DE60033941T2 - Neuartiges verfahren zur herstellung von l-epi-2-inosose und neuartiges verfahren zur herstellung von epi-inositol - Google Patents

Neuartiges verfahren zur herstellung von l-epi-2-inosose und neuartiges verfahren zur herstellung von epi-inositol Download PDF

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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Diese Erfindung betrifft ein Einstufenverfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose, die als solche biologische Aktivitäten aufweist und die von hohem Wert als Ausgangsmaterial zur Verwendung bei der Synthese von Arzneimitteln und anderem ist, wobei in dem Verfahren eine Ausgangsverbindung aus dem kostengünstigen myo-Inosit verwendet wird und unter der Wirkung eines Mikroorganismus in L-epi-2-Inosose umgewandelt wird, wobei keinerlei chemisches Syntheseverfahren beteiligt ist. Diese Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur effizienten Herstellung von epi-Inosit, der als solcher biologische Aktivitäten aufweist, und der als Arzneimittel nützlich ist, wobei L-epi-2-Inosose in dem Verfahren chemisch reduziert wird.
  • TECHNISCHER HINTERGRUND
  • Myo-Inosit ist eine bekannte natürlich auftretende Substanz, die durch die folgende planare Strukturformel (A) wiedergegeben wird
    Figure 00010001
    oder durch die folgende sterische Strukturformel (A')
    Figure 00020001
    L-epi-2-Inosose ist eine bekannte Substanz, die durch die folgende planare Strukturformel (B)
    Figure 00020002
    oder durch die folgende sterische Strukturformel (B')
    Figure 00020003
    wiedergegeben wird.
  • Ferner ist epi-Inosit eine bereits bekannte chemisch synthetisierte Substanz, die durch die folgende planare Strukturformel (C)
    Figure 00030001
    oder durch die folgende sterische Strukturformel (C')
    Figure 00030002
    wiedergegeben wird.
  • Epi-Inosit ist eines der Stereoisomeren von myo-Inosit.
  • Für Inososen (die auch als Pentahydroxycyclohexanone oder alicyclische Ketohexosen bezeichnet werden) ist allgemein bekannt, dass sie durch eine biologische Oxidation von Inosit synthetisiert wurden. [A. J. Kluyver und A. Boezaardt: "Rec. Trav. Chim." 58, Seite 956 (1939)], durch eine enzymatische Oxidation von Inosit [L. Anderson et al.: "Arch. Biochem. Biophys." 78, Seite 518 (1958)], durch Oxidation von Inosit mit Luft in Gegenwart eines Platinkatalysators [K. Heyns und H. Paulsen: "Chem. Ber." 86, Seite 833 (1953)] oder durch Oxidation von Inosit mit einem oxidierenden Reagens wie Salpetersäure [T. Posternak: "Helv. Chim. Acta" 19, Seite 1333 (1936)].
  • Als Inososen, die hergestellt werden können durch biologische Oxidation oder enzymatische Oxidation von myo-Inosit, einem der Inosite, ist nur eine Inosose bekannt, nämlich scyllo-Inosose (auch bezeichnet als myo-Inosose-2) [A. J. Kluyver und A. Boezaardt: "Rec. Trav. Chim." 58, Seite 956 (1939); L-Anderson, et al.,: "Arch. Biochem. Biophys." 78, Seite 518 (1958)]. Es wurde noch kein Mikroorganismus beschrieben, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose zu oxidieren. L-epi-2-Inosose ist nützlich als Ausgangsmaterial für die Synthese von D-chiro-Inosit (abgekürzt als DCI) [vgl. US-Patent Nr. 5 406 005]. DCI ist nützlich als Arzneimittel für die Therapie von Insulin-resistentem Diabetes (veröffentliche Beschreibung von WO 90/10439), und es wird erwartet, dass er als Arzneimittel zur Linderung des polycystischen Ovarialsyndroms genutzt werden kann [J. A. Nestler et al.: "New Engl. J. Med." 340, Seite 1314 (1999)]. Als bekanntes Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose wird beschrieben (1) ein Verfahren, bei dem L-epi-2-Inosose durch Oxidieren von myo-Inosit mit Salpetersäure unter Bildung einer racemischen Mischung von DL-epi-2-Inosose oxidiert wird (d.h. (±)-epi-2-Inosose), wonach die resultierende racemische Mischung mit Wasserstoff in Gegenwart eines Platinoxidkatalysators unter Bildung von epi-Inosit reduziert wird, und der epi-Inosit mit einem Mikroorganismus, Acetobacter suboxydans, mikrobiologisch oxidiert wird, um L-epi-2-Inosose herzustellen [T. Posternak: "Helv. Chim. Acta" 29, Seite 1991 (1946)]. Es wird auch beschrieben (2) ein Verfahren, bei dem L-epi-2-Inosose als eine derjenigen Verbindungen synthetisiert wird, die hergestellt werden können mit Hilfe einer Acyloin-Kondensation von Glucodialdose, nachdem diese Glucodialdose chemisch aus D-Glucuronsäure hergestellt wurde (US-Patent Nr. 5 406 005).
  • Inosit ist ein allgemeiner Name von sechswertigen Alkoholen, wie sie sich von Cyclohexan ableiten, und Inosit schließt neun Stereoisomere davon ein. Es wurden die natürlich auftretenden Inosite gefunden, die fünf Inosite einschließen, nämlich myo-Inosit, D-chiro-Inosit, L-chiro-Inosit, muco-Inosit und scyllo-Inosit. Die anderen Inosite schließen epi-Inosit, allo-Inosit, neo-Inosit und cis-Inosit ein. Die letztgenannten vier Inosite sind die nicht natürlich auftretenden Inosite, die mittels chemischer Synthesen hergestellt wurden. Von den nicht-natürlich auftretenden Inositen wird für epi-Inosit erwartet, dass er als Arzneimittel zur Verbesserung des mentalen Depressions- und Angstsyndroms genutzt werden kann [R. H. Belmaker et al., Internationale veröffentlichte Anmeldung WO 99/22727 auf Basis der PCT-Patentanmeldung PCT/IL/00523; sowie R. H. Belmaker et al., "Int. J. Neuro-psychopharmacol." Vol. 1, Seite 31 (1998)].
  • Als bekannte Verfahren zur Herstellung von epi-Inosit werden beschrieben (1) ein Verfahren zur Synthese von epi-Inosit, das die Oxidation von myo-Inosit mit Salpetersäure unter Bildung einer racemischen Mischung von DL-epi-2-Inososen, gefolgt von einer Reduktion der letzteren mit Wasserstoff in Gegenwart eines Platinoxidkatalysators umfasst [T. Posternak: "Helv. Chim. Acta" 29, Seite 1991 (1946); (2) ein Verfahren zur Synthese von epi-Inosit, das die Oxidation eines zweiwertigen Alkohols von Cyclohexadien mit Osmiumsäure umfasst [T. Tschamber et al., "Helv. Chim. Acta" 75, Seite 1052 (1992)]; (3) ein Verfahren zur Synthese von epi-Inosit, das die Hydrierung von Tetrahydrobenzochinon umfasst [L. Odier: veröffentlichte EP-Patentanmeldung Nr. 524082]; und (4) ein Verfahren zur Synthese von epi-Inosit, das das Schützen von muco-Inosit auf geeignete Weise umfasst, wonach das geschützte Derivat kombinierten Oxidations- und Reduktionsreaktionen unterzogen wird [K. E. Espelia et al., "Carbohydrate Res." 46, Seite 53 (1976)], Es ist auch ein Verfahren zur Synthese von epi-Inosit bekannt, bei dem Glucose oder Galactose einer Kombination von einer Ferrier'schen Cyclisierungsreaktion mit einer Reduktionsreaktion mit einem geeigneten Reduktionsmittel unterzogen werden [Takahashi et al., "J. Org. Syn. Chem. Soc., Japan" 58, Seite 120 (2000)].
  • Diese bekannten Verfahren zur Synthese von L-epi-2-Inosose und epi-Inosit sind jedoch nicht unbedingt befriedigend als Verfahren, die für eine Produktion von epi-Inosit in großem Maßstab geeignet sind, da die bekannten Verfahren insoweit Probleme haben, als sie komplex bei ihrer Verwirklichung sind, eine Umweltverschmutzung beinhalten und/oder zu teuer sind. Es existiert somit eine dringende Nachfrage nach einem neuen Verfahren, das L-epi-2-Inosose in einem kommerziellen Maßstab erzeugen kann und auf eine einfache Weise mit hoher Effizienz durchgeführt werden kann, sowie nach einem neuen Verfahren, das epi-Inosit auf leichte Weise mit einer hohen Effizienz erzeugen kann. Eine Aufgabe dieser Erfindung besteht darin, ein derartiges neues Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose und ein derartiges Verfahren zur Herstellung von epi-Inosit bereitzustellen, die die obigen Anforderungen erfüllen können und viele Vorteile aufweisen und die sowohl L-epi-2-Inosose oder epi-Inosit auf wirksame Weise erzeugen können.
  • OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
  • Wir, die vorliegenden Erfinder, haben intensive Untersuchungen durchgeführt, um die obige Aufgabe dieser Erfindung zu lösen.
  • Im Ergebnis haben wir gefunden, dass dann, wenn ein neuer mikrobieller Stamm, Xanthomonas sp. AB10119, der von uns aus einer Bodenprobe isoliert wurde, in einem wässrigen Reaktionsmedium mit myo-Inosit umgesetzt wird, das billig erhältlich ist und die Formel (A) oder (A'), die oben gezeigt werden, aufweist, die 4-Hydroxylgruppe von myo-Inosit bevorzugt oder im Wesentlichen bevorzugt oxidiert (oder dehydriert) wird, wodurch L-epi-2-Inosose der obigen Formel (B) oder (B') hergestellt wird. Wenn L-epi-2-Inosose, die auf diese Weise hergestellt wurde, isoliert wird, und mittels Analyse mit einem Instrument wie beispielsweise einer Vorrichtung für die kernmagnetische Resonanzspektroskopie, einer Vorrichtung für die Massenspektrometrie, einer polarimetrischen Apparatur, usw. untersucht wird, bestätigt sich, dass das auf diese Weise erhaltene L-epi-2-Inosose-Produkt L-epi-2-Inosose ist, die eine hohe optische Reinheit aufweist.
  • Ferner haben wir untersucht, ob sich Mikroorganismen, die die Aktivität oder Fähigkeit zum Umwandeln von myo-Inosit in L-epi-2-Inosose aufweisen, in natürlicher Umgebung umfangreich zu finden sind. Im Ergebnis haben wir nun gefunden und bestätigt, dass gewisse mikrobielle Stämme mit einer hohen Aktivität oder Fähigkeit zur Oxidation und Umwandlung von myo-Inosit in epi-2-Inosose unter vielen taxonomischen Variäten von gram-negativen Bakterien existieren, die zu den gram-negativen Bakterien gehören, beispielsweise zu gramnegativen Bakterien der Gattung Xanthomonas oder der Gattung Pseudomonas, die zur Familie der Pseudomonaceae gehören, Bakterien der Gattung Acetobacter oder der Gattung Gluconobacter, die zur Familie der Acetobacteraceae gehören, Bakterien der Gattung Agrobacterium, die zur Familie der Rhizobiaceae gehören; Bakterien der Gattung Erwinia, der Gattung Enterobacter, der Gattung Serratia und der Gattung Yersinia, die zur Familie der Enterobacteriaceae gehöre; und Bakterien der Gattung Pasteurella oder Haemophilus, die zur Familie der Pasteurellaceae gehören. von diesen Mikrobenstämmen kann der oben erwähnte Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 ganz besonders als Beispiel für Mikrobenstämme erwähnt werden, die eine hohe Aktivität oder Fähigkeit aufweisen, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose zu oxidieren und umzuwandeln. Es können beispielsweise auch erwähnt werden der Stamm Pseudomonas sp. AB 10215 und der Stamm Erwinia sp. 10135, die beide von uns neu aus Erdproben isoliert wurden.
  • Auf der Basis der obigen Befunde der vorliegenden Erfinder haben wir nunmehr ein neues Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose geschaffen, wie es weiter unten beschrieben wird. Wir haben somit nunmehr gefunden, dass dann, wenn ein Mikroorganismus, der Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 oder der Stamm Pseudomonas sp. AB 10215 oder der Stamm Erwinia sp. 10135 oder irgendein anderer geeigneter Stamm unter aeroben Bedingungen entweder in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge an myo-Inosit, übliche Kohlenstoffquellen und übliche Stickstoffquellen enthält, oder in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge myo-Inosit (wovon ein Teil als Kohlenstoffquelle dienen kann) und Stickstoffquellen enthält (wobei ein Teil der Stickstoffquellen auch als Kohlenstoffquelle dienen kann, und zwar in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen, wenn die genannten Stickstoffquellen bei ihrer Verwendung Stickstoffquellen organischer Natur sind), jedoch keine der üblichen Kohlenstoffquellen enthält, dass es dann machbar ist, L-epi-2-Inosose wirksam aus myo-Inosit herzustellen und L-epi-2-Inosose in der resultierenden Kulturbrühe zu akkumulieren. Wir haben ferner gefunden, dass gemäß dem neuen Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose, wie es oben erwähnt wurde, eine in der genannten Kulturbrühe akku mulierte L-epi-2-Inosose in einem Kulturbrühenüberstand gelöst bleiben kann, der durch Entfernen der mikrobiellen Zellen der Mikroorganismen aus der Kulturbrühe erhalten wird, und dass die L-epi-2-Inosose auf wirksame Weise dadurch als Produkt einer hohen Reinheit gewonnen werden kann, dass man den Kulturbrühenüberstand einer Behandlung mit Ionenaustauscherharzen wie beispielsweise Kationenaustauscherharzen, Anionenaustauscherharzen usw. unterzieht oder einer Behandlung mit Aktivkohle oder einer Behandlung zur Kristallisation von L-epi-2-Ionosose, oder irgendeiner Kombination dieser Behandlungen. Ferner haben wir, die vorliegenden Erfinder, eine weitere Untersuchung durchgeführt, und im Ergebnis haben wir ferner gefunden, dass dann, wenn der Kulturbrühenüberstand dadurch erzeugt wird, dass man die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der Kulturbrühe abtrennt, die die L-epi-2-Inosose in einer Form, wie sie durch die Kultivierung des Mikroorganismus in dem Kulturmedium wie oben erwähnt, hergestellt und akkumuliert wurde, enthält, und man den resultierenden Kulturbrühenüberstand, der L-epi-2-Inosose enthält, dann direkt mit einer geeigneten Menge eines Reduktionsmittels wie Natriumborhydrid oder eines anderen Reduktionsmittels vom Hydridtyp versetzt, das Natriumborhydrid äquivalent ist, und danach die L-epi-2-Inosose mit dem Reduktionsmittel reagieren lässt, dass man dann in effizienter Weise die Reduktion von L-epi-2-Inosose in epi-Inosit bewirken kann. Es wurde mit anderen Worten gefunden, dass L-epi-2-Inosose wirksam dadurch zur epi-Inosit reduziert werden kann, dass man L-epi-2-Inosose mit dem genannten Reduktionsmittel in dem Kulturbrühenüberstand umsetzt, bevor diese L-epi-Inosose aus dem Kulturbrühenüberstand isoliert wurde.
  • Wir haben ferner verschiedene Versuche im Hinblick auf die Prozedur zur Behandlung von myo-Inosit mit gram-negativen Bakterien durchgeführt, die in der Lage sind, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose durch Oxidation von myo-Inosit umzuwandeln, wofür der oben erwähnte Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 typisch ist, sowie verschiedene Versuche mit der Arbeitsweise einer direkten Behandlung von L-epi-2-Inosose, die in dem Kulturbrühenüberstand vorhanden ist, mit einem geeigneten Reduktionsmittel, ohne Isolation der L-epi-2-Inosose aus dem genannten Kulturbrühenüberstand, so dass epi-Inosit in dem genannten Kulturbrühenüberstand hergestellt wird. Im Ergebnis haben wir viele Erkenntnisse aus diesen Versuchen gewonnen. Diese Erfindung wurde nunmehr auf der Basis dieser Erkenntnisse, wie sie von uns gewonnen wurden, zum Abschluss gebracht.
  • Gemäß einem ersten Aspekt dieser Erfindung wird daher ein Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose bereitgestellt, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verfahren das Umsetzen von myo-Inosit mit einem Mikroorganismus umfasst, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann und man dadurch myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandelt, um L-epi-2-Inosose herzustellen.
  • Das Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung kann in der Praxis gemäß einer von zwei Arbeitsweisen (A) und (B) durchgeführt werden, wie sie nachfolgend beschrieben werden.
  • Die Arbeitsweise (A) umfasst die Stufen der Kultivierung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge an myo-Inosit, Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, um auf diese Weise den genannten Mikroorganismus mit myo-Inosit umzusetzen und L-epi-Inosose in der resultierenden Kulturbrühe herzustellen und zu akkumulieren, und dann die Ernte der genannten Kulturbrühe sowie die Schritte der Entfernung der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus aus der resultierenden Kulturbrühe, um auf diese Weise einen Kulturbrühenüberstand zu erhalten, der die auf die beschriebene Weise hergestellte und darin akkumulierte L-epi-2-Inosose enthält, und danach L-epi-2-Inosose aus dem resultierenden Kulturbrühenüberstand dadurch zu gewinnen, dass man den genannten Kulturbrühenüberstand einer Behandlung mit einem oder mehreren Ionenaustauscherharz(en) unterzieht, oder einer Behandlung mit Aktivkohle, oder einer Behandlung zur Kristallisation von L-epi-2-Inosose, oder einer Kombination dieser Behandlungen.
  • Die Arbeitsweise (B) umfasst die Stufen der Kultivierung des Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, in einem flüssigen Kulturmedium und dann die Abtrennung der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der resultierenden Kulturbrühe, die Stufen der Zugabe der auf diese Weise abgetrennten mikrobiellen Zellen zu einer Pufferlösung oder einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge an darin gelöstem myo-Inosit enthält, und des Umsetzens der so zugesetzten mikrobiellen Zellen mit myo-Inosit in der genannten Pufferlösung oder dem genannten flüssigen Kulturmedium, um myo-Inosit in L-epi-2-Inosose in der resultierenden Reaktionslösung oder in der resultierenden Kulturbrühe umzuwandeln; und die Stufe der Gewinnung der auf diese Weise in der Reaktionslösung oder genannten Kulturbrühe hergestellten und akkumulierten L-epi-2-Inosose dadurch, dass man die Reaktionslösung oder die Kulturbrühe einer Behandlung mit einem oder mehreren Ionenaustauscherharz(en) oder einer Behandlung mit einer Aktivkohle oder einer Behandlung zur Kristallisation von L-epi-2-Inosose oder irgendeiner Kombination dieser Behandlungen unterzieht.
  • Der in dem Verfahren gemäß einem ersten Aspekt dieser Erfindung zu verwendende Mikroorganismus kann irgendein Mikroorganismenstamm sein, solange dieser eine solche Aktivität oder Fähigkeit aufweist, dass der genannte Stamm in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln.
  • Als konkretere Beispiele gibt es eine Varietät von Bakterien, die L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit herstellen können, wie hierin weiter oben beschrieben wurde. Beispielsweise gibt es den Stamm AB 10119, den Stamm AB 10215 und den Stamm AB 10135, die aus Erdproben isoliert wurden, wie oben erwähnt wurde, und die die effektivsten Bakterienstämme darstellen, die in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwenden sind. Mikrobiologische Eigenschaften dieser drei Bakterienstämme sind nachfolgend in Tabelle 1a, Tabelle 1b, Tabelle 1c und Tabelle 1d gezeigt.
  • Übrigens haben wir unsere Versuche zur Identifikation der genannten drei genannten Bakterienstämme im Einklang mit den folgenden japanischen Fachbüchern durchgeführt, die die Titel Shin Saikin Baichigaku Koza (2. Auflage, veröffentlicht bei Kindai Shuppan); A Guide on Identification of Medical Bacteria (2. Auflage, veröffentlicht bei Kindai Shuppan); und A Manual on Practice of Bacteriology (veröffentlicht bei Maruzen Publishing Company) aufweisen. Außerdem wurden die Ergebnisse unserer obigen Versuche unter Bezugnahme auf Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1 (1984) ausgewertet, um die isolierten Bakterienstämme zu identifizieren.
  • Figure 00130001
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Die morphologischen Eigenschaften des oben erwähnten Stammes AB 10119 sind erster Linie dadurch charakterisiert, dass dieser Stamm gram-negative Stäbchen darstellt, die Kolonien bilden, die mit einer gelben Farbe pigmentiert sind, und eine Größe von 0,4-0,6 × 0,6-4,0 μm aufweisen. Dieser Stamm AB 10119 ist Katalase-positiv und Oxidase-negativ und zersetzt Glucose unter aeroben Bedingungen unter Bildung von Säure. Das Wachstum dieses Stammes AB 10119 in einem Minimal-Medium ist schlecht, wobei jedoch die Zugabe von Methionin zu dem Minimal-Medium ein gutes Wachstum dieses Stammes ergibt. Dieser Stamm AB 10119 weist nicht die Fähigkeit auf, Nitrate zu reduzieren, und ist empfindlich gegenüber 0,01% Methylgrün und Thionin. Der Typ des Ubichinon-Moleküls in den Zellen des Stamms AB 10119 ist Q8 und der GC-Gehalt der DNA beträgt 68%.
  • Um diese morphologischen Eigenschaften des Stamms AB 10119 zusammenzufassen, wurde dieser Stamm beurteilt als Mikrobenstamm, der zur Gattung Xanthomonas sp. AB 10119 gehört. Gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, Seiten 119-210 (1984) umfassen die bekannten Bakterien der Gattung Xanthomonas fünf Spezies, nämlich Xanthomonas campestris; Xanthomonas fragariae; Xanthomonas albilineans; Xanthomonas axonopodis; und Xanthomonas ampelina.
  • Im Ergebnis unserer Prüfung der morphologischen Eigenschaften des Stamms 10119 im Vergleich mit denen der oben erwähnten fünf bekannten Spezies scheint der Stamm AB 10119 am stärksten einer bekannten Spezies Xanthomonas campestris zu ähneln. Da jedoch die morphologischen Eigenschaften dieses Stamms AB 10119 nicht völlig mit denen von Xanthomonas campestris übereinstimmen, haben wir diesen neuen Stamm als Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 bezeichnet, um ihn von der genannten bekannten Spezies zu unterscheiden, und wir haben ihn bei der autori sierten japanischen Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, mit Sitz in 1-3, 1-chome, Higashi, Tsukuba-City, Präfektur Ibaraki, Japan hinterlegt, und zwar unter der Hinterlegungs-Nummer FERM P-17382 (Hinterlegungsdatum 7. Mai 1999). Anschließend wurde dieser Stamm AB 10119 neu unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7168 nach den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der gleichen nationalen Hinterlegungsstelle seit 23. Mai 2000 hinterlegt.
  • Die morphologischen Eigenschaften des obigen Stamms AB 10215 sind überwiegend dadurch charakterisiert, dass dieser Stamm von gram-negativen Stäbchen gebildet wird, die Kolonien bilden, die in einer fahlgelben Farbe pigmentiert sind, und eine Größe von 0,3-0,5 × 0,6-6,5 μm aufweisen. Dieser Stamm AB 10215 ist Katalase-positiv und Oxidase-negativ und zersetzt Glucose unter aeroben Bedingungen unter Bildung von Säure. Das Wachstum dieses Stamms AB 10215 in einem Minimalmedium ist gut und weist die Fähigkeit auf, Nitrate zu reduzieren und ist gegenüber 0,01% Methylgrün und Thionin empfindlich. Der Typ des Ubichinon-Moleküls in den Zellen des Stamms AB 10215 ist Q8, und der GC-Gehalt an DNA ist 68%.
  • Diese morphologischen Eigenschaften des Stamms AB 10215 zusammenfassend scheint dieser Stamm einem bekannten Stamm, Pseudomonas maltophilia, am ähnlichsten zu kommen, der beschrieben wird im Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, Seiten 140-199 (1984). Der Stamm AB 10215 stimmt jedoch nicht vollständig mit einer bekannten Spezies, Pseudomonas maltophilia, überein, so dass wir diesen neuen Stamm als Pseudomonas sp. AB 10215 bezeichnet haben, um ihn von der bekannten Spezies zu unterscheiden, und wir haben ihn bei der japanischen Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, mit Sitz in 1-3, 1-chome, Higashi, Tsukuba-City, Präfektor Ibaraki, Japan unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM P-17804 hinterlegt (Hinterlegungsdatum: 31. März 2000). Danach wurde dieser Stamm AB 10215 nach den Bedingungen des Budapester Vertrags bei dem gleichen Nationalen Institut seit dem 23. Mai 2000 unter FERM BP-7170 neuerlich hinterlegt.
  • Die morphologischen Eigenschaften des obigen Stamms AB 10135 sind überwiegend dadurch gekennzeichnet, dass dieser Stamm von gram-negativen Stäbchen gebildet wird, die Kolonien bilden, die mit einer milchweißen Farbe pigmentiert sind, und eine Größe von 0,4-0,6 × 0,8-2,0 μm aufweisen. Dieser Stamm AB 10135 kann Glucose sowohl unter aeroben Bedingungen als auch anaeroben Bedingungen zersetzen, wobei jedoch das Wachstum des Stamms AB 10135 unter anaeroben Bedingungen sehr viel schlechter ist, verglichen mit seinem Wachstum unter aeroben Bedingungen. Außerdem ist dieser Stamm AB 10135 Katalase-positiv und Oxidase-negativ, und zersetzt Glucose unter aeroben Bedingungen unter Erzeugung von Säure. Das Wachstum dieses Stamms AB 10315 in einem gewöhnlichen Agar-Nährmedium ist sehr schwach, wobei jedoch die Zugabe von 5% Saccharose zu dem Agar-Nährmedium ein sehr üppiges Wachstum dieses Stamms auslösen kann. Der Typ des Ubichinon-Moleküls in den Zellen dieses Stamms ist Q8, und der GC-Gehalt der DNA ist 68%.
  • Die morphologischen Eigenschaften des Stamms AB 10135 zusammenfassend, wurde geschlossen, dass dieser Stamm zur Gattung Erwinia gehört. Gemäß Bergey's Manual of Systematic Bacteriology Vol. 1, Seiten 469-476 (1984) wurden die bekannten bakteriellen Stämme, die zu der Gattung Erwinia gehören, 15 Spezies zugeordnet, wobei jedoch der Stamm AB 10135 mit keinem der bekannten Stämme völlig übereinstimmt. Wir haben daher diesen neuen Stamm AB 10135 als Erwinia sp. AB 10135 bezeichnet, um ihn von den bekannten Erwinia-Stämmen zu unterscheiden, und wir haben ihn bei der japanischen Hinterlegungsstelle, dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, mit Sitz in 1-3, 1-chome, Higashi, Tsukuba-City, Präfektur Ibaraki, Japan unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM P-17803 hinterlegt (Hinterlegungsdatum: 31. März 2000). Danach wurde dieser Stamm AB 10315 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei dem gleichen Nationalen Institut seit dem 23. Mai 2000 unter einer Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7169 neu hinterlegt.
  • Nunmehr werden die beiden Arbeitsweisen (A) und (B) gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung, die oben erwähnt sind, in näheren Einzelheiten beschrieben.
  • Bei der Arbeitsweise (A) wird eine erste Stufe durchgeführt, bei der der Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kultur-Nährmedium kultiviert wird, das eine Menge an myo-Inosit, Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, um auf diese Weise in der resultierenden Kulturbrühe L-epi-2-Inosose herzustellen und zu akkumulieren.
  • Die Zusammensetzung des in der ersten Stufe des Verfahrens zu verwendenden flüssigen Kulturmediums ist nicht spezifisch beschränkt, solange mit ihm der angestrebte Zweck erreicht werden kann. Das flüssige Kulturmedium, das verwendet wird, kann irgendein Kulturmedium sein, das eine Menge myo-Inosit als Ausgangsmaterial enthält, das in L-epi-2-Inosose umgewandelt werden soll, und das zusätzlich Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Nährstoffquellen organischer Natur, anor ganische Salze und anderes enthält. Es kann irgendeines der bekannten synthetischen Kulturmedien und der bekannten natürlichen Kulturmedien verwendet werden. Es ist erwünscht, dass das hier zu verwendende flüssige Kulturmedium 0,1% bis 40%, vorzugsweise 20% bis 30%, myo-Inosit enthält, als Kohlenstoffquelle 0,1% bis 20%, vorzugsweise 0,5% bis 5,0% Glucose, Saccharose, Maltose oder Stärke enthält, und als Stickstoffquelle 0,01 bis 5,0%, vorzugsweise 0,5% bis 2,0% Hefeextrakt, Pepton, Casaminosäuren, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid, Ammoniumnitrat oder Harnstoff usw. enthält. Es ist ferner vorteilhaft, dass das flüssige Kulturmedium mit anorganischen Salzen versetzt wird, die in der Lage sind, Ionen von Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium, Kobalt, Mangan, Zink, Eisen, Kupfer, Molybdän, Phosphat, Sulfat oder andere zu liefern, soweit erforderlich. L-epi-2-Inosose kann wirksam produziert werden, wenn die Kultivierung des verwendeten Mikroorganismus durchgeführt wird, während die Konzentration an Wasserstoffionen in der resultierenden Kulturbrühe auf einen pH-Wert von 4 bis 10, vorzugsweise 5 bis 9, eingestellt wird.
  • Die Bedingungen für die Kultivierung des Mikroorganismus können in Abhängigkeit von der Natur des Mikroorganismenstamms und dem verwendeten Kulturmedium variieren, wobei jedoch die Kultivierungstemperatur eine Temperatur von 5 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 37°C, sein kann. Es ist ferner bevorzugt, dass die Kultivierung des Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen so durchgeführt wird, dass man das flüssige Kulturmedium schüttelt oder Luft in das flüssige Kulturmedium einbläst, usw. Der Kultivierungszeitraum kann ein solcher Zeitraum sein, in dem das myo-Inosit, das in der erhaltenen Kulturbrühe vorhanden ist, völlig verbraucht wurde, und die Menge an L-epi-2-Inosose, die auf diese Weise hergestellt und in der resultierenden Kulturbrühe akkumuliert wird, ein Maximum erreicht hat. Der Kultivierungszeitraum kann üblicherweise 1 bis 14 Tage, vorzugsweise 3 bis 10 Tage, betragen. Somit kann die Kulturbrühe, die L-epi-2-Inosose enthält, in der ersten Stufe des oben erwähnten Verfahrens erzeugt werden.
  • Danach wird eine zweite Stufe durchgeführt, in der die gewünschte L-epi-2-Inosose aus der Kulturbrühe gewonnen wird. Zum Zwecke dieser Gewinnung kann man eines oder mehrere übliche Verfahren zur Anwendung bringen, die herkömmlicherweise zur Isolation und Reinigung von irgendwelchen wasserlöslichen und neutralen Substanzen aus der Kulturbrühe konventionell zur Anwendung kommen. Somit werden die mikrobiellen Zellen der Mikroorganismen, die in dieser Erfindung verwendet werden, zuerst aus der resultierenden Kulturbrühe, die L-epi-2-Inosose enthält, entfernt, und dann wird der resultierende Kulturbrühenüberstand mit Aktivkohle oder mit einem oder mehreren Ionenaustauscherharz(en) behandelt, so dass alle Verunreinigungen, außer L-epi-2-Inosose, fast ganz aus dem Kulturbrühenüberstand entfernt werden können. Für die Zwecke der Durchführung der Behandlungen mit Ionenaustauscherharzen ist es jedoch nicht möglich, ein stark basisches Anionenaustauschharz in der OH–-Form zu verwenden, da die letztgenannten Harze L-epi-2-Inosose chemisch zersetzen können. Danach kann L-epi-2-Inosose nach Wunsch aus dem Kulturbrühenüberstand isoliert werden, der auf diese Weise mit der Aktivkohle oder Ionenaustauscherharzen behandelt wurde, wenn der Kulturbrühenüberstand so behandelt wird, dass L-epi-2-Inosose aus der Lösung auskristallisiert und erforderlichenfalls zusätzlich umkristallisiert wird.
  • Für den Zweck der Durchführung der Gewinnung von L-epi-2-Inosose aus dem genannten Kulturbrühenüberstand ist es, genauer gesagt, bevorzugt, eine solche Arbeitsweise anzuwenden, die das Hindurchleiten des Kulturbrühenüberstands, der die akkumulierte L-epi-2-Inosose enthält, durch eine Säule eines stark sauren Kationenaustauscherharzes umfasst, beispielsweise Duolite (eingetragene Marke) C-20 (H+-Form), um unerwünschte Komponenten zu entfernen, das Sammeln der ausströmenden Flüssigkeit aus der Säule, das Hindurchleiten eines Volumens entionisierten Wassers durch die Säule zum Waschen der Säule, das Sammeln der resultierenden wässrigen Waschlösungen, das Kombinieren der abgeströmten Flüssigkeit mit den wässrigen Waschlösungen, das Hindurchleiten der erhaltenen kombinierten Lösung durch eine Säule eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes, beispielsweise Duolite (eingetragene Marke) A368S (in der Form der freien Base), das Sammeln der resultierenden abströmenden Flüssigkeit von der letztgenannten Säule, das Hindurchleiten eines Volumens entionisierten Wassers durch die letztgenannte Säule zum Waschen der Säule, das Sammeln der erhaltenen wässrigen Waschlösungen und das Kombinieren der letztgenannten abgeströmten Flüssigkeit mit den letztgenannten wässrigen Waschlösungen, um auf diese Weise eine wässrige Lösung zu erhalten, die L-epi-2-Inosose enthält, jedoch im wesentlichen keine Verunreinigung irgendeiner Art enthält. Die so erhaltene wässrige Lösung kann dann konzentriert werden, um eine konzentrierte Lösung von L-epi-2-Inosose zu erhalten, die dann mit einer geeigneten Menge Ethanol versetzt wird. Wenn man die resultierende Mischung, die L-epi-2-Inosose und Ethanol enthält, über Nacht bei Raumtemperatur oder niedriger Temperatur stehen lässt, kann L-epi-2-Inosose in Form reiner Kristalle kristallisieren.
  • Bei der obigen Arbeitsweise (B) des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung werden verschiedene Schritte durchgeführt, die das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der erforderlichen Fähigkeit in einem Kulturmedium, das Abtrennen der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der resultierenden Kulturbrühe und das Zusetzen der so abgetrennten mikrobiellen Zellen zu einer Pufferlösung oder einem flüssigen Kulturmedium, die myo-Inosit enthalten, sowie anschließend die Umsetzung der mikrobiellen Zellen mit myo-Inosit in der genannten Pufferlösung oder dem genannten flüssigen Kulturmedium umfasst, um L-epi-2-Inosose in der resultierenden Reaktionslösung herzustellen, die von der genannten Pufferlösung oder dem genannten flüssigen Kulturmedium gebildet wird.
  • Als mikrobielle Zellen für eine Verwendung in der Stufe der Umsetzung von myo-Inosit mit den mikrobiellen Zellen können entweder die Zellen verwendet werden, die durch Abtrennen der Zellen aus der Kulturbrühe gesammelt wurden, wie sie in der ersten Stufe von Arbeitsweise (A) erhalten werden, oder die Zellen, die geerntet wurden durch Kultivieren des Mikroorganismus in einer getrennten Stufe unter geeigneten Kultivierungsbedingungen. Das Sammeln der mikrobiellen Zellen aus der Kulturbrühe kann auf irgendeine geeignete Weise für die Abtrennung von mikrobiellen Zellen bewirkt werden, indem man die Kulturbrühe einer Zentrifugierung, einer Filtration oder einem ähnlichen Verfahren unterwirft.
  • Als Reaktionsmedium, das für die Umsetzung von myo-Inosit mit den mikrobiellen Zellen zu verwenden ist, kann entweder ein flüssiges Kulturmedium oder eine Pufferlösung verwendet werden. Als das genannte flüssige Kulturmedium kann ein Kulturmedium verwendet werden, das eine ähnliche Zusammensetzung aufweist wie das Kulturmedium, das in der oben erwähnten ersten Stufe von Arbeitsweise (A) verwendet wird. Es kann auch ein solches flüssiges Medium verwendet werden, das sich zusammensetzt aus einem derartigen Überstand einer Kulturbrühe, die erhalten werden kann durch Kultivieren der Mikroorganismen in einer getrennten Stufe, gefolgt von der Abtrennung der mikrobiellen Zellen der Mikroorganismen von der resultierenden Kulturbrühe. Als die genannte Pufferlösung kann eine Phosphatpufferlösung, eine Tris-Pufferlösung oder Good's-CHES-Pufferlösung oder eine andere in einer Konzentration von 10 bis 500 mM, vorzugsweise 20 bis 100 mM, verwendet werden. Die Anfangskonzentration von myo-Inosit in einer Lösung von myo-Inosit, wie er in einer Pufferlösung oder in einem flüssigen Kulturmedium aufgelöst wurde, kann vorzugsweise auf einem Niveau von 0,1 bis 40% (in Gewicht) liegen.
  • Die Reaktionsbedingungen zur Durchführung der Umsetzung von myo-Inosit mit den mikrobiellen Zellen kann in Abhängigkeit von der Natur des mikrobiellen Stamms und dem Kulturmedium oder der Pufferlösung variieren, die verwendet werden. Üblicherweise kann die Reaktionstemperatur bei 5 bis 60°C liegen, vorzugsweise 10 bis 45°C, und die Reaktionszeit kann 1 bis 50 Stunden betragen, vorzugsweise 3 bis 48 Stunden. Der pH des flüssigen Kulturmediums oder der Pufferlösung kann bei 2 bis 10 liegen, vorzugsweise 3 bis 9.
  • Nach dem Abschluss der Umsetzung von myo-Inosit mit den mikrobiellen Zellen kann die Isolierung des angestrebten Produkts, L-epi-2-Inosose, aus der resultierenden Reaktionslösung auf gleiche Weise bewirkt werden, wie in der obigen zweiten Stufe von Arbeitsweise (A).
  • Gemäß einem zweiten Aspekt dieser Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung von epi-Inosit geschaffen, das dadurch gekennzeichnet ist, dass das Verfahren die Stufen der Umsetzung eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, mit myo-Inosit in einem wässrigen Reaktionsmedium zur Herstellung von L-epi-2-Inosose in dem genannten wässrigen Reaktionsmedium umfasst, wodurch die resultierende Reaktionslösung erhalten wird, die die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus und die hergestellte L-epi-2-Inosose enthält, sowie das Entfernen der mikrobiellen Zellen aus der genannten Reaktionslösung, um ein Reaktionslösungsfiltrat zu erhalten, das L-epi-2-Inosose enthält, das Zugeben eines geeigneten Reduktionsmittels direkt in das besagte Reaktionslösungsfiltrat, das L-epi-2-Inosose enthält, und die Reaktion des Reduktionsmittels mit L-epi-2-Inosose, um epi-Inosit und myo-Inosit herzustellen.
  • Dieses Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung kann in der Praxis nach einer der folgenden drei Arbeitsweisen (C), (D) und (E) durchgeführt werden.
  • Arbeitsweise (C) gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung umfasst die Stufe (erster Schritt) der Kultivierung unter aeroben Bedingungen eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose in einem wässrigen Medium umzuwandeln, das aus einem flüssigen Kulturmedium zusammengesetzt ist, das eine Menge myo-Inosit, Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, und zwar auf die gleiche Weise, wie für die Stufe der Kultivierung des Mikroorganismus in Arbeitsweise (A) des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung beschrieben wird, so dass das myo-Inosit mit dem genannten Mikroorganismus in dem wässrigen Reaktionsmedium oder in der resultierenden Kulturbrühe umgesetzt wird, um auf diese Weise das myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln und auf diese Weise L-epi-Inosose in der genannten Kulturbrühe herzustellen und zu akkumulieren, so dass auf diese Weise die Kulturbrühe erhalten wird, die die resultierende Reaktionslösung ist, die die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus und L-epi-2-Ino sose enthält, sowie die Stufe (zweite Stufe) der Entfernung der mikrobiellen Zellen des genannten Mikroorganismus von der so erhaltenen resultierenden Kulturbrühe, nämlich der resultierenden Reaktionslösung, wodurch ein Kulturbrühenüberstand erzeugt wird, nämlich das Filtrat der Reaktionslösung, die die hergestellte L-epi-2-Inosose enthält, ohne irgendeine Isolierung der L-epi-2-Inosose durchzuführen; sowie die Stufen (drittes Stadium) der Zugabe, direkt in den resultierenden Kulturbrühenüberstand (nämlich das Reaktionslösungsfiltrat), eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetall-Trialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids als Reduktionsmittel, und Bewirken der reduzierenden Reaktion von L-epi-2-Inosose mit diesem Reaktionsmittel, wobei auf diese Weise epi-Inosit und myo-Inosit in dem genannten Kulturbrühenüberstand erzeugt werden, nämlich dem Reaktionslösungsfiltrat; sowie die Stufe (viertes Stadium) der Gewinnung des epi-Inosits und myo-Inosits aus der resultierenden Reaktionslösung der Reduktionsreaktion, die der Kulturbrühenüberstand ist, die das auf diese Weise hergestellte epi-Inosit und myo-Inosit enthalten; sowie die Stufe (fünftes Stadium) des Trennens der so gewonnenen epi-Inosit- und myo-Inosit-Produkte voneinander.
  • Arbeitsweise (D) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung umfasst die Stufen (erste Stadium) des Kultivierens unter aeroben Bedingungen eines Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose in einem flüssigen Kulturmedium umzuwandeln, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, und zwar auf die gleiche Weise wie in der Stufe zur Kultivierung des Mikroorganismus, wie sie beschrieben ist in Arbeitsweise (B) des Verfahrens gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung, wodurch eine Kulturbrühe des genannten Mikroorganismus erhalten wird, und dann Abtrennen der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der resultie renden Kulturbrühe; die Stufe (zweites Stadium) der Umsetzung der so abgetrennten mikrobiellen Zellen des genannten Mikroorganismus mit myo-Inosit in einem wässrigen Reaktionsmedium, das gebildet wird von einer wässrigen Pufferlösung oder einem flüssigen Kulturmedium, um in diesem wässrigen Reaktionsmedium L-epi-2-Inosose herzustellen; die Stufe (drittes Stadium) der Entfernung der mikrobiellen Zellen des genannten Mikrorganismus von der resultierenden wässrigen Reaktionslösung, die die mikrobiellen Zellen des genannten Mikroorganismus und die auf diese Weise hergestellte L-epi-2-Inosose enthält, um ein resultierendes Filtrat der Reaktionslösung zu erhalten, aus dem die mikrobiellen Zellen entfernt wurden, in dem jedoch die L-epi-2-Inosose gelöst zurückbleibt; die Stufen (viertes Stadium) der Zugabe eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetall-Trialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids als Reduktionsmittel zu dem Reaktionslösungsfiltrat und Bewirken der reduzierenden Reaktion von L-epi-2-Inosose mit dem genannten Reduktionsmittel, wodurch epi-Inosit und myo-Inosit in dem genannten Reaktionslösungsfiltrat hergestellt werden; die Stufe (fünftes Stadium) der Gewinnung des epi-Inosit und myo-Inosit aus der resultierenden Reaktionslösung der Reduktionsreaktion, die die so hergestellten epi-Inosit und myo-Inosit enthält; und die Stufe (sechstes Stadium) der Trennung des so gewonnenen epi-Inosit und myo-Inosit voneinander.
  • Arbeitsweise (E) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung ist gegenüber den obigen Arbeitsweisen (C) und (D) modifiziert. Die Arbeitsweise (E) betrifft ein solches Verfahren, bei dem, vor der Durchführung der Stufe der reduzierenden Reaktion von L-epi-2-Inosose mit dem zugesetzten Reduktionsmittel, eine Vorstufe durchgeführt wird, bei der der pH des wässrigen Mediums, das sich zusammensetzt aus dem Kulturbrühenüberstand oder dem Reaktionslösungsfiltrat, die L- epi-2-Inosose enthalten, einmal auf einen alkalischen pH in einem Bereich von pH 8 bis 12 eingestellt wird, und wobei dann eine Stufe durchgeführt wird, die die Zugabe eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetall-Trialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids als Reduktionsmittel zu dem alkalischen wässrigen Medium, das L-epi-2-Inosose enthält und einen pH von 8 bis 12 aufweist, umfasst, und die Durchführung der reduzierenden Reaktion von L-epi-2-Inosose mit dem genannten Reaktionsmittel. Gemäß Arbeitsweise (E) kann der gewünschte epi-Inosit auf eine solche Weise hergestellt werden, dass die Ausbeute des hergestellten epi-Inosits sehr viel größer ist als die des als Nebenprodukt hergestellten myo-Inosits. Die in dem Verfahren gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung zu verwendenden Mikroorganismen können die gleichen sein wie diejenigen, die in dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt dieser Erfindung verwendet werden, und die in der Lage sind, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln.
  • Die oben erwähnten Arbeitsweisen (C) und (E) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung werden nunmehr in näheren Einzelheiten erklärt.
  • Bei der Arbeitsweise (C) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung wird in aller Kürze eine erste Stufe durchgeführt, die das Beimpfen eines flüssigen Kulturnährmediums, das eine Menge myo-Inosit enthält, mit einem Mikroorganismus beinhaltet, der die gewünschte Fähigkeit hat, dann die Kultivierung des beimpften Mikroorganismus unter aeroben Bedingungen, um auf diese Weise myo-Inosit umzuwandeln und L-epi-2-Inosose in der resultierenden Kulturbrühe herzustellen und zu akkumulieren, und das Ernten der Kulturbrühe, die die gewünschte L-epi-2-Inosose enthält; sowie eine zweite Stufe, die die Entfernung der mikrobiellen Zellen aus der geernteten Kulturbrühe umfasst, um einen Kulturbrühenüberstand zu erhalten, der L-epi-2-Inosose enthält; sowie eine dritte Stufe, die die Zugabe eines geeigneten Reduktionsmittels direkt zu dem Kulturbrühenüberstand umfasst, ohne irgendeine Isolierung von L-epi-2-Inosose aus dem Kulturbrühenüberstand durchzuführen, und dann die reduzierende Reduktion von L-epi-2-Inosose; sowie eine vierte Stufe, die die Gewinnung des so hergestellten epi-Inosits aus der resultierenden Reaktionslösung umfasst.
  • Somit beginnt die Arbeitsweise (C) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung damit, dass man die erste Stufe durchführt, die die Kultivierung eines Mikroorganismus mit der gewünschten Fähigkeit in einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge myo-Inosit enthält, umfasst, um auf diese Weise myo-Inosit umzuwandeln und L-epi-2-Inosose in der Kulturbrühe herzustellen und zu akkumulieren, und das Ernten der Kulturbrühe, die L-epi-2-Inosit enthält. Diese erste Stufe kann vollständig auf die gleiche Weise durchgeführt werden, wie die erste Stufe der obigen Arbeitsweise (A).
  • In der zweiten Stufe der Arbeitsweise (C) wird dann die Stufe des Abtrennens der mikrobiellen Zellen der Mikroorganismen von der in der ersten Stufe geernteten Kulturbrühe bewirkt, um den Kulturbrühenüberstand zu erhalten, der L-epi-2-Inosose enthält. In der anschließenden dritten Stufe wird die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose durchgeführt, nachdem ein Hydrid als Reduktionsmittel direkt zu dem resultierenden Kulturbrühenüberstand zugesetzt wurde, so dass epi-Inosit und myo-Inosit in dem genannten Kulturbrühenüberstand hergestellt werden können. Die Reduktionsmittel können diejenigen sein, die in der Lage sind, L-epi-2-Inosose in epi-Inosit in einem wässrigen Medium zu reduzieren. Das Reduktionsmittel kann wünschenswerterweise beispielsweise Natriumborhydrid, Lithium borhydrid, Kaliumborhydrid, Natriumtrimethoxyborhydrid oder Natriumborcyanidhydrid sein. Die Reduktionsreaktion kann bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur durchgeführt werden. Die Reduktionsreaktion wird zu dem Zeitpunkt beendet, wenn die L-epi-2-Inosose vollständig verbraucht ist, oder zu einem Zeitpunkt, wenn die Menge der gewünschten Reaktionsprodukte ein geeignetes angestrebtes Niveau erreicht hat. Somit wird in dieser dritten Stufe ein Kulturbrühenüberstrand erhalten, der den hergestellten epi-Inosit und myo-Inosit enthält, und zwar als Reaktionslösung der Reduktionsreaktion.
  • Danach wird eine vierte Stufe durchgeführt, bei der epi-Inosit und myo-Inosit, wie sie hergestellt wurden, aus dem Kulturbrühenüberstand gewonnen werden, der erhalten wurde als Reaktionslösung der Reduktionsreaktion der dritten Stufe. In dieser vierten Stufe ist es zur Gewinnung bevorzugt, ein solches Verfahren anzuwenden, das das Hindurchleiten des Kulturbrühenüberstands, der epi-Inosit und myo-Inosit enthält, wie sie aus der dritten Stufe erhalten wurden, durch eine Kolonne eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, beispielsweise Duolite (eingetragene Marke) C-20 (H+-Form) umfasst, und zwar zum Zwecke der Entfernung unerwünschter Bestandteile, sowie dann das Sammeln der abströmenden Flüssigkeit aus der Kolonne, das Waschen der Kolonne aus dem Kationenaustauscherharz mit einem Volumen an entionisiertem Wasser, indem man das Wasser durch diese Kolonne durchleitet und die resultierenden wässrigen Waschflüssigkeiten sammelt, dann die so gesammelte abströmende Flüssigkeit mit den wässrigen Waschlösungen kombiniert, die auf diese Weise kombinierte Lösung durch eine Kolonne eines stark basischen Anionenaustauschharzes, beispielsweise Duolite (eingetragene Marke) A113 (OH–Form), hindurchleitet, die abfließende Flüssigkeit aus der letztgenannten Kolonne sammelt, die Kolonne des Anionenaustauscherharzes mit einem Volumen an entionisiertem Wasser wärmt, indem man das Wasser durch die letztgenannte Kolonne hindurchleitet, die resultierenden wässrigen Waschlösungen sammelt und die auf diese weise gesammelte abströmende Flüssigkeit mit den letztgenannten wässrigen Waschlösungen kombiniert, um auf diese Weise eine resultierende wässrige Lösung zu erhalten, die epi-Inosit und myo-Inosit enthält, jedoch im Wesentlichen frei von den Verunreinigungen ist.
  • In der abschließenden (und fünften) Stufe der Arbeitsweise (C) werden epi-Inosit und myo-Inosit jeweils getrennt aus der wässrigen Lösung von epi-Inosit und myo-Inosit, die in der obigen vierten Stufe erhalten wurde, abgetrennt. Zum Zwecke der Isolierung dieser Produkte ist es bevorzugt, eine solche Arbeitsweise zu wählen, die das Konzentrieren der genannten wässrigen Lösung von epi-Inosit und myo-Inosit unter einem verminderten Druck, das Hindurchleiten des resultierenden Konzentrats durch eine Kolonne aus einem stark basischen Anionenaustauscherharz, beispielsweise Amberlite (eingetragene Marke) CG-400 (OH-Form), dann das Eluieren der Kolonne des Anionenaustauscherharzes mit einem Volumen entionisiertem Wasser, indem man das Wasser durch diese Kolonne hindurchleitet, das getrennte Sammeln der Eluat-Fraktionen, die einen Hauptanteil an myo-Inosit enthalten, und der Eluat-Fraktion, die den gewünschten epi-Inosit enthält, und zwar als getrennte Fraktionen, umfasst. Die wässrige Lösung (die Eluat-Fraktionen), die epi-Inosit enthalten, kann konzentriert werden, und die resultierende konzentrierte Lösung von epi-Inosit wird mit einer geeigneten Menge Ethanol versetzt. Man lässt die resultierende Mischung bei Raumtemperatur oder niedrigerer Temperatur über Nacht stehen, so dass ein reines Produkt von epi-Inosit in Form von Kristallen auskristallisieren kann.
  • Zusätzlich kann, im Hinblick auf Arbeitsweise (C), wenn die vierte Stufe der Arbeitsweise (C) auf solch eine Weise durchgeführt wird, dass der Kulturbrühenüberstand, der epi-Inosit enthält, wie er bei der reduzierenden Reduktion hergestellt wurde, mit mehreren Kolonnen von Ionenaustauscherharzen behandelt wird, die in Reihe angeordnet sind, eine solche wässrige Lösung erhalten werden, die epi-Inosit und myo-Inosit enthält, jedoch im Wesentlichen frei von den Verunreinigungen ist. Es wurde von uns gefunden, dass epi-Inosit effizient von myo-Inosit isoliert werden kann, wenn die fünfte Stufe der Arbeitsweise (C) als Verfahren durchgeführt wird, das das Konzentrieren der oben erwähnten wässrigen Lösung umfasst, die epi- und myo-Inosit enthält, jedoch frei ist von den Verunreinigungen; sowie das Hindurchleiten der resultierenden konzentrierten Lösung durch eine Kolonne eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, das ein bestimmtes Styrol-Polymer mit Sulfonsäuregruppen als Ionenaustauschergruppe (Ca2+-Form) enthält, beispielsweise Diaion (eingetragene Marke) UBK 520M (Ca2+-Form); dadurch werden epi-Inosit und myo-Inosit in der genannten Kolonne absorbiert; und dass man dann diese Kolonne mit einem Volumen entionisiertem Wasser eluiert.
  • Bei der Arbeitsweise (D) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung, wird in Kürze, eine erste Stufe durchgeführt, die das Kultivieren eines Mikroorganismus mit der gewünschten Fähigkeit in einem flüssigen Kulturnährmedium unter aeroben Bedingungen und das Abtrennen der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der resultierenden Kulturbrühe umfasst, um auf diese Weise eine große Menge der genannten mikrobiellen Zellen zu erhalten; sowie eine zweite Stufe, die das Umsetzen der so abgetrennten mikrobiellen Zellen mit myo-Inosit in einem wässrigen Reaktionsmedium umfasst, das sich entweder aus einer Pufferlösung oder einem flüssigen Kultur medium zusammensetzt, die eine Menge an myo-Inosit enthalten, der darin gelöst ist, um auf diese Weise L-epi-2-Inosose in dem genannten wässrigen Reaktionsmedium zu erzeugen; sowie eine dritte Stufe, die das Entfernen der mikrobiellen Zellen von der resultierenden Reaktionslösung umfasst, um das Reaktionslösungsfiltrat zu erhalten, das L-epi-2-Inosose enthält; ferner eine vierte Stufe, die das Zugeben eines geeigneten Reduktionsmittels zu dem Reaktionslösungsfiltrat umfasst, ohne irgendeine Isolierung von L-epi-2-Inosose aus dem Reaktionslösungsfiltrat durchzuführen, und dann die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose durchzuführen, um auf diese Weise in dem genannten Filtrat epi-Inosit und myo-Inosit herzustellen; und eine fünfte Stufe, die das Gewinnen des so hergestellten epi-Inosits und myo-Inosits aus der resultierenden Reaktionslösung der Reduktion umfasst; sowie eine sechste Stufe, die das Isolieren von epi-Inosit von dem so gewonnenen myo-Inosit umfasst.
  • In der ersten Stufe der Arbeitsweise (D) wird der Mikroorganismus, der in der Lage ist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium kultiviert, das auf herkömmliche Weise verwendet wird, und die mikrobiellen Zellen des genannten Mikroorganismus werden von der resultierenden Kulturbrühe abgetrennt. Die so abgetrennten Zellen werden in der zweiten Stufe von Arbeitsweise (D) verwendet. Als die genannten mikrobiellen Zellen können solche mikrobiellen Zellen verwendet werden, die durch Abtrennen der Zellen aus der Kulturbrühe erhalten wurden, wie sie in der ersten Stufe der obigen Arbeitsweise (A) erhalten wird. Es können auch solche mikrobiellen Zellen verwendet werden, die dadurch erhalten wurden, dass man den verwendbaren Mikroorganismus in einer besonderen Stufe unter geeigneten Kultivierungsbedingungen kultivierte. Die Abtrennung und das Sammeln der mikrobiellen Zellen kann bewirkt werden dadurch, dass man die Kulturbrühe auf irgendeine bekannte Weise einer Zentrifugation, Filtration oder einem anderen Verfahren unterzieht.
  • In der zweiten Stufe von Arbeitsweise (D) kann ein solches wässriges Reaktionsmedium, das entweder aus einer wässrigen Pufferlösung oder einem wässrigen Kulturmedium als flüssiges Reaktionsmedium zusammengesetzt ist, verwendet werden, indem die Reaktion von myo-Inosit mit den mikrobiellen Zellen durchgeführt wird. Als hier verwendetes flüssiges Kulturmedium kann irgendeines von denen verwendet werden, die denen ähnlich sind, die in der ersten Stufe von Arbeitsweise (A) verwendet werden. Als Pufferlösung kann eine Phosphatpufferlösung, Good's-CHES-Pufferlösung und dergl. in einer Konzentration von 10 bis 500 mM, vorzugsweise 20 bis 100 mM, verwendet werden. Die Konzentration des in dem genannten wässrigen Reaktionsmedium aufgelösten myo-Inosits liegt wünschenswerterweise im Bereich von 0,1 bis 30 Gew.-%. Die Bedingungen für die Umsetzung der mikrobiellen Zellen mit myo-Inosit können in Abhängigkeit von der Natur des zu verwendenden Mikroorganismus und der zu verwendenden Pufferlösung oder des zu verwendenden flüssigen Kulturmediums variieren. Die Reaktionstemperatur beträgt 5 bis 60°C, vorzugsweise 10 bis 45°C, und die Reaktionszeit beträgt 1 bis 50 Stunden, vorzugsweise 3 bis 48 Stunden. Der pH der Pufferlösung oder des flüssigen Kulturmediums, die als wässriges Reaktionsmedium verwendet werden, liegt im Bereich von pH 2 bis 10, vorzugsweise pH 3 bis 9. Die Umsetzung der mikrobiellen Zellen mit myo-Inosit in der zweiten Stufe liefert die Reaktionslösung, die L-epi-2-Inosose enthält.
  • In der dritten Stufe der Arbeitsweise (D) werden die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der Reaktionslösung abgetrennt, die L-epi-2-Inosose enthält, die in der zweiten Stufe der Arbeitsweise (D) erhalten wurde, und zwar unter Anwendung eines bekannten Verfahrens wie Zentrifugation, Filtration und dergleichen. Auf diese Weise wird das Reaktionslösungsfiltrat, das L-epi-2-Inosose enthält, erhalten. In der anschließenden vierten Stufe wird die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose durchgeführt, nachdem ein Hydrid als Reduktionsmittel zu dem Reaktionslösungsfiltrat zugesetzt wurde, das L-epi-2-Inosose enthält, jedoch frei von den mikrobiellen Zellen ist. Auf diese Weise werden epi-Inosit und myo-Inosit hergestellt. Die reduzierende Reaktion in dieser vierten Stufe kann auf die gleiche Weise ausgeführt werden wie für die dritte Stufe von Arbeitsweise (C) erklärt wurde.
  • Als Nächstes wird die fünfte Stufe der Arbeitsweise (D) durchgeführt, in der epi-Inosit und myo-Inosit in Form ihrer wässrigen Lösung aus der resultierenden Reaktionslösung der obigen reduzierenden Reaktion, die epi-Inosit und myo-Inosit enthält, gewonnen werden. Danach wird die sechste Stufe durchgeführt, während der epi-Inosit aus der genannten wässrigen Lösung gewonnen wird, die epi-Inosit und myo-Inosit enthält. Diese fünfte und sechste Stufe von Arbeitsweise (D) können auf die gleiche Weise durchgeführt werden wie für die vierte und fünfte Stufe der obigen Arbeitsweise (C) beschrieben wurde.
  • Die obige Arbeitsweise (E) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung wird auf eine solche Weise durchgeführt, dass, bevor man die zweite Stufe von Arbeitsweise C) oder die vierte Stufe von Arbeitsweise (D) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung durchführt, wobei auf diesen Stufen ein Reduktionsmittel von einem Alkalimetallhydrid-Typ dem oben erwähnten Kulturbrühenüberstand oder dem Reaktionslösungsfiltrat zugesetzt wird, gefolgt von der Reduktion von L-epi-2-Inosose, eine Vorstufe durchgeführt wird, bei der der pH des Kulturbrühenüberstands oder Reaktionslösungsfiltrats einmal auf einen pH-Wert von 8 bis 11, vorzugsweise 9 bis 10, durch Zugabe von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid oder Natriumcarbonat oder Kaliumcarbonat eingestellt wird, und dass die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose dann unter Zugabe des Reduktionsmittels nach der genannten Vorstufe durchgeführt wird. Wir haben aufgrund unserer weiteren Untersuchung gefunden, dass dann, wenn der pH des Reaktionsmediums für die genannte reduzierende Reaktion einmal auf einen alkalischen pH-Wert eingestellt wurde, wie oben vorgeschlagen wird, die Ausbeute an epi-Inosit, wie er durch die reduzierende Reaktion hergestellt wird, um das 1,3- bis 1,5-fache erhöht werden kann, während die Ausbeute an myo-Inosit als Nebenprodukt um das ½ bis ¼-fache vermindert werden kann, und zwar verglichen mit dem Fall, wenn der pH des Reaktionsmediums für die reduzierende Reaktion nicht eingestellt wurde und wenn die Reaktion in dem Reaktionsmedium mit einem pH von 5 bis 7, wie üblich, so hergestellt wurde, dass 6 bis 7 Teile epi-Inosit pro 3 bis 4 Teile myo-Inosit durch die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose bei einem pH 5 bis 7 hergestellt wurden. Gemäß Arbeitsweise (E) kann die Reduktion von L-epi-2-Inosose mit dem Hydridmittel in einem wässrigen Reaktionsmedium mit einem pH von 8 bis 11 epi-Inosit in einer sehr viel höheren Ausbeute erzeugen, als die Ausbeute des Nebenprodukts myo-Inosit.
  • Der oben erwähnte Stamm AB 10119, Stamm AB 10215 und Stamm AB 10135 sind neue Mikroorganismen, und sie sind jeweils nützlich für die Herstellung von L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit. Gemäß einem dritten Aspekt dieser Erfindung wird daher als neuer Mikroorganismus der Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 bereitgestellt, der die charakteristische Fähigkeit aufweist, myo- Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln, und der hinterlegt wurde bei einer japanischen Hinterlegungsstelle, the National Institute of Bioscience Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7168.
  • Gemäß einem vierten Aspekt dieser Erfindung wird als neuer Mikroorganismus der Stamm Pseudomonas sp. AB 10215 bereitgestellt, der die charakteristische Fähigkeit aufweist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln und der hinterlegt wurde bei einer japanischen Hinterlegungsstelle, the National Institute of Bioscience Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7170.
  • Gemäß einem fünften Aspekt dieser Erfindung wird als neuer Mikroorganismus der Stamm Erwinia sp. AB 10135 bereitgestellt, der die charakteristische Fähigkeit aufweist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umzuwandeln und der hinterlegt wurde bei einer japanischen Hinterlegungsstelle, the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7169.
  • Gemäß dem ersten und zweiten Aspekt dieser Erfindung können L-epi-2-Inosose in einer hohen Reinheit, die nützlich ist als Ausgangsmaterial für die Synthese von Arzneimitteln und Landwirtschaftschemikalien, sowie epi-Inosit jeweils im industriellen Maßstab und auf wirtschaftliche Weise einfach hergestellt werden.
  • BESTE AUSFÜHRUNGSFORMEN DER ERFINDUNG
  • Die Erfindung wird nunmehr weiter in Einzelheiten unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele illustriert.
  • Beispiel 1
  • (a) Erstes Beispiel der Herstellung von L-epi-2-Inosose nach Arbeitsweise (A) gemäß dem ersten Aspekt eines erfindungsgemäßen Verfahrens
  • (1) Herstellung von L-epi-2-Inosose (ein erster Versuch)
  • In jeden von mehreren mit Strömungsbrechern versehenen Erlenmeyer-Kolben von 500 ml-Inhalt wurde eine 100 ml-Portion eines flüssigen Kulturmediums (insgesamt 3 Liter) gegossen, die 12,0% (360 g) myo-Inosit, 1,2% Hefeextrakt, 0,1% (NH4)2 SO4, 0,7% K2HPO4, 0,2% KH2PO4 und 0,01% MgSO4·7H2O enthielt und einen pH von 7 aufwies. Dann wurden die Kolben, die das Kulturmedium enthielten, in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 beimpft (hinterlegt unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7168), und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C drei Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten), um den Kulturbrühenüberstand zu erhalten.
  • Dieser Kulturbrühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den nachfolgend gezeigten Messbedingungen analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass L-epi-2-Inosose in einer Konzentration von 66 mg/ml in dem genannten Kulturbrühenüberstand hergestellt worden war (bei einer Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit von 55,6%). In dem zu diesem Zeitpunkt erhaltenen Brühenüberstand wurde kein myo-Inosit nachgewiesen.
  • Die obige Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit wurde mittels der nachfolgenden Berechnungsgleichung errechnet: Umwandlungsrate (%) von L-epi-2-Inosose = [Molzahl L-epi-2-Inosose, die in 1 ml des Brühenüberstands vorhanden ist ÷ Molzahl myo-Inosit ursprünglich vorhanden in 1 ml des flüssigen Kulturmediums] × 100.
  • Die Messbedingungen für die Hochleistungs-flüssigkeitschromatophische Analyse sind wie folgt:
    Kolonne: Wakosil 5NH2 : 4,6 × 350 mm
    Säulentemperatur: 40°C
    Detektor: RI-DETEKTOR ERC-7515A (ERMA CR. INC.)
    Menge des zugeführten Überstands: 20 μl
    Elutionslösemittel : Acetonitril-Wasser (4 : 1)
    Elutionszeit für L-epi-2-Inosose: 6,7 Minuten
  • (2) Herstellung von L-epi-2-Inosose (ein zweiter Versuch)
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsumlenkern mit einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml-Portion eines flüssigen Kulturmediums (insgesamt 400 ml) eingegossen, das 25,0% (250 mg/ml) myo-Inosit, 1,0% Glucose und 0,7% Hefeextrakt enthielt, wobei der pH nicht eingestellt wurde. Dann wurden die Kolben, die das Kulturmedium enthielten, in einem Autoklaven sterilisiert. Jeder Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 beimpft (hinterlegt unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7168), und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C 5 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten), um den Kulturbrühenüberstand zu erhalten.
  • Dieser Kulturbrühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter den oben gezeigten Messbedingungen analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass L-epi-2-Inosose in einer Konzentration von 247 mg/ml in dem genannten Brühenüberstand hergestellt worden war (bei einer Umwandlungsrate von 99,9%). In dem zu diesem Zeitpunkt erhaltenen Brühenüberstand wurde kein myo-Inosit nachgewiesen.
  • Die obige Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit wurde mittels der oben angegebenen Berechnungsgleichung errechnet.
  • (3) Herstellung von L-epi-2-Inosose (ein dritter Versuch)
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbrechern und einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml-Portion eines flüssigen Kulturmediums eingegossen, das 4,0% (40 mg/ml) myo-Inosit, 0,2% Hefeextrakt, 0,1% (NH4)2 SO4, 0,7% K2HPO4, 0,2% KH2PO4 und 0,01% MgSO4·7H2O enthielt und das einen pH von 7 aufwies. Dann wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Erwinia sp. AB 10135 beimpft (hinterlegt unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7169), und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C 5 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten), um den Kulturbrühenüberstand zu erhalten.
  • Dieser Kulturbrühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter den oben gezeigten Messbedingungen analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass L-epi-2-Inosose in einer Konzentration von 22 mg/ml in dem genannten Brühenüberstand hergestellt worden war (bei einer Umwandlungsrate von 55,6%). In dem zu diesem Zeitpunkt erhaltenen Brühenüberstand wurde kein myo-Inosit nachgewiesen.
  • Die obige Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose aus myo-Inosit wurde mittels der oben angegebenen Berechnungsgleichung errechnet.
  • (4) Herstellung von L-epi-2-Inosose (ein vierter Versuch)
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbrechern und einer Kapazität von 500 ml wurde ein 100 ml-Portion eines flüssigen Kulturmediums gegossen, das 25,0% (250 mg/ml) myo-Inosit, 1,0% Glucose und 0,7% Hefeextrakt enthielt, wobei der pH nicht eingestellt wurde. Dann wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Pseudomonas sp.AB 10215 beimpft (hinterlegt unter der Hinterlegungs-Nummer FERM BP-7170), und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C 5 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten), und lieferte den Kulturbrühenüberstand.
  • Dieser Kulturbrühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unter den oben gezeigten Messbedingungen analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass L-epi-2-Inosose in einer Konzentration von 244 mg/ml in dem Brühenüberstand hergestellt worden war (bei einer Umwand lungsrate von 98,7%). Zu diesem Zeitpunkt wurde kein myo-Inosit in dem Brühenüberstand nachgewiesen.
  • (b) Gewinnung und Isolierung von L-epi-2-Inosose
  • Der oben in Beispiel 1 (2) erhaltene Kulturbrühenüberstand wurde durch eine Kolonne (mit einem Innendurchmesser von 2 cm und einer Höhe von 30 cm) gelassen, die mit 80 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, Duolite (eingetragene Marke) C-20 (H+-Form) gepackt war. Anschließend wurde die Kolonne dadurch gewaschen, dass man 80 ml eines Ionen-ausgetauschten Wassers (d.h. entionisierten Wassers) hindurchströmen ließ. Anschließend wurde das resultierende abströmende Produkt, wie es beim Hindurchleiten des Kulturbrühenüberstands durch die Kolonne erhalten wurde, mit den wässrigen Waschflüssigkeiten kombiniert, wie sie durch Waschen der Kolonne mit dem entionisierten Wasser erhalten wurden. Die resultierende kombinierte Lösung wurde durch eine Kolonne (mit einem Innendurchmesser von 3 cm und einer Höhe von 30 cm) hindurchgeleitet, die 160 ml eines schwach basischen Anionenaustauscherharzes, Duolite (eingetragene Marke) 368 S (in Form der freien Base) enthielt, gefolgt von einem Waschen der Kolonne mit dem Anionen-ausgetauschten Harz durch Hindurchleiten von 160 ml entionisiertem Wasser.
  • Das erhaltene ausströmende Produkt aus der genannten Kolonne und die erhaltenen wässrigen Waschlösungen wurden kombiniert, und lieferten eine wässrige Lösung. Diese wässrige Lösung enthielt L-epi-2-Inosose, enthielt jedoch im Wesentlichen keine Verunreinigungen.
  • Die wie oben erhaltene wässrige Lösung wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen auf 200 ml konzentriert. Zu der konzentrierten Lösung wurde das Dreifache (in Volumen) an Ethanol zugegeben, und die resultierende Flüssigkeitsmischung ließ man über Nacht stehen, wodurch 60 g farblose Kristalle einer reinen L-epi-2-Inosose erhalten wurden. Die Ausbeute an gereinigtem Produkt L-epi-2-Inosose betrug zu diesem Zeitpunkt 60,7%, und die insgesamt erhaltene Ausbeute an L-epi-2-Inosose betrug 60,6% auf der Basis des Ausgangs-myo-Inosits.
  • Die obige Ausbeute an gereinigtem Produkt L-epi-2-Inosose wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Ausbeute (%) des gereinigten Produkts L-epi-2-Inosose = [Menge an gereinigter isolierter L-epi-2-Inosose ÷ Menge an L-epi-2-Inosose, die in 400 ml des Kulturbrühenüberstands vor der Reinigung vorhanden war] × 100.
  • Die oben erwähnte Gesamt-Ausbeute an L-epi-2-Inosose wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Gesamtausbeute (%) an L-epi-2-Inosose = [Molzahl der gereinigten isolierten L-epi-2-Inosose ÷ Molzahl myo-Inosit ursprünglich vorhanden in 400 ml des flüssigen Kulturmediums] × 100.
  • Beispiel 2
  • Zweites Beispiel für die Herstellung von L-epi-2-Inosose nach Arbeitsweise (A) gemäß dem Verfahren nach dem ersten Aspekt dieser Erfindung
  • (1) Herstellung einer Impfkultur
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbrechern und einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml-Portion eines flüssigen Kulturmediums gegossen, das 2,0% myo-Inosit, 0,2% Hefeextrakt, 0,1% (NH4)2 SO4, 0,7% K2HPO4, 0,2% KH2PO4 und 0,01% MgSO4·7H2O enthielt und einen pH von 7 aufwies. Dann wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 (FERM BP-7168) beimpft, und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C für einen Tag kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde als Impfkultur für die nachfolgende Stufe des Verfahrens verwendet.
  • (2) Herstellung von L-epi-2-Inosose in einem Becherfermenter von 4 Liter Volumen.
  • In jeden von mehreren Becherfermentern einer Kapazität von 4 Liter wurde eine 2,5 Liter-Portion eines flüssigen Kulturmediums eingegossen, das 12,0% myo-Inosit, 1,2% Hefeextrakt, 0,1% (NH4)2 SO4, 0,7% K2HPO4, 0,2% KH2 PO4 und 0,01% MgSO4·7H2O enthielt und einen pH von 7 aufwies. Dann wurden die Becherfermenter in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Fermenter wurde mit 25 ml der obigen Impfkultur des Stamms Xanthomonas sp. AB 10119 beimpft, die in der obigen Stufe (1) hergestellt worden war. Dann wurde die Kultivierung unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 27°C durchgeführt, wobei die Belüftungsrate 1 vvm betrug und die Zahl der Rührer-Umdrehungen 200 U/min. Die Kultivierung wurde drei Tage lang durchgeführt, wobei der pH der Kulturbrühe automatisch auf pH 7 ± 0,2 eingestellt wurde, indem man eine wässrige 5 M NaOH Lösung und 3 M Salzsäure zusetzte. Nach der abgeschlossenen Kultivierung nach 3 Tagen wurde die resultierende Kulturbrühe zentrifugiert (8000 U/min für 20 min), und es wurde auf diese Weise der Kulturbrühenüberstand als resultierender Überstand erhalten.
  • Der Kulturbrühenüberstand wurde so, wie er erhalten wurde, mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Messbedingungen analysiert, die den oben erwähnten ähnlich waren. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass L-epi-2-Inosose in einer Konzentration von 60 mg/ml in dem resultierenden Kulturbrühenüberstand erzeugt worden war (bei einer Umwandlungsrate von 50,6%).
  • Die Reinigung und Isolierung von L-epi-2-Inosose aus dem obigen Kulturbrühenüberstand wurde auf die gleiche Weise durchgeführt wie oben für Beispiel 1 (b) beschrieben ist. Es wurden auf diese Weise 114 g Kristalle erhalten (bei einer Ausbeute an gereinigtem L-epi-2-Inosose von 76,0%). Die Gesamtausbeute der gereinigten L-epi-2-Inosose betrug zu diesem Zeitpunkt, auf der Basis von myo-Inosit, 38,4%.
  • Die obige Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose wurde mit der Berechnungsgleichung errechnet, wie sie in Beispiel (b) angegeben wird, und die obige Ausbeute an gereinigter L-epi-2-Inosose wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Ausbeute (%) der gereinigten L-epi-2-Inosose = [Menge an gereinigter isolierter L-epi-2-Inosose ÷ Menge L-epi-2-Inosose, die vorhanden ist in 2,5 1 des Kulturbrühenüberstands vor der Reinigung] × 100.
  • Die oben erwähnte Gesamtausbeute von L-epi-2-Inosose auf der Basis von myo-Inosit wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung errechnet. Gesamtausbeute (%) L-epi-2-Inosose = [Molzahl gereinigter isolierter L-epi-2-Inosose ÷ Molzahl myo-Inosit, die ursprünglich in 2,5 ml des flüssigen Kulturmediums vorhanden war] × 100.
  • Beispiel 3
  • Beispiel zur Herstellung von L-epi-2-Inosose gemäß Arbeitsweise (B) gemäß dem Verfahren nach dem ersten Aspekt der Erfindung
  • (1) Herstellung von mikrobiellen Zellen
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbechern und einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml Portion eines flüssigen Kulturmediums (Gesamt 2 Liter) gegossen, das 0,5% myo-Inosit, 0,1% (NH4)2 SO4, 0,7% K2HPO4, 0,2% KH2PO4 und 0,01% MgSO4·7H2O enthielt und den pH von 7 aufwies. Dann wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 (FERM BP-7168) beimpft, und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C 3 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert, um die bakteriellen Zellen abzutrennen. Die auf diese Weise abgetrennten mikrobiellen Zellen wurden mit 200 ml einer 0,05 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,0) gewaschen und dann wiederum zentrifugiert, um die gewaschenen mikrobiellen Zellen des Bakteriums zu erhalten.
  • (2) Herstellung von L-epi-2-Inosose
  • Die gewaschenen mikrobiellen Zellen wurden wie erhalten (35 g) zu 400 ml einer 0,05 M Phosphat-Pufferlösung (pH: 7,0) zugesetzt, die 4 g myo-Inosit enthielt (bei einer myo-Inosit-Konzentration von 10 mg/ml). Die resultierende Mischung, die die zugesetzten mikrobiellen Zellen enthielt, wurde bei 30°C 24 Stunden unter langsamem Rühren mit einem Rührer inkubiert. Nach Abschluss der Inkubation wurde die resultierende Reaktionslösung, die die suspendierten mikrobiellen Zellen und die hergestellte gelöste L-epi-2-Inosose enthielt, mittels Flüssigkeitschromatographie analysiert. Es wurde gezeigt, dass L-epi-2-Inosose hergestellt worden war und sich darin in einer Konzentration von 6 mg/ml akkumuliert hatte (bei einer Umwandlungsrate von 60,7%). Die obige Reaktionslösung wurde zentrifugiert, um die mikrobiellen Zellen abzutrennen und das Reaktionslösungsfiltrat zu erhalten. Die Isolierung der L-epi-2-Inosose aus diesem Reaktionslösungsfiltrat wurde auf die gleiche Weise durchgeführt wie oben in Beispiel 1 (b) beschrieben wurde, wodurch 1,6 g Kristalle an L-epi-2-Inosose erhalten wurden (bei einer Ausbeute an gereinigter L-epi-2-Inosose von 66,7%). Die Gesamtausbeute der gereinigten L-epi-2-Inosose betrug 40,4% auf der Basis von myo-Inosit.
  • Die obige Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosit wurde ähnlich wie oben in Beispiel 1 errechnet, und die obige Ausbeute der gereinigten L-epi-2-Inosose wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Ausbeute (%) der gereinigten L-epi-2-Inosose = [Menge an gereinigter isolierter L-epi-2-Inosose ÷ Menge an L-epi-2-Inosose, die ursprünglich in 400 ml der Reaktionslösung vor der Reinigung enthalten war] × 100.
  • Die obige Gesamtausbeute der gereinigten L-epi-2-Inosose auf der Basis von myo-Inosit wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung ausgewertet. Gesamtausbeute (%) der gereinigten L-epi-2-Inosose = [Molzahl der gereinigten isolierten L-epi-2-Inosose ÷ Molzahl myo-Inosit, die ursprünglich 400 ml der Phosphat-Pufferlösung zugesetzt worden war] × 100.
  • Beispiel 4
  • Beispiel der Herstellung von epi-Inosit nach Arbeitsweise (C) des Verfahrens gemäß dem zweiten Aspekt dieser Erfindung
  • (1) Herstellung von L-epi-2-Inosose
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbrechern und einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml Portion eines flüssigen Kulturmediums (insgesamt 2 Liter) gegossen, das 25,0% (500 g) myo-Inosit, 1,0% Glucose und 2,5% Hefeextrakt enthielt, wobei der pH nicht eingestellt wurde. Danach wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 (FERM BP-7168) beimpft, und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C 5 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten) und lieferte den flüssigen Kulturbrühenüberstand.
  • Dieser flüssige Kulturbrühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie ähnlich wie in Beispiel 1 (1) analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass 415 g L-epi-2-Inosose in dem genannten flüssigen Kulturbrühenüberstand hergestellt worden waren (bei einer Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose von 83,9% aus myo-Inosit).
  • (2) Herstellung von epi-Inosit
  • Zu 2 Litern des flüssigen Kulturbrühenüberstands, der L-epi-2-Inosose enthält, der aus der obigen Stufe (1) erhalten worden war, wurden langsam 29,2 g Natriumborhydrid als Reduktionsmittel zugegeben. Die reduzierende Reaktion von L-epi-2-Inosose wurde dann bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach einem Abschluss der reduzierenden Reaktion wurde der flüssige Brühenüberstand (d.h. die Reaktionslösung, die aus der reduzierenden Reaktion erhalten wurde) mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter den unten angegebenen Messbedingungen analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass die Reaktionslösung, die aus der reduzierenden Reaktion erhalten wurde (nämlich der flüssige Brühenüberstand, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde), 235,8 g des hergestellten epi-Inosits und 102,4 g des als Nebenprodukt hergestellten myo-Inosits enthalten hatte (bei einer Gesamtreaktionsausbeute von epi-Inosit plus myo-Inosit, die 80,6% betrug). Die Umwandlungsrate von epi-Inosit aus L-epi-2-Inosose betrug 56,2%. Die Messbedingungen für die oben erwähnte Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie sind wie folgt:
    Kolonne: Wakosil 5NH2 : 4,6 × 250 mm
    Säulentemperatur: 40°C
    Detektor: RI-DETEKTOR ERC-7515A (ERMA CR. INC.)
    Menge der eingeführten Reaktionslösung: 20 μl
    Elutionslösemittel : Acetonitril-Wasser (4 : 1)
    Elutionszeit für epi-Inosit: 8,5 Minuten
  • Die oben erwähnte Gesamtausbeute (%) von epi-Inosit wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Gesamtausbeute (%) = [(Gesamtsumme der Molzahlen von epi-Inosit plus Molzahlen myo-Inosit, die in dem Brühenüberstand vorhanden sind, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wird) ÷ (Molzahl epi-2-Inosose, die ursprünglich in dem Brühenüberstand vorhanden war, wie er vor der reduzierenden Reaktion eingesetzt wurde)] × 100.
  • Die obige Umwandlungsrate von epi-Inosit aus L-epi-2-Inosose wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Umwandlungsrate (%) von epi-Inosit = [Molzahl epi-Inosit vorhanden in dem flüssigen Brühenüberstand, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde ÷ Molzahl L-epi-2-Inosose, vorhanden in dem flüssigen Brühenüberstand, wie er vor der reduzierenden Reaktion eingesetzt wurde] × 100.
  • (3) Erster Versuch zur Gewinnung und Isolierung von epi-Inosit
  • Die Reaktionslösung (nämlich der flüssige Brühenüberstand, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde), die in der obigen Stufe (2) erhalten wurde, wurde in zwei Hälften aufgeteilt. Eine Hälfte der genannten Reaktionslösung wurde durch eine Säule geleitet (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 30 cm), die 300 ml eines Kationenaustauscherharzes, Duolite (eingetragene Marke) C-20 (H+-Form) enthielt, um die abströmende Flüssigkeit aus der Kolonne zu erhalten. Dann wurde die Kolonne dadurch gewaschen, dass man 400 ml entionisiertes Wasser hindurchströmen ließ. Das resultierende ausgeströmte Produkt und die resultierenden wässrigen Waschlösungen wurden kombiniert, und die auf diese Weise kombinierte Lösung wurde durch eine Säule geleitet (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 60 cm), die 600 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, Duolite (eingetragene Marke) A-113 (OH–-Form) enthielt, um das ausströmende Produkt zu erhalten. Dann wurde diese Kolonne dadurch gewaschen, dass man 700 ml entionisiertes Wasser hindurchleitete.
  • Der resultierende Ausfluss aus der Kolonne und die resultierenden wässrigen Waschlösungen wurden miteinander kombiniert. Die auf diese Weise kombinierte resultierende wässrige Lösung enthielt den hergestellten epi-Inosit und den als Nebenprodukt hergestellten myo-Inosit, jedoch im Wesentlichen keine Verunreinigungen.
  • Die wie oben kombinierte und erhaltene wässrige Lösung wurde bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 300 ml konzentriert. Eine Ein-Viertel-Portion (75 ml) der resultierenden konzentrierten Lösung (300 ml) wurde durch eine Kolonne geleitet (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 200 cm), die 1500 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, Amberlite (eingetragene Marke) CG-400 (OH–Form) enthielt, und dann wurde die Säule dadurch eluiert, dass man ein Volumen von entionisiertem Wasser hindurchleitete. Das aus dieser Kolonne erhaltene Eluat wurde getrennt in Fraktionen gesammelt, die überwiegend myo-Inosit enthielten, sowie in Fraktionen, die überwiegend den gewünschten epi-Inosit enthielten. Die restlichen Drei-Viertel-Portionen (225 ml) der genannten konzentrierten Lösung wurden ähnlichen Behandlungen mit Kolonnen von Amberlite CG-400 (OH–-Form) auf eine solche Weise unterzogen, dass Eluat-Fraktionen erhalten werden konnten, die nur epi-Inosit enthielten. Die Eluat-Fraktionen wurden, wie erhalten, zum Trocknen konzentriert und lieferten 73 g epi-Inosit. Danach wurde dieser epi-Inosit in Wasser gelöst und lieferte eine 15-%ige wässrige Lösung, der dann ein doppeltes Volumen Ethanol zugesetzt wurde. Die resultierende Flüssigmischung ließ man über Nacht zur Umkristallisation von epi-Inosit stehen. Auf diese Weise wurden 63 g Kristalle des reinen epi-Inosits erhalten (bei einer Ausbeute des gereinig ten epi-Inosits von 53,4%). Die Gesamtausbeute von epi-Inosit aus myo-Inosit betrug 25,2%.
  • Die obige Umwandlungsrate von epi-Inosit wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Umwandlungsrate (%) des gereinigten epi-Inosits = [Menge des isolierten kristallinen epi-Inosits/Menge epi-Inosit, die in dem flüssigen Kulturbrühenüberstand vorhanden war, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde] × 100.
  • Die obige Gesamtausbeute von epi-Inosit aus myo-Inosit wurde mittels der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Gesamtausbeute (%) epi-Inosit = [Menge an kristallinem isoliertem epi-Inosit/Menge an myo-Inosit, die ursprünglich in 1 Liter des flüssigen Kulturmediums vorhanden war] × 100.
  • (4) Zweiter Versuch zur Gewinnung und Isolierung von epi-Inosit.
  • Die andere Hälfte der Reaktionslösung (des flüssigen Brühenüberstands, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde), wie sie vorher in der obigen Stufe (3) aufgeteilt worden war, wurde durch eine Kolonne (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 30 cm) hindurchgeleitet, die 300 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, Duolite (eingetragene Marke) C-20 (H+-Form) enthielt, um das abströmende Produkt aus dieser Kolonne zu erhalten. Dann wurde diese Kolonne dadurch gewaschen, dass man 400 ml entionisiertes Wasser hindurchleitete. Der resultierende flüssige Ausfluss und die resultierenden wässrigen Waschlösungen wurden miteinander kombiniert und dann durch eine Kolonne geleitet (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 60 cm), die 600 ml eines stark basischen Anionenaustauscherharzes Duolite (eingetragene Marke) A-113 (OH–Form) enthielt, um den Ausfluss zu erhalten. Danach wurde diese Kolonne durch Hindurchleiten von 700 ml entionisiertem Wasser gewaschen.
  • Der resultierende Ausfluss aus der letztgenannten Kolonne und die resultierenden wässrigen Waschlösungen wurden ebenfalls kombiniert. Die auf diese Weise erhaltene wässrige Lösung wurde bei vermindertem Druck auf ein Volumen von 300 ml konzentriert. Die resultierende konzentrierte Lösung (300 ml) wurde durch eine Säule (mit einem Innendurchmesser von 5 cm und einer Höhe von 200 cm) geleitet, die 1500 ml eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, Diaion (eingetragene Marke) UBK 520M (Ca+-Form) enthielt, um den Ausfluss zu erhalten. Diese Kolonne wurde dann eluiert, indem man ein Volumen an entionisiertem Wasser hindurchleitete. Das resultierende Eluat aus dieser Kolonne wurde getrennt in Fraktionen gesammelt, die überwiegend myo-Inosit enthielten sowie in Fraktionen, die überwiegend den gewünschten epi-Inosit enthielten. Aus diesem chromatographischen Prozess wurden 75 g epi-Inosit erhalten. Anschließend wurde dieser epi-Inosit in Wasser gelöst, so dass eine 15%-ige Lösung erhalten wurde, der dann das doppelte Volumen Ethanol zugesetzt wurde. Die resultierende Mischung ließ man über Nacht zu Umkristallisationszwecken stehen. Es wurden auf diese Weise 66 g Kristalle eines reinen epi-Inosits erhalten (bei einer Ausbeute an gereinigtem epi-Inosit von 56,0%). Die Gesamtausbeute des gereinigten epi-Inosits auf der Basis des myo-Inosits, der als Ausgangsmaterial verwendet wurde, betrug 26,4%.
  • Die Ausbeute des gereinigten epi-Inosits und die Gesamtausbeute desselben wurden auf die gleiche Weise errechnet, wie oben in Stufe (3).
  • Beispiel 5
  • Beispiel für die Herstellung von epi-Inosit nach den Arbeitsweisen (C) und (E) des Verfahrens nach dem zweiten Aspekt dieser Erfindung.
  • (1) Herstellung von L-epi-2-Inosose
  • In jeden von mehreren Erlenmeyer-Kolben mit Strömungsbrechern und einer Kapazität von 500 ml wurde eine 100 ml Portion eines flüssigen Kulturmediums gegossen, das 25,0% myo-Inosit, 1,0% Glucose und 0,7% Hefeextrakt enthielt, wobei der pH nicht eingestellt wurde. Anschließend wurden die Kolben in einem Autoklaven sterilisiert. Das sterilisierte Kulturmedium in jedem Kolben wurde mit dem Stamm Xanthomonas sp. AB 10119 (FERM BP-7168) beimpft, und der beimpfte Bakterienstamm wurde unter Schütteln bei 27°C für 5 Tage kultiviert. Die resultierende Kulturbrühe wurde zentrifugiert (8000 U/min für 20 Minuten) und lieferte den Kulturbrühenüberstand.
  • Dieser flüssige Brühenüberstand wurde mittels Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie in gleicher Weise wie in Beispiel 1 (1) analysiert. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass 22 g L-epi-2-Inosose in dem flüssigen Brühenüberstand hergestellt worden waren (bei einer Umwandlungsrate von L-epi-2-Inosose von 93,0% auf der Basis von myo-Inosit).
  • (2) Herstellung von epi-Inosit
  • Zu 100 ml des genannten flüssigen Brühenüberstands, der die L-epi-2-Inosose enthielt, der aus der obigen Stufe (1) erhalten wurde, wurde eine wässrige 5 M Natriumhydroxidlösung zugesetzt, um den pH des flüssigen Überstands auf pH 10 einzustellen. Unmittelbar danach wurden zu dem flüssigen Überstand mit dem pH 10 langsam 1,3 g Natriumborhydrid zugesetzt. Die reduzierende Reaktion wurde dann bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach Abschluss der Reaktion wurde der flüssige Brühenüberstand (d.h. die Reaktionslösung, die aus der reduzierenden Reaktion erhalten wurde), mittels Hochleistungschromatographie unter den Messbedingungen analysiert, wie sie in Beispiel 4 (2) beschrieben wurden. Im Ergebnis wurde bestätigt, dass die genannte Reaktionslösung der reduzierenden Reaktion (nämlich der reagierte flüssige Brühenüberstand) 18,4 g des produzierten epi-Inosits und 0,8 g des als Nebenprodukt produzierten myo-Inosits enthielt (bei einer Gesamt-Reaktionsausbeute von epi-Inosit plus myo-Inosit von 82,6%). Die Umwandlungsrate von epi-Inosit aus L-epi-2-Inosose betrug 79,1%. Die obige Gesamtreaktionsausbeute (%) von epi-Inosit plus myo-Inosit wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Gesamtreaktionsausbeute von epi-Inosit plus myo-Inosit = [Gesamtsumme der Molzahlen von epi-Inosit und der Molzahlen von myo-Inosit, die beide in dem flüssigen Brühenüberstand vorhanden sind, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde, ÷ Molzahl L-epi-2-Inosose, die ursprünglich in dem flüssigen Brühenüberstand vorhanden war, wie er vor der reduzierenden Reaktion eingesetzt wurde] × 100.
  • Die obige Umwandlungsrate von epi-Inosit aus L-epi-Inosose wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Umwandlungsrate (%) von epi-Inosit aus L-epi-2-Inosose = [Molzahl epi-Inosit, die in dem flüssigen Brühenüberstand vorhanden ist, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wird ÷ Molzahl L-epi-2-Inosose, die in dem flüssigen Brühenüberstand vorhanden ist, wie er vor der reduzierenden Reaktion eingesetzt wurde] × 100.
  • (3) Gewinnung und Isolierung von epi-Inosit
  • Die Gewinnung, Reinigung und Isolierung von epi-Inosit aus der genannten Reaktionslösung, die aus der Reduktion kam, erfolgte auf die gleiche Weise wie in Beispiel 4 (4) beschrieben wurde. Epi-Inosit wurde in Form von Kristallen bei einer Ausbeute von 15,7 g erhalten. Die Ausbeute des gereinigten epi-Inosits aus dem epi-Inosit, der ursprünglich in der Reaktionslösung vorhanden war, betrug zu diesem Zeitpunkt 85,3%. Die Ausbeute an epi-Inosit auf der Basis von L-epi-2-Inosose, die ursprünglich in der Reaktionslösung vor der Reduktion vorhanden war, betrug 67,5%. Die Gesamtausbeute des gereinigten epi-Inosits auf der Basis von myo-Inosit, der als Ausgangsmaterial verwendet worden war, betrug 62,8%.
  • Die obige Ausbeute des gereinigten epi-Inosits auf der Basis des epi-Inosits, der ursprünglich in der Reaktionslösung nach der reduzierenden Reaktion vorhanden war, wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Ausbeute (%) des gereinigten epi-Inosits = [Menge an gereinigtem epi-Inosit, wie isoliert, ÷ Menge an epi-Inosit, die ursprünglich in 100 ml der Reaktionslösung vorhanden war, nämlich dem flüssigen Brühenüberstand, wie er nach der reduzierenden Reaktion erhalten wurde] × 100.
  • Die obige Ausbeute an gereinigtem epi-Inosit auf der Basis von L-epi-2-Inosose wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung bewertet: Ausbeute (%) des gereinigten epi-Inosits = [Molzahl des gereinigten isolierten epi-Inosits ÷ Molzahl L-epi-2-Inosose, vorhanden in 100 ml des flüssigen Brühenüberstands, wie er vor der reduzierenden Reaktion eingesetzt wurde] × 100.
  • Die obige Gesamtausbeute des gereinigten epi-Inosits aus myo-Inosit wurde nach der folgenden Berechnungsgleichung errechnet: Gesamtausbeute (%) des gereinigten epi-Inosits = [Menge an gereinigtem isoliertem epi-Inosit ÷ Menge an myo-Inosit, ursprünglich vorhanden in 100 ml des flüssigen Kulturmediums bei Beginn der Kultivierung] × 100.
  • Gewerbliche Anwendbarkeit
  • Gemäß dieser Erfindung ist es möglich, aus myo-Inosit auf einem einfachen und effizienten Weg L-epi-2-Inosose herzustellen, die nützlich ist als Zwischenprodukt für die Synthese von Arzneimitteln. Gemäß der Erfindung ist es ferner möglich, einfach und effizient durch Reduktion von L-epi-2-Inosose epi-Inosit herzustellen, der als eine Vielzahl von Arzneimitteln nützlich ist. Somit sind die Verfahren gemäß dieser Erfindung nützlich für industrielle Zwecke.

Claims (21)

  1. Verfahren zur Herstellung von L-epi-2-Inosose, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren das Umsetzen von myo-Inosit mit einem Mikroorganismus umfasst, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann und man dadurch myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandelt, um L-epi-2-Inosose herzustellen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus, der verwendet wird und der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, ein Bakterium ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus, der verwendet wird und der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, ein gramnegatives Bakterium ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus, der verwendet wird und der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, ein gramnegatives Bakterium ist, das ausgewählt ist aus Bakterien der Gattung Xanthomonas oder Pseudomonas, die zur Familie der Pseudomonaceae gehören, oder aus Bakterien der Gattung Acetobacter oder Gluconobacter, die zur Familie der Acetobacteraceae gehören, oder aus Bakterien der Gattung Agrobacterium, die zur Familie der Rhizobiaceae gehören, oder aus Bakterien der Gattung Erwinia, Enterobacter, Serratia oder Yersinia, die zur Familie der Enterobacteriaceae gehören, oder aus Bakterien der Gattung Pasteurella oder Haemophilus, die zur Familie der Pasteurellaceae gehören.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei als Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, der Xanthomonas sp AB 10119 Stamm (hinterlegt unter FERM BP- 7168) oder der Pseudomonas sp. AB 10215 Stamm (hinterlegt unter FERM BP-7170) oder der Erwinia sp. 10135 Stamm (hinterlegt unter FERM BP-7169) verwendet wird.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wird, das eine Menge myo-Inosit, Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, wodurch der myo-Inosit mit dem Mikroorganismus in dem Kulturmedium umgesetzt wird, um L-epi-2-Inosose in der sich ergebenden Kulturbrühe herzustellen und anzureichern.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, umfassend die Schritte des Züchtens des Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, in einem flüssigen Kulturmedium, Abtrennen der mikrobiellen Zellen des gezüchteten Mikroorganismus aus der sich ergebenden Kulturbrühe, Zugeben der so abgetrennten mikrobiellen Zellen zu einer Pufferlösung oder einem flüssigen Kulturmedium, das eine Menge von darin gelöstem myo-Inosit enthält, und Umsetzen der so zugegebenen mikrobiellen Zellen mit dem myo-Inosit in der Pufferlösung oder dem flüssigen Kulturmedium, um myo-Inosit umzuwandeln und in der sich ergebenden Reaktionslösung oder der sich ergebenden Kulturbrühe L-epi-2-Inosose herzustellen.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Kulturbrühe oder die Reaktionslösung, die die mikrobiellen Zellen und die L-epi-2-Inosose, wie sie darin hergestellt und angereichert wurde, enthält, gemäß dem Verfahren von Anspruch 6 oder 7 erhalten wird, gefolgt von dem Entfernen der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus aus der Kulturbrühe oder der Reaktionslösung, und wobei der sich ergebende Kulturbrühenüberstand oder das sich ergebende Filtrat der Reaktionslösung, die beim Entfernen der mikrobiellen Zellen aus der Kulturbrühe oder der Reaktionslösung erhalten werden, die L-epi-2-Inosose enthalten, dann einer Behandlung mit Ionenaustauschharz(en) oder einer Behandlung mit Aktivkohle oder einer Behandlung zur Kristallisierung der L-epi-2-Inosose, oder irgendeiner Kombination dieser Behandlungen, unterzogen werden, wodurch L-epi-2-Inosose einer hohen Reinheit aus dem Kulturbrühenüberstand oder dem Filtrat der Reaktionslösung gewonnen wird.
  9. Verfahren zur Herstellung von epi-Inosit, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Schritte des Umsetzens eines Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, mit myo-Inosit in einem wässerigen Reaktionsmedium, um in dem wässerigen Reaktionsmedium L-epi-2-Inosose herzustellen, wodurch eine sich ergebende Reaktionslösung, die die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus und die hergestellte L-epi-2-Inosose darin enthält, erhalten wird, des Entfernens der mikrobiellen Zellen aus der Reaktionslösung, um ein Reaktionslösungsfiltrat zu erhalten, das L-epi-2-Inosose enthält, des Zugebens eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetalltrialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids als Reduktionsmittel direkt zu dem Reaktionslösungsfiltrat, das L-epi-2-Inosose enthält, und des Umsetzens des Reduktionsmittels mit L-epi-2-Inosose, um epi-Inosit und myo-Inosit herzustellen, umfasst.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus, der zum Umwandeln von myo-Inosit in L-epi-2-Inosose verwendet wird und dazu fähig ist, ein Bakterium ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus, der zum Umwandeln von myo-Inosit in L-epi-2-Inosose verwendet wird und dazu fähig ist, ein gramnegatives Bakterium ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Mikroorganismus, der zum Umwandeln von myo-Inosit in L-epi-2-Inosose verwendet wird und dazu fähig ist, ein gramnegatives Bakterium ist, das ausgewählt ist aus Bakterien der Gattung Xanthomonas oder Pseudomonas, die zur Familie der Pseudomonaceae gehören, oder Bakterien der Gattung Acetobacter oder Gluconobacter, die zur Familie der Acetobacteraceae gehören, oder Bakterien der Gattung Agrobacterium, die zur Familie der Rhizobiaceae gehören, oder Bakterien der Gattung Erwinia, Enterobacter, Serratia oder Yersinia, die zur Familie der Enterobacteriaceae gehören, oder Bakterien der Gattung Pasteurella oder Haemophilus, die zur Familie der Pasteurellaceae gehören.
  13. Verfahren nach Anspruch 9, wobei als Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, der Xanthomonas sp AB 10119 Stamm (hinterlegt unter FERM BP-7168) oder der Pseudomonas sp. AB 10215 Stamm (hinterlegt unter FERM BP-7170) oder der Erwinia sp. 10135 Stamm (hinterlegt unter FERM BP-7169) verwendet wird.
  14. Verfahren nach Anspruch 9, umfassend die Schritte des Züchtens eines Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, unter aeroben Bedingungen in einem solchen wässerigen Reaktionsmedium, das aus einem flüssigen Kulturmedium besteht, das eine Menge myo-Inosit, Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, um myo-Inosit mit dem Mikroorganismus in dem wässerigen Reaktionsmedium umzusetzen und dadurch L-epi-2-Inosose in der sich ergebenden Kulturbrühe herzustellen und anzusammeln, um die Kulturbrühe zu erhalten, die nämlich die sich ergebende Reaktionslösung ist, die die mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus und L-epi-2-Inosose enthält; sowie den Schritt des Entfernens der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus aus der sich ergebenden Reaktionslösung, nämlich der sich ergebenden Kulturbrühe, um einen Kulturbrühenüberstand herzustellen, der nämlich das Filtrat der Reaktionslösung ist, der L-epi-2-Inosose enthält, und die Schritte des direkten Zugebens eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetalltrialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids zu dem Kulturbrühenüberstand als Reduktionsmittel und des Durchführens der Reduktionsreaktion von L-epi-2-Inosose mit diesem Reduktionsmittel, um dadurch epi-Inosit und myo-Inosit in dem Kulturbrühenüberstand, nämlich dem Reaktionslösungsfiltrat, herzustellen, den Schritt des Gewinnens des epi-Inosits und myo-Inosits aus der sich ergebenden Reaktionslösung der Reduktionsreaktion, die nämlich der Kulturbrühenüberstand ist, der den so hergestellte epi-Inosit und myo-Inosit enthält, und den Schritt der Trennung des gewonnenen epi-Inosits und myo-Inosits voneinander.
  15. Verfahren nach Anspruch 9, das die Schritte des Züchtens eines Mikroorganismus, der myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln kann, unter aeroben Bedingungen in einem flüssigen Kulturmedium, das Kohlenstoffquellen und Stickstoffquellen enthält, um eine Kulturbrühe des Mikroorganismus zu erhalten, und dann des Abtrennens der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus von der sich ergebenden Kulturbrühe, den Schritt des Umsetzens der so abgetrennten mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus mit myo-Inosit in einem wässerigen Reaktionsmedium, das aus einer wässerigen Pufferlösung oder einem flüssigen Kulturmedium besteht, um in dem wässerigen Reaktionsmedium L-epi-2-Inosose zu erzeugen, den Schritt des Entfernens der mikrobiellen Zellen des Mikroorganismus aus der sich ergebenden wässerigen Reaktionslösung, die die mikrobiellen Zellen und die so hergestellte L-epi-2-Inosose enthält, um ein sich ergebendes Filtrat der Reaktionslösung zu erhalten, aus dem die mikrobiellen Zellen entfernt wurden, in dem jedoch L-epi-2-Inosose gelöst verbleibt, die Schritte des Zugebens eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetalltrialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanids als Reduktionsmittel zu dem Reaktionslösungsfiltrat und des Durchführens der Reduktionsreaktion der L-epi-2-Inosose mit dem Reduktionsmittel, um dadurch epi-Inosit und myo-Inosit in dem Reaktionslösungsfiltrat herzustellen, den Schritt des Gewinnens des epi-Inosits und myo-Inosits aus der sich ergebenden Reaktionslösung der Reduktionsreaktion, die das so hergestellte epi-Inosit und myo-Inosit enthält, und den Schritt der Trennung des so gewonnenen epi-Inosits und myo-Inosits voneinander umfasst.
  16. Verfahren nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, wobei, vor dem Durchführen des Schritts der oder dem Durchführen der Reduktionsreaktion von L-epi-2-Inosose mit dem Reduktionsmittel wie zugegeben, ein solcher vorausgehender Schritt durchgeführt wird, bei dem der pH des wässerigen Mediums, das aus dem Kulturbrühenüberstand oder dem Reaktionslösungsfiltrat besteht, die L-epi-2-Inosose enthalten, einmal auf einen alkalischen pH in einem pH-Bereich von 8 bis 12 eingestellt wird, und wobei dann der Schritt durchgeführt wird, der das Zugeben eines Alkalimetallborhydrids, eines Alkalimetalltrialkoxyborhydrids oder eines Alkalimetallborcyanides als Reduktionsmittel zu dem wässerigen Medium, das L-epi-2-Inosose enthält und einen pH von 8 bis 12 aufweist, und dann das Durchführen der Reduktionsreaktion der L-epi-2-Inosose mit dem Reduktionsmittel umfasst, wodurch der gewünschte epi-Inosit in einer Ausbeute hergestellt wird, die viel höher ist als diejenige des als Nebenprodukt hergestellten myo-Inosits.
  17. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das für die Reduktionsreaktion der L-epi-2-Inosose zu verwendende Reduktionsmittel ausgewählt wird aus Natriumborhydrid, Lithiumborhydrid, Kaliumborhydrid, Natriumtrimethoxyborhydrid und Natriumborcyanidhydrid.
  18. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das zu verwendende Reduktionsmittel Natriumborhydrid ist.
  19. Mikroorganismus, Xanthomonas sp. AB 10119 Stamm, der als eine charakteristische Eigenschaft aufweist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln zu können, und der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7168 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, in Japan, hinterlegt wurde.
  20. Mikroorganismus, Pseudomonas sp. AB 10215 Stamm, der als eine charakteristische Eigenschaft aufweist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln zu können, und der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7170 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, in Japan, hinterlegt wurde.
  21. Mikroorganismus, Erwinia sp. AB 10135 Stamm, der als eine charakteristische Eigenschaft aufweist, myo-Inosit in L-epi-2-Inosose umwandeln zu können, und der unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-7169 bei dem National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, in Japan, hinterlegt wurde.
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