WO2024084032A1 - Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend ein alkalisalz der glycolsäure und der milchsäure - Google Patents

Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend ein alkalisalz der glycolsäure und der milchsäure Download PDF

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WO2024084032A1
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glycolic acid
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dehydratase
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Nicole STAUNIG
Maria Dupont
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Annikki Gmbh
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    • C12Y402/01—Hydro-lyases (4.2.1)
    • C12Y402/01009—Dihydroxy-acid dehydratase (4.2.1.9), i.e. acetohydroxyacid dehydratase

Definitions

  • the invention relates to a process for producing an aqueous solution containing an alkali salt of glycolic acid and lactic acid.
  • Such solutions are used in the cosmetics industry as a basis for skin peeling products.
  • the invention is a carbon-economical enzymatic process for producing chemicals from renewable carbon sources.
  • it is the atom-economical production of Al potassium glycolate and alkali lactate by means of an enzymatic process in which D-xylonate and L-arabonate, the Ci oxidation products of the pentoses D-xylose and L-arabinose, are converted to the Cj building block glycolic acid (glycolate) and the Ca building block lactic acid (lactate).
  • D-xylose is used interchangeably with xylose
  • L-arabinose is used interchangeably with arabinose
  • L-arabonate is used interchangeably with arabonate and arabonic acid
  • D-xylonate is used interchangeably with xylonate and xylonic acid
  • glycolate is used interchangeably with glycolic acid
  • lactate is used interchangeably with lactic acid
  • glucose is used interchangeably with D-glucose.
  • glycolic acid also occurs naturally, for example in cane and beet sugar, its synthesis is currently carried out mainly from fossil fuels due to the low concentrations of the substance in these renewable raw materials. Since the glycolic acid synthesized in this way often still contains residues of formaldehyde, which is considered problematic especially when used in cosmetic products (e.g. in skin peelings (Sharad, 2013)), there is a need for alternative synthesis methods.
  • Chemo-enzymatic methods for glycolic acid production include the conversion of glycolonitrile synthesized from formaldehyde and hydrogen cyanide to glycolic acid using nitrilases (Panova et al., 2008; Ben-Bassat et al., 2008). This process cannot be described as sustainable due to the toxic, energy-intensive chemicals used, which are generally derived from fossil sources.
  • Another method is the conversion of ethylene glycol to glycolic acid using a microbial whole-cell biocatalyst (Gao et al., 2014). In this second case, the starting material is also generally produced chemically, which is energy-intensive.
  • a chemical process for producing glycolic acid that uses a renewable raw material as a starting material is the conversion of glyoxal obtained from bio-oil to glycolic acid in the presence of zeolite as a catalyst (Dapsens et al., 2014).
  • Bio-oil is obtained by pyrolysis of biomass - an energy-intensive process in which the original composition of the biomass is destroyed and the synthetic potential of the raw material remains unused.
  • the fermentative production of glycolic acid from glucose via the glyoxylate shunt using metabolic engineering in recombinant E. coli strains is known (WO 2007/141316A2, WO 2007/140816A1, WO 2010/108909A1, WO 2011/036213A2).
  • the fermentative production of 31.3 g/l glycolic acid in the fermentation supernatant was achieved with yields of 0.22 g glycolic acid per gram glucose (WO 2007/141316A2).
  • WO 2011/036213A2 then describes a further optimized fermentation process of the system, which achieves 53.9 g/l glycolic acid with a yield of 0.36 g glycolic acid per gram glucose within 40 h through adapted process control.
  • existing fermentative systems generally accept the loss of at least one carbon per sugar monomer and achieve only low final product concentrations in sugar mixtures.
  • alcohol dehydrogenases are used to produce high-quality chiral alcohols, whereby the cofactor NAD is regenerated, for example, by adding glucose and glucose dehydrogenase (Goldberg et al., 2007).
  • glucose or formate dehydrogenases (GDHs or FDHs) and alcohol dehydrogenases (ADHs) are used for recycling the cofactor (Schrittwieser et al., 2018).
  • EP2700714A1, US8859247B2 and EP2204453B1 describe a portfolio of cascade reactions in which glucose is converted to two molecules of pyruvate in a cascade of five enzymatic conversions. Starting from glucose, the cascade follows the non-phosphorylating Entner-Doudoroff pathway to D-glyceraldehyde and pyruvate (sugar oxidation, dehydration and aldol cleavage). D-glyceraldehyde is then further oxidized to D-glycerate and then dehydrated to pyruvate.
  • the enzymes in the cascade include a glucose dehydrogenase, a promiscuous dihydroxy acid dehydratase (catalyzes dehydration of gluconate and D-glycerate), a 2-keto-3-deoxygluconate aldolase and an aldehyde dehydrogenase. If a promiscuous dehydrogenase is used, which accepts both glucose and D-glyceraldehyde as substrate, the system can be minimized to three enzymes.
  • Xylose is first oxidized to 1,4-xylonolactone, which is opened to xylonate under the action of a lactonase.
  • a dehydratase converts xylonate to 2-keto-3-deoxy-xylonate, which is split by an aldolase into pyruvate and glycolaldehyde.
  • arabinose can also be converted via this pathway thanks to promiscuous enzymes in the pathway (Kopp et al., 2020).
  • Pyruvate is a central intermediate in cellular metabolism and serves, for example, as a precursor to the amino acid alanine or to acetyl-CoA, which is involved in the citric acid cycle. Reduction of pyruvate produces lactic acid or lactate, which has a wide range of applications. Lactic acid is used, for example, as an acidifier in the food industry, as a decalcifying agent, pH regulator or cleaning agent in the chemical industry, as an additive in anti-acne creams or moisturizers in the cosmetics industry and as a precursor for acrylic acid or ethyl lactate (Wee et al., 2006). In addition, lactic acid (like glycolic acid) can also be used for skin peeling (chemical peeling) (Smith, 1996). The bifunctional lactic acid can also be polymerized to produce polylactide (PLA), a biodegradable and biocompatible plastic that has applications in the packaging industry, textile industry, electronics and medicine ( Bal la et al., 2021).
  • PLA poly
  • Boer et al. presented an in vitro variant of the Dahms pathway using purified enzyme isolates, in which xylose or xylonolactone (1 mM substrate concentration) is converted to ethylene glycol (reduction of glycolaldehyde), glycolic acid (oxidation of glycolaldehyde) or lactate (reduction of pyruvate).
  • the main focus of the study was the application of a spectrophotometric assay to evaluate the efficiency of the cascade, which is based on the formation or consumption of NADH. For this purpose, 2 mM NAD external cofactor was added.
  • lactonase from Caulobacter crescentus
  • glycolic acid can be obtained in addition to lactic acid from the pentose xylose by fermentation in a metabolically engineered eukaryotic system (S. cerevisiae).
  • S. cerevisiae a metabolically engineered eukaryotic system
  • the product concentrations achieved are far below the theoretical yield.
  • glucose (10 g/l) and xylose (20 g/l) with a fermentation time of 2 days only 0.927 g/l lactic acid and 0.696 g/l glycolic acid are obtained; the concentrations achieved from fermentations of pure sugar are even lower.
  • This aim is achieved by a process in which an alkali salt of xylonic acid and/or arabonic acid in an aqueous solution is treated in vitro with an enzyme system containing a dehydratase, an aldolase, a glycolaldehyde dehydrogenase, a lactate dehydrogenase and NAD + as a cofactor, after which the enzyme system is separated.
  • an enzyme system containing a dehydratase, an aldolase, a glycolaldehyde dehydrogenase, a lactate dehydrogenase and NAD + as a cofactor
  • enzyme system refers to the totality of the four enzymes, i.e. dehydratase, aldolase, glycolaldehyde dehydrogenase, lactate dehydrogenase and NAD + as a cofactor. These four enzymes together with the cofactor can, for example, be added as such (enzyme isolates) to the aqueous solution. However, it is also possible to suspend cells that express the specified enzymes in the aqueous solution. In this case, the term “enzyme system” refers to a cell suspension. The term “enzyme system” also refers to a homogenate that can be obtained from the cell suspension by exposing the cells to ultrasound, for example, to cause them to burst. The term “enzyme system” also refers to lysates that are obtained from the homogenates by separating the solid cell components. Finally, the term “enzyme system” also refers to enzymes when they are immobilized in or on a matrix.
  • a great advantage of the process according to the invention is that the conversion can also be carried out under non-physiological conditions, such as high substrate concentrations, i.e. at concentrations under which a fermentative process cannot operate.
  • Another great advantage of the process according to the invention is that it can be carried out at low NAD + concentrations because this is intrinsically regenerated in the process.
  • the intrinsic regeneration is possible because the formation of the glycolate from the glycolaldehyde is an oxidation which consumes NAD + to form NADH, while the formation of the lactate from the pyruvate is a reduction which consumes NADH, thereby regenerating the NAD + .
  • This intrinsic regeneration is a decisive advantage due to the high price of NAD + and allows the process to be carried out on an industrial scale.
  • the enzymes forming the enzyme system are present in a suspension, in the homogenate and/or in the lysate of the corresponding cells forming them. It has been shown that when using suspensions, lysates and/or homogenates, the cofactor of the dehydrogenases does not have to be added separately because the small amounts of cofactor present in the suspension, in the lysate and/or in the homogenate are already sufficient to allow the last step of oxidation and reduction to take place due to the intrinsic regeneration of NAD + .
  • the system does not require the addition of an organic cosubstrate, which would impair energy and carbon efficiency and complicate downstream processing.
  • the process according to the invention thus extends the core reactions of the Dahms pathway, namely dehydration and aldol cleavage, to a self-contained Redox system which, with the help of the same cofactor pair (NAD + /NADH), oxidizes glycolaldehyde to glycolic acid and reduces pyruvate to lactate.
  • suspension means a suspension of resting cells. These are harvested after cultivation (separated from the nutrient medium) and suspended in a suitable buffer system. In contrast to fermentative processes, which also work with whole cells, the resting cells can no longer grow due to the removal of carbon sources and nutrients, but only serve to convert substrates (Lin & Tao, 2017).
  • Homogenate in this context means a physically and/or chemically treated suspension (e.g. treated by pressure, lysozyme or ultrasound), whereby the cell components are released from the cells. A lysate is obtained when the insoluble cell components of the homogenate are removed, for example by filtration or centrifugation (see Production Enzymes for details).
  • a potassium salt is used as the alkali salt.
  • the concentration of the alkali salt of xylonic acid and/or arabonic acid in the aqueous solution is 50 - 300 g/l, 100 - 200 g/l and finally 150 - 250 g/l.
  • the process according to the invention is carried out at a temperature between 20 and 50 °C, between 25 and 40 °C and even more preferably between 30 and 40 °C.
  • the most preferred pH range of the reaction is between 7.5 and 8.5.
  • all reaction steps of the process as well as the regeneration of the cofactors take place in a single reaction vessel (one-pot reaction), i.e. the costly isolation of the intermediates is avoided.
  • all enzymes are used at the beginning of the reaction.
  • the present invention is also based on the surprising finding that the yield of glycolate, for example, is higher when lactate is simultaneously formed by using lactate dehydrogenase, compared to the sole production of glycolate (and vice versa, see Example 5 below).
  • the dehydratase used in the process can be selected from one of the groups EC 4.2.1.5 (arabonate dehydratase), 4.2.1.6 (galactonate dehydratase), 4.2.1.7 (altronate dehydratase), 4.2.1.8 (mannonate dehydratase), 4.2.1.9 (dihydroxy acid dehydratase), 4.2.1.25 (L-arabonate dehydratase), 4.2.1.39 (gluconate dehydratase), 4.2.1.40 (glucarate dehydratase), 4.2.1.42 (galactarate dehydratase), 4.2.1.67 (ü-fuconate dehydratase), 4.2.1.68 (L-fuconate dehydratase), 4.2.1.82 (xylonate dehydratase), 4.2.1.140 (gluconate/galactonate dehydratase), 4.2.1.146 (L-galactonate dehydratase), 4.2.1.156 (L-talarate Dehydratase), 4.2.1.
  • the aldolase used in the process can be selected from one of the groups EC 4.1.2.18 (2-dehydro-3-deoxy-L- pentonate aldolase), 4.1.2.20 (2-dehydro-3-deoxyglucarate aldolase), 4.1.2.21 (2-dehydro-3-deoxy-6-phosphogalactonate aldolase), 4.1.2.28 (2-dehydro-3-deoxy-D-pentonate aldolase), 4.1.2.29 (5-dehydro- 2-deoxyphosphogluconate aldolase), 4.1.2.51 (2-dehydro-3-deoxy-D-gluconate aldolase), 4.1.2.52 (4-hydroxy-2-oxoheptandioate aldolase), 4.1.2.53 (2-keto-3-deoxy-L-rhamnonate aldolase), 4.1.2.54 (L-threo-3-deoxy-hexylosonate aldolase), 4.1.2.55 (2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate/2-de
  • the dehydrogenase used to reduce pyruvate to lactate preferably comes from groups EC 1.1.1.27 (L-lactate dehydrogenase).
  • the dehydrogenase used for the oxidation of glycolaldehyde to glycolic acid preferably comes from group EC 1.2.1.21 (glycolaldehyde dehydrogenase).
  • the enzymatic strategy presented here minimizes the number of enzymes and thus allows a highly efficient and cost-effective/price-competitive bioproduction process.
  • 2-Keto-3-deoxyxylonic acid lithium salt, sodium pyruvate, sodium L-lactate and glycolaldehyde dimer, IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranoside) and HEPES (2-(4-(2-hydroxyethyl)-l-piperazinyl)-ethanesulfonic acid) were purchased from Sigma-Aldrich, magnesium chloride hexahydrate, potassium dihydrogen phosphate, di-potassium hydrogen phosphate, NAD + , NADH disodium salt and sodium dodecyl sulfate (SDS) were purchased from Carl Roth, lysozyme and methanol were purchased from PanReac AppliChem (ITW Reagents), triethanolamine was purchased from Chem-Lab NV and sodium glycolate was purchased from Alfa Aesar. Potassium L-arabonate and potassium D-xylonate were prepared from the corresponding sugars according to literature procedure (Moore & Link
  • the gene to be expressed was first amplified in a PCR using the genomic DNA or its synthetic equivalent adapted to the codon usage of E. coli as a template together with specific oligonucleotides that additionally carry recognition sequences for restriction endonucleases and isolated from the reaction mixture. After nucleic acid digestion with the restriction enzymes Sphl and Hind II I, the gene fragment coding for the target enzyme was ligated into the backbone of the expression vector pQE70-Kan cut with Sphl and HindIII. The ligation product is transformed into chemically competent E. coli cells ToplOF and the resulting colonies were used for plasmid isolation and restriction analysis. The result of the cloning step was verified by restriction enzyme digestion and DNA sequencing. The resulting construct carries the target gene under the IPTG-inducible T5 promoter.
  • the resulting expression plasmid was transformed into the competent expression cells RB791. After 24 h of incubation at 37 °C, the resulting colonies were inoculated into LB medium for expression tests.
  • the cell pellets produced according to the above procedure were weighed in a suitable container, mixed with buffer (see Table 1 for buffer systems used) and dissolved in an ice bath while stirring.
  • the mass fraction of biomass was usually 20%, the rest was made up of the buffer.
  • Lysozyme was added to the cell suspension prepared above in an amount of 0.5 mg/ml.
  • a Branson Sonifier 450 was used to disrupt the cells.
  • the suspension was transferred to a 5 ml Eppendorf vial.
  • the homogenate prepared above was centrifuged for 10 min at 4 °C and 16000 rpm (Eppendorf centrifuge 5417R) to separate the insoluble cell fragments and obtain the lysate.
  • Substrate conversions and product concentrations were determined by HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography).
  • HPAEC High Performance Anion Exchange Chromatography
  • a Dionex ICS6000 system with AS-AP autosampler was used for this purpose.
  • the organic acids and their anions were measured using conductivity detection (CD) coupled to a Dionex AERS 500 electrolytically regenerated suppressor in external water mode.
  • CD conductivity detection
  • a Dionex lonPac ASll-HC-4pm column with a corresponding pre-column and a NaOH gradient was used to separate the analytes.
  • the mobile phase was also pretreated with a Dionex ATC Anion Trap Column.
  • HPLC High Performance Liquid Chromatography
  • Detection is carried out using a refractive index detector.
  • a Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) column with a corresponding pre-column was used for the measurement and eluted isocratically with 1 mM sulfuric acid.
  • Enzyme activities in the homogenates or lysates were determined using a Shimadzu UV-1900 spectrophotometer. The formation or consumption of NADH was monitored at a wavelength of 340 nm via the change in absorption. The measurements were carried out with 0.2 mM cofactor (NAD + or NADH). For this purpose, 20 ⁇ l of a 10 mM stock solution of the cofactor was placed in a cuvette (Greiner bio-one semi-micro cuvette made of polystyrene) and the desired pH value was adjusted with 100 mM TEA-HCl buffer (870 ⁇ l).
  • the glycolate and lactate-containing aqueous solution obtained according to the invention is prepared by denaturing the cell components after completion of the reaction (e.g. by the action of Heat) and subsequent filtration or centrifugation. Membrane filtration can also be carried out to remove smaller cell components. The filtrate obtained in this way can then be concentrated using a rotary evaporator, for example.
  • the following components were placed in two 2 ml Eppendorf vials (vial 1 and vial 2): 100 ⁇ l of a 2000 mM TEA-HCl buffer (pH 8.5), 200 ⁇ l of deionized water, 40 ⁇ l of dehydratase lysate, 40 ⁇ l of aldolase lysate, 2 U of glycolaldehyde dehydrogenase lysate and 2 U of lactate dehydrogenase lysate.
  • the reactions were started by adding 100 ⁇ l of a solution of potassium xylonate and potassium arabonate to both Eppendorf vials.
  • the solution for vial 1 contained 9 parts potassium xylonate (225.7 g/l) and one part potassium arabonate (25.0 g/l), the solution for vial 2 contained 2 parts potassium xylonate (166.3 g/l) and one part potassium arabonate (84.0 g/l).
  • the mixtures were incubated for a total of 48 h at 30 °C with continuous shaking (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). The total volume of the mixtures was 500 pl each.
  • the enzyme system can convert different mixing ratios of xylonate and arabonate with similar efficiency. This is relevant because the corresponding pentoses (xylose and arabinose) can be released from biomass where they occur in different ratios. They can thus be oxidized without prior separation and the resulting mixtures of sugar acids can be converted directly by the enzyme system to glycolate and lactate.
  • the following components were placed in a 2 ml Eppendorf vial: 100 ⁇ l of a 2000 mM TEA-HCl buffer (pH 8.5), 200 ⁇ l of deionized water, 40 ⁇ l of a dehydratase formulation (see the tables below for details), 40 ⁇ l of an aldolase formulation (see the tables below for details), 2 U of a glycolaldehyde dehydrogenase formulation and 2 U of lactate dehydrogenase lysate.
  • the reaction was started by adding 100 ⁇ l of a solution of 9 parts potassium xylonate (225.7 g/l) and one part potassium arabonate (25.0 g/l). The mixture was incubated for a total of 48 h at 30 °C with continuous shaking (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). The total volume was 500 ⁇ l.
  • the following components were placed in a 2 ml Eppendorf vial (vial 1): 100 ⁇ l of a 2000 mM TEA-HCl buffer (pH 8.5), 200 ⁇ l deionized water, 40 ⁇ l dehydratase lysate, 40 ⁇ l aldolase lysate, 2 U glycolaldehyde dehydrogenase lysate and 2 U lactate dehydrogenase lysate.
  • a similar mixture was placed in a second 2 ml Eppendorf vial (vial 2), but with 10 ⁇ l of a 10 mM NAD + solution and 190 instead of 200 ⁇ l deionized water.
  • the reactions were started by adding 100 ⁇ l of a solution of 9 parts potassium xylonate (225.7 g/l) and one part potassium arabonate (25.0 g/l) to both Eppendorf vials. The mixtures were incubated for a total of 48 h at 30 °C with continuous shaking (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). The total volume of the mixtures was 500 pl each.
  • the following components were placed in a 2 ml Eppendorf vial: 150 ⁇ l of a 2000 mM TEA-HCl buffer (pH 8.5), 90 ⁇ l deionized water, 60 ⁇ l dehydratase lysate, 60 ⁇ l aldolase lysate, 4 U glycolaldehyde dehydrogenase lysate and 4 U lactate dehydrogenase lysate.
  • the reaction was started by adding 100 ⁇ l of a solution of 9 parts potassium xylonate (450.1 g/l) and one part potassium arabonate (51.7 g/l). The mixture was incubated for a total of 48 hours at 30 °C with continuous shaking (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). The total volume of the mixture was 500 ⁇ l.
  • the reactions were started by adding 100 ⁇ l of a substrate solution (50 mM sodium pyruvate and 50 mM glycolaldehyde in deionized water). The mixtures were incubated for 1 h at 30 °C and 1200 rpm in an Eppendorf Thermomixer. The total volume of the mixtures was 500 ⁇ l each.
  • a substrate solution 50 mM sodium pyruvate and 50 mM glycolaldehyde in deionized water.
  • the mixtures were incubated for 1 h at 30 °C and 1200 rpm in an Eppendorf Thermomixer. The total volume of the mixtures was 500 ⁇ l each.
  • the concentrations of glycolaldehyde and pyruvate were 10 mM in all assays.
  • glycolaldehyde concentration cannot be clearly determined due to the peak overlap of lactate and glycolaldehyde in HPLC.
  • Poly(lactic Acid) A Versatile Biobased Polymer for the Future with Multifunctional Properties— From Monomer Synthesis, Polymerization Techniques and Molecular Weight Increase to PLA Applications. Polymers, 13(11), 1822. https://doi.org/10.3390/polyml3111822

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend ein Alkalisalz der Glycolsäure und der Milchsäure, indem ein Alkalisalz der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure, in einer wässerigen Lösung in vitro mit einem Enzymsystem behandelt wird, welches eine Dehydratase, eine Aldolase, eine Glycolaldehyd-Dehydrogenase, eine Lactat-Dehydrogenase sowie NAD+ als Kofaktor enthält, wonach das Enzymsystem abgetrennt wird.

Description

Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend ein Alkalisalz der Glycolsäure und der Milchsäure
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung, die ein Alkalisalz der Glycolsäure und der Milchsäure enthält. Derartige Lösungen werden in der Kosmetikindustrie als Basis für Hautpeeling-Produkte eingesetzt.
Bei der Erfindung handelt es sich um einen kohlenstoffökonomischen enzymatischen Prozess, um Chemikalien aus erneuerbaren Kohlenstoffquellen zu erzeugen. Im Speziellen handelt es sich um die atomökonomische Produktion von AI kal iglycolat und Alkal ilactat mittels eines enzymatischen Prozesses, bei dem D-Xylonat und L-Arabonat, die Ci-Oxidationsprodukte der Pentosen D-Xylose und L-Arabinose, zu dem Cj-Baustein Glycolsäure (Glycolat) und dem Ca-Baustein Milchsäure (Lactat) umgewandelt werden.
In diesem Dokument wird D-Xylose austauschbar mit Xylose, L-Arabinose austauschbar mit Arabinose, L-Arabonat austauschbar mit Arabonat und Arabonsäure, D-Xylonat austauschbar mit Xylonat und Xylonsäure, Glycolat austauschbar mit Glycolsäure, Lactat austauschbar mit Milchsäure sowie Glucose austauschbar mit D-Glucose verwendet.
Hintergrund der Erfindung
Obwohl Glycolsäure auch natürlich vorkommt, etwa im Rohr- und Rübenzucker, erfolgt ihre Synthese derzeit, wegen der geringen Konzentrationen der Substanz in diesen nachwachsenden Rohstoffen, größtenteils aus fossilen Brennstoffen. Da in der so synthetisierten Glycolsäure oft noch Reste an Formaldehyd vorhanden sind, was vor allem bei deren Verwendung in Kosmetikprodukten (z.B. in Hautpeelings (Sharad, 2013)) als problematisch angesehen wird, besteht Bedarf nach alternativen Synthesemethoden.
Chemo-enzymatische Methoden zur Glycolsäure-Herstellung umfassen die Umwandlung von aus Formaldehyd und Hydrogencyanid synthetisiertem Glycolonitril zu Glycolsäure mittels Nitrilasen (Panova et al., 2008; Ben-Bassat et al., 2008). Dieses Verfahren kann aufgrund der verwendeten toxischen, energieintensiv hergestellten und generell aus fossilen Quellen stammenden Chemikalien nicht als nachhaltig bezeichnet werden. Eine weitere Methode ist die Umwandlung von Ethylenglycol zu Glycolsäure mittels mikrobiellem Ganzzellbiokatalysator (Gao et al., 2014). Auch in diesem zweiten Fall wird der Ausgangsstoff generell energieintensiv chemisch hergestellt. Ein chemisches Verfahren zur Erzeugung von Glycolsäure, das einen erneuerbaren Rohstoff als Ausgangsstoff nimmt, ist die Umsetzung von aus Bio-Öl gewonnenem Glyoxal zu Glycolsäure in Gegenwart von Zeolith als Katalysator (Dapsens et al., 2014). Bio-Öl wird durch Pyrolyse von Biomasse gewonnen - ein energiereicher Prozess, bei dem die ursprüngliche Zusammensetzung der Biomasse zerstört wird und das synthetische Potential des Rohstoffes ungenutzt bleibt.
Um nachhaltige Produktionsverfahren für Chemikalien aus Biomasse zu entwickeln, werden weniger energieintensive Methoden benötigt, welche die bestehende Vielfalt des Biomaterials nutzen. So werden neben effizienten, sanften Methoden zur Depolymerisation von nachwachsenden Rohstoffen zu kürzerkettigen Zuckern effiziente Technologien benötigt, um diese Kohlenhydrat-Intermediate weiter in chemische Produkte umzuwandeln. Eine besondere Herausforderung besteht dabei darin, die nach der Depolymerisation entstehenden Stoffgemische effizient und möglichst vollständig in wertbringende Stoffströme umzuwandeln. Generell enthalten Strohe, Hölzer und andere pflanzenbasierte Rohstoffe Hemicellulose und Cellulose, aus welchen Monomer-Zucker in wechselnder Zusammensetzung freigesetzt werden können, vornehmlich die Pentosen Xylose und Arabinose, die Hexosen Glucose, Mannose und Galactose sowie von den Zuckern abgeleitete Säuren (z.B. Glucuronsäure). Methoden zur effizienten Trennung der C6- und C5-Zucker erlauben es, diese Stoffstromtypen getrennt voneinander weiter zu behandeln (z.B. WO 2011/014894). In Mais-Hüllen beispielsweise findet man, bezogen auf den Gesamtzucker, 10% Arabinose, 16% Xylose, 64% Glucose, 4% Galactose und 2% Mannose (Hromädkovä & Ebringerovä, 1995), in Weizenstroh hingegen sind es 5% Arabinose, 30% Xylose, 56% Glucose, 1% Galactose und 2% Mannose (Collins et al., 2014). Diese Prozentwerte zeigen, dass sich die Verhältnisse von Arabinose und Xylose in beiden Biomassen zueinander stark unterscheiden (Mais-Hüllen: 1:1,6 bzw. Weizenstroh: 1:6).
Derzeit fokussieren biotechnologische Bemühungen vor allem auf Verfahren, die auf die Umwandlung von Biomasse zu chemischen Produkten mittels Fermentationen abzielen, also auf die Stoffumwandlung während des Wachstums von Mikroben in einem Reaktor. Diese fermentativen Ganzzellprozesse sind trotz allen technischen Fortschritts auf dem Gebiet, wie etwa Metabolie Engineering und heterologe Pathway-Expression, durch die physiologischen Limitationen der zellulären Produktion (Toleranz gegenüber Lösungsmitteln, Temperatur, Stofftransport sowie gegenüber hohen Substrat- und Produktkonzentrationen, aber auch durch Nebenprodukte aus anderen Stoffwechselwegen in der Zelle) begrenzt (Claassens et al., 2019). Diese intrazellulären Prozesse und insbesondere der Energiebedarf für die metabolischen (oft auch CC -emittierenden) Schritte führen zum einen zu langen Prozesszeiten und zum anderen dazu, dass die erzielbare Kohlenstoffausbeute deutlich unter der theoretisch möglichen liegt. Daneben verwenden diese Prozesse generell meist biosynthetische Stoffwechselwege, die aus dem Substrat CO2 freisetzen, sodass selbst die theoretische Kohlenstoffausbeute im Produkt nur ein Bruchteil des eingesetzten Kohlenstoffs ist: Während bei Cg-Zuckern je nach Stoffwechselweg 1 - 4 Kohlenstoffe verloren gehen, sind es bei C5-Zuckern 1 - 3. Typische Eckdaten solcher Prozesse sind in der Literatur zusammengefasst (Salusjärvi et al., 2019).
So ist z.B. die fermentative Erzeugung von Glycolsäure aus Glucose über den Glyoxylat-Shunt mittels Metabolie Engineering in rekombinanten E. coli Stämmen bekannt (WO 2007/141316A2, WO 2007/140816A1, WO 2010/108909A1, WO 2011/036213A2). Dabei wurde etwa in einem Fall in einem 93 h dauernden Fermentationsprozess die fermentative Produktion von 31,3 g/l Glycolsäure im Fermentationsüberstand bei Ausbeuten von 0,22 g Glycolsäure pro Gramm Glucose erzielt (WO 2007/141316A2). Die WO 2011/036213A2 beschreibt dann einen weiter optimierten Fermentationsprozess des Systems, der innerhalb von 40 h durch adaptierte Prozessführung 53,9 g/l Glycolsäure bei einer Ausbeute von 0,36 g Glycolsäure pro Gramm Glucose erzielt.
Auch die fermentative Glycolsäure-Herstellung aus Pentosen, z.B. über die Kombination aus dem Ribulose-l-Phosphat-Pathway und Glyoxylat-Shunt, ist in der Literatur beschrieben (Pereira et al., 2016). Bei besagtem Prozess wird durch metabolisches Engineering eines E. co//-Stammes eine Ausbeute von 0,62 g Glycolsäure je Gramm Xylose erzielt. Die Glycolsäure-Endkonzentration nach 85 h liegt hier bei 41 g/l in der Fermentationsbrühe, die Ausbeute liegt bei 61% der theoretischen (1,22 mol/mol). Generell liegt das obere Limit von fermentativen Ansätzen zur Glycolsäure-Erzeugung derzeit bei 65,5 g/l Glycolsäure-Endkonzentration und 90% der theoretischen Ausbeute (wobei 100% theoretische Ausbeute den Verlust eines Kohlenstoffatoms pro Zuckermolekül bedeutet), wenn reine Glucose als Substrat verwendet wird (Deng et al., 2018; Salusjärvi et al., 2019). Für reine Xylose sind die erzielten Werte ähnlich (44 g/l Glycolsäure-Endkonzentration, 87% der theoretischen Ausbeute (Pereira et al., 2016; Salusjärvi et al., 2019)). Bei Zuckermischungen (Xylose + Glucose) sind die erzielbaren Glycolsäure- Konzentrationen jedoch um eine Größenordnung schlechter (Alkim et al., 2016; Salusjärvi et al., 2019). Dies ist auch in analogen Systemen, welche die fermentative Umwandlung von Zuckern zu Ethylenglycol verwirklichen, der Fall (Pereira et al., 2016; Salusjärvi et al., 2017; Uranukul et al., 2018; Salusjärvi et al., 2019).
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die fermentativ existierenden Systeme generell den Verlust von zumindest einem Kohlenstoff pro Zuckermonomer in Kauf nehmen und bei Zuckermischungen nur niedrige Produkt-Endkonzentrationen erzielen.
Auch zellfreie Umsetzungen von Metaboliten wurden bereits 1897 durch Eduard Buchner gezeigt, der mittels eines Zell-Lysates von Saccharomyces cerevisiae Glucose in Ethanol umwandelte (Buchner, 1897). 1985 stellten Welch und Scopes ein zellfreies System zur Ethanol-Produktion (Welch & Scopes, 1985) vor, das allerdings mangels Spezifität technologisch nicht nutzbar war.
Seitdem wurde eine Reihe weiterer Prozesse beschrieben, um Chemikalien aus aufgereinigten Enzymen (Enzymisolaten) zu produzieren. So werden Alkohol-Dehydrogenasen für die Produktion hochwertiger chiraler Alkohole genutzt, wobei der Kofaktor NAD z.B. durch Zugabe von Glucose und Glucose- Dehydrogenase regeneriert wird (Goldberg et al., 2007). Generell werden Glucose- oder Formiat- Dehydrogenasen (GDHs oder FDHs) und Alkohol-Dehydrogenasen (ADHs) für das Recycling des Kofaktors verwendet (Schrittwieser et al., 2018).
In den letzten Jahren hat sich das Interesse auf Prozesse verlagert, welche hochselektive Umsätze mittels Enzymkaskadenreaktionen nutzen, um die Zielchemikalie in einem Schritt (Eintopf oder One-Pot) zu erhalten. Die EP2700714A1, die US8859247B2 und die EP2204453B1 beschreiben ein Portfolio an Kaskadenreaktionen, in welchen Glucose in einer Kaskade aus fünf enzymatischen Umsetzungen zu zwei Molekülen Pyruvat umgewandelt wird. Von Glucose ausgehend folgt die Kaskade dem nicht- phosphorylierenden Entner-Doudoroff-Pfad zu D-Glyceraldehyd und Pyruvat (Zuckeroxidation, Dehydratisierung und Aldolspaltung). D-Glyceraldehyd wird danach weiter zu D-Glycerat oxidiert und anschließend zu Pyruvat dehydratisiert. Dieses dient dann als Plattform für weitere Transformationen zu einer Reihe an Aminosäuren und Alkoholen. Die Enzyme der Kaskade umfassen dabei eine Glucose- Dehydrogenase, eine promiskuitive Dihydroxysäure-Dehydratase (katalysiert Dehydratisierungen von Gluconat und D-Glycerat), eine 2-Keto-3-deoxygluconat-Aldolase und eine Aldehyd-Dehydrogenase. Bei Verwendung einer ebenfalls promiskuitiven Dehydrogenase, welche sowohl Glucose als auch D-Glyceraldehyd als Substrat akzeptiert, kann das System auf drei Enzyme minimiert werden.
Für die Pentose Xylose existiert eine ähnliche Kaskade, welche unter dem Namen Dahms-Pathway (Dahms, 1974) bekannt ist. Dabei wird Xylose zuerst zu 1,4-Xylonolacton oxidiert, welches unter Einwirkung einer Lactonase zum Xylonat geöffnet wird. Eine Dehydratase wandelt Xylonat zu 2-Keto-3- deoxy-xylonat um, welches durch eine Aldolase in Pyruvat und Glycolaldehyd gespaltet wird. Über diesen Pathway kann in Organismen wie Sulfolobus solfataricus dank promiskuitiver Enzyme des Pathways auch Arabinose umgesetzt werden (Kopp et al., 2020).
Pyruvat ist ein zentrales Intermediat im zellulären Stoffwechsel und dient beispielsweise als Vorstufe zur Aminosäure Alanin oder zum Acetyl-CoA, welches im Citratzyklus beteiligt ist. Durch Reduktion von Pyruvat gelangt man zu Milchsäure bzw. Lactat, welches über einen breiten Anwendungsbereich verfügt. Milchsäure wird z.B. als Säuerungsmittel in der Lebensmittelindustrie, als Entkalkungsmittel, pH-Regulator oder Reinigungsmittel in der chemischen Industrie, als Zusatz in Anti-Akne-Cremes oder Feuchtigkeitscremes in der kosmetischen Industrie sowie als Precursor für Acrylsäure oder Ethyllactat verwendet (Wee et al., 2006). Darüber hinaus kann Milchsäure (wie auch Glycolsäure) auch zum Hautpeeling (Chemisches Peeling) eingesetzt werden (Smith, 1996). Die bifunktionelle Milchsäure lässt sich des Weiteren auch polymerisieren, wobei Polylactid (PLA), ein bioabbaubarer und biokompatibler Kunststoff, entsteht, der Anwendungen in der Verpackungsindustrie, Textilindustrie, im Elektronik- sowie im Medizinbereich hat ( Bal la et al., 2021).
Boer et al. präsentierten eine in-vitro Variante des Dahms-Pathways mit gereinigten Enzymisolaten, bei der Xylose bzw. Xylonolacton (1 mM Substrat-Konzentration) zu Ethylenglycol (Reduktion von Glycolaldehyd), Glycolsäure (Oxidation von Glycolaldehyd) oder Lactat (Reduktion von Pyruvat) umgewandelt wird. Hauptaugenmerk der Studie war die Anwendung eines spektrophotometrischen Assays zur Evaluierung der Effizienz der Kaskade, die auf der Bildung bzw. dem Verbrauch von NADH basiert. Dazu wurden 2 mM NAD externer Kofaktor zugesetzt. Weiters wurde in der Studie auch die Rolle der Lactonase (aus Caulobacter crescentus) im Dahms-Pathway untersucht. Die Daten legen nahe, dass die spontane Ringöffnung des Xylonolactons vor allem bei pH 7 geschwindigkeitsbestimmend ist. Erst durch die Zugabe der Lactonase wird die Gesamt-Kinetik der Kaskade merklich beschleunigt, was aber auch durch die Erhöhung des pH-Wertes erreicht werden kann (Boer et al., 2019).
Aus der WO 2014/162063A1 ist bekannt, Glycolsäure neben Milchsäure fermentativ in einem metabolisch engineerten eukaryontischen System (S. cerevisiae) aus der Pentose Xylose zu gewinnen. Die erreichten Produktkonzentrationen liegen aber weit unter der theoretischen Ausbeute. So werden bei der Kofermentation von Glucose (10 g/l) und Xylose (20 g/l) bei einer Fermentationsdauer von 2 Tagen nur 0,927 g/l Milchsäure und 0,696 g/l Glycolsäure gewonnen, erzielte Konzentrationen aus Fermentationen von Reinzucker liegen sogar darunter.
Hier setzt nun die vorliegende Erfindung an, die sich zum Ziel setzt, ein Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend sowohl ein Alkalisalz der Glycolsäure als auch der Milchsäure zur Verfügung zu stellen, welches hohe Ausbeuten aufweist und bei höheren Konzentrationen durchführbar ist.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Dieses Ziel wird mit einem Verfahren erreicht, bei welchem ein Alkalisalz der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in einer wässerigen Lösung in vitro mit einem Enzymsystem behandelt wird, welches eine Dehydratase, eine Aldolase, eine Glycolaldehyd-Dehydrogenase, eine Lactat-Dehydrogenase sowie NAD+ als Kofaktor enthält, wonach das Enzymsystem abgetrennt wird. Es hat sich Überaschenderweise gezeigt, dass die erfindungsgemäß gesetzten Ziele erreicht werden können, wenn die Umsetzung nicht fermentativ durchgeführt wird, sondern die Enzyme als solche in der wässerigen Lösung enthalten sind, also in vitro gearbeitet wird.
Der Begriff „Enzymsystem" bezeichnet die Gesamtheit der vier Enzyme, also die Dehydratase, die Aldolase, die Glycolaldehyd-Dehydrogenase, die Lactat-Dehydrogenase sowie NAD+ als Kofaktor. Diese vier Enzyme samt dem Kofaktor können zum Beispiel als solche (Enzymisolate) der wässerigen Lösung zugegeben werden. Es ist jedoch auch möglich, Zellen, welche die angegebenen Enzyme exprimieren, in der wässerigen Lösung zu suspendieren. In diesem Fall wird unter dem Begriff „Enzymsystem" eine Zellsuspension verstanden. Ferner ist unter dem Begriff „Enzymsystem" ein Homogenat zu verstehen, welches aus der Zellsuspension erhalten werden kann, indem die Zellen z.B. Ultraschall ausgesetzt werden, um sie zum Platzen zu bringen. Ferner sind unter dem Begriff „Enzymsystem" auch Lysate zu verstehen, die aus den Homogenaten erhalten werden, indem die festen Zellbestandteile abgetrennt werden. Schließlich sind unter dem Begriff „Enzymsystem" auch Enzyme zu verstehen, wenn sie in oder an einer Matrix immobilisiert vorliegen.
Ein großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass die Umsetzung auch bei nichtphysiologischen Bedingungen, wie etwa hohe Substratkonzentrationen, vorgenommen werden kann, also bei Konzentrationen, unter denen ein fermentatives Verfahren nicht arbeiten kann.
Ein weiterer großer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, dass es bei niedrigen NAD+-Konzentrationen durchgeführt werden kann, weil dieses im Verfahren intrinsisch regeneriert wird. Die intrinsische Regenerierung ist möglich, weil die Bildung des Glycolats aus dem Glycolaldehyd eine Oxidation ist, welche NAD+ unter Bildung von NADH verbraucht, während die Bildung des Lactats aus dem Pyruvat eine Reduktion ist, welche NADH verbraucht, wodurch das NAD+ rückgebildet wird. Diese intrinsische Regenerierung ist aufgrund des hohen Preises von NAD+ ein entscheidender Vorteil und gestattet die großtechnische Durchführung des Verfahrens.
Das Reaktionsschema ist in der beiliegenden Figur dargestellt, welche auch die intrinsische Regenerierung zeigt. Oxidation und Reduktion können durch NAD+ gestartet werden, aber gleichermaßen auch durch NADH, sodass für die Zwecke der vorliegenden Patentansprüche und Beschreibung NAD+ auch für das korrespondierende NADH steht.
Bei einer weiteren, bevorzugten Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens liegen die das Enzymsystem bildenden Enzyme in einer Suspension, im Homogenat und/oder im Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vor. Es hat sich gezeigt, dass bei Verwendung von Suspensionen, Lysaten und/oder Homogenaten der Kofaktor der Dehydrogenasen nicht extra zugesetzt werden muss, weil die kleinen Mengen Kofaktor, die in der Suspension, im Lysat und/oder im Homogenat vorhanden sind, aufgrund der intrinsischen Regeneration des NAD+ bereits ausreichend sind, den letzten Schritt der Oxidation und Reduktion ablaufen zu lassen.
Durch die intrinsische Kofaktor-Regeneration kommt das System somit ohne den Zusatz eines organischen Kosubstrates aus, was die Energie- und Kohlenstoffeffizienz verschlechtern und die Aufarbeitung erschweren würde. Das erfindungsgemäße Verfahren erweitert somit die Kernreaktionen des Dahms-Pathways, nämlich die Dehydratisierung und Aldolspaltung, um ein in sich geschlossenes Redox-System, welches unter Zuhilfenahme desselben Kofaktorpaars (NAD+/NADH) Glycolaldehyd zur Glycolsäure oxidiert und Pyruvat zum Lactat reduziert.
Suspension bedeutet in diesem Kontext eine Suspension von resting cells. Diese werden nach der Kultivierung geerntet (vom Nährmedium abgetrennt) und in einem geeigneten Puffersystem suspendiert. Im Gegensatz zu fermentativen Verfahren, bei denen auch mit ganzen Zellen gearbeitet wird, können die resting cells aufgrund der Entfernung von Kohlenstoff-Quellen und Nährstoffen nicht mehr wachsen, sondern dienen nur der Umsetzung von Substraten (Lin & Tao, 2017). Homogenat steht in diesem Kontext für eine physikalisch und/oder chemisch behandelte Suspension (z.B. mittels Druckes, Lysozym oder Ultraschall behandelt), wobei die Zellbestandteile aus den Zellen freigesetzt werden. Ein Lysat wird erhalten, wenn die unlöslichen Zellbestandteile des Homogenats beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation entfernt werden (siehe Produktion Enzyme für Details).
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird als Alkalisalz ein Kaliumsalz eingesetzt.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Konzentration des Alkalisalzes der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in der wässerigen Lösung 50 - 300 g/l, 100 - 200 g/l und schließlich 150 - 250 g/l.
Zusätzlich ist bevorzugt, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 °C, zwischen 25 und 40 °C und noch mehr bevorzugt zwischen 30 und 40 °C durchgeführt wird.
Der besonders bevorzugte pH-Bereich der Reaktion liegt zwischen 7,5 und 8,5.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt der Erfindung finden alle Reaktionsschritte des Verfahrens sowie die Regeneration der Kofaktoren in einem einzigen Reaktionsgefäß statt (Eintopfreaktion), d.h. es wird die kostenintensive Isolierung der Intermediate vermieden. In dieser Ausführungsform werden alle Enzyme zu Beginn der Reaktion eingesetzt.
Die vorliegende Erfindung beruht darüber hinaus auch auf der überraschenden Erkenntnis, dass die Ausbeute z.B. an Glycolat höher ist, wenn gleichzeitig durch Einsatz der Lactat-Dehydrogenase Lactat gebildet wird, im Vergleich zur alleinigen Produktion von Glycolat (und umgekehrt, siehe unten Beispiel 5).
Die Umwandlung von Arabonat und/oder Xylonat über 4,5-Dihydroxy-2-oxopentanoat ((R)-4,5- Dihydroxy-2-oxopentanoat = 2-Keto-3-deoxy-arabonat (KDA) und/oder (S)-4,5-Dihydroxy-2- oxopentanoat = 2-Keto-3-deoxy-xylonat (KDX)) zu Pyruvat und Glycolaldehyd umfasst dabei eine Dehydratase und Aldolase.
Die im Verfahren verwendete Dehydratase kann aus einer der Gruppen EC 4.2.1.5 (Arabonat- Dehydratase), 4.2.1.6 (Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.7 (Altronat-Dehydratase), 4.2.1.8 (Mannonat- Dehydratase), 4.2.1.9 (Dihydroxysäure-Dehydratase), 4.2.1.25 (L-Arabonat-Dehydratase), 4.2.1.39 (Gluconat-Dehydratase), 4.2.1.40 (Glucarat-Dehydratase), 4.2.1.42 (Galactarat-Dehydratase), 4.2.1.67 (ü-Fuconat-Dehydratase), 4.2.1.68 (L-Fuconat-Dehydratase), 4.2.1.82 (Xylonat-Dehydratase), 4.2.1.140 (Gluconat/Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.146 (L-Galactonat-Dehydratase), 4.2.1.156 (L-Talarat- Dehydratase), 4.2.1.158 (Galactarat-Dehydratase, D-threo-bildend) und 4.2.1.176 (L-Lyxonat- Dehydratase) stammen, wobei die Gruppe 4.2.1.25 (L-Arabonat-Dehydratase) besonders bevorzugt ist.
Die im Verfahren verwendete Aldolase kann aus einer der Gruppen EC 4.1.2.18 (2-Dehydro-3-deoxy-L- pentonat-Aldolase), 4.1.2.20 (2-Dehydro-3-deoxyglucarat-Aldolase), 4.1.2.21 (2-Dehydro-3-deoxy-6- phosphogalactonat-Aldolase), 4.1.2.28 (2-Dehydro-3-deoxy-D-pentonat-Aldolase), 4.1.2.29 (5-Dehydro- 2-deoxyphosphogluconat-Aldolase), 4.1.2.51 (2-Dehydro-3-deoxy-D-gluconat-Aldolase), 4.1.2.52 (4- Hydroxy-2-oxoheptandioat-Aldolase), 4.1.2.53 (2-Keto-3-deoxy-L-rhamnonat-Aldolase), 4.1.2.54 (L- threo-3-Deoxy-hexylosonat-Aldolase), 4.1.2.55 (2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconat/2-Dehydro-3- deoxy-6-phosphogalactonat-Aldolase) sowie 4.1.3.39 (4-Hydroxy-2-oxovalerat-Aldolase) stammen, wobei die Gruppe 4.1.2.55 (2-Dehydro-3-deoxy-phosphogluconat/2-Dehydro-3-deoxy-6- phosphogalactonat-Aldolase) besonders bevorzugt ist.
Die zur Reduktion von Pyruvat zu Lactat verwendeten Dehydrogenase stammt vorzugsweise aus den Gruppen EC 1.1.1.27 (L-Lactat-Dehydrogenase).
Die zur Oxidation von Glycolaldehyd zu Glycolsäure verwendete Dehydrogenase stammt bevorzugt aus der Gruppe EC 1.2.1.21 (Glycolaldehyd-Dehydrogenase).
Die hier vorgestellte enzymatische Strategie minimiert die Anzahl der Enzyme und erlaubt somit einen hocheffizienten und kostengünstigen/preislich kompetitiven Bioproduktionsprozess.
Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung noch näher beschrieben.
Materialien
2-Keto-3-deoxyxylonsäure-Lithium-Salz, Natrium-Pyruvat, Natrium-L-Lactat und Glycolaldehyd-Dimer, IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) sowie HEPES (2-(4-(2-Hydroxyethyl)-l-piperazinyl)- ethansulfonsäure) wurden von Sigma-Aldrich, Magnesiumchlorid-Hexahydrat, Kaliumdihydrogenphosphat, di-Kaliumhydrogenphosphat, NAD+, NADH-Dinatriumsalz sowie Natriumdodecylsulfat (SDS) wurden von Carl Roth, Lysozym und Methanol wurden von PanReac AppliChem (ITW Reagents), Triethanolamin wurde von Chem-Lab NV und Natrium-Glycolat wurde von Alfa Aesar bezogen. Kalium-L-Arabonat und Kalium-D-Xylonat wurden gemäß Literaturvorschrift (Moore & Link, 1940) aus den entsprechenden Zuckern hergestellt.
Produktion der Enzyme
Für die rekombinante Enzymproduktion in einem Escherichia co//-Stamm wurde zunächst das zu exprimierende Gen in einer PCR unter der Verwendung der genomischen DNA oder deren synthetisch an die Codon-Verwendung von E. coli angepasstes Äquivalent als Matrize zusammen mit spezifischen Oligonukleotiden, die zusätzlich Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen tragen, amplifiziert und aus dem Reaktionsgemisch isoliert. Nach dem Nukleinsäure-Verdau mit den Restriktionsenzymen Sphl und Hind II I wurde das für das Target-Enzym kodierende Genfragment in das mit Sphl und Hindlll geschnittene Rückgrat des Expressionsvektors pQE70-Kan ligiert. Das Ligationsprodukt wird in chemisch kompetente E. co//-Zellen ToplOF transformiert und die entstandenen Kolonien wurden für die Plasmid-Isolierung und Restriktionsanalyse benutzt. Das Ergebnis des Klonierungs-Schritts wurde mittels Restriktionsenzym-Verdau und DNA-Sequenzierung überprüft. Das resultierende Konstrukt trägt das Target-Gen unter dem IPTG-induzierbaren T5- Promotor.
Für die Überexpression des Enzymes in E. coli wurde das resultierende Expressionsplasmid in die kompetenten Expressionszellen RB791 transformiert. Nach 24 h Inkubation bei 37 °C wurden entstandene Kolonien für die Expressionstests in LB-Medium angeimpft.
Am nächsten Tag wurden damit Expressionskulturen mit einer optische Dichte OD550 von 0,02 angeimpft und bei 37 °C geschüttelt, bis eine OD550 von 0,3 erreicht wurde. Anschließend wurde die Temperatur auf 25 °C gesenkt und die Kulturen wurden beim Erreichen einer OD550 von 0,5 mit 0,1 mM IPTG induziert. Nach 22 h wurden die Kulturen geerntet (vom Medium mittels Zentrifugation in Form eines Zellpellets abgetrennt) und auf die Expression des rekombinanten Enzymes mit Hilfe von SDS- Gelelektrophorese und einer Aktivitätsbestimmung (Verwendung in Use-Test oder optischenzymatischer Assay) analysiert.
Herstellung von Zell-Suspensionen
Zur Herstellung von Zell-Suspensionen wurden die nach obigem Verfahren hergestellten Zellpellets in einem geeigneten Gefäß eingewogen und mit Puffer versetzt (siehe Tabelle 1 für verwendete Puffer- Systeme) und unter Rührung im Eisbad gelöst. Der Massenanteil an Biomasse betrug üblicherweise 20%, der Rest entfiel auf den Puffer.
Herstellung von Homogenaten mittels Sonifier-Aufschlusses
Der oben hergestellten Zell-Suspension wurde Lysozym in einer Menge von 0,5 mg/ml zugefügt. Zum Zell-Aufschluss wurde ein Branson Sonifier 450 verwendet. Die Suspension wurde in ein 5 ml Eppendorf- Vial überführt. Die Metallspitze des Apparats wurde nun in die Suspension getaucht, danach wurde die Suspension dreimal mit je 15 Ultraschall-Stößen (Einstellungen am Gerät: Timer = 15; Duty Cycle = 50; Output Control = 3 - 5) behandelt. Auf diese Weise wurde das Homogenat als Mischung von aufgeschlossenen Zellen und Puffer erhalten.
Herstellung von Lysaten durch Zentrifugation
Das oben hergestellte Homogenat wurde 10 min bei 4 °C und 16000 rpm zentrifugiert (Eppendorf Zentrifuge 5417R), um die unlöslichen Zellfragmente abzutrennen und das Lysat zu erhalten.
Tabelle 1. Spenderorganismen und Aufschlussbedingungen für die in den Beispielen verwendeten Enzyme.
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Analytische Methoden
High Performance Anion Exchange Chromatography
Substrat-Umsätze und Produkt-Konzentrationen wurden durch HPAEC (High Performance Anion Exchange Chromatography) ermittelt. Dazu wurde ein Dionex ICS6000 System mit AS-AP Autosampler verwendet. Die Messung der organischen Säuren bzw. deren Anionen (Xylonat, Arabonat, 2-Keto-3- deoxy-xylonat, 2-Keto-3-deoxy-arabonat, Lactat und Pyruvat) erfolgte mittels Leitfähigkeitsdetektion (CD) gekoppelt an einen Dionex AERS 500 elektrolytisch regenerierten Suppressor im externen Wassermodus. Zur Trennung der Analyten wurde eine Dionex lonPac ASll-HC-4pm Säule mit entsprechender Vorsäule sowie einem NaOH-Gradienten verwendet. Das Laufmittel wurde zusätzlich mit einer Dionex ATC Anion Trap Column vorbehandelt.
High Performance Liquid Chromatography
Zur Quantifizierung von Glycolaldehyd und Glycolsäure wurde HPLC (High Performance Liquid Chromatography) verwendet. Detektion erfolgt mittels eines Brechungsindex-Detektors. Zur Messung wurde eine Phenomenex Rezex ROA-Organic Acid H+ (8%) Säule mit entsprechender Vorsäule verwendet und mit 1 mM Schwefelsäure isokratisch eluiert.
Bestimmung von Enzym-Aktivitäten (optisch-enzymatischer Assay)
Enzym-Aktivitäten in den Homogenaten bzw. Lysaten wurden mit einem Shimadzu UV-1900 Spektrophotometer bestimmt. Dazu wurde die Bildung bzw. der Verbrauch von NADH bei einer Wellenlänge von 340 nm über die Änderung der Absorption verfolgt. Die Messungen wurden mit 0,2 mM Kofaktor (NAD+ oder NADH) durchgeführt. Dazu wurden 20 pl einer 10 mM Stock-Lösung des Kofaktors in einer Küvette (Greiner bio-one Semi-Micro-Küvette aus Polystyrol) vorgelegt und der gewünschte pH-Wert wurde mit 100 mM TEA-HCl-Puffer eingestellt (870 pl). Nach Temperieren der Küvette wurden 10 pl Homogenat bzw. Lysat (verdünnt oder unverdünnt) und 100 pl Substrat-Lösung zugesetzt und die Messung unmittelbar danach gestartet. Die Messungen wurden standardmäßig bei 25 °C durchgeführt. Über den Extinktionskoeffizienten von NADH bei 340 nm (E = 6220 L mol 1 cm 1) kann die Enzym-Aktivität des Lysats in U/ml (bezogen auf das Volumen des Lysats) bzw. U/g (bezogen auf die zur Herstellung eingesetzte Biomasse) bestimmt werden. 1 U steht dabei für 1 pmol Substratumsatz pro Minute (1 U = 1 pmol/min = l,67-10'8 kat).
Allgemeines zur Aufarbeitung der Reaktionslösung
Die erfindungsgemäß erhaltene Glycolat- und Lactat-haltige wässerige Lösung wird hergestellt, indem nach Beendigung der Reaktion die Zellbestandteile durch Denaturieren (z.B. durch Einwirkung von Wärme) und anschließender Filtration bzw. Zentrifugation entfernt werden. Zur Entfernung von kleineren Zellbestandteilen kann zusätzlich eine Membranfiltration durchgeführt werden. Das so erhaltene Filtrat kann nun beispielsweise mittels Rotationsverdampfer aufkonzentriert werden.
Mit den nachfolgenden Beispielen werden bevorzugte Varianten des erfindungsgemäßen Verfahrens noch näher beschrieben. Die in diesen Beispielen eingesetzten Suspensionen, Homogenate und Lysate wurden nach den oben beschriebenen Verfahren hergestellt.
Beispiel 1
Behandeln von Xylonat/Arabonat-Mischungen in unterschiedlichen Zusammensetzungen (9/1 und 2/1 m/m) mit dem Enzymsystem
In zwei 2 ml Eppendorf-Vials (Vial 1 und Vial 2) wurden folgende Komponenten vorgelegt: 100 pl eines 2000 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8,5), 200 pl deionisiertes Wasser, 40 pl Dehydratase-Lysat, 40 pl Aldolase- Lysat, 2 U Glycolaldehyd-Dehydrogenase-Lysat sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. Durch Zugabe von je 100 pl einer Lösung von Kalium-Xylonat und Kalium-Arabonat zu beiden Eppendorf-Vials wurden die Reaktionen gestartet. Die Lösung für Vial 1 enthielt 9 Teile Kalium-Xylonat (225,7 g/l) und einen Teil Kalium-Arabonat (25,0 g/l), die Lösung für Vial 2 enthielt 2 Teile Kalium-Xylonat (166,3 g/l) und einen Teil Kalium-Arabonat (84,0 g/l). Die Ansätze wurden insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug je 500 pl.
Zur Aufarbeitung wurden 40 pl eines Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.
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* Der Umsatz der Substrate kann aufgrund der Peak-Überlappung in der HPAEC nur als Summenparameter angegeben werden.
** Die Konzentrationen und Massen der Produkte Glycolat und Lactat sowie deren Umsätze wurden für die jeweiligen freien Säuren berechnet.
Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass das Enzymsystem unterschiedliche Mischungsverhältnisse von Xylonat und Arabonat in ähnlicher Effizienz umsetzen kann. Das ist relevant, da die entsprechenden Pentosen (Xylose und Arabinose) aus Biomasse freigesetzt werden können, wo sie in unterschiedlichen Verhältnissen vorkommen. Diese können somit ohne vorgehende Trennung oxidiert werden und die entstehenden Mischungen der Zuckersäuren können direkt vom Enzymsystem zu Glycolat und Lactat umgewandelt werden.
Beispiel 2
Einfluss von verschiedenen Enzym-Formulierungen (Suspension, Homogenat oder Lysat) auf das Behandeln einer Xylonat/Arabonat (9/1 m/m)-Mischung mit dem Enzymsystem
In einem 2 ml Eppendorf-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 100 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 200 pl deionisiertes Wasser, 40 pl einer Dehydratase-Formulierung (siehe nachfolgende Tabellen für Details), 40 pl einer Aldolase-Formulierung (siehe nachfolgende Tabellen für Details), 2 U einer Glycolaldehyd-Dehydrogenase-Formulierung sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. Durch Zugabe von 100 pl einer Lösung von 9 Teilen Kalium-Xylonat (225,7 g/l) und einem Teil Kalium-Arabonat (25,0 g/l) wurde die Reaktion gestartet. Der Ansatz wurde insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. Das Gesamtvolumen betrug 500 pl.
Zur Aufarbeitung wurden 40 pl des Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.
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Figure imgf000014_0001
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* Der Umsatz der Substrate kann aufgrund der Peak-Überlappung in der HPAEC nur als Summenparameter angegeben werden.
** Die Konzentrationen und Massen der Produkte Glycolat und Lactat sowie deren Umsätze wurden für die jeweiligen freien Säuren berechnet.
Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass unterschiedliche Enzym-Formulierungen (Suspensionen, Homogenate und Lysate) für das Enzym-System verwendet werden können. Den größten Umsatz erhält man, wenn alle Enzyme in Form von Lysaten zugesetzt werden (vgl. Vial 1 von Beispiel 1).
Beispiel 3
Einfluss von NAD+-Zusatz auf das Behandeln einer Xylonat/Arabonat (9/1 m/m)-Mischung mit dem Enzymsystem
In einem 2 ml Eppendorf-Vial (Vial 1) wurden folgende Komponenten vorgelegt: 100 pl eines 2000 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8,5), 200 pl deionisiertes Wasser, 40 pl Dehydratase-Lysat, 40 pl Aldolase-Lysat, 2 U Glycolaldehyd-Dehydrogenase-Lysat sowie 2 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. In einem zweiten 2 ml Eppendorf-Vial (Vial 2) wurde eine ähnliche Mischung, allerdings mit 10 pl einer 10 mM NAD+-Lösung sowie mit 190 statt 200 pl deionisiertem Wasser, vorgelegt. Durch Zugabe von je 100 pl einer Lösung von 9 Teilen Kalium-Xylonat (225,7 g/l) und einem Teil Kalium-Arabonat (25,0 g/l) zu beiden Eppendorf- Vials wurden die Reaktionen gestartet. Die Ansätze wurden insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug je 500 pl.
Zur Aufarbeitung wurden 40 pl eines Ansatzes mit 160 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.
Figure imgf000014_0003
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* Der Umsatz der Substrate kann aufgrund der Peak-Überlappung in der HPAEC nur als Summenparameter angegeben werden.
** Die Konzentrationen und Massen der Produkte Glycolat und Lactat sowie deren Umsätze wurden für die jeweiligen freien Säuren berechnet.
Den obenstehenden Tabellen kann entnommen werden, dass die Zugabe von Kofaktor (0,2 mM NAD+) unter diesen Bedingungen keine Vorteile bezüglich des Umsatzes mit sich bringt.
Beispiel 4
Behandeln einer Xylonat/Arabonat (9/1 m/m)-Mischung (Substrat-Konzentration: 100 g/l) mit dem Enzymsystem
In einem 2 ml Eppendorf-Vial wurden folgende Komponenten vorgelegt: 150 pl eines 2000 mM TEA-HCI- Puffers (pH 8,5), 90 pl deionisiertes Wasser, 60 pl Dehydratase-Lysat, 60 pl Aldolase-Lysat, 4 U Glycolaldehyd-Dehydrogenase-Lysat sowie 4 U Lactat-Dehydrogenase-Lysat. Durch Zugabe von 100 pl einer Lösung von 9 Teilen Kalium-Xylonat (450,1 g/l) und einem Teil Kalium-Arabonat (51,7 g/l) wurde die Reaktion gestartet. Der Ansatz wurde insgesamt 48 h bei 30 °C unter kontinuierlichem Schütteln (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer) inkubiert. Das Gesamtvolumen des Ansatzes betrug 500 pl.
Zur Aufarbeitung wurden 20 pl des Ansatzes mit 180 pl Reinstwasser und 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:250 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen. Für die HPLC wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC -Vials überführt und vermessen (Rl-Detektion). Die Ergebnisse sind im Folgenden tabellarisch dargestellt.
Figure imgf000015_0003
* Der Umsatz der Substrate kann aufgrund der Peak-Überlappung in der HPAEC nur als Summenparameter angegeben werden. ** Die Konzentrationen und Massen der Produkte Glycolat und Lactat sowie deren Umsätze wurden für die jeweiligen freien Säuren berechnet.
Der obenstehenden Tabelle kann entnommen werden, dass das Verfahren auch für den Umsatz von konzentrierteren Substrat-Lösungen geeignet ist.
Beispiel 5
Behandeln einer Mischung von Glycolaldehyd und Pyruvat mit Glycolaldehyd-Dehydrogenase und/oder Lactat-Dehydrogenase und NAD+
In 2 ml Eppendorf-Vials wurden folgende Komponenten vorgelegt: 100 pl eines 500 mM TEA-HCl-Puffers (pH 8,5; finale Konzentration 100 mM), 0,1 U Lactat-Dehydrogenase (als Lysat) und/oder 0,1 U Glycolaldehyd-Dehydrogenase (als Lysat) und Kofaktor-Lösung (NADH, NAD+). Die finalen Enzymeinheiten und Kofaktor-Konzentrationen in den Ansätzen sind in der untenstehenden Tabelle angeführt. Alle Ansätze wurden mit einer entsprechenden Menge an deionisiertem Wasser auf 400 pl aufgefüllt.
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 100 pl einer Substrat-Lösung (50 mM Natrium-Pyruvat und 50 mM Glycolaldehyd in deionisiertem Wasser) gestartet. Die Ansätze wurden 1 h bei 30 °C und 1200 rpm in einem Eppendorf-Thermomixer inkubiert. Das Gesamtvolumen der Ansätze betrug je 500 pl.
Zur Aufarbeitung wurden 200 pl eines Ansatzes mit 200 pl MeOH versetzt und bei 60 °C für 20 min inkubiert (1200 rpm, Eppendorf Thermomixer). Nach der Denaturierung wurden die Proben 10 min bei max. g zentrifugiert. Der klare Überstand wurde 1:100 verdünnt und mittels HPAEC (Leitfähigkeitsdetektion) vermessen (Bestimmung von Pyruvat und Lactat). Für die HPLC (Rl-Detektion) wurden 150 pl des klaren Überstands in HPLC-Vials überführt und vermessen (Bestimmung von Glycolat und Glycolaldehyd*). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle dargestellt.
Die Konzentrationen von Glycolaldehyd und Pyruvat betrugen in allen Ansätzen 10 mM.
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* Die Glycolaldehyd-Konzentration kann aufgrund der Peak-Überlappung von Lactat und Glycolaldehyd in der HPLC nicht eindeutig bestimmt werden.
Der Tabelle kann entnommen werden, dass bei gleichzeitigem Einsatz von Lactat-Dehydrogenase und Glycolaldehyd-Dehydrogenase die Ausbeuten an Glycolat und Lactat (Ansatz 1) bei gleichen NAD+/NADH-Konzentrationen (10 mM) im Vergleich zu den Ansätzen 3 (nur Glycolaldehyd-DH) und 4 (nur Lactat-Dehydrogenase) signifikant gesteigert werden (Lactat: 5,9 mM auf 7,9 mM; Glycolat: 4,7 mM auf 9,9 mM). Literatur
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer wässerigen Lösung enthaltend ein Alkalisalz der Glycolsäure und der Milchsäure, indem ein Alkalisalz der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in einer wässerigen Lösung in vitro mit einem Enzymsystem behandelt wird, welches eine Dehydratase, eine Aldolase, eine Glycolaldehyd-Dehydrogenase, eine Lactat-Dehydrogenase sowie NAD+ als Kofaktor enthält, wonach das Enzymsystem abgetrennt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Alkalisalzes der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in der wässerigen Lösung 50 - 300 g/l ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Alkalisalzes der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in der wässerigen Lösung 100 - 200 g/l ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Konzentration des Alkalisalzes der Xylonsäure und/oder der Arabonsäure in der wässerigen Lösung 150 - 250 g/l ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 20 und 50 °C durchgeführt wird.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 25 und 40 °C durchgeführt wird.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es bei einer Temperatur zwischen 30 und 40 °C durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die das
Enzymsystem bildenden Enzyme als Lysat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vorliegen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die das
Enzymsystem bildenden Enzyme als Homogenat der entsprechenden, sie bildenden Zellen vorliegen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die das Enzymsystem bildenden Enzyme als Suspension der entsprechenden, sie bildenden Zellen vorliegen.
11. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der pH-Wert zwischen 7,5 und 8,5 liegt.
PCT/EP2023/079260 2022-10-20 2023-10-20 Verfahren zur herstellung einer wässerigen lösung enthaltend ein alkalisalz der glycolsäure und der milchsäure WO2024084032A1 (de)

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