of the sugars carried out in the process according to the invention can be carried out by different classes of enzymes.
  • oxidases using oxygen
  • dehydrogenases using the oxidized redox cofactors NAD (P) +
  • enzymes are used which are dependent on redox cofactors. Particularly preferred are exclusively from
  • a further preferred embodiment of the method according to the invention is accordingly characterized in that at least in one of the two stages, preferably at least in the second stage, particularly preferably both in the first as well as in the second stage, at least one redox cofactor and at least one enzyme dependent on this redox cofactor is present in the reaction mixture.
  • arabinose in particular in the first stage, is oxidized to arabic acid.
  • an L-arabinose dehydrogenase can be used for the oxidation of L-arabinose.
  • Suitable L-arabinose dehydrogenases are available, for example, from Azospirillum brasiliense or from
  • xylose in particular a part of the xylose remaining in the solution after the first stage, is oxidized to xylonic acid.
  • oxidation of D-xylose can be by means of a D-xylose dehydrogenase.
  • Suitable xylose dehydrogenases are available, for example, from Caulobacter crescentus.
  • glucose in particular in the first stage, is oxidized to gluconic acid.
  • a D-glucose-1-dehydrogenase can be used for the oxidation of glucose.
  • a suitable D-glucose-1 dehydrogenase is available from Bacillus subtilis.
  • a glucose oxidase can be used for the oxidation of glucose.
  • a suitable D-glucose oxidase is available from Aspergillus niger.
  • xylose in particular a part of the xylose remaining in the solution after the first step, is reduced to xylitol.
  • D-xylose reductase the reduction of D-xylose can be catalyzed by a D-xylose reductase.
  • Suitable xylose reductases are, for example, obtainable from Candida tropicalis, Candida parapsilosis or Saccharomyces cerevisiae.
  • the cofactors NADH, NADPH, NAD + and / or NADP + are used.
  • NAD + denotes the oxidized form
  • NADH denotes the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide
  • NADP + denotes the oxidized form
  • NADPH denotes the reduced form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate.
  • the cofactors can either be added separately to the reaction, or they are part of others Components of the reaction, eg the enzymes used or a combination of these two sources is used. When redox cofactors are used, they are present in a process according to the invention in substoichiometric amounts relative to the substrates.
  • the redox cofactors oxidized or reduced during reduction or oxidation reactions can be returned to their original redox state (redox cofactor recycling) by suitable enzymatic reactions and can thus undergo several reaction cycles.
  • Enzymatic cofactor regeneration systems are in particular selected from the group consisting of alcohol dehydrogenases, sugar dehydrogenases, NAD (P) H oxidases, hydrogenases or lactate dehydrogenases with consumption of co-substrates, in particular ketones, aldehydes, sugars, pyruvic acid and its salts and / or oxygen or with generation of hydrogen.
  • redox cofactor recycling can be accomplished by another redox enzyme, e.g. by an alcohol dehydrogenase, an NAD (P) H oxidase or a sugar reductase, e.g. a xylose reductase.
  • a sugar reductase is used.
  • redox cofactor recycling can also be accomplished by another redox enzyme, e.g. by an alcohol dehydrogenase or a sugar dehydrogenase, e.g. a glucose dehydrogenase or an arabinose dehydrogenase.
  • a sugar dehydrogenase is used.
  • NADH oxidases are available, for example, from Clostridium aminovalericum or Streptococcus mutans.
  • Suitable alcohol dehydrogenases are available, for example, from Lactobacillus kefir or Thermoanaerobium brockii.
  • glucose is converted with a glucose dehydrogenase to gluconic acid (lactone), the redox cofactor recycling being carried out by a xylose reductase.
  • the resulting gluconic acid is separated from the mixture of substances in a further particular embodiment of the process according to the present invention.
  • arabinose is converted to arabic acid (lactone) with an arabinose dehydrogenase, the redox cofactor recycling being effected by a xylose reductase.
  • the resulting arabic acid is used in a further particular embodiment of the
  • the xylose remaining after the first stage is reduced to xylitol both in the presence of resulting sugar acids and, optionally, after sugar acid separation, with an enzyme, preferably a xylose reductase, more preferably an NAD (P) - dependent xylose reductase.
  • an enzyme preferably a xylose reductase, more preferably an NAD (P) - dependent xylose reductase.
  • P NAD
  • the remaining xylose becomes NAD (P) -dependent
  • Xylose reductase reduced to xylitol wherein the redox cofactor recycling is done by a xylose dehydrogenase, so that the remaining xylose is oxidized to xylonic acid simultaneously.
  • both in the first and in the second stage at least one redox cofactor and at least one enzyme dependent on this redox cofactor are preferably present in the reaction mixture.
  • at least one redox cofactor and at least one enzyme dependent on this redox cofactor are preferably present in the reaction mixture.
  • enzymes in each of two stages e.g. a reductase on the one hand and a
  • all the enzymes used are particularly preferably dependent on a redox cofactor which is also present in the mixture.
  • the redox cofactor is either already contained in the enzyme preparations in sufficient quantity or it is additionally added redox cofactor to the reaction.
  • the redox cofactor used in the first and / or second stage is further preferred in each case by reduction and reduction processes taking place in parallel
  • the enzymes used in the process can be obtained by recombinant expression.
  • the expert person is known to various systems, such as E. coli, Saccharomyces cerevisiae or Pichia pastoris.
  • E. coli is used; a competent person is familiar with the usual protocols for this purpose.
  • the enzymes can be used in intact cells, in permeabilized cells or in the form of cell lysates.
  • the enzymes may either be used directly or further purified, for example by chromatographic methods for protein purification, which may be found in the literature and / or known to a person skilled in the art.
  • a simple purification step eg centrifugation or filtration
  • first and second stages can be carried out in a one-pot reaction.
  • the two stages can take place at least partially simultaneously. Based on the described enzymatic reactions a simultaneous reaction of the two stages is possible.
  • Another embodiment of the method according to the invention comprises the removal of accumulating sugar acids from the mixture.
  • the removal of accumulating sugar acids for example, arabic acid, gluconic acid or xylonic acid
  • the hemicellulose-containing material by means of digestion of a
  • Digestion methods for lignocellulose-containing material can also Brön et al. (2011).
  • a method for the digestion or delignification of lignocellulose-containing material can also be found, for example, WO 2010/124312 A2 (Ertl et al., 2010).
  • lignocellulosic material includes in particular lignocellulosic biomass, eg annual or perennial plants or parts of annuals or perennials such as wood such as softwood or hardwood or (dry) grasses or parts of grasses. preferably grasses, straw, such as wheat straw, rye straw or maize straw, energy grasses such as barnyardgrass, miscanthus / miscanthus, abaca, sisal, bagasse or atypical
  • Lignocellulosic substrates such as corn spindles, husks, e.g. Lemmas, such as wheat husks, rice husks, particularly preferably straw, in particular wheat straw, bagasse, energy grasses, in particular elephant grass, switch grass, and / or husks, in particular lemmas.
  • the lignocellulosic material can be obtained by digestion with an alcohol, in particular with a CI_ 4 -alcohol, water and an alkali.
  • an alcohol in particular with a CI_ 4 -alcohol, water and an alkali.
  • a corresponding method is known, for example, from WO 2010/124312 A2 (Ertl et al, 2010).
  • Sugar-acid lactones included and vice versa.
  • the ratio of these two products is highly dependent on the sugar used and on the reaction conditions, e.g. from the reaction time or v.a. from the pH value.
  • Example 1 Xylanase treatment to obtain a sugar mixture from biomass. It was used from straw-made delignified pulp. A description of the preparation of the pulp can be taken from WO 2010/124312 A2 (Example 1). 10 g (dry weight) of the pulp were washed with dist. Water was resuspended to 10% consistency and it was adjusted with H 2 S0 4 pH 4.9. 1000 ⁇ l of xylanase Ecopulp TX800A (Ecopulp Finland Oy) were added and incubated at 50 ° C. for 16 h. A 1.5% sugar solution (w / v) is obtained which contains mainly glucose, xylose and arabinose in a ratio of about 2: 10: 1.
  • Examples 2 to 5 serve to illustrate the possibilities of selective enzymatic oxidation or reduction of sugars from a sugar mixture.
  • Example 2 Glucose oxidation with a glucose dehydrogenase (NADH oxidase for cofactor recirculation).
  • a sugar mixture (about 500 ⁇ ), which contains glucose, xylose and arabinose (sugar concentration about 1%), 18.5 mg NaHC0 3 was added. Thereafter, 30 ⁇ glucose dehydrogenase (activity about 300 U / ml), 10 ⁇ NADH oxidase (activity about 1140 U / ml) and 2.5 ⁇ NADH (concentration 100 mM) were added. The mixture was incubated at 25 ° C for about 17 hours. 86% of the glucose was converted to gluconic acid. The resulting solution was passed through a strong ion exchanger (Amberlyst A-26 (OH), Alfa Aesar). As a result, the resulting gluconic acid was completely separated from the mixture.
  • a strong ion exchanger Amberlyst A-26 (OH), Alfa Aesar
  • Example 3 Arabinose oxidation with an arabinosedehydro genese (NADH oxidase for cofactor Recvcling).
  • Example 5 Arabinose oxidation with an arabmose dehydrogenase (xylose reductase for cofactor recycling), xylose reduction with a xylose reductase (alcohol dehydrogenase for cofactor recycling).
  • the solution was stirred in a 200 ml round bottom flask at 35 ° C. (water bath) with a magnetic stirrer (200 rpm) for 20 min. Arabinose is complete
  • the cofactor used was already sufficiently present in the enzyme lysates used and did not have to be added separately.
  • the first stage is the oxidation of arabinose and reduction of an equimolar part of xylose.
  • the second step which proceeds at least partially in parallel, involves the oxidation of half of the unreacted xylose by arabinose dehydrogenase activity and reduction of the other half of the remaining xylose.
  • the reaction mixture comprised the following components: 364 ⁇ M dH 2 O, 2.5 ⁇ M NADPH solution (100 mM), 10 ⁇ M D-glucose solution (50% w / v), 100 ⁇ M D-xylose solution (50% w / v). v), 5 ⁇ glucose dehydrogenase (300 U / ml, measured with glucose), 19 ⁇ xylose reductase (160 U / ml), and 5.6 mg CaC0 3 .
  • the glucose dehydrogenase used also has some xylose dehydrogenase activity.
  • the reaction was gently shaken at 35 ° C and sampled at various times. By GC / MS, the content of sugars and the reaction products was determined.
  • Gluconic acid 10 mg / ml xylonic acid, 20 mg / ml xylitol, 70 mg / ml xylose.
  • composition of the reaction after 6 h 10 mg / ml gluconic acid, 40 mg / ml xylonic acid, 50 mg / ml xylitol, 10 mg / ml xylose.
  • Gluconobacter oxydans for production of xylonic acid from hemicellulose hydrolysates. Applied and Environmental Microbiology 28, 367-372.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung von n+a Oxidations- und Reduktionsprodukten aus einem Gemisch von n Zuckern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5- und C6-Zuckern zur Verfügung, wobei n zumindest 2 und a zumindest 1 ist, wobei zumindest zwei der Zucker in der Mischung in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegen, wobei in einer ersten Stufe zumindest einer der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch oxidiert wird und gleichzeitig zumindest einer der anderen der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch reduziert wird und wobei in der ersten Stufe ein Teil zumindest einer der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker nicht umgesetzt wird, und welches dadurch gekennzeichnet ist, dass in zumindest einer zweiten Stufe zumindest ein Teil des in der ersten Stufe nicht umgesetzten Zuckers je zur Hälfte enzymatisch oxidiert wird und zur verbleibenden Hälfte enzymatisch reduziert wird.

Description

VERFAHREN ZUR ENZYM ATISCHEN PRODUKTION VON OXIDATIONS- UND
REDUKTIONSPRODUKTEN VON GEM ISCHTEN ZUCKERN
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von n+a Oxidations- und Reduktionsprodukten aus einem Gemisch von n Zuckern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5- und C6-Zuckern.
In der Literatur wurden viele Verfahren zur Fraktionierung von Zucker-Mischungen veröffentlicht. Viele davon sind auf Chromatographie basiert.
In US 2004/0173533 AI wurde ein Verfahren zur chromatographischen Trennung einer aus Zuckern, vorzugsweise aus Xylose und Glucose, bestehenden Mischung beschrieben. Die Trennung ergibt separate Ströme: Einer davon ist mit Xylose, der andere mit Glucose angereichert. Die Zucker-Mischung wird vorzugsweise durch Hydrolyse von Biomasse hergestellt.
Eine Trennung von Zuckern, Zuckeralkoholen, Kohlenhydraten und Mischungen davon wird in EP 1 490 521 Bl beschrieben, wobei in zumindest einem Schritt ein schwach basisches Anionen- Austauscherharz (vernetztes Polyacrylsäure-Polymer oder Epichlorhydrin- Triethylentetramin-Harz), in der chromatographischen Trennung verwendet wird.
Aus CA 2 359 337 ist ein Verfahren zur Zucker-Trennung bekannt, wobei die Trennung von Xylose, Mannose, Galactose, Arabinose, Glucose, Xylitol, Arabitol, Sorbitol, Galactitol oder Mannitol (oder andere Monosacharide) von anderen Zuckern oder Zuckeralkoholen mittels Chromatographie über einen Ionenaustauscher, der aus einem Anionaustauscher mit relativ niedrigem Hydroxyl-Gehalt hergestellt wurde, erfolgt.
Ein großer Nachteil von chromatographischen Zucker-Fraktionierungen ist die
unvollständige Auftrennung von Komponenten. Als Folge sind geringe Ausbeuten und ein erhöhter Anteil von anderen Zuckern in den Hauptzucker-Fraktion zu nennen.
Ein anderes Herangehen zur Zucker-Fraktionierung ist ein (optional) selektiver Zucker- Umsatz zu Komponenten, die aufgrund unterschiedlicher physikalischer oder chemischer Eigenschaften (Polarität, Löslichkeit usw.) leicht voneinander getrennt werden können.
Ein Beispiel solcher Fraktionierung ist in US 7 498 430 beschrieben, wobei die
Fraktionierung von Xylose und Arabinose von einer Mischung von Zuckern erfolgt. Die Fraktionierung geschieht durch Umsatz der Zucker zur Mischung von Xylose-Monoacetal und Arabinose-Diacetal. Anschließend wird Xylose-Monoacetal von Arabinose-Diacetal mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion abgetrennt.
In WO 2011/133536 AI wird ein Verfahren beschrieben, wobei C5- und/oder C6-Aldose- Zucker in Zucker-Hydrolysat mit einem Katalysator in Kontakt gebracht wird, um die Zucker zu Ketose-Isomeren umzusetzen. Weiterhin wurden die isomerisierten C5- und/oder C6-Ketosen in Kontakt mit einem complexing agent (CA) gebracht, wobei die Ketosen sich an den CA binden und ein Ketose-CA Konjugat entsteht. Ketose-CA Konjugat konnte selektiv von der Zucker-Mischung abgetrennt werden.
Als erster Schritt zur Zucker-Fraktionierung wird in der vorliegenden Erfindung ein Teil der Zucker in der Zuckermischung selektiv zu Zucker-Säuren umgesetzt. In der Literatur wurden einige Methoden zur Zucker-Säuren-Herstellung beschrieben.
Ein Prozess zur Herstellung von Gluconsäure ist aus US 2 651 592 bekannt. Es wird
Glucose-Lösung zu einem enzymatischen System zugegeben, das Katalase- und Glucose- Oxidase-Aktivität aufweist, wobei Wasserstoffperoxid in stöchiometrischer Menge zudosiert wird, um die ganze Glucose zu oxidieren.
In US 3 619 396 wird ein Verfahren beschrieben, wobei Gluconsäure enzymatisch aus Glucose-enthaltendem Material mittels Glucose-Oxidase hergestellt wird. Eine Verbesserung gegenüber bekannten Methoden besteht darin, dass das Reaktionsmedium einer
Elektrodialyse unterzogen wird, um Gluconsäure vom Medium zu trennen und Glucose- Oxidase zurückzugewinnen.
In US 3 935 071 wird Glucose zu Gluconsäure umgesetzt, wobei Glucose in wässriger Lösung mit Sauerstoff oxidiert wird. Glucose-Lösung wird durch einen Glucose-Oxidase und Katalase enthaltenden Katalysator, der fest an einen passenden Träger gebunden ist, geleitet. In einem Beispiel wird eine selektive Oxidation von Glucose in Gegenwart von Fructose beschrieben, wobei die entstehende Gluconsäure anschließend mittels
Ionenaustauscher abgetrennt wird.
Ein Verfahren zur Herstellung von Gluconsäure und deren Salzen ist aus CA 2 194 859 bekannt, wobei Glucose in einer Konzentration von 15 % oder mehr zu Gluconsäure bei einer Temperatur von 10°C oder höher in Gegenwart von Glucose-Oxidase und Katalase umgesetzt wird. Die Umsetzung ist so durchgeführt, dass ein Überschuss von Katalase- Aktivität relativ zur Oxidase-Aktivität verwendet wird.
In US 7 923 226 B2 wird ein Verfahren zur Herstellung von 1,2,4-Butantriol beschrieben, wobei auch Xylose zu Xylonolacton/Xylonsäure oxidiert wird. Allerdings offenbart dieses Patent kein Recyclingsystem für den bei der Reaktion reduzierten Redoxcofaktor.
Auch zur Herstellung von Zuckersäuren kommen bereits fermentative Verfahren zum Einsatz (z.B. Buchert et al., 1988; Toivari et al., 2012b).
In US 2 351 500 wird ein Verfahren beschrieben, wobei Glucose zu Gluconsäure durch Fermentation umgesetzt wird. Borsäure wird in einer Menge von 0.25 bis 1.5 relativ zu entstehender Gluconsäure zugegeben, um die Ausfällung von Gluconsäure-Salzen zu vermeiden.
Es gibt in der Literatur auch einige Beispiele für fermentative Verfahren, bei denen aus Xylose sowohl Xylonsäure als auch Xylitol entsteht. In Nygard et al. (2011) werden Kluyveromyces lactis Stämme verwendet, um Xylose in Xylonsäure und Xylitol umzuwandeln. Bei dem Verfahren wird allerdings ein großer Anteil an Biomasse erzeugt (ca. 50 % relativ zur Summe der Produkte Xylonsäure und Xylitol). In weiteren Verfahren aus dem Stand der Technik werden S. cerevisiae Stämme (Toivari et al., 2012b) oder modifizierte E. coli (Cao et al, 2013) verwendet, um Xylonsäure und Xylitol aus Xylose zu erzeugen. Auch hier wird sehr viel Biomasse erzeugt, wobei auch Substanzen verbraucht werden, die zusätzlich zu Xylose dem Medium zugegeben werden, wie z.B. Glucose.
Bei den beschriebenen Verfahren und weiteren fermentativen Verfahren zur Xylonat- Herstellung im Stand der Technik fallen die folgenden Schwierigkeiten auf: Verluste durch Produktion von Biomasse, Acetat oder anderen Zuckersäuren, relativ niedrige
Substratkonzentration und/oder relativ lange Reaktionszeiten.
Es sind einige enzymatische Verfahren zu Herstellung des Zuckeralkohols Xylitol unter Verwendung isolierter Enzyme bekannt (z.B. Zhang et al. (2011)). Bei diesen Verfahren wird der eingesetzte Redoxcofaktor durch eine weitere enzymatische Redoxreaktion regeneriert. Allerdings muss dafür jeweils ein zusätzliches Substrat in mindestens stöchiometrischer Menge zugegeben werden. Nidetzky et al. (1996) haben ein Verfahren beschrieben, bei dem aus Xylose Xylitol hergestellt wird und bei dem die Reduktionsäquivalente durch gleichzeitige Oxidation von entweder Glucose oder Xylose bereitgestellt werden.
Eine weitere bekannte Möglichkeit zur Herstellung des Zuckeralkohols Xylitol ist die Fermentation. In Ko et al. (2006) wird beispielweise ein Fermentationsverfahren zur
Gewinnung von Xylitol aus Xylose beschrieben. Dabei kommt ein genetisch veränderter Stamm von Candida tropicalis zum Einsatz. Die Regenerierung des Cofaktors der Xylose- Reduktase ist nicht näher spezifiziert und wird vom Gesamtstoffwechsel der Zellen übernommen. Nachteilig fällt auf, dass zusätzlich Glucose zu den Kulturen gegeben wird. Ein großer Teil der eingesetzten Zucker wird in Biomasse umgewandelt und dient nicht der Produktbildung. Vor allem wird nicht die stöchiometrisch mögliche Menge an Xylitol relativ zur eingesetzten Xylose erhalten.
In der Literatur sind Enzyme beschrieben, die die Umwandlung von L-Arabonat über L-2- Keto-3-deoxyarabonat und alpha-Ketoglutarat-Semialdehyd zu alpha-Ketoglutarat ermöglichen (Watanabe et al., 2006). Weiterhin sind Enzyme beschrieben, die die
Umwandlung von D-Xylonsäure über D-2-Keto-3-deoxyxylonat und alpha-Ketoglutarat- Semialdehyd zu alpha-Ketoglutarat ermöglichen (Stephens et al., 2006; Johnsen et al., 2009).
In der WO 2014/076012 AI wird unter anderem ein Verfahren beschrieben, bei welchem aus einem Gemisch von Arabinose und Xylose (in einem molaren Verhältnis von ca. 10 zu 90) die Arabinose zum Großteil enzymatisch zu Arabinolacton bzw. Arabonsäure oxidiert wird und die Xylose in im wesentlichen äquimolarem Verhältnis enzymatisch zu Xylitol reduziert wird.
Das beschriebene molare Verhältnis von Arabinose und Xylose ist typisch für ein Gemisch von Zuckern, welches durch Aufschluss von lignocellulosehaltiger Biomasse und
anschließendem enzymatischen Abbau des mit dem Aufschluss erhaltenen
hemicellulosehaltigen Materials erhalten werden kann.
Weiterer Stand der Technik ist aus der WO 2010/106230 AI bekannt.
Die vorliegende Erfindung stellt sich zur Aufgabe, die sehr komplexen Zucker-Mischungen, die oft aus Biomasse entstehen, mit hoher Reinheit und hoher Ausbeute zu fraktionieren, unabhängig von der Zahl und Struktur der Zucker. Weiterhin stellt sich die vorliegende Erfindung zur Aufgabe, eine Möglichkeit für die weitere Umsetzung von fraktionierten Zuckern / Zuckersäuren, insbesondere Xylose, Xylonsäure, Arabinose, Arabonsäure, zu weiteren Produkten, insbesondere zu Xylitol und α-Ketoglutarat, zur Verfügung zu stellen.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 1 gelöst.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den Unteransprüchen angeführt.
Die vorliegende Erfindung stellt zunächst ein Verfahren zur Gewinnung von n+a
Oxidations- und Reduktionsprodukten aus einem Gemisch von n Zuckern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5- und C6-Zuckern zur Verfügung,
wobei n zumindest 2 und a zumindest 1 ist,
wobei zumindest zwei der Zucker in der Mischung in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegen,
wobei in einer ersten Stufe zumindest einer der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch oxidiert wird und gleichzeitig zumindest einer der anderen der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch reduziert wird und
wobei in der ersten Stufe ein Teil zumindest einer der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker nicht umgesetzt wird,
und welches dadurch gekennzeichnet ist, dass in zumindest einer zweiten Stufe
zumindest ein Teil des in der ersten Stufe nicht umgesetzten Zuckers je zur Hälfte enzymatisch oxidiert wird und zur verbleibenden Hälfte enzymatisch reduziert wird.
Bevorzugt wird in der zweiten Stufe im Wesentlichen die gesamte Menge des in der ersten Stufe nicht umgesetzten Zuckers je zur Hälfte enzymatisch oxidiert wird und zur verbleibenden Hälfte enzymatisch reduziert.
Weiters bevorzugt werden die beiden in der ersten Stufe oxidierten bzw. reduzierten Zucker in im Wesentlichen äquimolarer Menge umgesetzt.
Das erfindungsgemäße Verfahren beruht auf einer Kopplung enzymatischer Oxidations- und Reduktionsreaktionen an Zuckern dergestalt, dass aus einer Zucker-Mischung voneinander trennbare Zucker-Oxidationsprodukte (wie z.B. Zuckersäuren) und Zucker- Reduktionsprodukte (wie z.B. Zuckeralkohole) gewonnen werden. In vielen insbesondere aus Biomasse gewonnenen Zucker-Mischungen liegen die darin enthaltenen Zucker nicht in äquimolarem Verhältnis vor. Wenn - wie z.B. in der
WO 2014/076012 AI beschrieben - in einer ersten Stufe eine enzymatische Oxidation des einen Zuckers und eine enzymatische Reduktion des anderen Zuckers in im Wesentlichen äquimolarem Verhältnis erfolgt, so verbleibt ein Teil des in der ursprünglichen Mischung in größerer Menge vorhandenen Zuckers in nicht umgesetzter Form in der Mischung.
Erfindungsgemäß wird nun auch dieser nicht umgesetzte Teil dieses Zuckers einer enzymatischen Oxidation und einer enzymatischen Reduktion unterworfen. Dadurch entstehen erneut in im wesentlichen äquimolarem Verhältnis ein Oxidationsprodukt (wie z.B. eine Zuckersäure) sowie ein Reduktionsprodukt (wie z.B. ein Zuckeralkohol) dieses Zuckers, welche voneinander getrennt werden können.
Wird der gesamte in der ersten Stufe nicht umgesetzte Teil dieses Zuckers oxidiert und reduziert, so resultiert eine Mischung, die ausschließlich aus diesen Oxidations- und Reduktionsprodukten besteht, und es ist somit eine vollständige Trennung der Produkte möglich.
Somit entstehen z.B. bei einer Mischung von zwei Zuckern (n=2) gemäß diesem Verfahren drei (a=l) Produkte, nämlich das Oxidationsprodukt des in der ersten Stufe oxidierten Zuckers sowie Oxidations- und Reduktionsprodukt des anderen Zuckers.
Insbesondere, wenn ein Gemisch von mehr als zwei Zuckern vorliegt, kann die erste Stufe mehrere Teilschritte umfassen:
So kann bei einem Gemisch von drei Zuckern A, B und C, bei denen der Zucker C in molarem Überschuss vorliegt, in einem ersten Teilschritt der ersten Stufe der Zucker A vollständig oxidiert oder reduziert und der Zucker C in äquimolarem Verhältnis
dementsprechend zum Teil reduziert oder oxidiert werden. In einem zweiten Teilschritt kann z.B. der Zucker B vollständig oxidiert oder reduziert werden und wiederum ein Teil des Zuckers C dementsprechend reduziert oder oxidiert werden. In der zweiten Stufe würde dann bevorzugt der gesamte nicht umgesetzte Teil des Zuckers C je zur Hälfte reduziert und oxidiert werden.
Die Teilschritte der ersten Stufe können zeitgleich oder auch hintereinander ablaufen. Bevorzugt werden erfindungsgemäß als Oxidationsprodukte Zuckersäuren bzw.
Zuckersäurelactone und als Reduktionsprodukte Zuckeralkohole erhalten.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt ein Stoffgemisch enthaltend Xylose und mindestens einen weiteren Zucker bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5-Zuckern, wie z.B. Arabinose, Lyxose, Ribose und aus C6- Zuckern, wie z.B. Allose, Altrose, Glucose, Mannose, Idose, Galactose und Talose umgesetzt.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Gemisch von Zuckern Xylose und Arabinose, wobei Xylose im Überschuss vorliegt.
Solche Gemische fallen insbesondere bei Abbau eines hemicellulosehaltigen Materials an, welches mittels Aufschluss eines lignocellulosischen Materials gewonnen wurde, insbesondere wenn das lignocellulosische Material ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stroh, insbesondere Weizenstroh, Bagasse, Energiegräser, insbesondere Elefantengras, Switchgras, und/oder Spelzen, insbesondere Deckspelzen, ist.
Typischerweise kann das molare Verhältnis von Xylose und Arabinose in solcherart gewonnenen Gemischen ca. 9: 1 betragen.
Bevorzugt wird in einer Ausführungsform, in welcher ein Zuckergemisch mit einem
Überschuss an Xylose und Arabinose vorliegt, in der ersten Stufe Arabinose zu Arabonsäure bzw. zum Arabonsäurelacton oxidiert sowie ein Teil der Xylose zu Xylitol reduziert und in der zweiten Stufe die nicht umgesetze Xylose ganz oder teilweise je zur Hälfte zu
Xylonsäure oder zum Xylonolacton oxidiert und die verbleibende Hälfte zum Xylitol reduziert.
In diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung müssen keine zusätzlichen Zucker zur Mischung zugegeben werden, um z.B. Xylitol zu erzeugen, da die benötigten
Oxidationsäquivalente durch die gleichzeitige oxidative Herstellung der Arabonsäure bereitgestellt werden.
Ausgehend von einem beispielhaften Verhältnis von Xylose zu Arabinose von 9: 1 im Gemisch ergibt sich dabei z.B. folgender Ablauf: Wenn in einem solchen Gemisch in einer ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Arabinose zu Arabonsäure oxidiert und ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Xylose zu Xylitol reduziert wird, so erhält man ein Gemisch aus 1 Teil Arabonsäure, 1 Teil Xylitol und 8 Teilen nicht umgesetzter Xylose.
Wird nun in der zweiten Stufe bevorzugt die gesamte nicht umgesetzte Xylose je zur Hälfte enzymatisch zu Xylonsäure und zur Hälfte zu Xylitol reduziert, ergibt sich (sofern die Arabonsäure nicht bereits zuvor abgetrennt wurde) ein Gemisch aus 1 Teil Arabonsäure, 4 Teilen Xylonsäure und 5 Teilen Xylitol.
Somit entsteht aus der ursprünglichen Zucker-Mischung in eleganter Weise ein Gemisch aus leicht voneinander trennbaren Oxidations- und Reduktionsprodukten, die entweder bereits für sich Wertstoffe darstellen (wie z.B. Xylitol) oder zu Wertprodukten weiterverarbeitet werden können.
So wird in dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bevorzugt entstandene Arabonsäure und/oder entstandene Xylonsäure zu α-Ketoglutarsäure weiterverarbeitet.
Auch diese Weiterverarbeitung kann bevorzugt enzymatisch erfolgen:
Zur enzymatischen Umwandlung der Zuckersäuren Arabonsäure und Xylonsäure zu alpha- Ketoglutarat kann im Falle der Arabonsäure diese mittels einer Arabonsäure-Dehydratase erst zu L-2-Keto-3-desoxyarabonat, dann mittels einer L-2-Keto-3-desoxyarabonat- Dehydratase zu alpha-Ketoglutarsäuresemialdehyd (alpha-KGSA) und weiter mittels einer alpha-KGSA-Dehydrogenase zu alpha-Ketoglutarat umgesetzt werden. Im Falle von Xylonsäure kann diese mittels einer Xylonsäure -Dehydratase erst zu D-2-Keto-3- desoxyxylonat, dann mittels einer D-2-Keto-3-desoxyxylonat-Dehydratase zu alpha- Ketoglutarsäuresemialdehyd (alpha-KGSA) und mittels einer alpha-KGSA-Dehydrogenase weiter zu alpha-Ketoglutarat umgesetzt werden.
Geeignete Vertreter der Enzym-Klassen L- Arabonsäure -Dehydratase und L-2-Keto-3- desoxyarabonat-Dehydratase sind zum Bespiel erhältlich aus Azospirillum brasiliense. Geeignete Vertreter der Enzym-Klassen Xylonsäure-Dehydratase und D-2-Keto-3- desoxyxylonat-Dehydratase sind zum Beispiel erhältlich aus Caulobacter crescentus.
Geeignete alpha-Ketoglutarsäuresemialdehyd-Dehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Azospirillum brasiliense oder aus Caulobacter crescentus. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass die Xylose und Arabinose enthaltende Mischung zusätzlich Glucose enthält.
Insbesondere in dieser Ausführungsform des Verfahrens wird die in der Mischung enthaltene Glucose zu Gluconsäure oxidiert.
Bevorzugt wird in dieser Ausführungsform des Verfahrens Arabinose, vorzugsweise nach Abtrennung der Gluconsäure, enzymatisch zu Arabonsäure oxidiert.
Ausgehend von einer beispielhaften Mischung von Xylose/ Arabinose/Glucose im Verhältnis 9:1 :0.4 (eine Mischung in dieser Größenordnung kann beispielsweise beim Aufschluss von Stroh und anschließendem enzymatischem Abbau erhalten werden) ergibt sich dabei z.B. folgender Ablauf:
Wenn in einem solchen Gemisch in einer ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Glucose zu Gluconsäure oxidiert und ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Xylose zu Xylitol reduziert wird, so erhält man ein Gemisch aus 1 Teil Arabinose, 0.4 Teilen Gluconsäure, 0.4 Teilen Xylitol und 8.6 Teilen nicht umgesetzter Xylose.
Wird in einer weiteren Reaktion der ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Arabinose zu Arabonsäure oxidiert und wieder ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Xylose zu Xylitol reduziert, so erhält man ein Gemisch aus 1 Teil Arabonsäure, 0.4 Teilen Gluconsäure, 1.4 Teilen Xylitol und 7.6 Teilen nicht umgesetzter Xylose.
Wird nun in der zweiten Stufe bevorzugt die gesamte nicht umgesetzte Xylose je zur Hälfte enzymatisch zu Xylonsäure oxidiert und zur Hälfte zu Xylitol reduziert, ergibt sich (sofern die Arabonsäure und/oder die Gluconsäure nicht bereits zuvor abgetrennt wurden) ein Gemisch aus 1 Teil Arabonsäure, 0.4 Teilen Gluconsäure, 3.8 Teilen Xylonsäure und 5.2 Teilen Xylitol.
Eine Weiterverarbeitung der entstandenen Arabonsäure und/oder Xylonsäure zu alpha- Ketoglutarat ist wie oben beschrieben möglich.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform enthält das Zuckergemisch Glucose im Überschuss zu dem/den anderen vorhandenen Zucker(n) und wird aus der Glucose zumindest zum Teil Sorbitol gewonnen. Es soll von einer beispielhaften Mischung von
Glucose/Mannose/Galactose/Xylose/Arabinose im Verhältnis 7: 1.4:0.7:0.7:0.4 ausgegangen werden. Eine Mischung in dieser Größenordnung kann beispielsweise beim Aufschluss von Holz und anschließendem enzymatischem Abbau erhalten werden (Berrocal et al. 2004,) Auch bei der kompletten Hydrolyse der Zucker-Polymere aus anderen lignocellulose- haltigen Biomassen, wie z.B. Stroh, Maisstroh, Reisstroh, Bagasse, Energiegräser kann eine Zucker-Mischung mit hohem Glucose-Anteil erhalten werden. Dabei ergibt sich dabei z.B. folgender Ablauf:
Wenn in einem solchen Gemisch in einer ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Mannose zu Mannonsäure oxidiert und ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Glucose zu Sorbitol reduziert wird, so erhält man ein Gemisch aus 1.4 Teilen Mannonsäure, 0.7 Teilen Galactose, 0.7 Teilen Xylose, 0.4 Teilen Arabinose, 1.4 Teilen Sorbitol sowie 5.6 Teilen nicht umgesetzter Glucose.
Wird in einer weiteren Reaktion der ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Galactose zu Galactonsäure oxidiert und wieder ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Glucose zu Sorbitol reduziert, so erhält man ein Gemisch aus 1.4 Teilen Mannonsäure, 0.7 Teilen Galactonsäure, 0.7 Teilen Xylose, 0.4 Teilen Arabinose, 2.1 Teilen Sorbitol sowie 4.9 Teilen nicht umgesetzter Glucose.
Wird in einer weiteren Reaktion der ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Xylose zu Xylonsäure oxidiert und wieder ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Glucose zu Sorbitol reduziert, so erhält man ein Gemisch aus 1.4 Teilen Mannonsäure, 0.7 Teilen Galactonsäure, 0.7 Teilen Xylonsäure, 0.4 Teilen Arabinose, 2.8 Teilen Sorbitol sowie 4.2 Teilen nicht umgesetzter Glucose.
Wird in einer weiteren Reaktion der ersten Stufe im Wesentlichen der gesamte Anteil an Arabinose zu Arabonsäure oxidiert und wieder ein im Wesentlichen äquimolarer Anteil an Glucose zu Sorbitol reduziert, so erhält man ein Gemisch aus 1.4 Teilen Mannonsäure, 0.7 Teilen Galactonsäure, 0.7 Teilen Xylonsäure, 0.4 Teilen Arabonsäure, 3.2 Teilen Sorbitol sowie 3.8 Teilen nicht umgesetzter Glucose.
Die Schritte der ersten Stufe können konsekutiv oder (teilweise) simultan ablaufen.
Außerdem kann nach einzelnen Schritten eine Abtrennung von Zuckersäuren erfolgen. Wird nun in der zweiten Stufe bevorzugt die gesamte nicht umgesetzte Glucose je zur Hälfte enzymatisch zu Gluconsäure oxidiert und zur Hälfte zu Sorbitol reduziert, ergibt sich (sofern die Zuckersäuren nicht bereits zuvor abgetrennt wurden) ein Gemisch aus 1.4 Teilen Mannonsäure, 0.7 Teilen Galactonsäure, 0,7 Teilen Xylonsäure, 0.4 Teilen Arabonsäure, 1.9 Teilen Gluconsäure und 5.1 Teilen Sorbitol.
Es kann (auch) nach der zweiten Stufe eine Abtrennung der Zuckersäuren erfolgen. Eine Weiterverarbeitung der entstandenen Arabonsäure und/oder Xylonsäure zu alpha- Ketoglutarat ist wie oben beschrieben möglich.
In einer möglichen optionalen weiteren Stufe kann das erhaltene D-Sorbitol enzymatisch oder nicht-enzymatisch, vorzugsweise enzymatisch, z.B. mit einer D-Sorbitol- Dehydrogenase oder mit einem Enzym mit D-Sorbitoldehydrogenase- Aktivität zu D- Fructose oxidiert werden. Durch das Enzym möglicherweise reduzierte Redoxcofaktoren NAD(P) können durch mindestens ein weiteres Redoxenzym regeneriert werden. Dadurch können die Redoxcofaktoren in substöchiometrischer Menge eingesetzt werden.
In dieser speziellen Ausführungsform kann das Verfahren gemäß vorliegender Erfindung z.B. dazu verwendet werden, sehr reine D-Fructose aus einem Biomasse-Hydrolysat mit Glucose-Anteil zu erhalten. Eine leichtere Abtrennung der anderen Zucker aus der Mischung wird durch die Umwandlung in Zuckersäuren ermöglicht. Darüber hinaus stellt die
Oxidation zu Zuckersäuren Redox-Äquivalente für die Reduktion von Glucose zu Sorbitol bereit. In der oben beschriebenen exemplarischen Mischung kann ein relativ hoher Anteil der Glucose in der Mischung zu Sorbitol umgewandelt werden, ohne externe Substanzen zum Redoxcofaktor-Recycling zuzugeben. Das so erhaltene Sorbitol steht zur Herstellung der wertvollen Produkts Fructose zur Verfügung.
Die im erfindungsgemäßen Verfahren durchgeführte enzymatische Oxidation der Zucker kann durch unterschiedliche Enzym-Klassen erfolgen. Zum Beispiel sind dafür geeignet Oxidasen (unter Verwendung von Sauerstoff) oder Dehydrogenasen (unter Verwendung der oxidierten Redoxcofaktoren NAD(P)+). Bevorzugt werden Enzyme eingesetzt, die von Redoxcofaktoren abhängig sind. Besonders bevorzugt werden ausschließlich von
Redoxcofaktoren abhängige Enzyme eingesetzt. Dadurch kann in eleganter Weise eine jeweils in äquimolarem Verhältnis ablaufende Oxidation bzw. Reduktion der betroffenen Zucker erreicht werden. -Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist demgemäß dadurch gekennzeichnet, dass zumindest in einer der beiden Stufen, bevorzugt zumindest in der zweiten Stufe, besonders bevorzugt sowohl in der ersten als auch in der zweiten Stufe mindestens ein Redoxcofaktor und mindestens ein von diesem Redoxcofaktor abhängiges Enzym in der Reaktionsmischung vorhanden ist.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt Arabinose, insbesondere in der ersten Stufe, zu Arabonsäure oxidiert. Zum Beispiel kann für die Oxidation von L- Arabinose eine L-Arabinose-Dehydrogenase verwendet werden. Geeignete L-Arabinose- Dehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Azospirillum brasiliense oder aus
Burkholderia vietnamiensis .
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt Xylose, insbesondere ein Teil der nach der ersten Stufe in der Lösung verbleibenden Xylose, zu Xylonsäure oxidiert. Zum Beispiel kann die Oxidation von D-Xylose mittels einer D-Xylose-Dehydrogenase erfolgen. Geeignete Xylose-Dehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Caulobacter crescentus. Alternativ können auch als Arabinose-Dehydrogenasen annotierte Enzyme mit breiterem Substratspektrum eingesetzt werden.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt Glucose, insbesondere in der ersten Stufe, zu Gluconsäure oxidiert. Zum Beispiel kann für die Oxidation von Glucose eine D-Glucose-1 -Dehydrogenase verwendet werden. Eine geeignete D-Glucose-1- Dehydrogenase ist zum Beispiel erhältlich aus Bacillus subtilis.
Weiters kann für die Oxidation von Glucose eine Glucose-Oxidase verwendet werden. Eine geeignete D-Glucose-Oxidase ist zum Beispiel erhältlich aus Aspergillus niger.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wird bevorzugt Xylose, insbesondere ein Teil der nach der ersten Stufe in der Lösung verbleibenden Xylose, zu Xylitol reduziert.
Zum Beispiel kann die Reduktion von D-Xylose durch eine D-Xylose-Reduktase katalysiert werden. Geeignete Xylosereduktasen sind zum Beispiel erhältlich aus Candida tropicalis, Candida parapsilosis oder Saccharomyces cerevisiae.
In einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können in bestimmten
Ausführungsformen die Cofaktoren NADH, NADPH, NAD+ und/oder NADP+ eingesetzt werden. Dabei bezeichnen NAD+ die oxidierte Form und NADH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotid, während NADP+ die oxidierte Form und NADPH die reduzierte Form von Nicotinamidadenindinucleotidphosphat bezeichnen. Die Cofaktoren können entweder der Reaktion gesondert zugesetzt werden, oder sie sind Bestandteil anderer Komponenten der Reaktion, z.B. der eingesetzten Enzyme oder es wird eine Kombination dieser beiden Quellen verwendet. Beim Einsatz von Redoxcofaktoren sind diese in einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung in substöchiometrischen Mengen relativ zu den Substraten vorhanden. Die bei Reduktions- oder Oxidationsreaktionen oxidierten oder reduzierten Redoxcofaktoren können durch geeignete enzymatische Reaktionen wieder in ihren ursprünglichen Redoxzustand überführt (Redoxcofaktor-Recycling) werden und können so mehrere Reaktionszyklen durchlaufen.
Enzymatische Cofaktor-Regenerierungssysteme sind insbesondere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Alkoholdehydrogenasen, Zuckerdehydro genasen, NAD(P)H- Oxidasen, Hydrogenasen oder Laktatdehydrogenasen unter Verbrauch von Co-Substraten, insbesondere Ketonen, Aldehyden, Zuckern, Brenztraubensäure und deren Salze und/oder Sauerstoff bzw. unter Erzeugung von Wasserstoff.
Bei der Produktion von Xylonsäure(-lacton) aus Xylose kann das Redoxcofaktor-Recycling durch ein weiteres Redox-Enzym erfolgen, z.B. durch eine Alkoholdehydrogenase, eine NAD(P)H-Oxidase oder eine Zucker-Reduktase, wie z.B. eine Xylose-Reduktase. Bevorzugt wird eine Zucker-Reduktase verwendet.
Bei der Produktion von Xylitol kann das Redoxcofaktor-Recycling ebenfalls durch ein weiteres Redox-Enzym erfolgen, z.B. durch eine Alkoholdehydrogenase oder eine Zucker- Dehydrogenase, wie z.B. eine Glucose-Dehydrogenase oder eine Arabinose-Dehydrogenase. Bevorzugt wird eine Zucker-Dehydrogenase verwendet.
Geeignete NADH-Oxidasen sind zum Beispiel erhältlich aus Clostridium aminovalericum oder Streptococcus mutans.
Geeignete Alkoholdehydrogenasen sind zum Beispiel erhältlich aus Lactobacillus kefir oder Thermoanaerobium brockii.
In einer besonderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird Glucose mit einer Glucosedehydrogenase zu Gluconsäure(-lacton) überführt, wobei das Redoxcofaktor-Recycling durch eine Xylosereduktase erfolgt. Die entstehende Gluconsäure wird in einer weiteren besonderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung von dem Stoffgemisch abgetrennt. In einer weiteren besonderen Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird Arabinose zu Arabonsäure(-lacton) mit einer Arabinosedehydrogenase überführt, wobei das Redoxcofaktor-Recycling durch eine Xylosereduktase erfolgt. Die entstandene Arabonsäure wird in einer weiteren besonderen Ausführungsform des
Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung von dem Stoffgemisch abgetrennt. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung wird Arabonsäure(-lacton) von dem Stoffgemisch nicht abgetrennt, worauf die verbleibende Xylose zu Xylonsäure(-lacton) oxidiert wird.
In einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die nach der ersten Stufe verbleibende Xylose sowohl in Gegenwart von entstehenden Zuckersäuren als auch gegebenenfalls nach Zuckersäuren- Abtrennung zu Xylitol reduziert und zwar mit einem Enzym, bevorzugt mit einer Xylosereduktase, mehr bevorzugt mit einer NAD(P)-abhängigen Xylosereduktase. In einem anderen Aspekt wird die verbleibende Xylose mit einer NAD(P)-abhängigen
Xylosereduktase zu Xylitol reduziert, wobei das Redoxcofaktor-Recycling durch eine Xylosedehydrogenase erfolgt, sodass die verbleibende Xylose gleichzeitig zu Xylonsäure oxidiert wird.
Bevorzugt ist somit im erfindungsgemäßen Verfahren sowohl in der ersten als auch in der zweiten Stufe mindestens ein Redoxcofaktor und mindestens ein von diesem Redoxcofaktor abhängiges Enzym in der Reaktionsmischung vorhanden. Üblicherweise sind in beiden Stufen jeweils zwei Enzyme vorhanden, z.B. eine Reduktase einerseits und eine
Dehydrogenase andererseits. Denkbar ist aber auch die Katalyse sowohl der Reduktion als auch der Oxidation durch ein einziges Enzym.
Wie oben bereits erwähnt, sind besonders bevorzugt alle eingesetzten Enzyme von einem Redoxcofaktor, der auch in der Mischung vorhanden ist, abhängig.
Der Redoxcofaktor ist entweder bereits in den Enzympräparationen in ausreichender Menge enthalten oder es wird zusätzlich Redoxcofaktor zur Reaktion gegeben.
Weiters bevorzugt wird im erfindungsgemäßen Verfahren der in der ersten und/oder zweiten Stufe eingesetzte Redoxcofaktor durch jeweils parallel ablaufende Reduktions- und
Oxidationsreaktionen regeneriert.
Die im Verfahren verwendeten Enzyme können durch rekombinante Expression gewonnen werden. Der fachkundigen Person sind dazu verschiedene Systeme bekannt, z.B. E. coli, Saccharomyces cerevisiae oder Pichia pastoris. Vorzugsweise wird E. coli verwendet; eine fachkundige Person ist hierzu mit den gängigen Protokollen vertraut. Die Enzyme können in intakten Zellen, in permeabilisierten Zellen oder in der Form von Zell-Lysaten eingesetzt werden. Im Fall von Zell-Lysaten können die Enzyme entweder direkt eingesetzt werden oder es kann eine weitere Aufreinigung erfolgen, z.B. mit chromatographischen Methoden zur Proteinreinigung, welche der Literatur entnommen werden können und/oder welche einer fachkundigen Person bekannt sind. Vorzugsweise wird bei Verwendung von Zell- Lysaten entweder keine weitere Reinigung oder nur ein einfacher Reinigungsschritt (z.B. Zentrifugation oder Filtration) durchgeführt.
Wie bereits aus den vorherigen Ausführungen hervorgeht, können im erfindungsgemäßen Verfahren erste und zweite Stufe in einer Eintopfreaktion durchgeführt werden.
Es lässt sich somit gegebenenfalls eine vollständige Auftrennung der Zucker-Mischung in nur einem einzigen Reaktionsgefäß erreichen.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die beiden Stufen zumindest teilweise zeitgleich ablaufen. Anhand der beschriebenen enzymatischen Reaktionen ist eine zeitgleiche Reaktionsführung der beiden Stufen möglich.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die Entfernung von anfallenden Zuckersäuren aus dem Gemisch. Die Entfernung anfallender Zuckersäuren (z.B. Arabonsäure, Gluconsäure oder Xylonsäure) kann dabei zwischen der ersten und der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens, oder auch erst nach der zweiten Stufe erfolgen.
Wie oben erwähnt, ist es möglich, in der ersten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens im Fall eines Gemisches von mehr als zwei Zuckern mehrere Zucker in parallel oder nacheinander ablaufenden Teilschritten der ersten Stufe zu oxidieren. Werden die
Teilschritte nacheinander durchgeführt, so ist in einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens nach jedem Teilschritt die Abtrennung der jeweiligen Zuckersäure möglich. Wahlweise können die Zuckersäuren nach der ersten Stufe auch gemeinsam abgetrennt oder alternativ in der Lösung belassen werden.
Für die Abtrennung der organischen Säuren sind einer fachkundigen Person mehrere Verfahren aus dem Stand der Technik bekannt. Diese schließen ein, sind aber nicht limitiert auf Ionenaustauscher-Chromatographie, Elektrodialyse, Kristallisation/Fällung und
Extraktion.
Wie bereits oben erwähnt, kann das die Zucker enthaltende Gemisch aus einem
hemicellulosehaltigen Material gewonnen werden.
Bevorzugt wurde das hemicellulosehaltige Material mittels Aufschluss eines
lignocellulosischen Materials gewonnen. Einer fachkundigen Person sind hierzu
verschiedene chemische, physikalische, mechanische und/oder enzymatische Methoden bekannt. Aufschlussmethoden für lignocellulosehaltiges Material können auch Brodeur et al. (2011) entnommen werden. Eine Methode für den Aufschluss bzw. die Delignifizierung von lignocellulosehaltigem Material kann außerdem beispielsweise WO 2010/124312 A2 (Ertl et al., 2010) entnommen werden.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung schließt„lignocellulosehaltiges Material" insbesondere lignocellulosehaltige Biomasse ein, z.B. einjährige oder mehrjährige Pflanzen oder Teile von einjährigen oder mehrjährigen Pflanzen, wie z.B. Holz, wie beispielsweise Nadelholz oder Laubholz, oder (trockene) Gräser, oder Teile von Gräsern, vorzugsweise Gräser, Stroh, wie z.B. Weizenstroh, Roggenstroh oder Maisstroh, Energiegräser, wie z.B. Rutenhirse, Miscanthus/Chinaschilf, Abaca, Sisal, Bagasse, oder untypische
Lignocellulosesubstrate, wie Maisspindeln, Spelzen, z.B. Deckspelzen, wie Weizenspelzen, Reisspelzen, besonders bevorzugt Stroh, insbesondere Weizenstroh, Bagasse, Energiegräser, insbesondere Elefantengras, Switchgras, und/oder Spelzen, insbesondere Deckspelzen.
Bevorzugt kann das lignocellulosische Material durch Aufschluss mit einem Alkohol, insbesondere mit einem Ci_4 -Alkohol, Wasser und einer Lauge, gewonnen werden. Ein entsprechendes Verfahren ist z.B. aus WO 2010/124312 A2 (Ertl et al, 2010) bekannt.
In einem Verfahren gemäß vorliegender Erfindung sind bei Nennung von Säuren die zugehörigen Salze dieser Säuren mit eingeschlossen und umgekehrt. Weiterhin sind speziell bei der Nennung von enzymatisch erzeugten Zuckersäuren auch die zugehörigen
Zuckersäure-Lactone mit eingeschlossen und umgekehrt. Bei enzymatischer Oxidation von Zuckern zu Zuckersäuren/Zuckersäurelactonen hängt das Verhältnis diese beiden Produkte stark vom verwendeten Zucker und von den Reaktionsbedingungen, wie z.B. von der Reaktionszeit oder v.a. vom pH- Wert ab.
Beispiele: Beispiel 1 : Xylanasebehandlung zur Gewinnung eines Zucker-Gemischs aus Biomasse. Es wurde aus Stroh hergestellte delignifizierte Pulpe eingesetzt. Eine Beschreibung zur Herstellung der Pulpe kann aus WO 2010/124312 A2 (Beispiel 1) entnommen werden. 10 g (Trockengewicht) der Pulpe wurden mit dest. Wasser auf 10 % Stoffdichte resuspendiert und es wurde mit H2S04 der pH- Wert 4.9 eingestellt. Es wurde 1000 μΐ der Xylanase Ecopulp TX800A (Ecopulp Finland Oy) zugegeben und 16 h bei 50°C inkubiert. Es wird eine 1,5- prozentige Zuckerlösung (w/v) erhalten, die hauptsächlich Glucose, Xylose und Arabinose in einem Verhältnis von ca. 2: 10: 1 enthält.
Die folgenden Beispiele 2 bis 5 dienen zur Veranschaulichung der Möglichkeiten der selektiven enzymatischen Oxidation bzw. Reduktion von Zuckern aus einer Zucker- Mischung.
Beispiel 2: Glucose-Oxidation mit einer Glucosedehydro genäse (NADH-Oxidase für Cofaktor-Recvcling) .
Zu einer Zucker-Mischung (ca. 500 μΐ), die Glucose, Xylose und Arabinose (Zucker- Konzentration ca. 1%) enthält, wurde 18,5 mg NaHC03 zugegeben. Danach wurde 30 μΐ Glucosedehydrogenase (Aktivität ca. 300 U/ml), 10 μΐ NADH-Oxidase (Aktivität ca. 1140 U/ml) und 2,5 μΐ NADH (Konzentration 100 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei 25 °C ca. 17 Stunden inkubiert. Es wurde 86% der Glucose zu Gluconsäure umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde durch einen starken Ionenaustauscher (Amberlyst A-26(OH), Alfa Aesar) geleitet. Dadurch wurde die entstandene Gluconsäure vollständig von der Mischung abgetrennt.
Beispiel 3: Arabinose-Oxidation mit einer Arabinosedehydro genäse (NADH-Oxidase für Cofaktor-Recvcling) .
Zu einer Zucker-Mischung (ca. 500 μΐ), die Glucose, Xylose und Arabinose (Zucker- Konzentration ca. 1%) enthält, wurde 6,2 mg NaHC03 zugegeben. Danach wurde 30 μΐ Arabinosedehydrogenase (Aktivität ca. 300 U/ml), 20 μΐ NADH-Oxidase (Aktivität ca. 1140 U/ml) und 2,5 μΐ NADH (Konzentration 100 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei 25 °C ca. 17 Stunden inkubiert. Es wurde 100% der Arabinose zu Arabonsäure umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde durch einen starken Ionenaustauscher (Amberlyst A-26(OH), Alfa Aesar) geleitet. Dadurch wurde die entstandene Arabonsäure vollständig von der Zucker-Mischung abgetrennt. Beispiel 4. Arabinose-Oxidation mit einer Arabmosedehydrogenase (Xylosereduktase für Cofaktor-Recycling) .
Zu einer Zucker-Mischung (ca. 500 μΐ), die Xylose und Arabinose (Xylose ca. 10%, Arabinose ca. 1%) enthält, wurde 16,9 mg NaHC03 zugegeben. Danach wurde 30 μΐ Arabmosedehydrogenase (Aktivität ca. 300 U/ml), 30 μΐ Xylosereduktase (Aktivität ca. 103 U/ml) und 2,5 μΐ NADH (Konzentration 100 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei 30°C ca. 20 Minuten inkubiert. Es wurde 100% der Arabinose zu Arabonsäure umgesetzt. Dabei wurde 10% der in der Mischung enthaltenen Xylose zu Xylitol umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde durch einen starken Ionenaustauscher (Amberlyst A-26(OH), Alfa Aesar) geleitet. Dadurch wurde die entstandene Arabonsäure vollständig von der Zucker- Mischung abgetrennt.
Beispiel 5. Arabinose-Oxidation mit einer Arabmosedehydrogenase (Xylosereduktase für Cofaktor-Recycling), Xylose-Reduktion mit einer Xylosereduktase (Alkoholdehydrogenase für Cofaktor-Recycling).
Eine aus Biomasse erhaltene Zuckerlösung (= Xylan-Hydrolysat) wurde durch Eindampfen auf eine Zuckerkonzentration von ca. 63 g/1 D-Xylose und 7 g/1 L- Arabinose aufkonzentriert und es wurde mit NaOH pH=8.0 eingestellt. Zu 80 ml dieser Lösung wurden 2,5 ml 500 mM Tris-HCl-Puffer pH=8.0, 200 U Xylose-Reduktase und 160 U Arabinose-Dehydrogenase zugegeben. Die Lösung wurde in einem 200 ml Rundkolben bei 35°C (Wasserbad) mit einem Magnetrührer (200 rpm) für 20 min gerührt. Die Arabinose ist vollständig
umgewandelt worden und die Lösung enthielt nun ca. 56 g/1 D-Xylose, ca. 7 g/1 Xylitol und ca. 7 g/1 L-Arabino-l,4-lacton/L-Arabonsäure.
In diesem Beispiel war der eingesetzte Cofaktor bereits zur Genüge in den eingesetzten Enzym-Lysaten vorhanden und musste nicht separat zugegeben werden.
Beispiel 6. Umsetzung einer Mischung aus Xylose und Arabinose (erfindungsgemäß)
Zu einer Zucker-Mischung (ca. 500 μΐ), die Xylose und Arabinose (Xylose ca. 10%>, Arabinose ca. 1%) enthält, wurde 16,9 mg NaHC03 zugegeben. Danach wurde 30 μΐ Arabmosedehydrogenase (Aktivität ca. 300 U/ml mit Arabinose; das Enzym weist auch eine gewisse Aktivität als Xylose-Dehydrogenase auf), 30 μΐ Xylosereduktase (Aktivität ca. 103 U/ml) und 2,5 μΐ NADH (Konzentration 100 mM) zugegeben. Die Mischung wurde bei 30°C ca. 72 Stunden inkubiert. Es wurde 100% der Arabinose zu Arabonsäure, 45% der Xylose zu Xylonsäure und 55% der Xylose zu Xylitol umgesetzt. Die erhaltene Lösung wurde durch einen starken Ionenaustauscher (Amberlyst A-26(OH), Alfa Aesar) geleitet. Dadurch wurde die entstandene Arabonsäure und Xylonsäure vollständig von der Mischung abgetrennt.
Dieses Beispiel demonstriert ein zumindest teilweise paralleles Ablaufen der ersten Stufe und der zweiten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens: Die erste Stufe ist die Oxidation der Arabinose und Reduktion eines äquimolaren Teils der Xylose. Die zweite Stufe, die zumindest teilweise parallel dazu abläuft, umfasst die Oxidation der Hälfte der nicht umgesetzten Xylose mittels Aktivität der Arabinosedehydrogenase und Reduktion der anderen Hälfte der verbleibenden Xylose.
Beispiel 7. Umsetzung einer Mischung aus Xylose und Glucose (erfindungsgemäß):
Der Reaktionsansatz umfasste die folgenden Komponenten: 364 μΐ dH20, 2.5 μΐ NADPH- Lösung (100 mM), 10 μΐ D-Glucose-Lösung (50 % w/v), 100 μΐ D-Xylose-Lösung (50 % w/v), 5 μΐ Glucose-Dehydrogenase (300 U/ml, gemessen mit Glucose), 19 μΐ Xylose- Reduktase (160 U/ml), und 5.6 mg CaC03. Die verwendete Glucose-Dehydrogenase weist auch eine gewisse Xylose-Dehydrogenase-Aktivität auf. Die Reaktion wurde bei 35°C leicht geschüttelt, und es wurden zu verschiedenen Zeitpunkten Proben entnommen. Mittels GC/MS wurde der Gehalt von Zuckern sowie der Reaktionsprodukte bestimmt.
Nach 1 h war die Glucose großteils zu Gluconsäure umgesetzt. Ebenfalls ist zu diesem Zeitpunkt ein kleiner Teil der eingesetzten Xylose (ca. 10 %) zu Xylonsäure oxidiert worden. Stöchiometrisch zu den gebildeten Zuckersäuren ist nach 1 h Xylose zu Xylitol reduziert worden. Ungefähre Zusammensetzung der Reaktion nach 1 h: 10 mg/ml
Gluconsäure, 10 mg/ml Xylonsäure, 20 mg/ml Xylitol, 70 mg/ml Xylose.
Nach 6 h war die Xylose zu ca. 90 % umgesetzt. Dabei wurden im Vergleich zum Zeitpunkt 1 h stöchiometrisch die Produkte Xylonsäure und Xylitol gebildet. Ungefähre
Zusammensetzung der Reaktion nach 6 h: 10 mg/ml Gluconsäure, 40 mg/ml Xylonsäure, 50 mg/ml Xylitol, 10 mg/ml Xylose.
Beispiel 8. Analytik der Reaktionen mittels GC/MS
Für die Analytik der Oxidationsreaktionen an der GC/MS wurden Substrate und Produkte derivatisiert. 4 μΐ der Proben wurden dazu in ein Glas-Vial überführt und in der Speedvac getrocknet. Zum Derivatisieren wurden dann 150 μΐ Pyridin und 50 μΐ einer 99: 1-Mischung aus N,0-Bis(trimethylsilyl)trifiuoroacetamid und Trimethylchlorosilan zugegeben. Die Derivatisierung erfolgte für 16 h bei 60°C. Die Proben wurden anschließend über GC-MS analysiert. Die Proben wurden dabei über die Trennsäule HP-5ms (5 %-Phenyl)- methylpolysiloxan im Gaschromatograph aufgetrennt und dem Massenspektrometer GCMS QP2010 Plus von Shimadzu analysiert.
Nicht-Patentliteratur :
Berrocal A., Baezal J., Rodriguez J., Espinosa M., and Freer J. (2004) Effect of tree age on Variation of Pinus radiate D. Don. chemical composition. J. Chil. Chem. Soc. 49(3), 251-256 (http://www.scielo.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0717-97072004000300012 , abgerufen am 10. Juni 2016)
Brodeur, G., Yau, E., Badal, K., Collier, J., Ramachandran, K., and Ramakrishnan, S.
(201 1). Chemical and Physicochemical Pretreatment of Lignocellulosic Biomass: A Review.
Enzyme Research 201 1.
Buchert J., Puls J., and Poutanen K. (1988). Comparison of Pseudomonas fragi and
Gluconobacter oxydans for production of xylonic acid from hemicellulose hydrolysates. Applied and Environmental Microbiology 28, 367-372.
Johnsen, U., Dambeck, M., Zaiss, H., Fuhrer, T., Soppa, J., Sauer, U., and Schönheit, P. (2009). d-Xylose Degradation Pathway in the Halophilic Archaeon Haloferax volcanii. Journal of Biological Chemistry 284, 27290-27303.
Ko, B., Kim, J., and Kim, J. (2006). Production of Xylitol from D-Xylose by a Xylitol Dehydrogenase Gene-Disrupted Mutant of Candida tropicalis. Applied and Environmental Microbiology 72, 4207-4213.
Nidetzky, B., Neuhauser, W., Haltrich, D., and Kulbe, K. (1996). Continuous enzymatic production of xylitol with simultaneous coenzyme regeneration in a charged membrane reactor. Biotechnology and Bioengineering 52, 387-396.
Stephens, C, Christen, B., Fuchs, T., Sundaram, V., Watanabe, K., and Jenal, U. (2006). Genetic Analysis of a Novel Pathway for D-Xylose Metabolism in Caulobacter crescentus. Journal of Bacteriology 189, 2181-2185.
Toivari, M., Nygärd, Y., Penttilä, M., Ruohonen, L., and Wiebe, M. (2012a). Microbial d- xylonate production. Applied Microbiology and Biotechnology 96, 1-8.
Toivari, M., Nygärd, Y., Kumpula, E.-P., Vehkomäki, M.-L., Bencina, M., Valkonen, M., Maaheimo, H., Andberg, M., Koivula, A., Ruohonen, L., et al. (2012b). Metabolie engineering of Saccharomyces cerevisiae for bioconversion of d-xylose to d-xylonate. Metabolie Engineering 14.
Watanabe, S., Shimada, N., Tajima, K., Kodaki, T., and Makino, K. (2006). Identification and Characterization of 1-Arabonate Dehydratase, l-2-Keto-3-deoxyarabonate Dehydratase, and 1-Arabinolactonase Involved in an Alternative Pathway of 1-Arabinose Metabolism NOVEL EVOLUTIONÄR Y INSIGHT INTO SUGAR METABOLISM. Journal of Biological Chemistry 281, 33521-33536.
Zhang, Y., Gao, F., Zhang, S.-P., Su, Z.-G., Ma, G.-H., and Wang, P. (2011). Simultaneous produetion of 1,3-dihydroxyacetone and xylitol from glycerol and xylose using a nanoparticle-supported multi-enzyme System with in situ cofactor regeneration. Bioresource Technology 102, 1837-1843.

Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Gewinnung von n+a Oxidations- und Reduktionsprodukten aus einem Gemisch von n Zuckern ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus C5- und C6- Zuckern,
wobei n zumindest 2 und a zumindest 1 ist,
wobei zumindest zwei der Zucker in der Mischung in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegen,
wobei in einer ersten Stufe zumindest einer der in einem nicht äquimolaren
Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch oxidiert wird und gleichzeitig zumindest einer der anderen der in einem nicht äquimolaren Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker enzymatisch reduziert wird und
wobei in der ersten Stufe ein Teil zumindest einer der in einem nicht äquimolaren
Verhältnis zueinander vorliegenden Zucker nicht umgesetzt wird,
dadurch gekennzeichnet, dass in zumindest einer zweiten Stufe zumindest ein Teil des in der ersten Stufe nicht umgesetzten Zuckers je zur Hälfte enzymatisch oxidiert wird und zur verbleibenden Hälfte enzymatisch reduziert wird.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Oxidationsprodukte Zuckersäuren bzw. Zuckersäurelactone und als Reduktionsprodukte Zuckeralkohole erhalten werden.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch von Zuckern Xylose und Arabinose enthält, wobei Xylose im Überschuss vorliegt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass in der ersten Stufe Arabinose zu Arabonsäure bzw. zum Arabonsäurelacton oxidiert sowie ein Teil der Xylose zu Xylitol reduziert wird und in der zweiten Stufe die nicht umgesetzte Xylose ganz oder teilweise je zur Hälfte zu Xylonsäure oder zum Xylonolacton oxidiert wird und die verbleibende Hälfte zum Xylitol reduziert wird.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass entstandene Arabonsäure und/oder entstandene Xylonsäure zu a-Ketoglutarsäure weiterverarbeitet wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 3 bis 5 dadurch gekennzeichnet, dass die Mischung zusätzlich Glucose enthält.
7. Verfahren gemäß einem Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Gemisch Glucose im Überschuss zu dem/den anderen vorhandenen Zucker(n) enthält und aus der Glucose zumindest zum Teil Sorbitol gewonnen wird.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zumindest in einer der beiden Stufen, bevorzugt zumindest in der zweiten Stufe, besonders bevorzugt sowohl in der ersten als auch in der zweiten Stufe mindestens ein Redoxcofaktor und mindestens ein von diesem Redoxcofaktor abhängiges Enzym in der Reaktionsmischung vorhanden ist.
9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass der/die
Redoxcofaktor(en) durch parallel ablaufende enzymatische Reaktionen regeneriert wird/werden, bevorzugt sowohl in der ersten als auch in der zweiten Stufe.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass erste und zweite Stufe in einer Eintopfreaktion durchgeführt werden.
11. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Stufen zumindest teilweise zeitgleich verlaufen.
12. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Entfernung von anfallenden Zuckersäuren aus dem Gemisch.
13. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das die Zucker enthaltende Gemisch aus einem hemicellulosehaltigen Material gewonnen wurde.
14. Verfahren gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das
hemicellulosehaltige Material mittels Aufschluss eines lignocellulosischen Materials gewonnen wurde.
15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das lignocellulosische Material ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Stroh, insbesondere Weizenstroh, Bagasse, Energiegräser, insbesondere Elefantengras, Switchgras, und/oder Spelzen, insbesondere Deckspelzen, ist. Verfahren gemäß Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass das lignocellulosische Material durch Aufschluss mit einem Alkohol, insbesondere mit einem Ci_4 -Alkohol, Wasser und einer Lauge, gewonnen wurde.
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Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107849589A (zh) * 2015-07-24 2018-03-27 安尼基有限责任公司 用于酶促制备混合糖的氧化产物和还原产物的方法
EP3464606A1 (de) * 2016-05-23 2019-04-10 Annikki GmbH Verfahren zur enzymatischen umwandlung von d-glucose in d-fructose via d-sorbitol
WO2019008131A1 (en) * 2017-07-06 2019-01-10 Consejo Superior De Investigaciones Científicas PSEUDOMONAS PUTIDA RECOMBINANT FOR THE PRODUCTION OF D-XYLONATE FROM D-XYLOSE

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2351500A (en) 1941-02-06 1944-06-13 Claude R Wickard Process for gluconic acid production
US2651592A (en) 1950-08-15 1953-09-08 Ben L Sarett Enzymatic process for producing gluconic acid
US3619396A (en) 1969-01-29 1971-11-09 Cpc International Inc Enzymatic production of gluconic acid
DE2214442C3 (de) 1972-03-24 1981-09-10 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Verfahren zur Überführung von Glucose in Gluconsäure
US5897995A (en) 1995-05-12 1999-04-27 Gist-Brocades, B.V. Enzymatic production of gluconic acid or its salts
AU2387200A (en) 1999-01-14 2000-08-01 Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College, The Process for the separation of sugars
CA2454823A1 (en) 2001-07-24 2003-02-06 Arkenol, Inc. Separation of xylose and glucose
FI20020592A (fi) 2002-03-27 2003-09-28 Danisco Sweeteners Oy Menetelmä sokereiden, sokerialkoholien, hiilihydraattien ja niiden seosten erottamiseksi niitä sisältävistä liuoksista
WO2005068642A2 (en) 2003-10-01 2005-07-28 Board Of Trustees Operating Michigan State University Bacterial synthesis of 1,2,4-butanetriol enantiomers
US7498430B2 (en) 2004-11-09 2009-03-03 Board Of Trustees Of Michigan State University Process for the preparation and separation of arabinose and xylose from a mixture of saccharides
FI20095278A0 (fi) 2009-03-18 2009-03-18 Valtion Teknillinen Ksylonihapon valmistus
TW201114906A (en) 2009-04-30 2011-05-01 Annikki Gmbh Process for the production of carbohydrate cleavage products from a lignocellulosic material
WO2011133536A1 (en) 2010-04-19 2011-10-27 The University Of Toledo Aldose-ketose transformation for separation and/or chemical conversion of c6 and c5 sugars from biomass materials
GB201116971D0 (en) * 2011-10-03 2011-11-16 Isis Innovation Cofactor regeneration system
TW201343623A (zh) * 2012-02-07 2013-11-01 Annikki Gmbh 使氧化還原輔因子經酶催化再生之方法
AT513562A1 (de) * 2012-11-14 2014-05-15 Annikki Gmbh Verfahren zur Gewinnung von Zuckerderivaten
CA2907576C (en) * 2013-03-27 2021-05-04 Annikki Gmbh Method for isomerisation of glucose
CN104611476B (zh) * 2013-11-04 2018-04-27 南京工业大学 一种木糖与阿拉伯糖分离的方法
CN107849589A (zh) * 2015-07-24 2018-03-27 安尼基有限责任公司 用于酶促制备混合糖的氧化产物和还原产物的方法

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