Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfah ren für die Herstellung des Antibiotikums Validamycin As
Es hat sich gezeigt, dass das Antibiotikum, genannt Valid amycin oder T-7545, durch Züchtung eines Stammes von
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus, welcher zur Gattung Streptomyces gehört, erhalten werden kann und dass die Validamycine eine hervorragende Hemmwirkung gegen Pflanzenkrankheiten, z. B. den Blattscheidebrand von Reispflanzen, besitzen (vergleiche britische Patentschrift Nummer 1278289).
Bei Versuchen wurden die folgenden Resultate mit Valid amycinen festgestellt: i) 8 Komponenten von Validamycinkomplexen, nämlich der Validamycine A, B, C, D, E und F und die Validoxyl amine A und B wurden in der Fermentierbrühe festgestellt.
ii) Validamycin A besitzt die höchste Wirksamkeit unter diesen Verbindungen gegen Pellicularia sasakii, und die Validamycine C, E und F können in das Validamycin A übergeführt werden, welches der folgenden Formel entspricht:
EMI1.1
iii) Sämtliche Validamycine C, E und F bestehen aus 2 Mol D-Glucose und 1 Mol Validoxylamin A der Strukturformel:
EMI1.2
und besitzen die gleiche Molekularformel, nämlich die Formel C26H45NOi8.
iv) Eines von zwei Mol D-Glucose ist ss-glycosidisch verbunden mit der in 3-Stellung vorhandenen Hydroxylgruppe des gesättigten Cyclitolteiles (Validaminteiles) von Validoxylamin A in den Validamycinmolekülen C, E und F.
v) Die andere D-Glucose ist a-glycosidisch in jedem Molekül der Validamyome C, E und F an eine andere Hydroxylgruppe gebunden.
vi) In der Struktur von Validamycin E haftet die a-D Glucopyranosyl-(1e4)-ss-D-Glucopyranosylgruppe an der in 3-Stellung vorhandenen Hydroxylgruppe des gesättigten Cyclitolteiles (Validaminteiles) von Validoxylamin A.
vii) Die a-glycosidisch gebundene D-Glucose in den beiden Validamycinen C und F haftet am ungesättigten Cyclitolteil (Valienaminteil) des Validoxylamins A. Wenngleich die Strukturen der Validamycine C und F in bezug auf die Haftung an der a-D-Glucosidbindung sich voneinander unterscheiden, verbleibt die Bestimmung der genauen Stellen der Bindungen.
Es wurde nun die Überführung der Validamycine C, E und F in das Validamycin A durch Hydrolyse derselben mittels eines chemischen Vorganges und eines enzymatischen Vorganges mit Erfolg durchgeführt.
Gemäss vorliegender Erfindung verwendet man als Ausgangsmaterial mindestens eines der Validamycine C, E und F. Sie werden aus den Antibiotika, nämlich den Validamycinen, wie dies nachstehend beschrieben wird, chromatographisch isoliert.
Für die Hydrolyse der Validamycine C, E oder F in das Validamycin A durch enzymatische Umsetzung kann man Enzyme beliebigen Ursprungs verwenden, vorausgesetzt, dass sie eine a-Glucosidasewirkung aufweisen. Solche Enzyme können vorzugsweise durch Züchtung verschiedener Mikroorganismen erzielt werden. Aspergillus terreus (IFO 6346), Endomycopsis fibuligera (IFO 0109), Endomycopsis chodatii (IFO 6130), Endomyces decipiens (IFO 0102) sind typische Beispiele solcher Mikroorganismen. Die in Klammern wiedergegebenen IFO-Zahlen geben an, unter welchen Nummern dieselben in List of Cultures , 4. Ausgabe, veröffentlicht durch Institute for Fermentation , Osaka, zugänglich sind.
Zum Wachstum dieser Organismen verwendet man vorzugsweise ein Nährmedium, welches Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen und zu deren Wachstum erforderliche anorganische Salze aufweist. Als Kohlenstoffquellen kann man beispielsweise Glucose, Sucrose, Dextrin, Stärke und Glycerin verwenden.
Als Stickstoffquellen kommen beispielsweise organische Materialien enthaltendes Stickstoff, z. B. Pepton, Fleischextrakt, Casein, Hefe und Hefeextrakt sowie anorganische Stickstoffverbindungen, z. B. Ammoniumnitrat, Ammoniumphosphat, Ammoniumsulfat und Natriumnitrat, und als anorganische Salze beispielsweise Kaliumphosphat, Kaliumchlorid oder Magnesiumsulfat. in Frage.
Man kann für die Züchtung des Mikroorganismus eine stationäre Kultur verwenden, doch eignet sich eine submerse Kultur oder eine Schüttelkultur eher.
Die erfindungsgemäss durchzuführende Hydrolyse kann durch Verwendung der so erhaltenen Kultur als solche oder nach Aufarbeitung dieser Kultur durchgeführt werden. Die Bezeichnung aufgearbeitete Kultur bezieht sich auf ein beliebiges Material, welches so bearbeitet worden ist, dass die gewünschten Enzyme so konzentriert worden sind, dass die Hydrolyse leichter vor sich geht; somit kann eine Kulturbrühe als solche, die gewaschenen Zellen oder die Enzymlösung, welche aus den Zellen erhalten worden ist, als Enzymquelle für die Hydrolyse Verwendung finden. Verwendet man die Kulturbrühe als solche als Enzymquelle, so kann man die Validamycine C, E und F vor dem Wachstum des Mediums oder in einem beliebigen Zeitpunkt der Züchtung zugeben.
Verwendet man gewaschene Zellen, so erfolgt die Hydrolyse im allgemeinen in folgender Weise. Die gewaschenen Zellen werden in einem geeigneten Medium, z. B. destilliertem Wasser, einer Pufferlösung, z. B. einer Phosphatpufferlösung, oder in einer physiologischen Kochsalzlösung, suspendiert.
Bei der Hydrolyse des Validamycins C, E oder F zur Überführung in Validamycin A in chemischer Weise wird man diese Hydrolyse vorzugsweise unter Verwendung einer Mineralsäure, z. B. Salzsäure, oder einer organischen Säure, z. B. p-Toluolsulfonsäure, in verdünnter Konzentration, nämlich in ungefähr 0;05 bis In-Verdünnung, im Lösungsmittel, z. B. Wasser, einem niederen Alkylalkohol, z. B. Methanol, Äthanol oder einer Mischung davon, bei einer Temperatur im Bereiche zwischen Zimmertemperatur bis 1000 C durchführen. Obwohl die Reaktionsdauer hauptsächlich von der Reaktionstemperatur und der Konzentration der Säure abhängt, liegt die Reaktionsdauer vorzugsweise zwischen 3 bis 6 Stunden, sofern die Hydrolyse bei einer Temperatur von ungefähr 800 C mit 0,5 n-Schwefelsäure durchgeführt wird.
Bei der oben erwähnten Hydrolyse ist es ferner möglich, ein Kationenaustauschharz vom Sulfonsäuretypus, z. B. Amberlite IR120 (Warenzeichen der Firma Rohm & Haas, Co.) oder Dowex 50W (Warenzeichen der Firma Dow Chemical, Co.) als Säure zu verwenden.
Da die gewünschte Verbindung, nämlich Validamycin A, wasserlöslich und eine schwach basische Polyhydroxyverbindung ist, wird man diese Verbindung vorzugsweise durch Verwendung der physikochemischen Eigenschaften einer basischen Polyhydroxyverbindung reinigen.
Es wurde festgestellt, dass man nach dem Adsorbieren des Reaktionsproduktes auf einem geeigneten Adsorptionsmittel, z. B. Aktivkohle, die gewünschte Verbindung mit Hilfe eines geeigneten Lösungsmittels, z. B. wässrigemAlkohol oder wässrigem Aceton, eluieren kann. Man kann aber auch nach der Adsorption des Reaktionsproduktes auf dem Kationenaustauschharz die gewünschte Verbindung durch Verwendung einer sauren oder basischen wässrigen Lösung oder einer Pufferlösung eluieren. Schliesslich kann man auch chromatographieren unter Verwendung eines stark basischen Anionenaustauschharzes in der CH-Form als Adsorptionsmittel und Wasser als Eluiermittel.
Das Verfahren für die Herstellung der als Ausgangsmaterialien verwendeten Validamycine C, E und F wird in den nachstehenden Absätzen beschrieben. Die Erfindung selbst wird in den folgenden Beispielen näher erläutert. Im folgenden bedeuten die Prozentsätze mit Ausnahme jener hinsichtlich der Ausbeuten Gewichtsprozent/Volumenprozent.
1. Einem einen pH-Wert von 7,0 aufweisenden Medium, enthaltend 3 0/0 Glucose, 2,2 0/0 Sojabohnenmehl und 0,3 0/0 Pepton, gibt man 0,4 Olo ausgefälltes Calciumcarbonat hinzu.
Dann werden jeweils 50 ml (insgesamt 2 Liter) des obigen Mediums in vier 2-Liter-Kolben gegossen, worauf man die Medien sterilisiert. Jedem dieser Medien gibt man eine Öse voll einer Schrägkultur von Streptomyces hygroscopicus var.
limbneus (IFO-12703) als Impfstoff hinzu, worauf man während 2 Tagen bei 280 C unter Schütteln züchtet, um eine Samenkultur zu erzielen.
Hierauf gibt man in einen rostfreien 200-Liter-Stahlbehälter 100 Liter (pH 7,0) eines Mediums hinzu, welches 5 o/o Glucose, 3,6 O/o Sojabohnenmehl und 0,5 0/0 Pepton enthält, worauf man 0,6 ovo ausgefälltes Calciumcarbonat zusetzt. Nach dem Sterilisieren wird das Medium mit 2 Liter der oben erwähnten Samenkultur angeimpft. Die Züchtung erfolgt dann während 114 Stunden.
Die Kulturbrühe (950 Liter), bestehend aus Streptomyces hygroscopicus var. limoneus (IFO-12703), welche nach der obigen Methode erhalten worden ist, wird mittels Oxalsäure auf einen pH-Wert von 4,0 eingestellt und durch Zugabe eines Filterstoffes filtriert. 720 Liter des so erhaltenen Filtrates werden durch eine Säule (Harzgehalt 120 Liter) Amberlite (Rohm & Haas Co.) IR-120 (OH-Form) geleitet. Diese Säule wird mit 360 Liter Wasser gewaschen. Die Waschwasser und das ausfliessende Material werden durch eine Säule (Harzgehalt: 140 Liter) Amberlite IR-45 (OH-Form) geleitet und hierauf auf eine Säule (Harzgehalt: 60 Liter) Dowex (Dow Chemical Company) 50W X 2 (H-Form) durchfliessen gelassen.
Diese letztere Säule wird mit Wasser gewaschen und mit 200 Liter einer wässrigen 0,5-n-Ammoniaklösung eluiert und die Validamycin enthaltenden Fraktionen gepoolt und unter vermindertem Druck eingeengt.
40 Liter des Konzentrates werden unter Verwendung einer Säule (Harzgehalt: 30 Liter) Amberlite IRA-900 (OH Form) und unter Verwendung von Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Jede Fraktion wird durch Dünnschichtchromatographie (Silicagel G; Entwickler: Mischung von n Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 4:1:1), durch Gaschromatographie und durch Flüssigkeitschromatographie getestet. Die wirksamen Komponenten werden in der Reihenfolge der Validamycine D, A, B, C, F und E eluiert.
Die aus Amberlite IRA-900 eluierten Validamycine C, E und F enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck zu einem Sirup eingeengt, worauf man Aceton hinzugibt, um die wirksamen Komponenten in Form eines rohen Pulvers auszufällen. 400 g des so erhaltenen rohen Pulvers werden in 2 Liter Wasser gelöst und die Lösung unter Verwendung einer Säule (Harzgehalt: 22 Liter) Dowex 1x2 (OH Form) und Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Jede der Fraktionen wird durch Dünnschichtchromatographie und Gaschromatographie getestet. Dabei findet man Validamycin A in den 75 bis 115 Liter Fraktionen, die Validamycine B und C-in den 135 bis 275 Liter Fraktionen und die Validamycine E und F in den 325 bis 760 Liter Fraktionen.
Jede der das Validamycin C und die Validamycine E und F enthaltenden Gruppen der Fraktionen wird gesammelt und untervermindertem Druck eingeengt, worauf man mit Aceton versetzt. Auf diese Weise erhält man weisse Pulver. Auf diese Weise erhält man 42,0 g eines weissen Pulvers, welches zur Hauptsache die Validamycine B und C enthält, und 5,6 g eines weissen Pulvers, welches zur Hauptsache die Validamycine E und F enthält.
15 g dieses an Validamycinen B und C relativ reichen, rohen Produktes, welches man nach der obigen Methode erhalten kann, werden unter Verwendung einer Säule (870 ml, 3,5 cm X 95 cm) Dowex 1 X 2 (OH-Form, Teilchengrösse 0,125 bis 0,149 mm) und Wasser als Eluiermittel chromatographiert.
Jede der Fraktionen wird durch Dünnschichtchromatographie (Silicagel G; Mischung von n-Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis 4:1:1; Farbreagenz: Naphthoresorcinol -H2SO4) oder durch Gaschromatographie getestet.
Dabei werden ungefähr 0,2 g Validamycin C in den Fraktionen, welche ungefähr den 10- bis 20fachen Mengen des Volumens des Harzes entsprechen, eluiert.
Da sich das aus der oben erwähnten Methode erhältliche rohe Pulver zur Hauptsache aus Validamycin C zusammensetzt, aber noch eine kleine Menge Validamycin B enthält, wird es nach den nachstehenden Angaben weiter gereinigt.
1 g des obigen Pulvers wird unter Verwendung einer Säule (1,3 cm X 90 mm); Kieselgel (Merck's Kieselgel, 0,05 bis 0,2 mm) und als Entwickler eine Mischung n-Propanol, Essigsäure und Wasser im Mischungsverhältnis von 4:1:1 chromatographiert. Bei den so erhaltenen Fraktionen werden jene, welche eine positive Naphthoresorcinreaktion ergeben, durch Dünnschichtchromatographie bestätigt. Jene Fraktionen, welche nur Validamycin C enthalten, werden gesammelt und zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird dann auf Dowex 50W X 2 (Pyridinform) adsorbiert, worauf man mit einer ln Pyridin-Acetatpufferlösung (pH 6,5) eluiert. Die einen positiven Naphthoresorcinoltest ergebenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, worauf man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin C, erhält.
Zur Feststellung der physikochemischen Werte wird das Pulver mittels einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form) weiter gereinigt.
5,2 g des weissen Pulvers, welches zur Hauptsache aus den Validamycinen E und F besteht, werden unter Verwendung einer Säule (2,7 cm X 43 cm) Dowex 1 X 2 (OH-Form, Teilchengrösse 0,125 bis 0,149 mm) unter Verwendung von Wasser als Eluiermittel chromatographiert. Das Eluat wird durch Verwendung eines Refraktometers überwacht und jede Fraktion wird identifiziert und mit Hilfe einer automatischen Flüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie auf deren Reinheitsgrad getestet.
Die Validamycine E und F werden im Eluat, entsprechend ungefähr dem 30fachen Volumen des Harzes, erhalten.
Bei dieser Arbeitsweise wird das Validamycin F etwas vor demValidamycinE eluiert und, wie durch automatische Flüssigkeitschromatographie bestimmt wird, enthalten die ersten Fraktionen verhältnismässig grosse Mengen an Validamycin F, während die letzteren Fraktionen reich an Validamycin E sind. Die 80 o/o oder mehr Validamycin E enthaltenden Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 1,3 g eines weissen Pulvers erhält.
Das so erhaltene Pulver, welches 80 o/o oder mehr Validamycin E enthält, wird durch Chromatographie mittels Dowex 50W X 8 (Pyridinform; Eluierungsmittel: 0,1 molare Pyridin Acetatpufferlösung, pH 6,0) und hierauf auf Dowex 1 X 2 (OH-Form; Eluierungsmittel: Wasser) gereinigt. Die das Validamycin E enthaltenden Fraktionen werden gesammelt und unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Auf diese Weise erhält man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin E. Nötigenfalls wird die obige Arbeitsweise einmal wiederholt wobei man das Validamycin E von hohem Reinheitsgrad erhält.
In der gleichen Weise, wie dies für das Validamycin E beschrieben worden ist, werden die an Validamycin F reichen Fraktionen gesammelt und gereinigt, wobei man ein weisses Pulver, bestehend aus Validamycin F, erhält. Nötigenfalls wird diese Massnahme einmal wiederholt, worauf man das Validamycin F in reiner Form erhält.
Die als Ausgangsmaterialien verwendetenValidamycine 0, E und F sowie das Validamycin A weisen die folgenden Molekularformeln auf, entsprechend den folgenden Elementaranalysen, und besitzen die folgenden Zersetzungspunkte.
Eigenschaften Molekularformel Molekular- Elementaranalyse Zers. Verbindung gewicht Gef. Ber. produkt
C 46,64 C 46,60 Validamycin A C20H3sNOl3H2O 515,5 H 7,15 H 7,24 1001350 C
N 2,95 N 2,72
C 46,48 C 46,08 Validamycin C C20H45NOl8H2O 677,7 H 6,99 H 6,99 142-1600 C
N 2,15 N 2,07
C 46,22 C 46,08 Validamycin E C2sH4sNOt8H20 677,7 H 7,19 H 6,99 263-2680 C
N 1,94 N 2,07 046,00 C 46,08 Validamycin F C26H4sNO18H20 677,7 H 6,90 H 6,99 165-1730 C
N 1,95 N 2,07
Beispiel 1
In 60 ml eines Mediums (pH 5,7), bestehend aus 0,5 o/o Validamycin C, 0,5 0/0 Ammoniumsulfat,
0,1 0/0 monobasischem Kaliumphosphat, 0,050/0 Ferrichlorid, 0,05 /0 Kaliumchlorid, 0,05 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt, wird Endomyces decipiens (IFO 0102) während 6 Tagen bei 280 C inkubiert. Hierauf wird das Filtrat durch eine mit Aktivkohle beschickte Säule (10 ml) geleitet. Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 50 ml Wasser, enthaltend 7 0/0 n-Butanol, eluiert. Die ausfliessende Flüssigkeit wird hierauf durch eine Dowex 50W X 2 Säule (H-Form, 10 ml) geleitet.
Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 50 ml 0,5n-NH40H eluiert. Die abfliessende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird hierauf in 10 ml Wasser gelöst und über einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form 95 ml) unter Verwendung von Wasser als Entwickler chromatographiert. Zum Überwachen der Eluierungskurve wird ein Refraktometer eingesetzt, wobei jede Fraktion durch Gaschromatographie geprüft wird. Die nur Validamycin A (240 bis 320 ml) enthaltenden kombinierten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 165 mg Validamycin A in Form eines weissen Pulvers in einer Ausbeute von 72 0/0 erhält.
Beispiel 2
300 mg Validamycin F werden einer durch Enzym katalysierten hydrolytischen Spaltung unterworfen, wobei man 140 mg Validamycin A in einer Ausbeute von 61 o/o erhält, wenn man nach der Methode gemäss Beispiel 1 arbeitet. Bei dieser Arbeitsweise werden jedoch das Substrat und die den Mikroorganismus erzeugende a-Glucosidase durch Validamycin F bzw. Endomycopsis chodatii (IFO 6130) ersetzt.
Beispiel 3
Endomyces decipiens (IFO 0102) wird in 800 ml eines Mediums (pH 5,7), das sich aus 2 o/o Stärke, 0,5 o/o Ammoniumsulfat, 0,1 0/0 monobasischem Kaliumsulfat, 0,05 o/o Ferrichlorid, 0,05 0/0 Kaliumchlorid, 0,05 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt zusammensetzt, inokuliert. Die Züchtung erfolgt während 4 Tagen bei 280 C, worauf man die Zellen durch Filtrieren sammelt. Die Zellen werden hierauf mit jeweils 200 ml Portionen Wasser gewaschen.
200 mg Validamycin E werden 40 ml einer Phosphatpufferlösung (0,1 Mol, pH 6,5) zugegeben, in welcher die gewaschenen Zellen suspendiert werden. Die Umsetzung wird während 6 Stunden bei 300 C durchgeführt.
Nach der Eliminierung der Zellen durch Filtrieren wird das Filtrat durch eine Säule aus Dowex 50W X 2 (H-Form, 30 ml)-Harz hindurchgeführt.
Nach dem Waschen der Säule mit Wasser wird das Produkt mit 150 ml einer 0,5n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert und die ausfliessende Flüssigkeit unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird in 10 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird unter Verwendung einer Säule, enthaltend Dowex 1 X 2 (OH-Form, 95 ml) und Wasser als Entwicklerlösungsmittel, chromatographiert.
Jede so erhaltene Fraktion wird mit einem Differentialrefraktometer und mittels Gaschromatographie getestet, wobei man feststellt, dass Validamycin A in den Fraktionen zwischen 240 ml und 300 ml eluiert wird.
Die vereinigten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 135 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 89 O/o erhält.
Beispiel 4
Gewaschene Zellen von Endomyces decipiens (IFO 0102), welche man in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3 erhält, werden in 40 ml einer 0,1 molaren Phosphatpufferlösung vom pH-Wert 6,5 suspendiert, worauf man sie unter Anwendung einer Ribo-Cell-Fraktioniervorrichtung (Modell RF-1, Sarvall Co.) und durch anschliessendes Zentrifugieren verkleinert.
Die oben schwimmende Flüssigkeit wird zu 200 mg Validamycin E hinzugegeben. Das Gemisch wird hierauf während 6 Stunden bei 300 C stehengelassen, worauf man mit 50 ml Wasser verdünnt. Die verdünnte Lösung wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 3 chromatographiert, wobei man 110 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 72 /o erhält.
Beispiel 5
Man arbeitet in gleicher Weise wie in Beispiel 3, wobei man eine Mischung von 200 mg der Validamycine E und F im Verhältnis von 3:1 unter Verwendung von Endomyces decipiens (IFO 0102) hydrolysiert. Auf diese Weise erhält man 120 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 79 /o.
Beispiel 6
In 60 ml eines Mediums (pH 7,0), das sich aus 0,5 0/0 Validamycin E, 1,0 0/0 Ammoniumnitrat, 0,5 0/0 monobasischem Kaliumphosphat, 0,2 o/o Magnesiumsulfat und 0,05 o/o Hefeextrakt zusammensetzt, wird Aspergillus terreus (IFO 6346) während 10 Tagen bei 240 C inkubiert.
Das durch Filtrieren des Reaktionsgemisches erhaltene Filtrat wird in ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 gereinigt, wobei man 80 mg Validamycin A als weisses Pulver in einer Ausbeute von 53 /0 erhält.
Beispiel 7
Eine Lösung von 2 g Validamycin E in 200 ml einer 0,5n Schwefelsäurelösung wird während 3 Stunden auf dem Wasserbade bei ungefähr 800 C hydrolysiert. Das Reaktionsgemisch wird hierauf durch eine Säule aus Amberlite IR-45 (OH-Form, 100 ml) hindurchgeleitet, um die Sulfationen zu entfernen.
Die ausfliessende Flüssigkeit und die Waschwasser (300 ml) werden durch eine Säule aus Dowex 50W X 2 (H-Form, 30ml) geleitet.
Nach dem Waschen mit Wasser wird die Säule mit 150 ml einer 0,5n-Ammoniumhydroxydlösung eluiert. Die ausfliessende Flüssigkeit wird unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird hierauf in 10 ml Wasser gelöst. Dann wird diese Lösung unter Verwendung einer Säule von Dowex 1 X 2 (OH-Form, 150 ml) und unter Verwendung von Wasser als Entwicklerlösungsmittel chromatographiert, worauf man Validamycin A in den Fraktionen zwischen 420 ml und 600 ml eluiert. Die kombinierten Fraktionen werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt, wobei man 650 mg Validamycin A in einer Ausbeute von 43 o/o erhält.
Beispiel 8
Validamycin C wird mit einer 0,5n-Schwefelsäurelösung während 6 Stunden bei 800 C hydrolysiert. Hierauf wird die Reaktionslösung in ähnlicher Weise wie in Beispiel 7 gereinigt, worauf man das Validamycin A in einer Ausbeute von 10 0/0 erhält.
The present invention relates to a method for the production of the antibiotic validamycin As
The antibiotic, called Valid amycin, or T-7545, has been shown to be produced by breeding a strain of
Streptomyces hygroscopicus var. Limoneus, which belongs to the genus Streptomyces, can be obtained and that the validamycins have an excellent inhibitory effect against plant diseases, e.g. B. the leaf shedding of rice plants have (see British patent specification number 1278289).
The following results were found in tests with validamycins: i) 8 components of validamycin complexes, namely the validamycins A, B, C, D, E and F and the validoxyl amines A and B were found in the fermentation broth.
ii) Validamycin A has the highest effectiveness among these compounds against Pellicularia sasakii, and the Validamycins C, E and F can be converted into the Validamycin A, which corresponds to the following formula:
EMI1.1
iii) All validamycins C, E and F consist of 2 moles of D-glucose and 1 mole of validoxylamine A of the structural formula:
EMI1.2
and have the same molecular formula, namely the formula C26H45NOi8.
iv) One of two moles of D-glucose is ss-glycosidically linked to the 3-position hydroxyl group of the saturated cyclitol part (validamine part) of validoxylamine A in the validamycin molecules C, E and F.
v) The other D-glucose is a-glycosidically bound to a different hydroxyl group in each molecule of the validamyomes C, E and F.
vi) In the structure of Validamycin E, the a-D glucopyranosyl- (1e4) -ss-D-glucopyranosyl group adheres to the 3-position hydroxyl group of the saturated cyclitol part (validamine part) of validoxylamine A.
vii) The a-glycosidically bound D-glucose in the two validamycins C and F adheres to the unsaturated cyclitol part (valienamine part) of validoxylamine A. Although the structures of the validamycins C and F differ from one another with regard to the adhesion to the aD-glucoside bond, what remains is the determination of the exact locations of the bonds.
The conversion of the validamycins C, E and F into the validamycin A by hydrolysis of the same by means of a chemical process and an enzymatic process has now been carried out successfully.
According to the present invention, at least one of the validamycins C, E and F is used as the starting material. They are isolated by chromatography from the antibiotics, namely the validamycins, as will be described below.
Enzymes of any origin can be used for the hydrolysis of the validamycins C, E or F into the validamycin A by enzymatic conversion, provided that they have an α-glucosidase effect. Such enzymes can preferably be obtained by cultivating various microorganisms. Aspergillus terreus (IFO 6346), Endomycopsis fibuligera (IFO 0109), Endomycopsis chodatii (IFO 6130), Endomyces decipiens (IFO 0102) are typical examples of such microorganisms. The IFO numbers in brackets indicate under which numbers they are available in List of Cultures, 4th Edition, published by the Institute for Fermentation, Osaka.
For the growth of these organisms, a nutrient medium is preferably used which has carbon sources, nitrogen sources and inorganic salts necessary for their growth. As carbon sources, for example, glucose, sucrose, dextrin, starch and glycerin can be used.
As nitrogen sources, for example, nitrogen containing organic materials, e.g. B. peptone, meat extract, casein, yeast and yeast extract and inorganic nitrogen compounds, e.g. B. ammonium nitrate, ammonium phosphate, ammonium sulfate and sodium nitrate, and as inorganic salts, for example, potassium phosphate, potassium chloride or magnesium sulfate. in question.
A stationary culture can be used for culturing the microorganism, but a submerged culture or a shaking culture is more suitable.
The hydrolysis to be carried out according to the invention can be carried out using the culture thus obtained as such or after this culture has been worked up. The term processed culture refers to any material that has been processed so that the desired enzymes have been concentrated in such a way that hydrolysis occurs more easily; thus, a culture broth as such, the washed cells or the enzyme solution obtained from the cells can be used as the enzyme source for hydrolysis. If the culture broth is used as such as the enzyme source, the validamycins C, E and F can be added before the growth of the medium or at any time during the cultivation.
If washed cells are used, the hydrolysis is generally carried out in the following manner. The washed cells are placed in a suitable medium, e.g. B. distilled water, a buffer solution, e.g. B. a phosphate buffer solution, or in a physiological saline solution, suspended.
In the hydrolysis of validamycin C, E or F for conversion to validamycin A in a chemical manner, this hydrolysis is preferably carried out using a mineral acid, e.g. B. hydrochloric acid, or an organic acid, e.g. B. p-toluenesulfonic acid, in dilute concentration, namely in about 0.05 to In dilution, in the solvent, for. B. water, a lower alkyl alcohol, e.g. B. methanol, ethanol or a mixture thereof, at a temperature in the range between room temperature to 1000 C. Although the reaction time mainly depends on the reaction temperature and the concentration of the acid, the reaction time is preferably between 3 to 6 hours if the hydrolysis is carried out at a temperature of about 800 ° C. with 0.5N sulfuric acid.
In the above-mentioned hydrolysis, it is also possible to use a sulfonic acid type cation exchange resin, e.g. B. Amberlite IR120 (trademark of Rohm & Haas, Co.) or Dowex 50W (trademark of Dow Chemical, Co.) as the acid.
Since the desired compound, namely validamycin A, is water soluble and a weakly basic polyhydroxy compound, one will preferably purify this compound by utilizing the physicochemical properties of a basic polyhydroxy compound.
It has been found that after adsorbing the reaction product on a suitable adsorbent, e.g. B. activated carbon, the desired compound using a suitable solvent, e.g. Aqueous alcohol or aqueous acetone can elute. However, after the reaction product has been adsorbed on the cation exchange resin, the desired compound can be eluted by using an acidic or basic aqueous solution or a buffer solution. Finally, it is also possible to chromatograph using a strongly basic anion exchange resin in the CH form as adsorbent and water as eluent.
The procedure for the preparation of the Validamycins C, E and F used as starting materials is described in the following paragraphs. The invention itself is explained in more detail in the following examples. In the following, the percentages other than those relating to the yields are weight percent / volume percent.
1. A medium having a pH of 7.0 and containing 3% glucose, 2.2% soybean meal and 0.3% peptone is added 0.4% of precipitated calcium carbonate.
Then 50 ml each (2 liters total) of the above medium is poured into four 2-liter flasks and the media is sterilized. Each of these media is given a loop full of a slant culture of Streptomyces hygroscopicus var.
limbneus (IFO-12703) was added as a vaccine, followed by cultivation for 2 days at 280 ° C. with shaking in order to achieve a seed culture.
100 liters (pH 7.0) of a medium containing 5% glucose, 3.6% soybean meal and 0.5% peptone are then added to a 200-liter stainless steel container, whereupon 0 , 6 ovo precipitated calcium carbonate added. After sterilization, the medium is inoculated with 2 liters of the above-mentioned seed culture. Cultivation then takes place for 114 hours.
The culture broth (950 liters), consisting of Streptomyces hygroscopicus var. Limoneus (IFO-12703), which has been obtained by the above method, is adjusted to a pH of 4.0 using oxalic acid and filtered by adding a filter material. 720 liters of the filtrate thus obtained are passed through a column (resin content 120 liters) Amberlite (Rohm & Haas Co.) IR-120 (OH form). This column is washed with 360 liters of water. The washing water and the effluent are passed through a column (resin content: 140 liters) Amberlite IR-45 (OH form) and then onto a column (resin content: 60 liters) Dowex (Dow Chemical Company) 50W X 2 (H form ) allowed to flow through.
This latter column is washed with water and eluted with 200 liters of an aqueous 0.5 N ammonia solution, and the fractions containing validamycin are pooled and concentrated under reduced pressure.
40 liters of the concentrate are chromatographed using a column (resin content: 30 liters) Amberlite IRA-900 (OH form) and using water as the eluent. Each fraction is tested by thin layer chromatography (silica gel G; developer: mixture of n propanol, acetic acid and water in a mixing ratio of 4: 1: 1), by gas chromatography and by liquid chromatography. The active components are eluted in the order of the validamycins D, A, B, C, F and E.
The fractions containing Validamycins C, E and F eluted from Amberlite IRA-900 are concentrated under reduced pressure to a syrup, after which acetone is added to precipitate the active components in the form of a crude powder. 400 g of the crude powder thus obtained are dissolved in 2 liters of water and the solution is chromatographed using a column (resin content: 22 liters) Dowex 1x2 (OH form) and water as the eluent. Each of the fractions is tested by thin layer chromatography and gas chromatography. Validamycin A is found in the 75 to 115 liter fractions, the Validamycins B and C in the 135 to 275 liter fractions and the Validamycin E and F in the 325 to 760 liter fractions.
Each of the groups of the fractions containing the validamycin C and the validamycin E and F is collected and concentrated under reduced pressure, after which acetone is added. In this way you get white powders. In this way, 42.0 g of a white powder, which mainly contains the validamycins B and C, and 5.6 g of a white powder, which mainly contains the validamycins E and F, are obtained.
15 g of this crude product, which is relatively rich in validamycins B and C and which can be obtained by the above method, are converted using a column (870 ml, 3.5 cm X 95 cm) Dowex 1 X 2 (OH form, particle size 0.125 to 0.149 mm) and water as the eluent.
Each of the fractions is tested by thin layer chromatography (silica gel G; mixture of n-propanol, acetic acid and water in a mixing ratio of 4: 1: 1; color reagent: naphthoresorcinol -H2SO4) or by gas chromatography.
About 0.2 g of validamycin C are eluted in the fractions which correspond to about 10 to 20 times the amount of the volume of the resin.
Since the raw powder obtained from the above-mentioned method consists mainly of validamycin C, but still contains a small amount of validamycin B, it is further purified according to the following information.
1 g of the above powder is extracted using a column (1.3 cm X 90 mm); Silica gel (Merck's silica gel, 0.05 to 0.2 mm) and a mixture of n-propanol, acetic acid and water in a mixing ratio of 4: 1: 1 as a developer. Of the fractions thus obtained, those giving a positive reaction to naphthoresorcinol are confirmed by thin layer chromatography. Those fractions which only contain validamycin C are collected and concentrated to dryness. The residue is then adsorbed onto Dowex 50W X 2 (pyridine form), whereupon it is eluted with an IN pyridine-acetate buffer solution (pH 6.5). The fractions giving a positive naphthoresorcinol test are collected and concentrated to dryness under reduced pressure, whereupon a white powder consisting of validamycin C is obtained.
To determine the physicochemical values, the powder is further purified using a column of Dowex 1 X 2 (OH form).
5.2 g of the white powder, which consists mainly of the validamycins E and F, are made using a column (2.7 cm X 43 cm) Dowex 1 X 2 (OH shape, particle size 0.125 to 0.149 mm) chromatographed with water as the eluent. The eluate is monitored using a refractometer and each fraction is identified and tested for purity using automatic liquid chromatography and gas chromatography.
The Validamycins E and F are obtained in the eluate, corresponding to approximately 30 times the volume of the resin.
In this procedure, the validamycin F is eluted slightly before the validamycin E and, as determined by automatic liquid chromatography, the first fractions contain relatively large amounts of validamycin F, while the latter fractions are rich in validamycin E. The fractions containing 80 o / o or more validamycin E are concentrated to dryness under reduced pressure, 1.3 g of a white powder being obtained.
The powder thus obtained, which contains 80 o / o or more Validamycin E, is chromatographed using Dowex 50W X 8 (pyridine form; eluent: 0.1 molar pyridine acetate buffer solution, pH 6.0) and then on Dowex 1 X 2 (OH -Form; eluent: water) purified. The fractions containing the validamycin E are collected and concentrated to dryness under reduced pressure. In this way, a white powder consisting of Validamycin E. is obtained. If necessary, the above procedure is repeated once, whereby Validamycin E is obtained with a high degree of purity.
In the same way as has been described for validamycin E, the fractions rich in validamycin F are collected and purified, a white powder consisting of validamycin F being obtained. If necessary, this measure is repeated once, whereupon the validamycin F is obtained in pure form.
The validamycins 0, E and F as well as the validamycin A used as starting materials have the following molecular formulas, corresponding to the following elemental analyzes, and have the following decomposition points.
Properties Molecular Formula Molecular Elemental Analysis Dec. Connection weight Gef. product
C 46.64 C 46.60 validamycin A C20H3sNOl3H2O 515.5 H 7.15 H 7.24 1001350 C
N 2.95 N 2.72
C 46.48 C 46.08 Validamycin C C20H45NOl8H2O 677.7 H 6.99 H 6.99 142-1600 C
N 2.15 N 2.07
C 46.22 C 46.08 Validamycin E C2sH4sNOt8H20 677.7 H 7.19 H 6.99 263-2680 C
N 1.94 N 2.07 046.00 C 46.08 Validamycin F C26H4sNO18H20 677.7 H 6.90 H 6.99 165-1730 C
N 1.95 N 2.07
example 1
In 60 ml of a medium (pH 5.7), consisting of 0.5 o / o Validamycin C, 0.5 0/0 ammonium sulfate,
0.1% / 0 monobasic potassium phosphate, 0.050 / 0 ferric chloride, 0.05 / 0 potassium chloride, 0.05% magnesium sulfate and 0.05% yeast extract, Endomyces decipiens (IFO 0102) is used at 280 ° C. for 6 days incubated. The filtrate is then passed through a column (10 ml) charged with activated charcoal. After washing with water, the column is eluted with 50 ml of water containing 7% n-butanol. The outflowing liquid is then passed through a Dowex 50W X 2 column (H-shape, 10 ml).
After washing with water, the column is eluted with 50 ml of 0.5N NH40H. The flowing liquid is concentrated to dryness under reduced pressure. The residue is then dissolved in 10 ml of water and chromatographed on a column of Dowex 1 X 2 (OH form 95 ml) using water as a developer. A refractometer is used to monitor the elution curve and each fraction is checked by gas chromatography. The combined fractions containing only validamycin A (240 to 320 ml) are concentrated to dryness under reduced pressure, 165 mg of validamycin A being obtained in the form of a white powder in a yield of 72%.
Example 2
300 mg validamycin F are subjected to an enzyme-catalyzed hydrolytic cleavage, 140 mg validamycin A being obtained in a yield of 61% if the method according to example 1 is used. In this procedure, however, the substrate and the a-glucosidase which produces the microorganism are replaced by Validamycin F or Endomycopsis chodatii (IFO 6130).
Example 3
Endomyces decipiens (IFO 0102) is dissolved in 800 ml of a medium (pH 5.7), which consists of 2 o / o starch, 0.5 o / o ammonium sulfate, 0.1 0/0 monobasic potassium sulfate, 0.05 o / o ferric chloride, 0.05 o / o potassium chloride, 0.05 o / o magnesium sulfate and 0.05 o / o yeast extract, inoculated. Cultivation takes place for 4 days at 280 ° C., after which the cells are collected by filtration. The cells are then washed with 200 ml portions of water each time.
200 mg Validamycin E are added to 40 ml of a phosphate buffer solution (0.1 mol, pH 6.5), in which the washed cells are suspended. The reaction is carried out at 300 ° C. for 6 hours.
After eliminating the cells by filtration, the filtrate is passed through a column of Dowex 50W X 2 (H-form, 30 ml) resin.
After washing the column with water, the product is eluted with 150 ml of a 0.5N ammonium hydroxide solution and the liquid which flows out is concentrated to dryness under reduced pressure. The residue is dissolved in 10 ml of water. This solution is chromatographed using a column containing Dowex 1 X 2 (OH form, 95 ml) and water as the developing solvent.
Each fraction thus obtained is tested on a differential refractometer and by gas chromatography, it being found that validamycin A is eluted in the fractions between 240 ml and 300 ml.
The combined fractions are concentrated to dryness under reduced pressure, 135 mg of validamycin A being obtained as a white powder in a yield of 89%.
Example 4
Washed cells of Endomyces decipiens (IFO 0102), which are obtained in a similar manner to Example 3, are suspended in 40 ml of a 0.1 molar phosphate buffer solution of pH 6.5, whereupon they are suspended using a Ribo-Cell Fractionator (model RF-1, Sarvall Co.) and reduced in size by subsequent centrifugation.
The liquid floating above is added to 200 mg validamycin E. The mixture is then left to stand at 300 ° C. for 6 hours, after which it is diluted with 50 ml of water. The diluted solution is chromatographed in a manner similar to Example 3, 110 mg of validamycin A being obtained as a white powder in a yield of 72%.
Example 5
The procedure is the same as in Example 3, a mixture of 200 mg of Validamycins E and F being hydrolyzed in a ratio of 3: 1 using Endomyces decipiens (IFO 0102). In this way, 120 mg of validamycin A are obtained as a white powder in a yield of 79%.
Example 6
In 60 ml of a medium (pH 7.0) consisting of 0.5% validamycin E, 1.0% ammonium nitrate, 0.5% monobasic potassium phosphate, 0.2% magnesium sulfate and 0 , 05 o / o yeast extract, Aspergillus terreus (IFO 6346) is incubated at 240 ° C. for 10 days.
The filtrate obtained by filtering the reaction mixture is purified in a manner similar to that in Example 1, 80 mg of validamycin A being obtained as a white powder in a yield of 53/0.
Example 7
A solution of 2 g of validamycin E in 200 ml of a 0.5N sulfuric acid solution is hydrolyzed on a water bath at about 800 ° C. for 3 hours. The reaction mixture is then passed through a column of Amberlite IR-45 (OH form, 100 ml) in order to remove the sulfate ions.
The outflowing liquid and the washing water (300 ml) are passed through a column made of Dowex 50W X 2 (H-form, 30 ml).
After washing with water, the column is eluted with 150 ml of a 0.5N ammonium hydroxide solution. The liquid flowing out is concentrated to dryness under reduced pressure. The residue is then dissolved in 10 ml of water. This solution is then chromatographed using a Dowex 1 X 2 column (OH form, 150 ml) and using water as the developing solvent, after which validamycin A is eluted in fractions between 420 ml and 600 ml. The combined fractions are concentrated to dryness under reduced pressure, 650 mg of validamycin A being obtained in a yield of 43%.
Example 8
Validamycin C is hydrolyzed with a 0.5N sulfuric acid solution for 6 hours at 800 C. The reaction solution is then purified in a manner similar to that in Example 7, whereupon the validamycin A is obtained in a yield of 10%.