CN105722988B - 用于含糖基质的微生物发酵的工艺以及在该工艺中使用呈原子、离子或者气态的氢 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于通过含糖基质的发酵选择性地增加醇类生产的生化工艺，在发酵工艺中将氢输入至微生物，发酵工艺包括含糖麦芽汁、真菌或者细菌属的微生物养料。通过在直流或者交流电流中施加预电解或全电解的电压于发酵媒介来生产氢。还描述了使用原子、离子或者气态的氢输入至发酵媒介中的微生物，用于选择性地生产醇类。

Description

用于含糖基质的微生物发酵的工艺以及在该工艺中使用呈原 子、离子或者气态的氢

技术领域

本发明涉及一种用于通过糖的微生物发酵选择性地增加醇类的生产的生化工艺。

尤其，在该工艺中将合适浓度的氢输入至微生物，这能够以连续、半连续或者批量生产方式进行，所述工艺包括含糖麦芽汁、真菌或者细菌属的微生物，具有自然存在的或者尤其选择的或者适应的特性，或者重组的特性，絮凝线悬浮在发酵的麦芽汁或者固定床中以及微量养料中。

背景技术

醇类是具有结合至一个或多个饱和碳的羟基官能团(-OH)的有机化合物，包含一个或多个碳原子。此类化合物中最公知的是乙醇或者酒精。后者能够发现于酒精饮料中，清洁产品中，医药产品中，诸如化学溶剂，还在其最大量应用中作为用于内燃机的燃料。

世界范围内超过90％的乙醇是通过糖的发酵生产的，糖来自直接来源，诸如甘蔗、糖蜜以及果浆，或者通过淀粉和纤维素的水解直接获得。在这些淀粉性的、不洁的以及纤维质的团组中，多种谷物突出，诸如玉米、木薯、其他块茎、高粱、小麦、大麦、甘蔗的甘蔗渣、马铃薯、乳清等。

通过发酵和蒸馏来制造乙醇基本分为四个阶段：制备原材料或者糖化、液化、发酵和蒸馏。对于生产酒和啤酒，不存在蒸馏阶段。原材料的制备(诸如磨削、破碎以及滤取)包括将糖、淀粉或者纤维素源传送通过处理器。在第二阶段，人们获得稀释的基质，该基质能够在发酵中被处理或者被传递通过其他中间处理，该处理是通过水解效应将淀粉性或纤维素链分解为糖分子。所获得的含糖果汁或者麦芽汁被引导向发酵。

发酵阶段包括：添加微生物、菌类或者细菌，它们通过多个酶促反应将糖转化为醇类。在该工艺之后，以特征为表格1所示的发酵周期的工业量级获得发酵的麦芽汁或者酒。

然后酒进行至第四最后步骤即分级蒸馏，引起水化或者无水醇类，这取决于蒸馏工艺和脱水的期望采用的特性。

更直接影响醇类生产结果的步骤，因此研究最多的一个步骤是发酵，也称为醇类或者乙基发酵，在“rota etilica”(乙基路径)的情形下，这是将糖(诸如多糖以及单糖类，诸如丙糖、丁糖、戊糖以及己糖，它们之中蔗糖、葡萄糖、果糖以及木糖突出)转换为醇类的生化工艺。在该工艺中，负责将糖转换为丙酮酸分子或者丙酮酸盐的微生物参与多个胞内酶促反应，通常称为糖分解路径。随后，在厌氧条件下，发生具有发酵工艺特性的两个其他酶促反应。第一反应是丙酮酸的脱羧，通过丙酮酸脱羧酶执行，依靠该反应从丙酮酸分子消除羧基，将其转换为乙醛分子，同时释放二氧化碳。第二反应是通过酶醇类脱氢酶执行的还原乙醇乙醛，从而适当地完成发酵反应。

总之，发酵工艺的特征在于，它们结合基质、微生物的类型以及应激以及尤其适当的操作条件，目的是最大化工艺产量以及在发酵时特殊特性将传递至麦芽汁，因为其经受各种条件即发酵激活以及抑制条件，随之而来的是干扰了效率及工艺本身的质量。

发酵工艺产量

以所有反应(不管它们是化学的或者酶的)为特性的主要特征是涉及转换因素的这些特征，或者更具体地涉及这些转换的效率或者产量。从自然发生说的观念得出的是，醇类发酵已经经受实验评价和理论方面的考虑，被视为现有技术中最成功的工艺之一。关联于微生物的细胞性质，主要的菌类(作为真核单细胞生物，例如动物性质的细胞)对其的研究和理解已经在有氧和无氧呼吸工艺中是主要的，作为易于实验获取的方式，后者还公知为醇类及乳酸发酵，并且自由发展。

在1810年，盖·吕萨克提出化学方程式，该方程式涉及由葡萄糖的醇类发酵生产乙醇和二氧化碳，迄今为止其公知为：

葡萄糖乙醇二氧化碳

C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH+2CO₂(方程(1))

100g 51.1g 48.8g

在1863年，路易·巴斯德引入了负责将葡萄糖(单糖类)转换为乙醇及二氧化碳的微生物的概念和反应。三十四年后，在1897年，爱德华·比希纳在实验室发酵了糖，没有使用活的微生物，引入了发酵工艺的酶促反应的概念，如下示出：

葡萄糖 微生物 乙醇 二氧化碳

C₆H₁₂O₆ + 酒化酶→2C₂H₅OH+2CO₂

酒化酶指的是复合酶，其催化将糖发酵为乙醇和二氧化碳。

因而，比希纳提出了假设：酵母细胞在媒介中分泌蛋白质，引起糖的发酵。稍后，被证明的是：这些发酵反应发生在酵母细胞的内部。

所有这种开发与将糖转化为醇类的效率性质或者产量一致，通过核验，在自然发酵条件中，葡萄糖分子将产生高达两个乙醇分子以及两个二氧化碳分子。该理解完全公知为盖·吕萨克(G-L)产量，在葡萄糖发酵中其最大值为51.1％(质量/质量)。图1和图2图示了一系列反应以及葡萄糖发酵中的最大质量产量。

为了比较的目的，以下示出了用于戊糖、己糖和二糖类(蔗糖)的发酵工艺产量的简化方程。二糖类蔗糖是甘蔗中主要的糖。

戊糖：3C₅H₁₀O₅→5C₂H₅OH+5CO₂

100g 51.1g 48.8g

己糖：C₆H₁₂O₆→2C₂H₅OH+2CO₂

100g 51.1g 48.8g

蔗糖：C₁₂H₂₂O₁₁+H₂O+转化酶→4C₂H₅OH+4CO₂

100g 53.8g 51.4g

转化酶指的是催化己糖、果糖及葡萄糖中的蔗糖的水解的酶，己糖、果糖以及葡萄糖的混合物还称为转化糖浆。

在通过糖的发酵的醇类工业中，追求较大工艺产量是恒定的，这涉及物理化学以及生物学域中完整及复杂的研究和实验。一般来说，人们可以从效率或者醇类产量的观点方面书写方程用于醇类发酵工艺的完整处理，该方程如下：

[糖]+[微生物]→[乙醇]+[CO₂]+[副产物]+能量

此处人们理解的是，产生的乙醇[Ethanol]的浓度与转换中所消耗的糖[Sugar]的浓度之间的商作为最大实际产量。

在发酵工艺期间，除了菌类和细菌，各种微生物性质会贡献于糖的消耗，诸如酵母。这些微生物消耗含糖基质，用于物种的细胞生长，还有副产物的产生(诸如酸以及高级醇)，转至寄生过程并且引起发酵产量的下降。

在1937年，Firmin Boinot在法国的专利以及1941年他获得用于实施工业醇类发酵工艺的专利US2,230,318。在三十年代，该工艺进入巴西，显著贡献于增加发酵产量，该工艺现在在世界上比较普遍，公知为叫做Melle-Boinot的工艺，主要但不专用于利用酵母进行发酵。该工艺的优点是，直接并发的还原糖，通过重复使用微生物以及通过其处理及再循环而提供糖，进行离心分离，接着在pH为2至3的媒介中进行酸性处理达二至四小时的周期，该媒介呈浓缩形式并且促进细菌菌群的急剧降低。在该处理之后，酵母乳(将离心的酵母称做其)如果返回至工艺则被浓缩及处理。该操作可以引起糖消耗降低至小于可获得的糖的1％(百分之一)。

二氧化碳作为在丙酮酸的脱羧中释放的产物，被认为是发酵工艺的并行产物。

正如以上讨论的，除了寄生工艺产生的副产物，在醇类发酵期间将生成其他产物，诸如：丙三醇、有机酸(琥珀酸的、乙酸的、丙酮酸以及其他)和高级醇、乙醛、乙偶姻、丁二醇以及其他化合物。据估计，在这些转换中消耗了该工艺中可获得的3％至5％(百分之三至五)的糖。

在能量方面，作为示意性的，在厌氧条件下，酵母脱离其代谢至醇类发酵，乙醇和二氧化碳是整个工艺仅有的两种排出物。因而，遵循如下：

C₆H₁₂O₆+2Pi+2ADP→2C₂H₅OH+2CO₂+2H₂O+2ATP

(ΔGO＝-56千卡/摩尔)

另一方面，在有氧条件下，尤其在细胞增殖阶段，酵母进行呼吸作用。不同于在其细胞质中发生的发酵，在线粒体中发生的呼吸作用导致所形成的ATP(三磷酸腺苷)(能量交换器件)的量十九倍于在醇类发酵中所获得的量，如下所示：

C₆H₁₂O₆+60₂+38Pi+38ADP→6CO₂+38ATP+6H₂O

(ΔGO＝-686千卡/摩尔)

许多反应仍发生在发酵工艺期间，初始降低寄生工艺中的糖消耗以及不期望的副产物。在发酵时控制麦芽汁的Ph及温度，以及控制存在的微量营养素以及污染物，这些是变量，它们在工艺中呈现重要的位置并且能够刺激或者抑制化学动态。

当相比于其他抑制剂(诸如亚硫酸盐、乳酸、醇类含量以及高浓度糖)时，尤其关联于高操作温度(最高>38℃)的低pH的媒介(pH<4.0)被证明是用于乙醇工业生产的单元中所获得和使用的酵母的最大生理兴趣因素。pH4.5的麦芽汁，具有的温度范围为20℃至37℃，能够保护不受应激因子影响，并且可获得细胞的更高生存能力、发芽、醇类产量、酵母的规则形态，减小剩余的糖以降低媒介中释放的氨基酸，从而提供更好的醇类效率以及工艺稳定性。

关于营养，酵母是通过吸收供养的异养微生物。对酵母的发展所必须的主要营养物是如下营养物以使得能够发生满意的发酵：(i)氮，塑性转换元素，对酵母的生长很重要；(ii)磷，能量运输元素，缺乏其时发酵将不发生；(iii)钾；(iv)镁；(v)锌；(vi)锰，它们在酶促反应中都是重要的；复合维生素B，其是发酵加速剂，此外存在其他盐，诸如钴、铜、硫、硼，它们被称为微量营养素。

酵母还是腐生微生物，腐生微生物要求详尽的碳源-葡萄糖或另一种糖，该碳源供给化学能量以及主要由碳、氧和氢构成的其细胞结构的碳骨架。还需要一些维生素，诸如硫胺素和泛酸。

关于氮源，酵母使用呈氨(NH⁴⁺)、酰胺(尿素)或胺(呈氨基酸的形式)形式的该元素，没有代谢能力以使用硝酸盐，以及很少或者没有从媒介使用蛋白质的能力。

因为氨形式是主要的一种形式，所以在不存在氨形式时酵母寻求其他形式，诸如氨基酸，从而引起次要成分的生产增加，次要成分诸如异戊基、戊烷基、丙烷基、异丙基、丁基、异丁醇。磷以H₂PO^4-离子的形式被吸收，在pH4.5时这是主要形式，而硫能够从硫酸盐、亚硫酸盐或者硫代硫酸盐被吸取。但是，如上所述，在酵母的处理中使用硫酸，或者在混合麦芽汁中使用糖蜜，这样可避免额外使用硫，当硫过量时对微生物是致命的，因为硫的存在被证明对工艺是充分的。

基于前述，以及考虑到例如利用葡萄糖基质或者利用可直接发酵糖的醇类发酵产量，根据方程(1)，在最大理论质量G-L产量为0.511m/m时(作为100％最大理论产量)，而且在大多数无菌及受控生产环境中实际发酵工艺产量能够达到最大值的92％至94％。在较少控制和无菌的单元中，该值可以低于85％，这意味着在生产工艺中有相当大的损失。

在该方面，人们不断寻求所有以及效率的每次增加，聚焦于改进的适当操作控制、微生物的应激和性质，选择、结合及修改更高生产力以及更大工艺阻力。鉴于在这些工业媒介中与醇类生产相关的较高数量，发酵产量增加0.1％至0.5％已经被证明是相当大的投资。

现有技术的发展

已经发表了各种文献以改善用于生产乙醇的工艺的产量，举例如下：

文献US4,451,566描述了用于从可发酵糖酶解生产乙醇的方法和装置。用于催化将糖转换为乙醇的一系列酶保留在多个反应区域中。可发酵糖溶液相继通过这些区域，醇类恢复在最后的区域中。尽管提供了比普通工艺更有效的反应，但是本文献提供了昂贵、复杂及难以维持的溶液。专利申请WO2007/064546描述了用于改善乙醇产量的工艺，通过监控以及控制发酵罐的氧还原潜力可减少发酵时间并且降低副产物的形成。但是，该工艺由于涉及的高成本需要非常具体并且难以维持监控，影响了该方案的工业应用。

专利文献WO2008/024331描述了一种磁发酵的方法，包括使生物材料经受静态磁场以用于实施发酵产物中的生物材料的发酵。发酵反应可以发生在碱性或者酸性媒介中，磁场可以是正的或负的。本文献利用静态磁场以提供更适合于微生物的细胞增殖的环境。尽管在醇类发酵中增加了微生物的数量，因而增加了反应产量，但是该工艺需要对整个反应进行持续监控及总体控制，这使得该工艺过度昂贵，因此工业应用时具有经济不可行性。

正如专利U8,377,665描述的，现有技术还公开了用于改善碳捕获效率的方法。该方法包括细菌发酵，根据Wood-Ljungdahl通路使用气态基质，Wood-Ljungdahl通路包括在细菌线中发生的一系列酶促反应。

虽然存在许多描述发酵工艺以改善生产乙醇的产量的文献参考，但是，现有技术并未具体描述为了选择性生产的目的而在代谢发酵工艺中氢的作用，该工艺构成创新的原始技术。而且，所有发展的工艺都追寻将实际产量增加至高达G-L产量的理论限制。

发明内容

发明目的

本发明的目的是提供一种用于含糖基质的微生物发酵的工艺，该工艺包括将氢输入至真菌或细菌属的微生物，利用自然发生的特性，或者尤其选择或者适于或者重组絮凝线，或者悬浮在发酵的麦芽汁或者固定床中。

本发明的第二目的在于，使用离子、原子或者气态的氢或者它们的混合物，用于输入至真菌或者细菌属的微生物，利用自然发生的特性，或者尤其选择或者适于或者重组絮凝线，或者悬浮在麦芽汁或者固定床中，用于醇类的选择性生产。

本发明的第三目的在于，建立创新的生化工艺，用于通过糖的发酵选择性地生产醇类，诸如多糖和单糖类，诸如丙糖、丁糖、戊糖以及己糖，其中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及木糖突出，更多的利用碳，结果增加了选择性生产的醇类，超过了G-L的理论产量，并且降低了在发酵中二氧化碳的释放。

使用“原子或者离子状态”，此处人们理解氢为原子(H)或者离子(H⁺)形式。

使用“气态”，此处人们理解为分子氢气(H₂)。

本发明的第四目的在于，建立有效的环境有利的工艺，在将发酵的糖转换为醇类时更多利用碳，此外还降低释放至环境的二氧化碳。

本发明的第五目的在于，取消对更高水平的效率的限制，改变微生物的细胞代谢，不从基因方面改变它们。

由于其简化性、经济性以及效率，本发明的工艺能够应用在生产的新工业单元，或者实施在已经安装的结构以及单元中。

发明描述

本发明涉及一种用于含糖基质的微生物发酵的工艺，该工艺包括将氢输入至悬浮存在于发酵的麦芽汁或者固定床中的真菌或者细菌属的微生物，所述发酵的麦芽汁或者固定床包含含糖基质以及微量营养素。

将原子、离子或者气态的氢输入至存在于发酵中的微生物是依靠直接施加至发酵的麦芽汁或者固定床中的至少两个电极进行的，施加预电解模式电压或者全电解电压。该氢气还经由水的电解产生自生物反应器，在该情况下输入微生物是经由直接涌出至所述生物反应器而进行的。

对原子、离子或者气态的氢的控制是依靠施加至致动发酵的麦芽汁或者固定床的电极上的电压进行的，预电解模式电压的范围为0.1V至1.24V，全电解电压的范围为1.24V至30V，可以是直流电或者交流电，后者包括的周期为50Hz至100Hz、100Hz至500Ha以及500Ha至1000Hz。

本发明还涉及使用原子、离子或者气态的氢或者其混合物，特征在于，将氢输入至存在于发酵媒介中的微生物，发酵媒介包含含糖基质，诸如多糖和单糖类，比如丙糖、丁糖、戊糖以及己糖、蔗糖、葡萄糖、果糖以及木糖突出，用于选择性地生产醇类。

因此，本发明中描述的工艺包括：修改醇类的生产的质量效率限制为更高参数，更改微生物的细胞代谢而不在基因上更改它们。氢还原反应关联于其易于渗透微生物的细胞膜，访问它们的内舱、细胞质、线粒体和胞内器官，提供创新的生化工艺以用于通过糖的发酵选择性地生产醇类，引起更好地使用碳，结果将增加发酵反应中的醇类产量并且降低释放的二氧化碳的含量。

附图说明

图1指的是现有技术的糖分解路径(糖酵解)，在葡萄糖的工艺中，这发生在微生物或者真核或者原核细胞的细胞质中，包括该序列的最后步骤即生产丙酮酸；

图2示出现有技术发酵工艺中包括的醇类发酵反应，其中每个丙酮酸分子通过丙酮酸脱羟酶经受羟基的释放，结果释放二氧化碳分子和乙醛分子，后者通过酶醇类脱羟酶反应被转化为乙醇；

图3示出本发明描述的工艺中包括的发酵反应，在该反应中，用羟基还原羧基，羟基源自于除了等效还原剂之外通过丙酮酸脱羧酶进行两个丙酮酸分子的脱羧，优选通过提升氢的能力被还原，引起形成了通过双羧基合成的乙醛分子，作为新醇类发酵通路的产物；

图4指的是基于本发明的摩尔当量的包含操作范围的图形，根据方程(3)，其包含用于蔗糖、氢气、乙醇、二氧化碳、质量(m/m)产量的曲线限制，以及用于蔗糖相对于G-L(％)最大质量理论产量的增加质量产量；

图5指的是包含质量产量曲线的对数测量的图形，质量产量以及浓度的百分比增加，在本发明中的摩尔当量[H]、[乙醇]、[CO₂]中。

具体实施方式

如前所述，通过糖的发酵进行醇类生产的工艺已经公知于本领域的技术人员，在它们的效率限制方面，普遍考虑的是盖·吕萨克在1810年提出的化学方程式(方程(1))。根据该公式，在当今现有技术中，发酵的葡萄糖分子能够至多产生2个乙醇分子和2个二氧化碳分子，如方程(2)所示。

C₆H₁₂O₆+酒化酶→2C₂H₅OH+2CO₂ (方程(2))

1kg 0.511kg 0.488kg

作为转换，考虑到基本存在于甘蔗糖中的蔗糖的发酵，人们可替换地获得以下方程：

C₁₂H₂₂O₁₁+H₂O+转化酶→ 4C₂H₅OH + 4CO₂ (方程(3))

1kg 0.538kg 0.514kg

人们能够从方程(2)和(3)看出，在葡萄糖的发酵中，最大质量效率的条件为0.511(m/m)质量/质量，在蔗糖的发酵中最大质量效率的条件为0.538m/m。甚至通过考虑酶促反应的作用的最近方程布置，在当今现有技术包括的工艺中，在全球产量估计方面已经考虑了该限制。

根据现有技术，在糖分解路径(也称为糖酵解)中，其是微生物的细胞细胞质中发生的一系列酶促反应，微生物可以是真核或者原核单细胞微生物，在葡萄糖(分子中具有六个碳原子的糖)的工艺中，该系统的最后步骤中生产丙酮酸：

(离子)，丙酮酸是酸性的，其分子中存在3个(三个)碳原子，如图1所示。因此，从这些反应中，两个丙酮酸分子源自葡萄糖分子。然后，在厌氧模式中，在不存在氧气的情况下，发生醇类发酵。在该发酵工艺中，从每个丙酮酸分子，通过丙酮酸脱羧酶，将发生羧基的释放，结果释放二氧化碳分子和乙醛分子，在这之后，如图2所示，乙醛分子通过酶醇类脱氢酶的作用被转化为乙醇。这些酶促反应是可逆的。

因而，根据现有技术，在醇类发酵工艺中用于每个葡萄糖糖分子的两个乙醇分子和两个二氧化碳分子的最大生产存在关系，也称为乙基属发酵。

因而，碳基的还原源自于羰基()[即，酮类和醛类的自由基]与羟基O-H()-[即，醇类和苯酚的自由基]的合成，源自于通过丙酮酸脱羧酶进行两个丙酮酸分子的脱羧，除了还原当量-RE/ER，优选通过高可用性或者充足的氢进行还原，将导致形成了通过双羧基合成的乙醛分子，作为新醇类发酵路径的产物。利用充足的氢，酶NADH、NADPH以及FADH2的浓度增加，在细胞质或者线粒体氧化-还原过程中还有其他重要的电子载体。以下方程示出了这些辅酶的氧化-还原过程：

辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原

(方程(4))

辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐的还原

(方程(5))

辅酶黄素腺嘌呤二核苷酸的还原

(方程(6))

然后，如图3所示，通过酶醇类脱氢酶的还原反应，乙醛分子被还原为乙醇分子。

因而，本发明能够使人们获得通用的简化方程，诸如以下方程(7)，用于糖、氢、微生物以及该类型发酵中获得的产物的典型浓度，诸如乙醇、二氧化碳及水的浓度：

[糖]+[H]□[微生物]→□□C₂H₅OH]+[CO₂]+[H₂O] (方程(7))

项“[]”表示通过采用酵母、真核单细胞菌类在含糖麦芽汁的典型发酵反应中，糖、氢、活性微生物、乙醇、二氧化碳及水(它们是氢存在时醇类发酵的药剂和产物)的相应浓度，符号“□”旨在示出将氢输入至微生物。

该发明原则与通用方程(7)一同也应用于涉及细菌、原核细胞的发酵，同时处理碳水化合物，诸如多糖和单糖类，比如丙糖、丁糖、戊糖以及己糖，其中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及木糖突出，同时选择性地生产乙醇或者高级醇。

凭借其简化性、经济性以及效率，本发明能够应用在新生产单元中，或者实施在已经安装的结构和单元中。

因此，本发明涉及一种生化工艺，用于通过修改及改善如下步骤来选择性地增加醇类生产的产量：发酵包含糖的溶液；采用类菌类或者细菌的发酵微生物。这些改善包括将原子、离子或其混合物的水基状态的氢输入至参与含糖麦芽汁的发酵反应中的微生物。

本工艺包括在5％至和25％(质量/体积)的微生物之间添加5％-30％(质量/体积)的含糖基质。微生物是以自动控制方式完成的，作为可获得的发酵的麦芽汁和必要内容物的函数。

为了输入氢，需要用于生成这种氢的系统，该系统包括：

(i)依靠电极向发酵媒介供给预电解电压，所述电压包括的值低于水在该媒介中发生电解所需的电压，特征在于，发酵的麦芽汁的离子条件，优选在0.1V至1.124V之间，或者

(ii)向发酵媒介供给水的全电解电压，特征在于，发酵的麦芽汁的离子条件，优选在1.24V至30V之间，更优选地在1.24V至20V之间，以及仍然更优选地在1.24V至10V之间；

(iii)经由水的电解从反应器中生产氢，电压在1.5V至30V之间。

施加至发酵媒介的电极包括至少一个阴极以及一个阳极，在发酵时阴极和阳极优选直接作用在麦芽汁上。

在本发明的实施例中，在将微生物供给至生物反应器的阶段，将电极(阳极以及阴极)直接施加至微生物。

在本发明第二实施例中，使用在发酵媒介中的电极包括至少一个阴极以及一个阳极，在发酵时阴极优选直接作用在麦芽汁上，同时阳极可以施加在另一电解质上，另一电解质是可替换的盐，作为两个电解质，同时媒介被离子可渗透的分离膜分离。

含糖麦芽汁包括糖，诸如多糖和单糖类，比如丙糖、丁糖、戊糖以及己糖，其中，蔗糖、葡萄糖、果糖以及木糖突出，或者其混合物。

在本发明的实施例中，本发明的发酵微生物选自菌类组的酵母，比如酿酒酵母属、更具体来说酿酒酵母属酵母菌株，以及粟酒裂殖酵母、木糖发酵酵母、圆酵母、休哈塔假丝酵母的类型，具有自然发生的线，或者尤其选择的或者适于的或者重组的絮凝线，悬浮在发酵的麦芽汁或者固定床中。

在本发明第二实施例中，发酵微生物选自细菌组，尤其比如运动发酵单胞菌属、大肠杆菌和梭状芽胞杆菌的类型，具有自然发生的线，或者尤其选择的或者适于的或者重组的絮凝线，悬浮在发酵的麦芽汁或者固定床中。

在优选实施例中，所选择的发酵微生物包括酿酒酵母属类型的菌类。

在另一优选实施例中，所选择的发酵微生物包括运动发酵单胞菌属类型的细菌。

发酵麦芽汁还允许添加微量营养素，诸如氮、磷、钾、镁、钙、锌、锰、铜、铁、硫、钴、碘或者其混合物。

添加的微生物的含量作为变量，在工艺期间应该根据需要被控制。

尤其，本发明的工艺包括输入适当浓度的原子、离子或者分子的氢，在该工艺中所述氢已经在预电解或者全电解条件下以控制的方式根据方程(7)、表格2和图4在微生物中生产。批量方式、连续以及半连续发酵工艺是本发明可以想象的，以及人们可以采用生物反应器的布置，在数量和体积上，在基质浓度的它们操作条件下、在离子或者分子阶段中氢输入的微生物以及可用性方面具有类似或者不同的功能。

虽然人们还未明确在理论上建立在存在菌类或者细菌时在充足氢浓度的媒介中在厌氧和有氧模式下将糖转化为醇类的路径，但是人们已经能够在这些呼吸及发酵工艺中进行选择性地生产物质。

本发明中执行的比较实验指出，乙醇生产的产量理论上增加至高达50％，使糖(蔗糖)发酵的最大质量理论效率是0.8m/m，结果降低了放射的二氧化碳高达100％，利用酵母酿酒酵母。

在本发明中，通过执行的测试，人们已经观察到，在用酵母进行糖发酵的乙基属路径中，两个丙酮酸分子(来源于糖酵解)在它们通过丙酮酸脱羧酶的脱羧中，促进了释放两个羧基羧基随后通过充足存在于媒介中的氢的作用被还原当量-ER/RE还原，这能够产生另一乙醛分子，乙醛分子通过醇类脱氢酶在还原时被脱氢为乙醇，引起其选择性的增加(sic)。结果，正如能够从图3推论出的，降低了释放的二氧化碳。

虽然乙醇生产的增加可以达到理论限制的50％，但是相对于传统工艺，二氧化碳的降低可以达到相应极限理论水平的100％。进一步在该发酵模型中，在面对胞内工艺中糖的浓度增加时，作为可获得的氢的浓度增加的结果，引起更复杂的酶促反应，人们能够核验反应的动力学的降低，这会引起发酵周期的增加。

存在于发酵媒介中的氢可以是原子、离子或者气态的或者其混合物。为了获得氢，需要氢生成系统，所述系统可以包括：(i)使发酵媒介经受预电解电电压(该电压低于发生水电解所需的电压)，特征在于，发酵时麦芽汁的离子条件；或者(ii)使发酵媒介经受等于或者高于水电解电压的全电解电压，特征在于，发酵时麦芽汁的离子条件。

在预电解模式中，形成离子和原子形式的氢，没有气态的氢。这种离子和原子氢的形成仅需要低于发生水电解所需电压的电压，特征在于，发酵时麦芽汁的离子条件。该电压范围从0.1V至1.24V，优选0.7V至1.1V。

用于生成预电解及全电解氢的系统可以这样发生，使得电压将是直流或者交流，其中，后者可以是范围为50至2,000Hz，优选50Hz至150Hz，或者从100Hz至500Hz或者从400Hz至1,000Hz的周期。

在本发明的实施例中，在全电解条件下，该系统包括直流电，从而避免在发酵时添加氧气至麦芽汁，从而偏爱厌氧条件。通过选择在发酵时直接作用在麦芽汁上的阴极，同时阳极将施加在另一电解质上，后者是含盐的，根据两个电解质，利用通过可渗透的分离膜所分离的媒介，该膜是多孔的并且优选由多孔材料制成。

一旦生成氢的该系统在以半连续或者连续批量方式操作的反应器上开始，重要的是，通过测量pH、温度、糖浓度、氢浓度、活性微生物浓度、醇类的浓度、二氧化碳的浓度以及微量营养素的含量以及浓度，来连续控制该工艺。

额外地或者专门地，气态相位的氢可以通过直接涌出至生物反应器中的发酵的麦芽汁，或者通过用于在生物反应器中进料或者循环麦芽汁的线路，被直接引入至发酵中的生物反应器。该氢气可以经由细菌发酵或者通过其他平行发酵工艺中的藻类来生产，特征在于，在反应器外部生产氢，或者经由水的电解，或者其可以是工业氢。

进一步指出的是，氢可以在开始发酵工艺时立即被输入，或者在该步骤之前也即在微生物制备期间被输入。

本发明描述的工艺反映的行为区别于现有技术发酵工艺，因为：

-高剂量的氢充当强还原剂；

-在醇类的浓度中其提供了更好地产量；

-不存在微生物的遗传性修改；

-相应降低了释放的二氧化碳的含量；以及

-改变了反应的动力学。

而且，相比于常规发酵工艺，本发明的工艺提供了以下优势：

1、其提供了易于将氢扩散通过微生物、菌类或者细菌的细胞膜，能够使其达到细胞内舱；

2、其不影响细胞的生理参数(温度、压力、pH以及pO2)

3、其不干涉代谢氧化反应，不损害ROS氧气以及细胞信号的活性组分；

4、高浓度的氢耐受良好，结果具有较少系统性副作用；以及

5、其可以以半连续以及连续批量模式应用于发酵，易于应用至现存的发酵工艺和装备。

根据本发明对整个工艺以及产物产量的控制

根据通用方程(7)，现在将提供发酵工艺以及对整个工艺变量的按需操作控制。

根据通用方程(7)，现在将提供发酵工艺以及对整个工艺变量的按需操作控制。变量的列表由现有技术中的变量组成，旨在将工艺维持在现有技术的发酵工艺中典型使用的物理、化学工艺标准内，诸如pH和温度、控制水平、供料以及放料，独创性地添加控制以及反应物及产物(包括微量营养素)的浓度。该控制在整个生产工艺期间实施，能够使人们引导所述工艺在适当计划的操作条件内。

在本发明中，对浓度的控制不同于对可溶性固体和糖的浓度的控制，正如在VHG(超高浓度)发酵的情况下，通过其人们从具有高含量糖的麦芽汁发酵工艺可获得的醇类浓度超过12％体积，从而防止破坏微生物或者阻碍以及迟缓发酵，以及在整个工艺中人们旨在控制或者限制发酵周期，作为用于产物控制的工具。在这些传统情况下，对糖及微生物的浓度的控制被降低以建立工艺操作限制。

超高浓度发酵是发酵开始于高浓度的基质，目的在于生产具有高醇类的酒，具有高于12％体积的典型浓度。

当发酵工艺中断时，或者当其显著降低其动力学时，甚至当存在基质时，作为应激因子的结果，诸如多余醇类含量或者缺乏微生物的结构微量营养素，会发生阻碍以及迟缓发酵。

根据本发明，对浓度的控制超出上述提到的限制，是生化的控制，旨在通用方程(7)包括的构思内的产物产量。

通用简化方程(7)的示意平衡直接关联于产物产量的限制，考虑基质、糖、活性微生物以及输入体[H]的浓度，目的在于选择性地生产醇类，随之降低产生的二氧化碳。

为了简化控制模式的建立，对浓度限定了三个操作范围，从基质以及氢的浓度开始，旨在所还原的醇类的浓度。但是，这些限定不通过示范使用工艺的操作范围而限制本发明，其在连续控制模式中更全面地操作。

图4示出了基于蔗糖的摩尔的操作范围，提升曲线的阈值见于以下的表格2。

图5示出了质量产量曲线的对数测量，质量产量以及[H]、[乙醇]及[CO₂]的摩尔当量的浓度的百分比增加。考虑到胞内酶促反应的统计条件，这些值被证明对于操作最有利查找是更注重实际的。

证明本发明的化验

为了检验及评价对发酵的麦芽汁的工艺的功效，进行了一些化验，采用多数使用在燃料乙醇及饮料工业中的甘蔗汁以及酿酒酵母属类型的酵母微生物。以下给出了该工艺的例子，并不旨在限制本发明的保护范围。稍后将报告化验条件及结果以及生化模型的检验。

例子1-预电解模式中常规发酵与根据本发明的发酵之间的比较

在该试验中，人们已经发现氢对含糖麦芽汁的乙基发酵的影响，利用的电压低于发生水电解所需的电压。在该试验中以及在以下的试验中，人们在批量发酵中使用非精制糖和工业酵母酿酒酵母作为反应物。

构建了两个生物反应器，其中的一个生物反应器作为基础或者常规，另一个生物反应器组装有氢生成系统(使用0.95V的直流电压)，以在发酵工艺期间生产离子以及原子氢。

在最大体积为100升的两个生物反应器中，一个生物反应器添加有反应物和高达50升操作体积的水。

更具体来说，人们在每个生物反应器中进行两个试验，在分离的两堆中同时用5kg的商用酵母(菌类、酿酒酵母属)来发酵8kg的红糖基质(基本由蔗糖构成)。

基质和菌类在生物反应器中混合之前被溶解以及制备，利用60-90rpm的扁刀型搅拌器进行搅拌。在混合两个组分之后立即从该反应器中收集样本，测量初始参数，诸如可溶性固体[Brix]、温度[℃]以及酸度[pH]。使用蒸馏器以及数字密度计每小时对Brix、温度以及pH进行测量，采用此类的标准实验室标准。不添加微量营养素至该工艺，目的在于隔离变量。

表格3指出了实验中以及预电解测试的条件下所使用的组分。在两个同步的反应器中进行两个试验。

表格4指出用于控制参数pH、温度℃、Brix及乙醇浓度而采用的实验。在该测试中，人们观察到用于控制发酵的参数的变化。

这两个实验中获得的结果描述于以下表格5。

表格5-在预电解模式下在常规生物反应器中，在包含氢生成系统的生物反应器中的发酵所实现的结果。

-发酵结束—根据本发明的发酵的电气系统在6小时之后关闭。反应器保持操作，同时搅拌，在6小时之后进行最后测量。剩余发酵持续16小时。

在6小时时间中能够易于观察到乙醇生产的增加，因为人们能够核验到本发明工艺在平均1.62℃有更多糖。如果盖-吕萨克方程(1)用来计算糖转换为乙醇的理论值，该额外的糖含量可以生产1.1°GL的更多乙醇。

结果，乙醇生产中的产量在表格5中直接读取，相比于具有相同实验标准和产量计算所预期的传统理论值(盖-吕萨克产量)增加了6.8％和8.3％。在二氧化碳的释放中观察到的乙醇浓度的增加和降低伴随有化学动力学的更改，这示出了能够应用的简化生化模型。

例子2-在全电解模式中常规发酵和根据本发明的发酵之间的比较

在该试验中，人们插入两个生物反应器(一个是基础反应器以及本发明的一个基础反应器)9kg的红糖和6kg的工业酵母(即酿酒酵母)。

例子1中使用了两个生物反应器，一个作为基础或常规反应器，另一个装备有氢生成系统，它们与例子2中采用的相同。在该例子中，在发酵工艺期间，人们采用1.6V的全电解模式电压，生产离子以及气态氢。

表格6指出在全电解测试的条件及实验中使用的组分。

在添加组分之后人们立即从反应器收集样本，并且测量初始参数，诸如可溶性固体[Brix]、温度[℃]以及酸度[pH]。每小时执行对Brix、温度、pH以及醇类浓度的测量。对该工艺不添加微量营养素，目的在于隔离变量。利用两个生物反应器仅进行一个测试。

该实验的测试结果描述于表7和表8。

表7和表8-在全电解下在常规生物反应器中在包含氢生成系统的生物反应器的发酵中所实现的结果。

*-发酵的结束-在6小时之后关闭根据本发明的电系统。反应器保持操作，同时搅拌，在6小时之后进行最后测量。剩余发酵持续另一16小时。

应该注意的是，根据G-L产量，用于(□Et/□Bx)的值指的是局部产量。对于蔗糖，根据表7和表8中最右栏的值，最大产量为0.538m/m以及0.682v/v。

结果，本发明的生物反应器中生产乙醇的产量为17％至20％，高于期望的最大传统理论值(盖-吕萨克产量)，如能够在表格1中更清楚地观察到的。

对于局部值，人们知道的是，在样本的制备以及持续的发酵工艺之间，甚至在收集的样本中，分析方法存在误差，当采样的时刻在过程中具有发酵反应较大动力学周期时，这会引起显著偏离。

生化模型的结果以及核验

为了以更好的方式呈现上述结果，以下表格解释了涉及在工艺期间局部生产乙醇的值，以及在发酵工艺结束时，始终伴随有根据本发明生物反应器的值以及在常规工艺或者基础生物反应器中获得的值。需要指出的是，这些示出的值是直接获得的，不仅来自于试验期间实现的结果。

人们观察到，在表格9、10和11中，“增加产量”栏中的值呈现累积的最终局部值，根据本发明获得的值始终较高。最终值6.9％和8.3％，相对于在相应试验1和2中获得的现有技术的最大发酵产量0.538质量/质量或者0.682体积/体积，以预电解电压模式和直流电DC操作，本质上仅在其产物限制上限制本发明。[蔗糖]、[氢]以及[酵母]的浓度从低(I)至中等(II)摩尔当量的范围中。

涉及“增加产量”的试验3的表格11中提出的值，用于局部最终，是强有力的以及决定性的。人们能够看到，试验3中16.7％的最终或者累积值反应了根据本发明的工艺的迅速响应，以增加原子、离子以及气态氢的浓度，具有图4和图5期望的行为。

前两个试验中的生化模型，加上试验3特别提出的值以及特性被证明在其技术以及创新限制中在技术上是有效的。

正如预期的，试验3在适度范围(II)的摩尔当量中操作，具有大致更改的反应动力学，因为该工艺通过消耗的糖(□Et/□Bx)已经降低了乙醇生产率，所以仍然有大量糖存在于媒介中。微量营养素(主要为N(氮))的可用性在面向高微生物活性方面对增加生物量是基本的，这在发酵工艺中是自然现象。缺乏主要的氮可防止发酵微生物增殖，是应激发酵条件。

除了此处的分析以及报告，用数据证实了工艺期间降低了二氧化碳的释放，相比于常规生物反应器中同时进行的工艺，具有清楚的降低证据。本领域技术人员具有这些方法-外观以及气味-用于估计该性质。

在表格12中，人们提出发酵结果的概要，考虑了三个试验中生产的乙醇的体积。

因而，根据实验室试验中获得的结果，人们考虑证实了本发明的工艺。

作为生化工艺的结果，降低了二氧化碳的释放，同时选择性地增加了醇类的生产，体现为极大环境和操作重要性的技术性补充。本发明提供的一些经济以及环境优势列出如下：

1、直接的经济增加，同时增加了醇类的生产；

2、增加了生产，不会引起增加工厂面积；

3、减少二氧化碳的生产；

4、工艺装备不需要对生产体积以及生物反应器和蒸馏装备进行调节；

5、在发酵中，在恢复醇类的装备中通过排出二氧化碳降低尺寸以及能量消耗；

6、增加碳信用同时增加醇类的生产，同时减少二氧化碳的释放；

7、在环境中改善目标技术。乙醇完全作为绿色燃料以及具有较大经济可行性。

Claims (18)

1.一种用于含糖基质的微生物发酵生产乙醇的工艺，其特征在于，包括将足够的氢输入至悬浮在发酵的麦芽汁或者固定床中的选自酿酒酵母属的微生物或者粟酒裂殖酵母，所述发酵的麦芽汁或者固定床包含糖和所述微生物，

其中所述氢为通过电解产生的离子状态。

2.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，通过施加电压至至少两个电极来生成氢，所述电极施加至发酵的麦芽汁或者固定床。

3.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，通过施加包括至少一个阴极及一个阳极的所述电极来生成氢，所述阴极直接施加至发酵的麦芽汁，所述阳极施加至另一电解质，后者是含盐的。

4.根据权利要求2所述的工艺，其特征在于，包括添加：

·5％至30％(质量/体积)的含糖基质；

·5％至25％(质量/体积)的所述选自酿酒酵母属的微生物。

5.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，电极经受水的预电解的模式，电压范围为0.1V至1.24V，以生产离子氢。

6.根据权利要求5所述的工艺，其特征在于，预电解模式包括范围为0.7V至1.1V的电压。

7.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，所述电极经受水的全电解的模式，电压范围为1.24V至30V，以生产离子氢。

8.根据权利要求7所述的工艺，其特征在于，所述全电解模式包括的电压范围为1.24V至20V。

9.根据权利要求8所述的工艺，其特征在于，所述全电解模式包括的电压范围为1.24V至10V。

10.根据权利要求4所述的工艺，其特征在于，施加至所述电极的电压发生在直流或者具有范围为50Hz至2000Hz的周期的交流模式中。

11.根据权利要求10所述的工艺，其特征在于，施加至所述电极的所述电压发生在交流模式中，具有范围为50Hz至150Hz、100Hz至500Hz或者400Hz至1000Hz的周期。

12.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述糖选自：单糖、蔗糖和具有丙糖、丁糖、戊糖以及己糖的多糖。

13.根据权利要求12所述的工艺，其特征在于，所述糖选自葡萄糖、果糖以及木糖或者其混合物。

14.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，所述酿酒酵母属的微生物为酿酒酵母属酵母菌株。

15.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，微量营养素选自氮、磷、钾、镁、钙、锌、锰、铜、铁、钴、硫、碘或者其混合物。

16.根据权利要求1所述的工艺，其特征在于，发酵工艺在连续、半连续或者批量工艺中进行。

17.根据权利要求16所述的工艺，其特征在于，所述发酵工艺中的pH、温度、控制水平、进料以及放料、糖的浓度、氢的浓度、活性微生物的浓度、醇类的浓度、二氧化碳的浓度以及微量营养素的含量被连续控制。

18.离子状态的氢在前述权利要求1-17中任一项所述的工艺中的应用，其特征在于，将氢输入至发酵媒介中的微生物，所述发酵媒介包含用于选择性地生产乙醇的含糖基质。