DE60002020T2

DE60002020T2 - Verfahren zur Herstellen von hochreinem Xylitol

Info

Publication number: DE60002020T2
Application number: DE2000602020
Authority: DE
Inventors: Yuuichi Kawasaki-shi Aoki; Eriko Kawasaki-shi Ono; Kazutaka Kawasaki-shi Nagashima
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 1999-08-10
Filing date: 2000-07-27
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2020-07-28
Also published as: PE20010618A1; EP1075795A2; US6538133B1; CN1283700A; BR0003392A; KR20010049918A; DE60002020D1; EP1075795B1; EP1075795A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
[Technisches Gebiet, dem die Erfindung angehört]
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Xylit, speziell auf ein Verfahren zur Herstellung eines hochreinen Xylits, mit dessen Hilfe Xylit hergestellt werden kann, indem es in hoher Reinheit aus der Kulturbrühe eines Xylit bildenden Mikroorganismus (z. B. einer Xylit enthaltenden enzymatischen Reaktionsbrühe oder einer Xylit-Fermentationsbrühe) unter geschickter Anwendung von Ionenaustauscherharzen abgetrennt wird.
[Stand der Technik]
Xylit kommt im weiten Umfang auch in der Natur vor und ist ein natürlich auftretender Süßstoff, der auch in Früchten und Gemüsen, wie Erdbeeren, Blumenkohl, Salat und Spinat, enthalten ist. Xylit hat die Eigenschaft eines niedrigeren Brennwerts, obwohl es einen mit Saccharose vergleichbaren Süßgrad zeigt. Außerdem hat es eine ausgezeichnete Eigenschaft, d. h. eine Karies verhindernde Eigenschaft.
Wie in US Patent 4 008 825 angegeben ist, wird Xylit hauptsächlich durch Reduktion von Xylose hergestellt, die wiederum durch Hydrolyse von Xylan, das in pflanzlichen Materialien vorkommt, erhältlich ist. Da der Gehalt an Xylan in pflanzlichen Materialien niedrig ist, tritt bei dieser Methode die Schwierigkeit auf, daß die Ausbeute an Xylose, die durch diese Hydrolyse erhalten wird, niedrig ist und außerdem, daß zahlreiche Verunreinigungen, wie andere Pentosen und Hexosen die Xylose begleiten. Darüber hinaus treten als weitere Probleme die Bildung einer großen Menge an flüssigen Abfall während der Hydrolyse auf und die Aufbereitung der flüssigen Abfälle aus Gründen des Umweltschutzes verursacht hohe Kosten.
Die so erhaltene Xylose wird dann durch Reduktion in Gegenwart eines Katalysators in Xylit umgewandelt. Wenn Xylose reduziert wird, werden gleichzeitig mit der Xylose die vor stehend erwähnten Verunreinigungen reduziert, wie andere Pentosen und Hexosen, welche die Xylose begleiten, und werden in Zuckeralkohole mit einer Struktur ähnlich der des Xylits umgewandelt. Wie in der offengelegten japanischen Patentanmeldung (Kokai) 2690/1980, den japanischen Patentveröffentlichungen (Kokoku) 15054/1986 und 35169/1983 und anderen beschrieben wird, ist es daher erforderlich, die verunreinigenden, zahlreichen Arten von Zuckeralkoholen aus dem angestrebten Xylit zu entfernen.
Es ist daher wünschenswert, Xylose in möglichst reiner Form aus einem Hydrolysat von Xylan abzutrennen. Xylose mit niedriger Reinheit kann die Verfahrensstufen erschweren, die zur Reinigung von durch Reduktion von Xylose erhaltenem Xylit benötigt werden und führt infolgedessen zu einem Anstieg der Produktionskosten für Xylit.
Zur Lösung dieses Problems ist es erwünscht, ein Verfahren zur Herstellung von Xylit zu entwickeln, dessen Ausgangsmaterial leicht erhältlich ist und bei dem nur eine sehr geringe Menge an Abfall gebildet wird und das mit geringen Kosten durchgeführt werden kann.
Als eine solche Methode wurde die Herstellung von Xylit aus leicht erhältlicher Glycose mit Hilfe eines Mikroorganismus ohne Zwischenschaltung von Xylose als Zwischenprodukt, untersucht. Beispielsweise offenbart die internationale PCT-Veröffentlichung WO 94/0325 ein Verfahren zur Herstellung von Xylit aus Glucose unter Verwendung einer Hefe.
Ein Verfahren zur Herstellung von Xylit aus Glucose unter Verwendung eines Mikroorganismus kann die relativ strengen Bedingungen sowie die Gefahr ausschalten, mit denen die Hydrolyse von Xylan, das in Pflanzenmaterialien vorkommt, und die Hydrierung von Xylose unter Verwendung eines Metallkatalysators verbunden ist, wobei es die Herstellung von Xylit unter milden Bedingungen ermöglicht. Infolgedessen führt es zur Verminderung der Produktionskosten.
Durch Mikroorganismen gebildeter Xylit kann jedoch von organischen Säuren (beispielsweise Zitronensäure, Essigsäure, Gluconsäure, Fumarsäure und Äpfelsäure) als Nebenprodukte sowie von Zuckern und Zuckeralkoholen (beispielsweise Glucose, D-Arabit und Glycerin) als Nebenprodukte begleitet sein. Er wird außerdem von einigen Bestandteilen des Mediums und von den Mikroorganismen abgeleiteten Komponenten begleitet. Es ist daher schwierig, Xylit mit hoher Reinheit zu erhalten, wenn die Kulturbrühe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus (Brühe der enzymatischen Reaktion für Xylit oder Brühe der Xylit-Fermentation) als solche konzentriert wird, um den Xylit zu kristallisieren. Außerdem bezieht sich die erwähnte WO 94/0325 tatsächlich auf die Reinigung von durch Fermentation erhaltenem Xylit, es wird jedoch keine konkrete Verfahrensweise zur Reinigung des Xylits beschrieben. Darüber hinaus sind auch, abgesehen von dieser Veröffentlichung, keine Reinigungsverfahren für Xylit bei Methoden zur Herstellung von Xylit ausgehend von Glucose und unter Verwendung eines Mikroorganismus bekannt. Wenn daher hochreiner Xylit aus einer Xylit enthaltenden Lösung gewonnen werden kann, die unter Verwendung eines Mikroorganismus gebildet wurde (Xylit-Fermentationsbrühe oder Xylitenzymatische Reaktionsbrühe), dann bedeutet dies, daß Xylit in einfacher Weise kommerziell mit niedrigen Kosten erhalten werden kann.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
[Durch die Erfindung zu lösende Probleme]
Es ist daher Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Methode zur Herstellung von hochreinem Xylit in großtechnisch wirksamer Weise aus einer Xylit enthaltenden Lösung (einer Kulturbrühe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus, beispielsweise einer Xylit enthaltenden enzymatische Reaktionsbrühe oder einer Xylit enthaltenden Fermentationsbrühe) bei dem Verfahren zur Herstellung von Xylit unter Verwendung eines Xylit produzierenden Mikroorganismus zur Verfügung zu stellen.
[Methoden zur Lösung der Probleme]
Als Ergebnis von weitreichenden Untersuchungen einer Herstellungsmethode für hochreinen Xylit wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß hochreiner Xylit aus einer Kulturbrühe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus, wie einer Xylit enthaltenden enzymatischen Reaktionsbrühe oder einer Xylit enthaltenden Fermentationsbrühe unter geschickter Anwendung von Ionenaustauscherharzen erhalten werden kann. Die vorliegende Erfindung wurde aufgrund dieser Feststellungen fertiggestellt.
Die Erfindung bezieht sich somit auf ein Verfahren zur Herstellung von Xylit hoher Reinheit, welches folgende Schritte umfaßt: (1) Entfernen des festen Materials aus einer Kulturbrühe, die durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus in einem wäßrigen Kulturmedium erhalten wurde, (2) Entsalzen der resultierenden, von festem Material befreiten Kulturbrühe durch Entfernen von ionischen Substanzen aus dieser mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes, (3) Behandeln der resultierenden entsalzten Lösung durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, um den Xylit von einem anderen oder anderen Zuckeralkoholen) und Zukker(n) abzutrennen und (4) Isolieren des Xylits durch Abtrennen in hoher Reinheit aus der resultierenden Xylit-Lösung (Xylit-Fraktion). Die Erfindung bezieht sich auch auf ein ähnliches Verfahren, wobei jedoch das Entsalzen zweimal durchgeführt wird, indem eine Ionen-Ausschlußstufe zwischen Stufen (1) und (2) des vorstehend erwähnten Verfahrens eingeschoben wird, d. h. auf ein Verfahren zur Herstellung von Xylit in hoher Reinheit, welches folgende Stufen umfaßt: (1) Entfernen des festen Materials aus einer Kulturbrühe, die durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus in einem wäßrigen Kulturmedium erhalten wurde, (2a) Entsalzen der resultierenden, von festem Material befreiten Kulturbrühe durch Entfernung des größten Teils der ionischen Substanzen mit Hilfe der Ionenausschluß-Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, (2b) Entsalzen der aus der Ionenausschluß-Chromatographie resultierenden Lösung (der partiell entsalzten Lösung) durch Entfernen der verbliebenen ionischen Substanzen daraus mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes, (3) Behandeln der resultierenden entsalzten Lösung durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, wobei der Xylit von dem oder den anderen Zuckeralkohol en) und Zucker(n) abgetrennt wird und (4) Isolieren des Xylits durch seine Abtrennung in hoher Reinheit aus der resultierenden Xylit-Lösung (Xylit-Fraktion)
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNG
1 zeigt ein Ionenausschluß-Chromatogramm, erhalten unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes "UBK-550" (Stufe (2a) in Beispiel 3).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Nachstehend wird die vorliegende Erfindung ausführlicher erläutert.
Eine enzymatische Xylit enthaltende Reaktionsbrühe oder eine Xylit-Fermentationsbrühe, die erfindungsgemäß behandelt werden, können beispielsweise durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus, Gluconobacter oxydans ATCC 621, in einem Kulturmedium, das D-Arabit enthält, wobei der in dem Medium enthaltende D-Arabit in Xylit umgewandelt wird (enzymatische Reaktion) erhalten werden. D-Arabit kann seinerseits aus Glucose durch Fermentation mit Hilfe einer bekannten mikrobiologischen Methode erhalten werden, wie beispielsweise in Can. J. Microbiol., 31 (1985), 467–471 beschrieben ist. Der so gebildete D-Arabit kann nach dem Abtrennen aus der Fermentationsbrühe oder in Form dieser resultierenden Fermentationsbrühe ohne Abtrennung als Kulturmedium für einen Xylit produzierenden Mikroorganismus (Medium für die enzymatische Reaktion) verwendet werden. Schließlich wird Xylit durch enzymatische Reaktion oder Fermentation mit Hilfe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus hergestellt.
Da die so erhaltene Kulturbrühe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus (eine Xylit enthaltende enzymatische Reaktionsbrühe oder eine Xylit enthaltende Fermentationsbrühe) Zellen des Mikroorganismus und andere unlösliche Bestandteile (festes Material) enthält, wird zuerst das feste Material durch eine geeignete Methode, wie Zentrifugieren, entfernt (Stufe (1)).
Die so erhaltene, resultierende vom festen Material befreite Kulturbrühe enthält als Verunreinigungen nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien (nicht metabolisierte Ausgangsmaterialien), als Zwischenprodukte gebildete Zucker und Zuckeralkohole, Nebenprodukte, wie organische Säuren und anorganische Salze, die als Bestandteile des Kulturmediums zugesetzt wurden. Wenn diese Verunreinigungen zu entfernen sind, erfolgt zuerst die Entfernung von ionischen Substanzen einschließlich organischer Säuren, d. h. es wird zuerst ein Entsalzen durchgeführt. Wenn versucht wird, z. B. den Xylit durch Kristallisation aus einer solchen Xylit enthaltenden enzymatischen Reaktionsbrühe oder Fermentationsbrühe ohne vorheriges Entsalzen abzutrennen, kann das Konzentrieren einer solchen Brühe und die anschließende Zugabe von Xylit-Impfkristallen nicht zur Kristallisation von Xylit führen oder, falls er auskristallisiert, ist die Ausbeute merklich vermindert.
Solche ionischen Substanzen können aus einer Xylit-Lösung entfernt werden, indem diese beispielsweise durch ein Kationenaustauscherharz, wie "SK-1B" (hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation) und durch ein Anionenaustauscherharz, wie "WA30", hergestellt von, der gleichen Firma, geleitet wird (Stufe (2)).
Die resultierende entsalzte Lösung enthält, wenn auch der größte Teil der Gesamtfeststoffe oder des Feststoffge halts Xylit ist, nicht-ionische Verunreinigungen, wie nicht umgesetzte Ausgangsmaterialien oder nicht metabolisierte Ausgangsmaterialien und als Zwischenprodukte auftretende Zucker und Zuckeralkohole in kleinen Mengen. Daher werden diese Verunreinigungen durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes abgetrennt (Stufe (3)). Für diese chromatographische Abtrennung kann ein stark saures Kationenaustauscherharz, beispielsweise "UBK-555", hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, vorzugsweise in der Ca-Form verwendet werden. Die einer solchen chromatographischen Trennung zu unterwerfende Xylit-Lösung sollte eine Feststoffkonzentration von 10 bis 100 g/dl, vorzugsweise 30 bis 50 g/dl haben (wenn die Konzentration einer gegebenen, zu behandelnden Xylit-Lösung außerhalb diese Bereiches liegt, wird die Konzentration durch Verdünnen oder durch Konzentrieren so eingestellt, daß sie innerhalb des Bereiches ist), und wird in einer Menge von 5 bis 20%, vorzugsweise 5 bis 10%, bezogen auf die Menge des Harzes, aufgebracht. Durch diese chromatographische Trennung wird die Xylit-Lösung in eine Xylit-Fraktion und eine Fraktion von Zuckern und anderen Zuckeralkoholen fraktioniert. Die Fraktion von Zuckern und anderen Zuckeralkoholen kann gewünschtenfalls in die Umwandlungsstufe mit Hilfe eines Mikroorganismus zurückgeführt werden, wobei sie in Xylit umgewandelt werden.
Die chromatographische Trennung wird nach dem Entsalzen durchgeführt, um zu verhindern, daß Calciumionen des stark sauren Kationenaustauscherharzes für die Chromatographie durch die Einwirkung der ionischen Verunreinigungen, d.h. der organischen Säuren und anorganischen Salze, eliminiert werden.
Der gewünschte Xylit kann in hoher Reinheit erhalten werden, indem er aus der durch die chromatographische Trennung fraktionierten Xylit-Lösung abgetrennt wird (Stufe (4)).
Die Isolierung von Xylit mit hoher Reinheit durch Abtrennen aus der vorstehend erwähnten Xylit-Fraktion kann bei spielsweise durch Kristallisation durch Konzentrieren erfolgen, was per se eine übliche Verfahrensweise ist. Diese Kristallisation kann bewirkt werden, indem eine Xylit-Lösung soweit konzentriert wird, bis der Feststoffgehalt eine Konzentration im Bereich von 35 bis 85 g/10 g Wasser erreicht, wonach Kristallkeime zugesetzt werden und allmählich gekühlt wird. Der Xylit kann in hoher Reinheit erhalten werden, indem die resultierenden ausgefällten Xylit-Kristalle mit Hilfe einer geeigneten Fest-Flüssig-Trennmethode, wie Filtration, Zentrifugieren oder dergleichen, abgetrennt werden. Eine solche Isolierung durch Abtrennen kann auch durch Kristallisation unter Zugabe eines organischen Lösungsmittels, was per se eine konventionelle Verfahrensweise ist, erfolgen. Im einzelnen, wenn die vorstehend erwähnte Xylit-Fraktion mit einem niederen Alkohol versetzt wird, der mindestens mit Wasser mischbar ist (ein organisches Lösungsmittel), wie Methanol, Ethanol, Isopropylalkohol oder dergleichen, kristallisiert der in einem solchen Alkohol kaum lösliche Xylit aus. Der Xylit kann auch in höher Reinheit durch Abtrennung erhalten werden, indem die resultierenden ausgefällten Xylit-Kristalle einer geeigneten Fest-Flüssig-Trennung, wie durch Filtration, Zentrifugation oder dergleichen unterworfen werden, wie im Fall der vorstehend beschriebenen Kristallisation durch Konzentrieren. Alternativ können die Kristallisation durch Konzentrieren und die Kristallisation durch Zugabe eines organischen Lösungsmittels in Kombination angewendet werden. So wird z. B. die vorstehend angegebene Xylit-Fraktion zuerst in einem gewissen Ausmaß konzentriert und dann mit einem solchen organischen Lösungsmittel versetzt, wodurch der Xylit auskristallisiert.
Vorstehend wurde eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, bei der die Stufe des Entsalzens einmal bzw. in einer Stufe durchgeführt wird (einstufiges Entsalzungsverfahren). Diese Ausführungsform kann auch dadurch verwirklicht werden, daß eine Entsalzungsstufe durch Ionenauschluß-Chromatographie als Vorstufe vor der obigen Entsal zungsstufe eingefügt wird (zweistufiges Entsalzungsverfahren) .
Nachstehend werden die Entsalzungsstufen (Stufen (2a) und (2b)) des zweistufigen Entsalzungsverfahrens ausführlich beschrieben.
Wie bereits unter Bezugnahme auf das einstufige Entsalzungsverfahren erläutert wurde, enthält die Xylit-Lösung, die durch Entfernen des festen Materials aus einer Kulturbrühe eines Xylit produzierenden Mikroorganismus erhalten wurde, noch Verunreinigungen, wie organische Säuren und anorganische Salze.
Das Entfernen von organischen Säuren erfolgt gewöhnlich mit Hilfe von Innenaustausch-Verfahren unter Verwendung eines Ionenaustauscherharzes. Diese Verfahren benötigen eine solche Menge des Harzes, daß die organischen Säuren vollständig adsorbiert werden können und die organischen Säuren werden an dem Harz adsorbiert, um sie zu entfernen. Um das Harz wieder zu verwenden, müssen die adsorbierten organischen Säuren außerdem unter Verwendung einer großen Menge einer Säure oder von Alkali eluiert werden, wodurch ein großer Anteil an flüssigem Abfall resultiert und dadurch Kosten für Ausgangsmaterialien und für die Behandlung der flüssigen Abfälle verursacht werden. Es ist daher bevorzugt, das Harz in möglichst geringen Mengen einzusetzen, und wenn diese organischen Säuren mit Hilfe einer einfacheren Verfahrensweise entfernt werden können, ist es möglich, die Menge des zu verwendenden Harzes zu verringern, wodurch wiederum die Kosten für die Xylit-Produktion erniedrigt werden und daher Xylit kommerziell in einfacherer Weise und kostengünstiger erhalten werden kann.
Dies wurde mit Hilfe des zweistufigen Entsalzungsverfahrens ermöglicht, bei dem das Entsalzen mit Hilfe der Ionenausschluß-Chromatographie (Stufe (2a)) durchgeführt wird, bevor die Entsalzungsstufe mit einem Kationenaustauscherharz und einem Anionenaustauscherharz des vorstehend erklärten einstufigen Entsalzungsverfahrens (Stufe (2b)) vorgenommen wird. Wie gut bekannt ist, werden, wenn ein Ionenaustauscherharz in eine Elektrolytlösung eingetaucht wird, Elektrolyte mit den Gegenionen des Ionenaustauscherharzes entsprechend dem Donnan-Ausschluß ausgeschlossen und dadurch gehindert, in das Ionenaustauscherharz einzutreten. Andererseits können Nicht-Elektrolyte ohne Ausschluß durch das Harz in das Ionenaustauscherharz eintreten. Die Verfahrensweise zum Gewinnen einer Nicht-Elektrolyte enthaltenden Fraktion wird als Ionenausschluß-Verfahren oder Ionenausschluß-Chromatographie bezeichnet, wobei unter Ausnutzung dieser Erscheinung eine Lösung, die sowohl Elektrolyte, als auch Nicht-Elektrolyte enthält, auf eine Kolonne eines Ionenaustauscherharzes aufgegeben wird; eine Elektrolyte enthaltende Fraktion, die durch das Harz ausgeschlossen wird, zuerst eluiert wird und danach eine Nicht-Elektrolyte enthaltende Fraktion, die später eluiert wird, aus der Kolonne gewonnen wird.
Das Entsalzen mit Hilfe der Ionenausschluß-Chromatographie (Stufe (2a)) benutzt ein stark saures Kationenaustauscherharz, beispielsweise "UBK-550" hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, vorzugsweise in der Na-Form oder der NH₃-Form. Eine der Ionenausschluß-Chromatographie zu unterwerfende Xylit-Lösung sollte eine Konzentration der Gesamtfeststoffe oder des Feststoffgehalts von 10 bis 100 g/dl, vorzugsweise 25 bis 70 g/dl, aufweisen und wird in einer Menge von 5 bis 20%, vorzugsweise 5 bis 10%, bezogen auf die Menge des Harzes, aufgegeben. Dadurch können etwa 80 der organischen Säuren, d.h. der größte Teil der ionischen Substanzen, aus der Xylit-Lösung entfernt werden.
Die verbleibenden ionischen Substanzen werden mit Hilfe der Entsalzung des vorstehend erläuterten einstufigen Entsalzungsverfahrens entfernt. Dabei wird die Xylit-Lösung, nachdem sie der Entsalzung mit Hilfe dieser Ionenausschluß-Chromatographie (Stufe (2a)) unterworfen wurde, durch ein Kationenaustauscherharz, z. B. "SK-1B", hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, und ein Anionenaustauscherharz, z. B.
"WA30" geleitet, wodurch diese verbliebenen ionischen Substanzen aus der Xylit-Lösung entfernt werden (Stufe (2b)).
Das zweistufige Entsalzungsverfahren ist das gleiche wie das einstufige Entsalzungsverfahren, mit der Ausnahme, daß die Entsalzungsstufe (Stufe (2)) des letzteren Verfahrens durch die zwei Entsalzungsstufen, d.h. eine erste Entsalzungsstufe mit Hilfe des Ionenausschluß-Verfahrens (Stufe (2a)), die vorstehend beschrieben wurde, und eine zweite Entsalzungsstufe mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes (Stufe (2b)) ersetzt ist. Daher ist keine weitere Erläuterung notwendig.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen zur weiteren Erläuterung der Erfindung.
Die quantitative Analyse jeder der nachstehend gezeigten Komponenten wurde mit Hilfe von HPLC durchgeführt.
Die analytischen Bedingungen sind wie folgt:

(a) Für die drei Arten von Komponenten, d. h. Xylit, Arabit und Xylulose: Kolonne: HPLC-Kolonne "Shodex SUGARSC-1211" (6 mm∅ × 250 mm), hergestellt von Showa Denko K. K., Kolonnen-Badtemperatur: 60°C, Elutionsmittel: Acetonitril/Wasser = 40/60, Detektion: RI-Detektor.
(b) Für die drei Arten von Komponenten, d.h. Essigsäure, Zitronensäure und Gluconsäure: Kolonne: HPLC-Kolonne "YMC YMC-PackODS-AM303" (4,6 mm∅ × 250 mm), hergestellt von YMC Co. Ltd., Kolonnen-Badtemperatur: 20°C, Elutionsmittel: 0,1 M NaH₂PO₄-Puffer (pH = 2,8)/Acetonitril = 95/5 Detektion: UV-Detektor (220 nm).

Beispiel 1 (einstufiges Entsalzungsverfahren, ausgehend von D-Arabit)
(1) Herstellung von Xylit durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus und Entfernen des festen Materials aus der Kulturbrühe des Xylit produzierenden Mikroorganismus
(Stufe (1)):
3,7 l eines wäßrigen Kulturmediums (pH = 7,0), das 2,4 (Gew./Vol.) Kartoffeldextrose (hergestellt von Difco), 3 Hefeextrakt (hergestellt von Difco), 0,5 % Fleischextrakt (hergestellt von Difco) und 1,5% Glycerin enthielt, wurden durch 15-minütiges Erhitzen auf 120°C sterilisiert. D-Arabit, der durch 15-minütiges Erhitzen auf 120°C sterilisiert worden war, wurde in einer Menge von 2% (Gew./Vol.) zu dem obigen Kulturmedium gegeben. Das Kulturmedium wurde mit Gluconobacter oxydans ATCC 621 beimpft und unter Schütteln bei 30°C während 3 Tagen kultiviert bzw. inkubiert. Die Mikroorganismen-Zellen wurden aus der resultierenden Kulturbrühe durch Zentrifugieren gewonnen und einmal mit physiologischer Salzlösung gewaschen.
D-Arabit wurde in 0,1 m Phosphatpuffer (pH = 6,0) in einer solchen Menge gelöst, daß seine Endkonzentration 5 (Gew./Vol.) betrug, wodurch eine Lösung in einer Menge von 320 ml erhalten wurde. Unter Verwendung der Lösung als Basis-Kulturmedium (Reaktionslösung) wurden die vorstehend gewonnenen und gewaschenen Mikroorganismen-Zellen diesem in einer Menge von etwa 10% (Gew./Vol.), angegeben als Naßgewicht, zugesetzt. Um eine pH-Verminderung des Kulturmediums im Verlauf der Kultivierung oder Inkubation (Reaktion) zu verhindern, wurde außerdem Calciumcarbonat in einer Menge von 2 (Gew./Vol.) zugesetzt. Die Kultur wurde unter Schütteln bei 30°C durchgeführt. Als Kohlenstoffquelle wurde Glucose in einer Menge von 1% (Gew./Vol.) zu Beginn der Kultur zugesetzt und nach 6 Stunden vom Beginn der Kultur wurde Ethanol in einer Menge von 5% (Gew./Vol.) zugegeben. 24 Stunden nach Be ginn der Kultur war Xylit in einer Menge von 4,9 g pro 1 dl der Kulturbrühe gebildet worden (Ausbeute 98%, bezogen auf D-Arabit).
Zu diesem Zeitpunkt wurde die Kultur beendet und die resultierende Kulturbrühe (Xylit enthaltende enzymatische Reaktionsbrühe) wurde zentrifugiert, um die Mikrobenzellen und andere unlösliche Komponenten (festes Material) zu entfernen, wonach mit Hilfe eines 0,2 μm-Membranfilters filtriert wurde.
Das resultierende Filtrat hatte eine Menge von 260 ml und enthielt Xylit in einer Konzentration von 4,5 g/dl, Essigsäure in einer Konzentration von 3,4 g/dl, Gluconsäure in einer Konzentration von 1,77 g/dl und Phosphorsäure in einer Konzentration von 0,10 g/dl.
(2) Entfernen der ionischen Substanzen mit Hilfe der Ionenaustausch-Chromatographie (Stufe (2)):
Ein 200 ml-Anteil wurde aus der in der vorherigen Stufe (1) erhaltenen Xylit-Lösung entnommen. Der Anteil wurde zuerst durch eine mit 200 ml "SK-1BL" (H-Form), ein von Mitsubishi Chemical Corporation hergestelltes Kationenaustauscherharz, gepackte Kolonne geleitet und dann durch eine mit 250 ml "MARATHON A2M×BD" (OH-Form), hergestellt von der gleichen Firma, gepackte Kolonne geleitet, um die Entsalzung vorzunehmen.
Die entsalzte Lösung wurde in einer Menge von 510 ml gewonnen und enthielt Xylit in einer Konzentration von 1,43 g/dl und Gluconsäure in einer Konzentration von 0,03 g/dl. (3) Abtrennung von Zuckern und anderen Zuckeralkoholen durch Chromatographie (Stufe (3)): Die durch mehrfaches Wiederholen der Stufen (1) und (2) erhaltenen entsalzten Lösungen wurden kombiniert und konzentriert, wodurch eine Xylit-Lösung erhalten wurde, welche die einzelnen Komponenten in folgenden Konzentrationen enthielt: Xylit in einer Konzentration von 34,5 g/dl, D-Arabit in einer Konzentration von 0,5 g/dl und D-Xylulose in einer Konzentration von 0,7 g/dl.
1300 ml "UBK-555" (Ca-Form), ein von Mitsubishi Chemical Corporation hergestelltes Kationenaustauscherharz, wurde in eine mit einem Wärmeisoliermantel ausgestattete Kolonne mit einem Durchmesser von 5,0 cm gepackt, auf die 125 ml der vorstehend erwähnten Xylit-Lösung aufgegeben wurden und mit entionisiertem Wasser in einer Fließrate von 9 ml/min entwickelt. Das Eluat wurde zwischen 0,74 RV und 1,2 RV fraktioniert oder gewonnen, wobei 540 ml einer Lösung erhalten wurden, die Xylit in einer Konzentration von 8,2 g/dl und D-Arabit in einer Konzentration von 0,1 g/dl enthielt.
(4) Gewinnung des Xylits durch Abtrennung (Stufe (4)): Eine Lösung, die Xylit in einer Konzentration von 7,5 g/dl und D-Arabit in einer Konzentration von 0,09 g/dl enthielt, wurde wie in Stufe (3) hergestellt. Ein Anteil von 1720 ml wurde aus der Lösung entnommen und mit Aktivkohle versetzt, um sie zu entfärben. Nach dem Abfiltrieren der Aktivkohle wurde das Filtrat konzentriert, bis die Konzentration des Xylits 45 g pro 10 g Wasser betrug. Nach dem Konzentrieren wurden dem Konzentrat Keimkristalle von Xylit zugesetzt und es wurde während einer Dauer von etwa 3,5 Stunden allmählich von 60°C auf 25°C abgekühlt, während die Temperatur geregelt wurde. Es wurde dann über Nacht gerührt, um die Kristallisation des Xylits fertigzustellen.
Nach Beendigung der Kristallisation wurden die Kristalle abgetrennt, mit einer kleinen Menge Wasser gewaschen und getrocknet, wobei kristalliner Xylit in einer Menge von 80,1 g mit einer Reinheit von 99,1% erhalten wurde. Die Kristalle enthielten 0,9% Feuchtigkeit, jedoch wurden keine anderen Verunreinigungen festgestellt und daher wurde gefunden, daß es sich um hochreinen kristallinen Xylit handelte.
Beispiel 2 (einstufiges Entsalzungsverfahren, ausgehend von der Fermentation von D-Arabit)
Ein YM-Kulturmedium, hergestellt von Difco, wurde mit Debaryomyces hansenii var. hansenii Stamm IFO 0060 beimpft und wurde 3 Tage lang bei 30°C kultiviert oder inkubiert.
Ein Kulturmedium (pH = 6,0), das 10% D-Glucose, 0,5 Pepton, 0,1% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ und 0,2% Hefeextrakt enthielt, wurde durch 15-minütiges Erhitzen auf 120°C sterilisiert. Nach der Sterilisation wurden 2% (Gew./Vol.) gesondert sterilisiertes CaCO₃ zugesetzt, um eine Verminderung des pH-Werts des Mediums im Verlauf der Kultur zu verhindern. Das Kulturmedium wurde mit der vorstehend erwähnten Kulturlösung in einer Menge von 10% (Vol./Vol.) beimpft und es wurde dann bei 30°C kultiviert. Am dritten Tag der Kultur hatte sich D-Arabit in einer Konzentration von 3,6 g/dl gebildet (36 Ausbeute, bezogen auf die D-Glucose).
Mit der Ausnahme, daß das Basis-Kulturmedium in Stufe (1) in Beispiel 1 durch 1000 ml der resultierenden D-Arabit-Fermentationsbrühe ersetzt wurde, wurde die gleiche Verfahrensweise, die in diesem Beispiel angegeben ist, durchgeführt, wobei schließlich hochreiner kristalliner Xylit in einer Menge von 15,8 g erhalten wurde.
Beispiel 3 (zweistufiges Entsalzungsverfahren, ausgehend von D-Arabit)
(1) Herstellung von Xylit durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus und Entfernen des festen Materials aus der Kulturbrühe des Xylit produzierenden Mikroorganismus (Stufe (1)):
Die gleiche Verfahrensweise wie in Stufe (1) des Beispiels 1 wurde durchgeführt, wobei die unlöslichen Komponenten (festes Material) entfernt wurden, und der restliche Anteil wurde dann durch ein Membranfilter geleitet, um ein Filtrat zu erhalten (dieses hatte eine ähnliche Zusammensetzung wie das Filtrat in Stufe (1) des Beispiels 1).
(2) Ausschluß der ionischen Substanzen durch das Ionenausschluß-Verfahren (Stufe (2a)):
1700 ml "UBK-550" (NH₃-Form, erhalten durch Ersatz der Na-Form mit wäßrigem Ammoniak), hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, wurde in eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5,6 cm gepackt. Auf diese Kolonne wurden 110 ml einer wäßrigen Xylit-Lösung aufgegeben, die 45,1 g/dl Xylit, 0,5 g/dl D-Arabit, 5,9 g/dl Zitronensäure und 11,0 g/dl Gluconsäure enthielt und die durch Konzentrieren des in Stufe (1) erhaltenen Filtrats gebildet wurde. Das Entwickeln erfolgte mit entionisiertem Wasser in einer Fließrate von 8 ml/min.
Wie später in 1 gezeigt ist, wurden der Xylit, der Arabit und die organischen Säuren abgetrennt, wobei eine wäßrige Xylit-Lösung in einer Menge von 580 ml erhalten wurde, die 6,9 g/dl Xylit, 0,08 g/dl D-Arabit, 0,06 g/dl Zitronensäure und 0,64 g/dl Gluconsäure enthielt.
(3) Entfernen der ionischen Substanzen durch IonenaustauschChromatographie (Stufe (2b)):
Nachdem die erste Stufe der Entsalzung mit Hilfe des Ionenausschluß-Verfahrens durchgeführt worden war, wurde nach der vorherigen Stufe (2a) eine zweite Entsalzungsstufe durchgeführt, die mit Hilfe einer konventionellen Methode unter Verwendung eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes wie in Stufe (2) des Beispiels 1 beschrieben ist, vorgenommen wurde.
(4) Abtrennung von Zuckern und anderen Zuckeralkoholen durch Chromatographie (Stufe (3)):
Eine Xylit-Lösung der gleichen Zusammensetzung wie die in Stufe (3) des Beispiels 1, die 34,5 g/dl Xylit, 0,5 g/dl D-Arabit und 0,7 g/dl D-Xylulose enthielt, wurde durch Wiederholen der Stufen (1) bis (2b) erhalten.
125 ml der vorstehend erwähnten Xylit-Lösung wurden auf eine Kolonne mit einem Durchmesser von 5,0 cm, die mit einem Wärmeisoliermantel ausgestattet war und mit 1300 ml "UBK-555" (Ca-Form), einem Kationenaustauscherharz, hergestellt von Mitsubishi Chemical Corporation, gepackt war, aufgegeben und mit entionisiertem Wasser in einer Fließrate von 9 ml/min entwickelt. Das Eluat wurde zwischen 0,74 RV und 1,2 RV gewonnen, wobei wie in Stufe (3) des Beispiels 1 540 ml einer Lösung erhalten wurden, die 8,2 g/dl Xylit und 0,1 g/dl D-Arabit enthielt.
(5) Gewinnung von Xylit durch Abtrennen (Stufe (4)):
Nach der Verfahrensweise der Stufe (4) des Beispiels 1 wurde die gleiche Menge an Xylit mit gleicher Reinheit wie in dieser Stufe aus einer Xylit-Lösung erhalten, welche die gleiche Zusammensetzung wie in dieser Stufe hatte.
Beispiel 4 (zweistufiges Entsalzungsverfahren, ausgehend von der D-Arabit-Fermentation)
Eine Fermentationsbrühe (1050 ml) von D-Arabit, die durch eine D-Arabit-Fermentation ähnlich der in Beispiel 2 erhalten wurde, wurde in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise aufgearbeitet, wobei 17,4 g hochreiner kristalliner Xylit erhalten wurden.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit, welches folgende Stufen umfaßt: (1) Entfernen von festen Materialien aus einer Kulturbrühe, die durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus in einem wäßrigen Kul-turmedium erhalten wurde, (2) Entsalzen der resultierenden, von festen Materialien befreiten Kulturbrühe durch Entfernen der ionischen Substanzen daraus mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes, (3) Behandeln der resultierenden entsalzten Lösung durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes zur Abtrennung des Xylits von anderen Zuckeralkoholen und Zuckern und (4) Gewinnen des Xylits durch Abtrennung von Xylit in hoher Reinheit aus der resultierenden Xylit-Lösung (Fraktion).
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit nach Anspruch 1, wobei das stark saure Kationenaustauscherharz in Stufe (3) in der Ca-Form vorliegt.
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kulturbrühe in Stufe (1) eine Kulturbrühe ist, die durch schließliches Kultivieren eines Xylit bildenden Mikroorganismus, ausgehend von D-Arabit, D-Xylulose oder Glucose, als Ausgangsmaterial, erhalten wurde.
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit, welches folgende Stufen umfaßt: (1) Entfernen der festen Materialien aus einer Kulturbrühe, die durch Kultivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus in einem wäßrigen Kul-turmedium erhalten wurde, (2a) Entsalzen der resultierenden, von festen Materialien befreiten Kulturbrühe durch Entfernen des größten Teils der ionischen Substanzen daraus mit Hilfe der Ionenausschluß-Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, (2b) Entsalzen der aus der Ionenausschluß-Chromatographie resultierenden partiell entsalzten Lösung durch Entfernen der verbliebenen ionischen Substanzen mit Hilfe eines Kationenaustauscherharzes und eines Anionenaustauscherharzes, (3) Behandeln der resultierenden entsalzten Lösung durch Chromatographie unter Verwendung eines stark sauren Kationenaustauscherharzes zur Abtrennung des Xylits von den anderen Zuckeralkoholen und Zukkern und (4) Gewinnen des Xylits durch seine Abtrennung in hoher Reinheit aus der resultierenden Xylitlösung (Fraktion).
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit nach Anspruch 4, wobei das stark saure Kationenaustauscherharz in Stufe (3) in der Ca-Form vorliegt.
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit nach Anspruch 4 oder 5, wobei das stark saure Kationenaustauscherharz in Stufe (2a) in der Na-Form oder der NH3-Form vorliegt.
Verfahren zur Herstellung von Xylit mit hoher Reinheit nach einem der Ansprüche 4 bis 6, wobei die Kulturbrühe in Stufe (1) eine Kulturbrühe ist, die durch schließliches Kul-tivieren eines Xylit produzierenden Mikroorganismus, ausgehend von D-Arabit, D-Xylulose oder Glucose als Ausgangsmaterial erhalten wurde.