DD210074A5

DD210074A5 - PROCESS FOR THE PREPARATION OF RHAMNOSIS OR FUCOSE

Info

Publication number: DD210074A5
Application number: DD83253796A
Authority: DD
Inventors: Hartmut Voelskow; Merten Schlingmann
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1982-08-10
Filing date: 1983-08-08
Publication date: 1984-05-30
Also published as: OA07517A; FI832848A0; AU1782083A; DK363483D0; BR8304279A; IL69444A0; EP0102535A2; DK363483A; NO832858L; PT77172A; GR78922B; PT77172B; ES8404412A1; FI832848A; ES524806A0; DE3300633A1

Abstract

Durch Fermentation mit Bakterien der Gattungen Alcaligenes, Klebsiella, Pseudomonas oder Enterobacter werden extracellulaere Polysaccharide erzeugt, die reich an Rhamnose oder Fucose sind. Diese Desoxyzucker koennen nach saurer Hydrolyse des Polysaccharids aus dem Hydrolysat isoliert werden.By fermentation with bacteria of the genera Alcaligenes, Klebsiella, Pseudomonas or Enterobacter extracellular polysaccharides rich in rhamnose or fucose are produced. These deoxysugars can be isolated from the hydrolyzate after acid hydrolysis of the polysaccharide.

Description

AP C 12 Ή/ 62 684 11AP C 12 Ή / 62 684 11

Verfahren zur Herstellung von Hhamnose oder FucoseProcess for the preparation of hhamnose or fucose

Field of application of the invention

Die Erfindung "betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Hhamnose oder Fucose.The invention relates to a process for the production of hhamnose or fucose.

W Die erfindungsgemäß hergestellte Shamnose oder Fucose werden angewandt als Ausgangsstoff für die Synthese von Aromastoffen.W The shamnose or fucose prepared according to the invention are used as starting material for the synthesis of flavorings.

Characteristic of the known technical solutions

Die Desoxyzucker Bhamnose und Fucose sind auf chemischem Weg nur sehr schwer zugänglich. Es ist bekannt, daß zahlreiche Bakterien in der Lage sind, Desoxyzucker zu synthetisieren. Lipopolysaccharide enthalten sehr häufig Hhamnose und/oder Fucose, ebenso zahlreiche estracelluläre Polysaccharide» jedoch jeweils nur in sehr geringen Mengen.The deoxysugars Bhamnose and Fucose are chemically very difficult to access. It is known that many bacteria are capable of synthesizing deoxysugars. Lipopolysaccharides very often contain hhamnose and / or fucose, as well as numerous estracellular polysaccharides, but only in very small quantities.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung eines verbesserten Verfahrens, mit dem Rhamnose oder Fucose auf einfache Weise in guter Ausbeute hergestellt werden können.The aim of the invention is to provide an improved process by which rhamnose or fucose can be prepared in a simple manner in good yield.

Explanation of the essence of the invention

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, geeignete 3ak~ terien zum Fermentieren von extracellularem Polysaccharid aufzufinden.The invention has for its object to find suitable 3ak ~ terien for fermenting extracellular polysaccharide.

, ·λ unwinQ^ -*-1 ⁹S 50 I , · Λ unwinQ ^ - * - 1 ⁹ S 50 I

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wurde nun gefunden, daß Bakterien der Gattungen Alealigenes, Elebsiella, Pseudomonas und Snterobacter esrbracelluläre Polysaccharide synthetisieren können, die mehr als 10 % Rhamnose und/oder Fucose enthalten, und daß diese Desoxyzucker aus den gebildeten Polysacchariden auch in guten Ausbeuten gewonnen werden können. Im folgenden werden bevorzugte Ausgestaltungen dieser Erfindung näher erläutert.has now been found that bacteria of the genera Alealigenes, Elebsiella, Pseudomonas and Snterobacter can synthesize esrbracellular polysaccharides containing more than 10 % rhamnose and / or fucose, and that these deoxysugars can be obtained from the polysaccharides formed in good yields. In the following preferred embodiments of this invention will be explained in more detail.

line Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, ein Bakterium der Gattung Alealigenes in einem zuckerreichen Medium in belüfteter Submerskultur au fermentieren» das gebildete Polysaccharid - nach vorheriger Isolierung und gegebenenfalls Trocknung oder unmittelbar - zu hydrolysieren und aus dem Hydrolysat die Ehamnose zu gewinnen.Line refinement of the method according to the invention consists in fermenting a bacteria of the genus Alealigenes in a sugar-rich medium in aerated Submerskultur au »hydrolyze the polysaccharide formed - after prior isolation and optionally drying or immediately - and to win the Ehamnose from the hydrolyzate.

Eine andere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß ein Bakterium der Gattung Pseudornonas , insbesondere der aus der EP-PS 12 552 bekannte Stamm ATCC 31^61, wie beschrieben fermentiert und aus dem rhamnosereichen Exopolysaccharid die Rhamnose isoliert wird.Another embodiment of the invention is that a bacterium of the genus Pseudornonas, in particular the known from EP-PS 12 552 strain ATCC 31 ^ 61, fermented as described and isolated from the rhamnosereichen exopolysaccharide rhamnose.

Eine andere Ausgestaltung der Erfindung besteht darin, daß ein Bakterium der Gattung Klebsiella, insbesondere der Art Klebsiella pneumoniae, vor allem der aus der US-PS 4 350 bekannte Stamm ATCC 31^88, wie beschrieben fermentiert und aus dem fucosereichen Exopolysaccharid die Fucose isoliert wird. Zahlreiche nichtpathogene Stämme wurden in letzterAnother embodiment of the invention is that a bacterium of the genus Klebsiella, in particular the species Klebsiella pneumoniae, especially the known from US-PS 4 350 known strain ATCC 31 ^ 88, fermented as described and isolated from the fucose-rich exopolysaccharide, the fucose , Numerous non-pathogenic strains have been in last

. Zeit aus der Art K. pneumoniae ausgegliedert und der neuen Art K. planticola zugeordnet. Unabhängig von dieser Nomenklatur betrifft diese Ausgestaltung der Erfindung die Verwendung solcher Bakterien der Gattung Klebsiella, die fucosereiche Exopolysaccharide bilden., Time spun off from the species K. pneumoniae and assigned to the new species K. planticola. Regardless of this nomenclature, this embodiment of the invention relates to the use of such bacteria of the genus Klebsiella, which form high-fucose exopolysaccharides.

Eine weitere Ausführungsform der Erfindung besteht darin, ein Bakterium der Gattung Enterobacter, vorzugsweise der Arten Enterobacter cloacae oder Enterobacter sakazaki, wie vorstehend beschrieben zu fermentieren und aus dem erhaltenen Polysaccharid Fucose zu gewinnen.Another embodiment of the invention consists of fermenting a bacterium of the genus Enterobacter, preferably of the species Enterobacter cloacae or Enterobacter sakazaki, as described above, and of obtaining fucose from the resulting polysaccharide.

Die Auswahl geeigneter Stämme der genannten Bakterienarten erfolgt durch chromatographische Analyse der gebildeten Exopolysaccharide, die in üblicher Weise hydrolysiert werden, beispielsweise durch Papier-, Dünnschicht-, Hochdruckflüssig- oder Gaschromatographie geeigneter Derivate.The selection of suitable strains of the bacterial species mentioned is carried out by chromatographic analysis of the exopolysaccharides formed, which are hydrolyzed in a conventional manner, for example by paper, thin-layer, high pressure liquid or gas chromatography suitable derivatives.

Als zuckerreiche Kulturmedien für die beschriebenen Verfahren dienen solche, die als Kohlenstoffquelle im wesentlichen Glucose, Saccharose, Lactose, Galactose, Fructose oder andere zuckerhaltige Rohstoffe wie Molke enthalten. Als Stickstoffqueilen dienen anorganische Salze wie NatriumnitratSugar-rich culture media for the processes described are those which contain essentially as glucose, sucrose, lactose, galactose, fructose or other sugar-containing raw materials, such as whey, as carbon source. As nitrogen quenelles serve inorganic salts such as sodium nitrate

oder Ammoniumsalze und/oder organische Stickstoffquellen wie Cornsteep (Maisquellwasser), Hefeextrakt, Sojamehl oderor ammonium salts and / or organic nitrogen sources such as Cornsteep (corn steep liquor), yeast extract, soybean meal or

dergleichen. Wird Molke als Zuckerquelle verwendet, so kann aufgrund ihres Eiweißgehaltes der Anteil der übrigen Stickstof fquellen verringert werden. Weiterhin enthalten die Kulturmedien die üblichen Salze und Spurenelemente.like. If whey is used as a source of sugar, so the proportion of other nitrogen sources can be reduced due to their protein content. Furthermore, the culture media contain the usual salts and trace elements.

Die Fermentationsbedingungen entsprechen den für Bakterien dieser Gattungen üblichen: Die Temperatur wird in einem Bereich von etwa 25 bis etwa 4O⁰C, insbesondere etwa 30°C gehalten. Der pH-Wert wird auf einen Bereich von etwa 6 bis 7,5, insbesondere etwa 6,8 eingestellt und konstant gehalten. Die Kultur wird mit etwa 1 bis 2 1, vorzugsweise 1,5 pro Minute und pro 1 Medium belüftet und gerührt.The fermentation conditions correspond to the normal for bacteria of these genera: The temperature is maintained in a range of about 25 to about 4O ⁰ C, more preferably about 30 ° C. The pH is adjusted to a range of about 6 to 7.5, especially about 6.8 and kept constant. The culture is aerated and stirred at about 1 to 2 liters, preferably 1.5 per minute per 1 medium.

Nach etwa 5 bis 7 Tagen ist der Zucker abgebaut und die Bakterien haben etwa 15 bis 25 g Polysaccharid pro Liter Medium, meistens etwa 20 g/l Medium, ausgeschieden. Der Gehalt an Rhamnose bzw. Fucose liegt bei leistungsfähigen Stämmen bei über 20 %, teilweise über 50 *.After about 5 to 7 days, the sugar has broken down and the bacteria have excreted about 15 to 25 g of polysaccharide per liter of medium, usually about 20 g / l of medium. The content of rhamnose or fucose is in efficient strains over 20 %, sometimes over 50 *.

Die Hydrolyse der Polysaccharide erfolgt in bekannter Weise, z. B. mit wäßrigen Säuren wie Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure oder Essigsäure, zweckmäßig bei erhöhter Temperatur, vorzugsweise bei etwa 80 bis 120 C.The hydrolysis of the polysaccharides is carried out in a known manner, for. B. with aqueous acids such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid or acetic acid, expediently at elevated temperature, preferably at about 80 to 120 C.

Die Hydrolyse ist im allgemeinen nach 4 bis 10 Stunden abgeschlossen. Je nach Art der eingesetzten Säure kann diese durch Destillation oder neutralisierende Fällung entfernt und die säurefreie zuckerhaltige Lösung in bekannter Weise aufgetrennt werden.The hydrolysis is generally completed after 4 to 10 hours. Depending on the nature of the acid used, it can be removed by distillation or neutralizing precipitation and the acid-free sugar-containing solution can be separated in a known manner.

Je nach Zusammensetzung des Hydrolysats erfolgt die Abtrennung des gewünschten Desoxyzuckers durch chromatographische Methoden, beispielsweise durch lonenaustauschchromatographie, oder Adsorption an geeigneten oberflächenreichen Substanzen wie Zeolithen. Eine andere bevorzugte Aufarbeitung besteht darin, daß das Hydrolysat fermentativ aufgearbeitet wird, wobei die Nebenprodukte abgebaut werden und der gewünschte Desoxyzucker angereichert wird.Depending on the composition of the hydrolyzate, the separation of the desired deoxy sugar is carried out by chromatographic methods, for example by ion exchange chromatography, or adsorption on suitable surface-rich substances, such as zeolites. Another preferred workup is that the hydrolyzate is worked up by fermentation, wherein the by-products are degraded and the desired deoxy sugar is enriched.

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Die erfindungsgemaB erhältlichen Methylpentosen JRhamnose und Pucose eignen sich als Ausgangsstoff für die Synthese von Aromastoffen.The Methylpentosen JRhamnose and Pucose available according to the invention are suitable as starting material for the synthesis of flavorings.

embodiment

In den folgenden Beispielen beziehen sich Proaentangaben auf das Gewicht, sofern nichts anderes angegeben ist.In the following examples, percentages are by weight unless otherwise specified.

example 1

Alcaligenes sp. wird in einem Kulturmedium gezüchtet, das pro Liter die folgenden Inhaltsstoffe enthielt:Alcaligenes sp. is cultured in a culture medium containing per liter the following ingredients:

5050 gG Glucoseglucose 0,005 S0.005 p ?e(i.I? E (I.I 1.51.5 Cr O Cr O Cornsteep (trocken)Cornsteep (dry) 0,001 g0.001 g HnSO₄ HnSO ₄ 1,01.0 SS UaIIO₃ UaIIO ₃ 0,0005 g0.0005 g SnCl₂ SnCl ₂ 1,01.0 δδ KH₂PO₄ KH ₂ PO ₄ 0,00012 g0.00012 g CuSO₄ CuSO ₄ 0,50.5 SS MgSO₄*7H₂OMgSO ₄ .7H ₂ O 0,00011 g0.00011 g CoCl₂ CoCl ₂ 0,0150,015 SS CaCl₂ CaCl ₂ 0,00012 g0.00012 g Ha₂MoHa ₂ mo

Die Temperatur der Kultur ?jird auf 30 ⁰C und der pH-Wert auf 6,8 eingestellt und konstant gehalten. Die gerührte Kultur ^ird mit 1,5 1 Luft pro Minute und pro Liter Medium versorgt. Fach 6 Tagen ist der Zucker abgebaut.The temperature of the culture? Jird to 30 ⁰ C and the pH adjusted to 6.8 and kept constant. The stirred culture is supplied with 1.5 l of air per minute and per liter of medium. Tray 6 days, the sugar is mined.

Pro Liter Kulturmedium wurden etwa 20 g Polysaccharid ausgeschieden, das au etwa 50 % aus Hhamnose, 30 % Glucose, 15 % Galactose so^ie etyja 5 % ?ucose bestand.About 20 g of polysaccharide were excreted per liter of culture medium, which consisted of about 50 % of hhamnose, 30 % glucose, 15 % galactose and 5 % γ-glucose.

Das Polysaccharid wurde mit wäßriger Salzsäure bei et^ua 100 ⁰C im Verlauf von 6 Stunden hydrolysiert. Anschließf vsurde der Chlorwasserstoff durch Destillation entfernt.The polysaccharide was hydrolysed with aqueous hydrochloric acid at inter alia, et ^ 100 ⁰ C in the course of 6 hours. Then the hydrogen chloride was removed by distillation.

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Das neutrale Hydrolysat -wird auf eine Zuckerkonzentration von etwa 20 % mit Wasser verdünnt und 1 % Hefeextrakt, 0,6 % Harnstoff, 0,12 % KH₂PO^ und 0,018 % Ha₂HPO^ zugesetzt. Hach Einstellung des pH-Wertes auf 6,0 bis 6,5 wird mit einer Hefe der Axt Saccnaromyces cerevisiae beimpft, die die Glucose und Galactose aus dem gespaltenen Polysaccharid unter anaeroben Bedingungen bei 30 bis 37 ⁰G zu Ethanol vergärt und die Desoxyzucker zurückläßt.The neutral hydrolyzate is diluted to a sugar concentration of about 20 % with water and 1 % yeast extract, 0.6% urea, 0.12 % KH ₂ PO ^ and 0.018 % Ha ₂ HPO ^ added. Hach adjustment of the pH to 6.0 to 6.5 is inoculated with a yeast of the ax Saccnaromyces cerevisiae, which fermented the glucose and galactose from the cleaved polysaccharide under anaerobic conditions at 30 to 37 ⁰ G to ethanol and leaves the deoxy sugar.

Im Kulturmedium kann anstelle der Glucose als Zucker auch Saccharose, Lactose, Galactose, Mannose, Fructose oder Molke eingesetzt werden, wobei im Falle der Molke nach Bestimmung des Lactosegehaits ebenfalls etwa 50g Zucker pro Liter eingesetzt werden. Aufgrund des Eiweißgehaltes der Molke wird der Anteil an Cornsteep und NaN0_ entsprechend reduziert. Man erhält so zwischen 15 und 25 g Polysaccharid pro Liter, die zu 40 bis 60 % aus Rhamnose, 20 bis 40 % aus Glucose, 10 bis 20 % aus Galactose sowie 1 bis 5 % Fucose bestehen.In the culture medium sucrose, lactose, galactose, mannose, fructose or whey can be used instead of the glucose as sugar, wherein in the case of whey after determining the Lactosegehaits also about 50g of sugar per liter are used. Due to the protein content of the whey, the proportion of Cornsteep and NaN0_ is correspondingly reduced. This gives between 15 and 25 g of polysaccharide per liter, which consist of 40 to 60 % of rhamnose, 20 to 40 % of glucose, 10 to 20 % of galactose and 1 to 5 % of fucose.

Die Hydrolyse kann anstelle von Salzsäure auch mit Schwefeisäure, Phosphorsäure oder Essigsäure bei 80 bis 120 C im Verlauf von 4 bis 10 Stunden erfolgen. Nach der Hydrolyse kann die Essigsäure - wie die Salzsäure - durch Destillation entfernt werden, während Schwefelsäure und Phosphorsäure mit Hilfe von Calciumionen abgetrennt werden können.The hydrolysis can be carried out instead of hydrochloric acid with sulfuric acid, phosphoric acid or acetic acid at 80 to 120 C in the course of 4 to 10 hours. After the hydrolysis, the acetic acid, like the hydrochloric acid, can be removed by distillation, while sulfuric acid and phosphoric acid can be separated by means of calcium ions.

Die Abtrennung der Glucose und Galactose aus dem Hydrolysat durch Vergärung kann anstelle von Saccharomyces cerevisiae auch mit anderen Hefearten, einzeln oder gemeinsam, erfolgenThe separation of the glucose and galactose from the hydrolyzate by fermentation can be carried out instead of Saccharomyces cerevisiae with other yeast species, individually or together

Aus dem Hydrolysat kann die Glucose auch durch das Enzym Glucoseoxvdase in Gegenwart von Sauerstoff in Gluconsäure überführt werden, die bei pH 11 bis 12 mit Calcium- oder Magnesium-Ionen in Form der schwerlöslichen Salze abgetrennt werden kann. Hierbei bleiben die nicht umgesetzten Zucker im überstand gelöst., woraus sie isoliert und, falls erforderlich, nach bekannten Methoden getrennt werden können.From the hydrolyzate, the glucose can also be converted by the enzyme Glucoseoxvdase in the presence of oxygen in gluconic acid, which can be separated at pH 11 to 12 with calcium or magnesium ions in the form of sparingly soluble salts. In this case, the unreacted sugars remain dissolved in the supernatant, from which they can be isolated and, if necessary, separated by known methods.

Example 2

Beispiel 1 wird in der Form abgewandelt, daß das Kulturmedium anstelle von NaNO₃ und KH₂PG₁. pro Liter 1 g Hefeextrakt und anstelle der 1,5·g Cornsteep 2 g enthält. Weiterhin wird anstelle von Alcaligenes sp. Enterobacter sakazaki eingesetzt. Die Fermentationsparameter stimmen mit Beispiel 1 überein.Example 1 is modified in the form that the culture medium instead of NaNO ₃ and KH ₂ PG ₁ . 1 g yeast extract per liter and 2 g instead of the 1.5 g cornsteep. Furthermore, instead of Alcaligenes sp. Enterobacter sakazaki used. The fermentation parameters are consistent with Example 1.

In der Kultur werden nach 6 Tagen 16 g Polysaccharid pro Liter gebildet, wobei die Glucose zu 95 % abgebaut ist. Das Polysaccharid enthält etwa 30 % Fucose.In the culture 16 g of polysaccharide per liter are formed after 6 days, wherein the glucose is degraded to 95 % . The polysaccharide contains about 30 % fucose.

Arbeitet man anstelle von Glucose mit den anderen in Beispiel 1 genannten Zuckern bzw. Molke, so erhält man innerhalb von 5 bis 7 Tagen pro Liter Kulturmedium 12 bis 18 g Polysaccharid, das 20 bis 40 % Fucose enthält.If, instead of glucose, the other sugars or whey mentioned in Example 1 are used, 12 to 18 g of polysaccharide containing 20 to 40 % of fucose are obtained per liter of culture medium within 5 to 7 days.

Example 3

J Das nach Beispiel 1 der EP-PS 12 552 erhaltene rhamnosereiche Exopolysaccharid wird gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet und die Rhamnose isoliert J rhamnosereiche The exopolysaccharide obtained according to Example 1 of EP-PS 12552 is worked up according to Example 1 and the rhamnose isolated

15 15

Example 4

Nach den Angaben der US-PS 4 350 769 wird ein fucosereiches Exopolysaccharid erzeugt und gemäß Beispiel 1 aufgearbeitet 20According to US Pat. No. 4,350,769, a fucose-rich exopolysaccharide is produced and worked up in accordance with Example 1 20

Claims

ι? σ 12 sr / 62 584 11 invention spoke

1. A process for the production of Ehamnose or Fucose, characterized in that one produces by enrichment with bacteria of the genus Älcaligenes, Klebsiella, Pseudomonas or Snterobacter an extracellular polysaccharide rich in these desosaccharides, hydrolyzes this and separates the formed deoxysugars.

2. The method of item 1, characterized by _a d,

that one produces a rnamnosereich.es polysaccharide with bacteria of the genus Älcaligenes or Ps eudomonas,

3 "Method according to item 1 or 2, characterized in that bacteria of the Pseudomonas strain ATGC 31 451 are used,

4, Method according to item 1, characterized in that one produces a fucosereiches polysaccharide with bacteria of the genus Snterobacter or Klebsieila.

5. The method according to item 4, characterized in that bacteria of the species Snterobacter sakazaki be used.

6, method according to item 4, characterized in that bacteria of the species Snterobacter cloacae are used.

7. The method according to item 4, characterized in that bacteria of the species Eüebsiella pneumoniae be used.

AP G 12 IT / 25319 φ 62 684 11

8. The method according to item 7> characterized in that 'bacteria of the strain ATGC 31 488 are used.

9 «method according to one or more of the items 1 to 8, characterized in that the fermentation is carried out under aerobic conditions at 25 to 40 ⁰ C and in a pH range of 6 to 7» 5 and the polysaccharide formed at elevated temperature with · Acids are hydrolyzed «

10. Method near point 9, characterized in that the hydrolysis takes place at 80 to 120 ⁰ G.

11. Method according to one or more of the items 1 to 10, characterized in that the separation of the desosugar sugar formed takes place by chromatography,

12. Method according to one or more of items 1 to 10, characterized in that the separation of the desoxy sugar formed takes place by adsorption.

13 * Method according to one or more of the items 1 to 10, characterized in that the - separation of the formed deoxy sugar is carried out by fermentative degradation of the by-products.