TWI719317B - 用於生產乳酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本發明揭示一種以生質製備乳酸的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種和/或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株培養於一含有糖蜜以及玉米浸液的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中獲得該菌株的種菌培養物；以及利用該菌株的種菌培養物來對該生質進行發酵；其中，該生質包含一可發酵糖以及該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc 基因被刪除、破壞或已失效。

Description

用於生產乳酸的方法
本發明是有關於一種以生質製備乳酸的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種和/或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株培養於一含有糖蜜以及玉米浸液的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中獲得該菌株的種菌培養物；以及利用該菌株的種菌培養物來對該生質進行發酵；其中，該生質包含一可發酵糖以及該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc 基因被刪除、破壞或已失效。
乳酸(lactic acid)是一種具有發展價值的化合物，它被廣泛地應用於食品、化妝品(cosmetic)、藥品(pharmaceutical)以及化學工業(chemical industry)，特別是現今環保意識抬頭，乳酸經常被用來合成生物可降解塑膠(biodegradable plastics)。近年來，在物質和原料逐漸缺乏的情況下，藉由廢棄物再利用的方式來產生生質能(biomass energy)已開始受到重視，其中纖維素生質(cellulosic biomass)是較常被使用的可再生能量資源(renewable energy resources)之一。目前有許多化學方法或生物學方法可以將纖維素生質轉換成乳酸(lactic acid)，由於生物學方法對於生態環境較為友善並且所需要的成本較為低廉，因此，在產業應用上，生物學方法已被廣泛地用來處理有機廢棄物(organic waste)。
生物學方法主要是利用微生物發酵來將纖維素生質轉化成為乳酸，而乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)[包括乳桿菌屬(Lacto bacill us )、乳球菌屬(Lactococcu s )、小球菌屬(Pedio coccus )、腸球菌屬(Enterococcu s )、鏈球菌屬(Streptococcus )以及芽孢桿菌屬(Bacillus )]是最常被用來發酵產乳酸的微生物。
在利用纖維素生質來生成乳酸的過程中通常會得到一纖維素生質水解液(cellulosic biomass hydrolysate)，該纖維素生質水解液除了含有還原糖(reducing sugars)(包括五碳糖以及六碳糖)之外，還會含有因著半纖維素(hemicellulose)與還原糖之降解所產生的發酵抑制物[例如醋酸、糠醛(furfural)、羥甲糠醛(hydroxymethyl furfural, HMF)、乙醯丙酸(levulinic acid)以及酚類化合物(phenolic compounds)等]，這些發酵抑制物會抑制微生物的生長與發酵，而使得還原糖的利用率無法獲得有效提升，甚至會被降低，進而影響乳酸的產量。
為了降低發酵抑制物所造成的不利影響，已有研究是藉由對菌種進行馴化(acclimation)來提高微生物對於這些發酵抑制物的耐受性，並促使微生物能有效利用還原糖來生成乳酸。例如，在Jiang T.et al . (2016),PLoS One. , 11:e0149101中，Jiang T.等人藉由以氦氣為基礎的氛圍與室溫電漿(Helium-based atmospheric and room temperature plasma, Helium-based ARTP)來對凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans ) NL01分離株進行突變，而得到一突變株，然後將該突變株培養於玉米稈之經濃縮的稀酸水解液[condensed dilute-acid hydrolysate (CDH) of corn stover]來進行演化實驗(evolution experiment)，藉此而得到一高抑制物-耐受性的突變株(high inhibitor-tolerance mutant)(它被命名為凝結芽孢桿菌GKN316分離株)。接著，將凝結芽孢桿菌NL01分離株與GKN316分離株分別接種至含有25%以及50% CDH的木糖培養基(xylose medium)中並進行發酵培養，繼而將所得到之培養物拿來進行細胞生長(cell growth)與乳酸產率(lactic acid yield)的分析。實驗結果顯示，無論是使用含有25%或50% CDH的木糖培養基來進行發酵培養時，凝結芽孢桿菌GKN316分離株的生長速度以及乳酸產率皆高於凝結芽孢桿菌NL01分離株所具者，特別是在使用含有50% CDH的木糖培養基來進行發酵培養時，凝結芽孢桿菌GKN316分離株與NL01分離株之間存在有明顯的差異性。
已知大多數的酵母菌(yeast)因不具有LDH 基因[其編碼乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)]，而使得它們在發酵產乳酸上的效率較低，甚至是無法生產乳酸。因此，有研究藉由對酵母菌進行基因修飾(gene modification)來使其具有生產乳酸的能力或提高乳酸的產量。例如，在Ikushima S.et al . (2009),Biosci. Biotechnol. Biochem., 73:1818-1824中，Ikushima S.等人將高蛋白假絲酵母菌(Candida utilis )的pdc 基因[其編碼丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)]剔除，而得到一Cupdc1 無效突變株(Cupdc1 -null mutant)。接著，在CuPDC1 啟動子(CuPDC1 promoter)的調控下，將來自於家牛(Bos taurus )的2個LDH 基因複本併入至該Cupdc1 無效突變株的基因體中，由此所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌Cupdc1 Δ 4-LDH2菌株 (recombinantCandida utilis Cupdc1 Δ 4-LDH2 strain)經由發酵實驗而被證實具有優異的乳酸生成效率(efficiency of lactic acid production)。在Tamakawa H.et al . (2012),J. Biosci. Bioeng ., 113:73-75中，Tamakawa H.等人進一步將木糖-發酵細菌(xylose-fermentation bacteria)中與木糖代謝路徑有關聯的基因(包括xr 基因、xdh 基因以及xk 基因)導入至依據Ikushima S.et al . (2009)(同上述)當中所述方法而被製備的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株中，由此所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌XR/XDH/XK菌株(recombinantCandida utilis XR/XDH/XK strain)可以有效地共發酵五碳糖與六碳糖，進而提高乳酸的產量。
許多食品工業的副產物由於富含許多可供微生物生長所需的營養源(nutrient source)，因而具有可供再利用的價值。已有研究指出，使用含有糖蜜和/或玉米浸液的發酵培養基來進行發酵，可以促進乳酸菌細胞的增生，進而提升乳酸的產量。例如，在Lee K.B.et al. (2013),Afr. J. Biotechnol. , 12:2013-2018中，Lee K.B.等人將唾液乳酸桿菌(Lactobacillus salivarius ) L29分離株培養於MRS肉湯培養基(MRS broth)中而得到一接種源，接著將該接種源接種至含有不同濃度[包括2%、4%、6%、8%以及10% (v/v)]的蔗糖蜜與不同濃度[包括2%、4%、6%、8%以及10% (v/v)]的玉米浸液之發酵培養基中並進行發酵培養，繼而將所得到之培養物拿來進行活細胞數目(number of viable cell)與乳酸產率(lactic acid yield)的分析。實驗結果顯示，使用含有6% (v/v)的蔗糖蜜與6% (v/v)的玉米浸液之發酵培養基來進行培養可以促進唾液乳酸桿菌L29分離株的生長，並且提高乳酸產量。
雖然已存在有上述文獻報導，申請人仍致力於發展一種可供工業發酵產業更有效地利用生質來生產乳酸的方法，特別地，該方法不需要對纖維素生質水解液進行去毒處理，而是以含有糖蜜與玉米浸液的種菌培養基來對芽孢桿菌屬物種或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株進行種菌培養，由此所得到的種菌培養物(seed culture)對於發酵製程中所產生的抑制物(例如醋酸、糠醛以及羥甲糠醛等)具有優異的抵抗性，因此能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。
發明概要
於是，本發明提供一種以生質製備乳酸的方法，其包括： 將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種和/或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株培養於一含有糖蜜以及玉米浸液的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中獲得該菌株的種菌培養物；以及 利用該菌株的種菌培養物來對該生質進行發酵； 其中，該生質包含一可發酵糖以及該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc 基因被刪除、破壞或已失效。
發明的詳細說明
要被瞭解的是：若有任何一件前案刊物在此被引述，該前案刊物不構成一個下述承認：在台灣或任何其他國家之中，該前案刊物形成本技藝中的常見一般知識之一部分。
為了這本說明書之目的，將被清楚地瞭解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限於”，以及文字“包括(comprises)”具有一對應的意義。
除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同瞭解的意義。一熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述於本文中者相似或等效的方法和材料，它們可被用於實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料之限制。為表清楚，下面的界定被使用於本文中。
相較於化學方法，利用微生物發酵來將纖維素生質(cellulosic biomass)轉換成乳酸因為對於生態環境較為有利並且較少能源上的需求而受到重視。然而，在利用纖維素生質來生成乳酸的過程中通常會伴隨著發酵抑制物的生成，進而影響微生物的發酵能力以及乳酸產量。為了讓微生物能有效地利用纖維素生質來產乳酸，申請人經由研究發現，以含有糖蜜與玉米浸液的種菌培養基來對芽孢桿菌屬物種或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株進行種菌培養，由此所製得的種菌培養物對於發酵製程中所產生的抑制物具有優異的抵抗性，因而可以有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，並達到提升乳酸產率之目的。
於是，本發明提供一種以生質製備乳酸的方法，其包括： 將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種和/或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株培養於一含有糖蜜以及玉米浸液的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中獲得該菌株的種菌培養物；以及 利用該菌株的種菌培養物來對該生質進行發酵； 其中，該生質包含一可發酵糖以及該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc 基因被刪除、破壞或已失效。
依據本發明，該生質(biomass)可以是一纖維素生質(cellulosic biomass)、一半纖維素生質(hemicellulosic biomass)、一木質纖維素生質(lignocellulosic biomass)，或它們的一混合物。在本發明的一個較佳具體例中，該生質是一纖維素生質。
適用於本發明的纖維素生質包括，但不限於：生物能源作物(bioenergy crops)、農業殘餘物(agricultural residues)、都市固體廢棄物(municipal solid waste)、工業固體廢棄物(industrial solid waste)、來自造紙的淤泥(sludge from paper manufacture)、庭園廢棄物(yard waste)、廢材(wood waste)與林業廢棄物(forestry waste)，以及它們的組合。
較佳地，該纖維素生質是選自於下列所構成的群組：芒草(miscanthus)、軟木(softwood)、硬木(hardwood)、玉米穗軸(corn cobs)、作物殘渣(crop residues)[諸如玉米殼(corn husks)]、玉米秸稈(corn stover)、禾草(grasses)、麥稈(wheat straw)、大麥稈(barley straw)、乾草(hay)、稻稈(rice straw)、柳枝稷(switchgrass)、廢紙(waste paper)、甘蔗渣(sugarcane bagasse)、蜀黍植物材料(sorghum plant material)、大豆植物材料(soybean plant material)、得自穀粒(grains)之研磨的組分、樹木、樹枝、根、葉、木屑(sawdust)、灌木(shrubs)與灌木叢(bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它們的組合。
依據本發明，該生質是藉由對纖維素生質進行糖化(saccharification)而產生的一纖維素生質水解液(cellulosic biomass hydrolysate)。
依據本發明，該生質在進行糖化之前可被進行一前處理(pretreatment)。
適用於本發明的前處理包括，但不限於：蒸氣爆裂(steam explosion)、熱化學前處理法(thermal chemical pretreatment)、機械粉碎、酸處理、有機溶解(organosolve)、亞硫酸鹽前處理(sulfite pretreatment)，以及它們的組合。
如本文中所使用的，術語“纖維素生質水解液(cellulosic biomass hydrolysate)”與“木質纖維素生質水解液(lignocellulosic biomass hydrolysate)”係可被交替地使用。
在本發明的一個較佳具體例中，該纖維素生質水解液是藉由對稻稈依序進行稀酸處理(dilute acid treatment)、蒸氣爆裂處理(steam explosion treatment)以及糖化而被製得。
依據本發明，該纖維素生質水解液包含至少一種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物：醋酸、糠醛、羥甲糠醛、乙醯丙酸以及酚類化合物。
較佳地，該纖維素生質水解液含有1至8 g/L的醋酸。更佳地，該纖維素生質水解液含有3至7 g/L的醋酸。
較佳地，該纖維素生質水解液含有0.5至7 g/L的糠醛。更佳地，該纖維素生質水解液含有1至6 g/L的糠醛。
較佳地，該纖維素生質水解液含有0.5至7 g/L的羥甲糠醛。更佳地，該纖維素生質水解液含有1至6 g/L的羥甲糠醛。
較佳地，該纖維素生質水解液含有1至8 g/L的乙醯丙酸。更佳地，該纖維素生質水解液含有3至7 g/L的乙醯丙酸。
較佳地，該纖維素生質水解液含有0.1至5 g/L的酚類化合物。更佳地，該纖維素生質水解液含有0.5至4 g/L的酚類化合物。
如本文中所使用的，術語“可發酵糖(fermentable sugars)”意指在一發酵製程(fermentation process)中可被微生物作為碳源來使用的單醣(monosaccharide)以及寡醣(oligosaccharide)。較佳地，該可發酵糖包含一種五碳糖以及一種六碳糖。在本發明的一個較佳具體例中，該可發酵糖包含葡萄糖與木糖。
如本文中所使用的，術語“芽孢桿菌屬物種”意欲涵蓋所有能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種的菌株，適用於本發明的芽孢桿菌屬物種的菌株包括，但不限於，源自於下列的菌株：凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans )、枯草桿菌(Bacillus subtilis )、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens )、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium )、甲基營養型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus )，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該芽孢桿菌屬物種是凝結芽孢桿菌。
如本文中所使用的，術語“重組型假絲酵母菌屬物種”意欲涵蓋所有能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的重組型假絲酵母菌屬物種的菌株，其中該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc 基因被刪除、破壞或已失效。
如本文中所使用的，術語“刪除(delete)”意指刪除一基因之全部或部分的編碼區域。
如本文中所使用的，術語“破壞(disrupt)”意指在一基因中進行核苷酸的刪除、插入(insertion)或突變(mutation)，而使得該基因無法表現產生一活性酵素(active enzyme)，或使該基因表現產生一具有被嚴重降低活性(severely reduced activity)的酵素。
如本文中所使用的，術語“已失效(disable)”意指一基因或其所編碼的蛋白質被去活化(inactive)，進而失去原有的活性或功能。
依據本發明，適用於本發明的重組型假絲酵母菌屬物種的菌株包括，但不限於，源自於下列的菌株：重組型高蛋白假絲酵母菌(recombinantCandida utilis )、重組型博伊丁假絲酵母(recombinantCandida boidinii )、重組型熱帶念珠菌(recombinantCandida tropicalis )、重組型近平滑念珠菌(recombinantCandida parapsilosis )，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該重組型假絲酵母菌屬物種是重組型高蛋白假絲酵母菌(recombinantCandida utilis )。
依據本發明，該重組型高蛋白假絲酵母菌的基因組DNA進一步包括一編碼木糖還原酶(xylose reductase, XR)的基因、一編碼木酮糖激酶(xylulose kinase, XK)的基因及一編碼木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)的基因。
在本發明的一個較佳具體例中，該重組型假絲酵母菌屬物種是藉由將一株以寄存編號BCRC 20325被寄存於食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心(BCRC of FIRDI)的高蛋白假絲酵母菌[亦以寄存編號ATCC 9950被寄存於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)]之基因組DNA中的pdc 基因[其編碼丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)]進行剔除並導入LDH 基因[其編碼乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)]、xr 基因、xk 基因及xdh 基因至該高蛋白假絲酵母菌的基因組DNA中而製得。
如本文中所使用的，術語“糖蜜(molasses)”意指在精製來自於一植物的糖的過程中在移去糖膏(massecuite)中的蔗糖結晶(sucrose crystal)後所得到之殘餘的糖漿(syrup)。適用於本發明的糖蜜種類沒有特別限制，而可包括各種商業上可購得的產品。較佳地，該糖蜜是選自於由下列所構成的群組：蔗糖蜜、甜菜糖蜜、柑橘糖蜜、玉米糖蜜，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該糖蜜是蔗糖蜜。
如本文中所使用的，術語“玉米浸液(corn steep liquor)”意指在玉米濕磨製程中藉由稀酸浸泡玉米所得到的濃縮液。適用於本發明的玉米浸液種類沒有特別限制，而可包括各種商業上可購得的產品。
依據本發明，當該菌株是重組型假絲酵母菌屬物種時，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在4至6% (v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在1至3% (v/v)的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一為6% (v/v)的濃度，該玉米浸液具有一為3% (v/v)的濃度。
依據本發明，當該菌株是芽孢桿菌屬物種時，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一範圍落在6至7% (v/v)的濃度，該玉米浸液具有一範圍落在6.5至7.5% (v/v)的濃度。在本發明的一個較佳具體例中，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，該糖蜜具有一為6% (v/v)的濃度，該玉米浸液具有一為7% (v/v)的濃度。
依據本發明，該發酵步驟是在實質上沒有糖蜜以及玉米浸液的條件下被進行。
如本文中所使用的，術語“實質上沒有(substantially free of)”意指一被具體指明的成分缺少有意義的數量。較佳地，該發酵步驟是在完全沒有該成分的條件下被進行，或者該成分的數量對於該發酵步驟不具有可測量的影響(measurable effect)。
較佳實施例之詳細說明
本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應瞭解的是，該等實施例僅是供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。實施例 一般實驗材料： 1. 製備重組型高蛋白假絲酵母菌(recombinantCandida utilis )的接種源：
在下面實驗中所使用的高蛋白假絲酵母菌是一種能夠藉由消耗五碳糖與六碳糖來產生乳酸的重組型高蛋白假絲酵母菌，其大體上是依據Ikushima S.et al . (2009)(同上述)以及Tamakawa H.et al . (2012)(同上述)當中所述的方法而被製備。簡言之，首先，依據Ikushima S.et al . (2009)(同上述)當中所述的方法，將一高蛋白假絲酵母菌BCRC 20325 [購自於台灣的食品工業發展研究所(Food Industry Research and Development Institute, FIRDI)的生物資源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center, BCRC)(300新竹市食品路331號，台灣)，亦以寄存編號ATCC 9950被寄存於美國類型培養物收集中心(American Type Culture Collection, ATCC)]的pdc 基因[其編碼丙酮酸去羧酶(pyruvate decarboxylase, PDC)]剔除，繼而將來自於牛(bovine)的LDH 基因[其編碼乳酸去氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)]插入(insert)至該經剔除的pdc 基因位置中，藉此而得到一能夠表現LDH 基因的ΔPDC 突變菌株。接著，依據Tamakawa H.et al . (2012)(同上述)當中所述的方法，將一編碼木酮糖激酶(xylulose kinase, XK)的基因、一編碼木糖還原酶(xylose reductase, XR)的基因以及一編碼木糖醇脫氫酶(xylitol dehydrogenase, XDH)的基因導入至該ΔPDC 突變菌株的基因組DNA中，由此所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌能夠藉由消耗葡萄糖與木糖來產生乳酸。 2. 在下面實施例中所使用的凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans ) BCRC 910831已於西元2018年3月2日被寄存於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)，亦以寄存編號CCTCC M 2018310被寄存於中國典型培養物保藏中心(China Center for Type Culture Collection, CCTCC)。 3. 在下面實施例中，被拿來作為比較之用的重組型釀酒酵母菌(recombinantSaccharomyces cerevisiae )是得自於申請人先前美國專利案US 9382557 B2，並已以寄存編號DSM 26705被寄存於德國微生物以及細胞培養物收集中心有限公司(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ)，亦以寄存編號BCRC 920083被寄存於台灣的食品工業發展研究所(FIRDI)的生物資源保存及研究中心(BCRC)。 4. 在下面實施例中，用於配製種菌培養基的蔗糖蜜(cane molasses)以及玉米浸液(corn steep liquor)分別是購自於台灣糖業股份有限公司(Taiwan Sugar Corporation)以及豐年豐和企業股份有限公司(Fonen And FonHer Enterprise Co., LTD)，其中蔗糖蜜含有435 g/L的蔗糖、36.5 g/L的葡萄糖以及86 g/L的果糖，而玉米浸液含有60.88% (w/w)的水、17.67% (w/w)的粗蛋白質、6.49% (w/w)的粗灰分以及177.94 ppm的二氧化硫。 5. 在下面實施例中所使用的葡萄糖以及木糖是購自於景明化工股份有限公司(Echo Chemical Co., LTD)。 6. 在下面實施例中所使用的乳酸、醋酸、糠醛(furfural)、羥甲糠醛(hydroxymethylfurfural, HMF)、乙醯丙酸(levulinic acid)以及CaCO3 是購自於Sigma-Aldrich。 7. 在下面實施例中所使用的YPD40培養基具有一如下面表1所示的配方。 表1. YPD40培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0001
 8. 在下面實施例中所使用的YPD50培養基具有一如下面表2所示的配方。 表2. YPD50培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0002
 9. 在下面實施例中，用於發酵培養重組型高蛋白假絲酵母菌的發酵培養基具有一如下面表3所示的配方。 表3. 用於發酵培養重組型高蛋白假絲酵母菌的發酵培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0003
 10. 在下面實施例中，用於發酵培養凝結芽孢桿菌BCRC 910831的發酵培養基具有一如下面表4所示的配方。 表4. 用於發酵培養凝結芽孢桿菌BCRC 910831的發酵培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0004
 一般實驗方法： 1. 高效能液相層析(high performance liquid chromatography, HPLC)分析：
在下面的實施例中，被用來進行HPLC分析的待測樣品中所含有的成分及其濃度(g/L)是參考美國國家再生能源實驗室(National Renewable Energy Laboratory, NREL)所頒布的有關標準生物質分析之實驗室分析程序(laboratory analytical procedures, LAPs)，並藉由使用一配備有一個折射率偵測器(refractive index detector, RI detector)(L2400, Hitachi)的高效能液相層析儀(DIONEX Ultimate 3000)來進行測定，其中所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為Aminex HPX-87H管柱(BioRad)；流動相：5 mM硫酸(配於水中)；流速被控制為0.6 mL/分鐘；樣品注射體積為20 μL；管柱烘箱(column oven)溫度控制在65℃；RI溫度控制在45℃。實施例1. 在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與3% (v/v) 的玉米浸液之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成6組，其中包括5個實驗組(亦即實驗組1至5)以及1個對照組。接著，將實驗組1至5的菌株分別接種至具有如下面表5中所示的配方之種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表1中所示的YPD40培養基(100 mL)中。 表5. 各個實驗組的種菌培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0005
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(30℃、150-200 rpm)內並於一好氧條件下進行培養歷時24小時，而使得該培養物的OD600 值能達至20 (約4.6 g菌體/L)。接著，所形成的細菌培養物以6,000 g來進行離心歷時10分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用無菌水予以清洗1次，繼而以如上面表3中所示的發酵培養基來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物。
之後，將各組種菌培養物分別以4×108 細胞/mL的接種量接種於一含有100 mL的如上面表3中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一好氧條件下以及一恆溫培養箱(33℃、100-150 rpm)中進行發酵反應歷時72小時。
之後，所得到的各組發酵培養物以16,800 rpm來進行離心歷時1分鐘，接著收集上澄液[即發酵產物(fermentation product)]並依據上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來進行乳酸含量的分析。
乳酸產率是藉由將所測得的乳酸含量以及發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量以及木糖含量代入下列公式(1)而被計算出：公式 (1) ： A ＝ [B/(C+D)] × 100 其中：A＝乳酸產率(%) B＝所測得的乳酸含量(g/L) C＝發酵前發酵培養基中所含有的葡萄糖含量(g/L) D＝發酵前發酵培養基中所含有的木糖含量(g/L) 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖1中。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，由含有4、5或6% (v/v)的蔗糖蜜與3% (v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物皆能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率，其中以含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基之效果最佳。實施例2. 在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成4組，其中包括3個實驗組(亦即實驗組1至3)以及1個對照組。接著，將實驗組1至3的菌株分別接種至具有如下面表6中所示的配方之種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表1中所示的YPD40培養基(100 mL)中。 表6. 各個實驗組的種菌培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0006
之後，依照實施例1當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算。 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖2中。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，由含有1或3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率，其中以含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基之效果最佳。實施例3. 在存在有不同的發酵抑制物的發酵條件下，由含有3% (v/v) 的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響
於本實施例中，申請人使用含有醋酸、糠醛或羥甲糠醛的發酵培養基來模擬含有醋酸、糠醛或羥甲糠醛的生質(例如，纖維素生質水解液)，並探討依據本發明所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物在發酵過程中對於不同發酵抑制物的抵抗性。 實驗方法： A、 含有 不同濃度的醋酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)。接著，將各個實驗組的菌株分別接種至含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基(100 mL)中，以及將各個對照組的菌株分別接種至如上面表1中所示的YPD40培養基(100 mL)中。
之後，依照實施例1當中所述的方式來進行種菌培養物的製備與發酵反應，不同之處在於：各組菌株在一好氧條件下進行培養所得到的培養物的OD600 值達至12 (約2.76 g菌體/L)，以及所得到的種菌培養物是以2.4×108 細胞/mL的接種量來進行發酵反應歷時48小時。而有關各組的發酵培養基大體上是參照上面表3中所示的配方來進行製備，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸濃度是分別依據下面表7中所示者來作調整。 表7. 各組發酵培養基的醋酸濃度
Figure 107120357-A0304-0007
之後，所得到的各組發酵培養物是參照實施例1當中所述的方式來進行乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算。B、 含有不同濃度的糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)，接著，依照上面第A項當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸被替換為下面表8中所示之不同濃度的糠醛。 表8. 各組發酵培養基的糠醛濃度
Figure 107120357-A0304-0008
 C、 含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)，接著，依照上面第A項當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸被替換為下面表9中所示之不同濃度的羥甲糠醛。 表9. 各組發酵培養基的羥甲糠醛濃度
Figure 107120357-A0304-0009
 結果 ： A、 含有 不同濃度的醋酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖3中。這個實驗結果顯示，在存在有0.3、0.5或0.7% (w/v)的醋酸的發酵條件下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。B、 含有不同濃度的糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖4中。這個實驗結果顯示，在存在有0.1、0.3或0.5% (w/v)的糠醛的發酵條件下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。C、 含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖5中。這個實驗結果顯示，在存在有0.1、0.3或0.5% (w/v)的羥甲糠醛的發酵條件下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。
基於上述的實驗結果，申請人認為：由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵製程中所產生的抑制物(即醋酸、糠醛以及羥甲糠醛)具有優異的抵抗性，因此能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。實施例4. 在存在有不同的發酵抑制物的發酵條件下，由含有3% (v/v) 的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型釀酒酵母菌(recombinantSaccharomyces cerevisiae ) 的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響
於本實施例中，申請人使用重組型釀酒酵母菌BCRC 920083作為試驗菌株，並使用含有醋酸、糠醛或羥甲糠醛的發酵培養基來模擬含有醋酸、糠醛或羥甲糠醛的生質(例如，纖維素生質水解液)，俾以評估由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型釀酒酵母菌BCRC 920083的種菌培養物在發酵過程中對於不同發酵抑制物的抵抗性。 實驗方法：
首先，將重組型釀酒酵母菌菌株BCRC 920083分成6組，其中包括3個實驗組(亦即實驗組1至3)以及3個對照組(亦即對照組1至3)，接著，依照實施例3的“實驗方法”的第A項當中所述的方法來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基所含有的發酵抑制物及濃度是分別依據下面表10中所示者來作調整。 表10. 各組發酵培養基所含有的發酵抑制物及濃度
Figure 107120357-A0304-0010
 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖6中。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸、糠醛或羥甲糠醛的發酵條件下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型釀酒酵母菌BCRC 920083的種菌培養物對於發酵製程中所產生的抑制物(即醋酸、糠醛以及羥甲糠醛)不具有抵抗性，因而無法有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乳酸。實施例5. 使用 一 經稀酸催化蒸氣爆裂的稻稈 纖維素生質水解液作 為基質對於由含有3% (v/v) 的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物在發酵生成乳酸上的影響
於本實施例中，申請人使用一經稀酸催化蒸氣爆裂的稻稈纖維素生質水解液作為基質，並探討由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物利用該基質來發酵生成乳酸的情形。 實驗材料： 1. 稻稈纖維素生質水解液(cellulosic biomass hydrolysate of rice straw)之製備：
首先，將稻稈(得自於弘遠農產商行)切成適當的尺寸，繼而以粉碎機予以粉碎，接著加入3% (w/w)硫酸溶液並予以充分混合，然後在121℃下進行反應歷時120至180分鐘。之後，使用立式壓榨機(vertical press)(購自於豐映科技股份有限公司)在一為1 MPa的壓力下來進行壓榨，繼而分別收取液體與固體部分。接著，將該固體部分置於一蒸氣爆裂反應系統(購自於七福工業股份有限公司)，繼而通入蒸氣並在一為190至200℃的溫度下進行加熱歷時3至5分鐘。接著，將該蒸氣爆裂反應系統的壓力快速地降低至1 atm，以進行蒸氣爆裂處理，然後收集所得到的渣料(pulp)，繼而加入上述固液分離步驟所收取的液體並予以充分混合。接著，利用NaOH將所得到的混合物的初始pH值調整至5.5，繼而加入一由纖維素酶(cellulase)與半纖維素酶(hemicellulase)所構成之混合物(Novozymes Cellic® CTec3，使用量為30 FPU/克纖維素生質)，並在一為50℃的溫度下以及一為70 rpm的攪拌速率下進行糖化作用(saccharification)歷時72小時，並且在糖化作用開始之後的第2、4、8以及24小時，對該混合物添加5 N的NaOH溶液以使其pH值被維持在5.0，藉此而得到一經酸催化蒸氣爆裂的稻稈纖維素生質水解液(下面簡稱“稻稈纖維素生質水解液”)。之後，依據上面“一般實驗方法”的第1項「高效能液相層析分析」當中所述的方法來分析該稻稈纖維素生質水解液中的醣類以及抑制物的濃度，而分析結果顯示出該稻稈纖維素生質水解液含有7% (w/v)葡萄糖、1.5% (w/v)木糖、0.3% (w/v)醋酸、0.1% (w/v)糠醛以及0.05% (w/v)羥甲糠醛。 實驗方法：
首先，將依據上面“一般實驗材料”的第1項所得到的重組型高蛋白假絲酵母菌菌株分成1個實驗組以及1個對照組。接著，將實驗組的菌株接種至含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表1中所示的YPD40培養基(100 mL)中。
之後，依照實施例1當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：以稻稈纖維素生質水解液作為發酵培養基，以及將發酵反應時間調整至48小時。 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖7中。這個實驗結果顯示，在使用稻稈纖維素生質水解液作為基質下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。實施例6. 在 存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與7% (v/v) 的玉米浸液之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831 的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響 實驗方法：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成7組，其中包括6個實驗組(亦即實驗組1至6)以及1個對照組。接著，將實驗組1至6的菌株分別接種至具有如下面表11中所示的配方之種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表2中所示的YPD50培養基(100 mL)中。 表11. 各個實驗組的種菌培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0011
之後，將各組菌株置於一恆溫振盪培養箱(50℃、150 rpm)內並於一好氧條件下進行培養歷時24小時，而使得該培養物的OD420 值能達到8 (約0.8 g菌體/L)。接著，所形成的細菌培養物以6,000 g來進行離心歷時10分鐘，然後收集細胞沉澱物並使用無菌水予以清洗1次，繼而以如上面表4中所示的發酵培養基來充份懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物。
之後，將各組種菌培養物分別以4×109 細胞/mL的接種量接種於一含有100 mL的如上面表4中所示的發酵培養基的錐形瓶中，然後於一厭氧條件下以及一恆溫培養箱(50℃、150 rpm)中進行發酵反應歷時48小時。
之後，所得到的各組發酵培養物是參照實施例1當中所述的方式來進行乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算。 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖8中。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，由含有6或7% (v/v)的蔗糖蜜與7% (v/v)的玉米浸液之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物皆能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率，其中以含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基之效果最佳。實施例7. 在 存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831 的 種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響 實驗方法：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成7組，其中包括6個實驗組(亦即實驗組1至6)以及1個對照組。接著，將實驗組1至6的菌株分別接種至具有如下面表12中所示的配方之種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表2中所示的YPD50培養基(100 mL)中。 表12.各個實驗組的種菌培養基的配方
Figure 107120357-A0304-0012
之後，依照實施例6當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：將發酵反應時間調整至72小時。 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖9中。這個實驗結果顯示，在存在有醋酸的發酵條件下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物能夠有效的提升發酵製程的乳酸產率。實施例8. 在 存在有不同的發酵抑制物的發酵條件下，由含有7% (v/v) 的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831 的種菌培養物對於發酵製程的乳酸產率的影響
於本實施例中，申請人使用含有醋酸、糠醛、羥甲糠醛或乙醯丙酸的發酵培養基來模擬含有醋酸、糠醛、羥甲糠醛或乙醯丙酸的生質(例如，纖維素生質水解液)，並探討依據本發明所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物在發酵過程中對於不同發酵抑制物的抵抗性。 實驗方法： A、 含有 不同濃度的醋酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)。接著，將各個實驗組的菌株分別接種至含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基(100 mL)中，以及將各個對照組的菌株分別接種至如上面表2中所示的YPD50培養基(100 mL)中。
之後，依照實施例6當中所述的方式來進行種菌培養物的製備與發酵反應，不同之處在於：將發酵反應時間調整至72小時。而有關各組的發酵培養基大體上是參照上面表4中所示的配方來進行製備，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸濃度是分別依據下面表13中所示者來作調整。 表13. 各組發酵培養基的醋酸濃度
Figure 107120357-A0304-0013
之後，所得到的各組發酵培養物是參照實施例1當中所述的方式來進行乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算。B、 含有不同濃度的糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)。接著，依照上面第A項當中所述的方法來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸被替換為下面表14中所示之不同濃度的糠醛。 表14. 各組發酵培養基的糠醛濃度
Figure 107120357-A0304-0014
 C、 含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)。接著，依照上面第A項當中所述的方法來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸被替換為下面表15中所示之不同濃度的羥甲糠醛。 表15. 各組發酵培養基中的羥甲糠醛濃度
Figure 107120357-A0304-0015
 D、 含有不同濃度的乙醯丙酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成8組，其中包括4個實驗組(亦即實驗組1至4)以及4個對照組(亦即對照組1至4)。接著，依照上面第A項當中所述的方法來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：各組發酵培養基的醋酸被替換為下面表16中所示之不同濃度的乙醯丙酸。 表16. 各組發酵培養基的乙醯丙酸濃度
Figure 107120357-A0304-0016
 結果 ： A、 含有 不同濃度的醋酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖10中。這個實驗結果顯示，在存在有0.3、0.5或0.7% (w/v)的醋酸的發酵條件下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。B、 含有不同濃度的糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖11中。這個實驗結果顯示，在存在有0.2、0.4或0.6% (w/v)的糠醛的發酵條件下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。C、 含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖12中。這個實驗結果顯示，在存在有0.2、0.4或0.6% (w/v)的羥甲糠醛的發酵條件下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。D、 含有不同濃度的乙醯丙酸的發酵培養基對於乳酸產率的影響：
本實驗所測得的結果被顯示於圖13中。這個實驗結果顯示，在存在有0.3、0.5或0.7% (w/v)的乙醯丙酸的發酵條件下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物皆能夠有效地提升發酵製程的乳酸產率。
基於上述的實驗結果，申請人認為：由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物對於發酵製程中所產生的抑制物(即醋酸、糠醛、羥甲糠醛以及乙醯丙酸)具有優異的抵抗性，因此能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。實施例9. 使用 一 經稀酸催化蒸氣爆裂的稻稈 纖維素生質水解液作 為基質對於由含有7% (v/v) 的玉米浸液與6% (v/v) 的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌 BCRC 910831 的種菌培養物在發酵生成乳酸上的影響
於本實施例中，申請人使用依據上面實施例5所得到的稻稈纖維素生質水解液作為基質，並探討由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物利用該基質來發酵生成乳酸的情形。 實驗方法：
首先，將凝結芽孢桿菌BCRC 910831菌株分成1個實驗組以及1個對照組。接著，將實驗組的菌株接種至含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜的種菌培養基(100 mL)中，以及將對照組的菌株接種至如上面表2中所示的YPD50培養基(100 mL)中。
之後，依照實施例6當中所述的方式來進行種菌培養物的製備、發酵反應、乳酸含量的分析以及乳酸產率的計算，不同之處在於：以稻稈纖維素生質水解液作為發酵培養基。 結果 ：
本實驗所測得的結果被顯示於圖14中。這個實驗結果顯示，在使用稻稈纖維素生質水解液作為基質下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所製得之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。
綜合以上的實驗結果，申請人認為：以含有玉米浸液與蔗糖蜜的種菌培養基來對芽孢桿菌屬物種或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株進行種菌培養，由此所製得的種菌培養物對於發酵製程中所產生的抑制物具有優異的抵抗性，因此能夠有效地利用葡萄糖與木糖來進行發酵，進而提升乳酸產率。
於本說明書中被引述之所有專利和文獻以其整體被併入本案作為參考資料。若有所衝突時，本案詳細說明(包含界定在內)將佔上風。
雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明之範圍和精神之下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明僅受如隨文檢附之申請專利範圍所示者之限制。
本發明的上述以及其它目的、特徵與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例和隨文檢附的圖式後，將變得明顯，其中： 圖1顯示在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與3% (v/v)的玉米浸液之種菌培養基所得到之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響； 圖2顯示在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所得到之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響； 圖3顯示在含有不同濃度的醋酸的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖4顯示在含有不同濃度的糠醛的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖5顯示在含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖6顯示在含有不同種類的發酵抑制物的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖7顯示在使用稻稈纖維素生質水解液作為基質來進行發酵反應的情況下，由含有3% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所得到之重組型高蛋白假絲酵母菌的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響； 圖8顯示在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的蔗糖蜜與7% (v/v)的玉米浸液之種菌培養基所得到之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響； 圖9顯示在存在有醋酸的發酵條件下，由含有不同濃度的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所得到之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響； 圖10顯示在含有不同濃度的醋酸的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖11顯示在含有不同濃度的糠醛的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖12顯示在含有不同濃度的羥甲糠醛的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率； 圖13顯示在含有不同濃度的乙醯丙酸的發酵條件下，各組發酵產物所測得的乳酸產率；以及 圖14顯示在使用稻稈纖維素生質水解液作為基質來進行發酵反應的情況下，由含有7% (v/v)的玉米浸液與6% (v/v)的蔗糖蜜之種菌培養基所得到之凝結芽孢桿菌BCRC 910831的種菌培養物對於發酵產乳酸的影響。

Claims (11)

  1. 一種以生質製備乳酸的方法，其包括：將一能夠藉由消耗葡萄糖以及木糖來產生乳酸的芽孢桿菌屬物種和/或重組型假絲酵母菌屬物種的菌株培養於一含有糖蜜以及玉米浸液的種菌培養基中，俾以在該種菌培養基中獲得該菌株的種菌培養物，其中，以該種菌培養基的總體積為計算基礎，當該菌株是芽孢桿菌屬物種時，該糖蜜具有6至7%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有6.5至7.5%(v/v)的濃度；以及當該菌株是重組型假絲酵母菌屬物種時，該糖蜜具有4至6%(v/v)的濃度，該玉米浸液具有1至3%(v/v)的濃度；以及利用該菌株的種菌培養物來對該生質進行發酵；其中，該生質包含一可發酵糖，以及該重組型假絲酵母菌屬物種的基因組DNA包括一編碼乳酸去氫酶的基因，並且其基因組DNA中的pdc基因被刪除、破壞或已失效。
  2. 如請求項1的方法，其中該重組型假絲酵母菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：重組型高蛋白假絲酵母菌(recombinant Candida utilis)、重組型博伊丁假絲酵母(recombinant Candida boidinii)、重組型熱帶念珠菌(recombinant Candida tropicalis)、重組型近平滑念珠 菌(recombinant Candida parapsilosis)，以及它們的組合。
  3. 如請求項2的方法，其中該重組型假絲酵母菌屬物種是重組型高蛋白假絲酵母菌。
  4. 如請求項3的方法，其中該重組型高蛋白假絲酵母菌的基因組DNA進一步包括一編碼木糖還原酶的基因、一編碼木酮糖激酶的基因及一編碼木糖醇脫氫酶的基因。
  5. 如請求項1的方法，其中該芽孢桿菌屬物種是選自於由下列所構成的群組：凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)、枯草桿菌(Bacillus subtilis)、液化澱粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)、甲基營養型芽孢桿菌(Bacillus methylotrophicus)，以及它們的組合。
  6. 如請求項5的方法，其中該芽孢桿菌屬物種是凝結芽孢桿菌。
  7. 如請求項1的方法，其中該發酵步驟是在實質上沒有糖蜜以及玉米浸液的條件下被進行。
  8. 如請求項1的方法，其中該可發酵糖包含一種五碳糖以及一種六碳糖。
  9. 如請求項8的方法，其中該可發酵糖包含葡萄糖與木糖。
  10. 如請求項1的方法，其中該生質是一纖維素生質水解液。
  11. 如請求項10的方法，其中該纖維素生質水解液包含至少一種選自於由下列所構成之群組中的發酵抑制物：醋酸、糠醛、羥甲糠醛、乙醯丙酸以及酚類化合物。
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