DE2921052C2 - - Google Patents
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Description
Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur
mikrobiologischen Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen
unter Verwendung eines bei aerober Gärung
zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil
von 12-Desoxyherzglykosiden fähigen
neuen Mikroorganismenstammes (vgl. Anspruch 1).
Es ist bekannt, daß die handelsüblichen Herzmittel
Lanatosid-C, Acetyldigoxin und Digoxin aus den Blättern
der Pflanze Digitalis lanata gewonnen werden. Die Blätter
dieser Pflanze enthalten ein Gemisch der Glykoside
Lanatosid-A, Lanatosid-B, Lanatosid-C und Lanatosid-D.
Es kann aber unter der Einwirkung der vorliegenden
hydrolysierend wirkenden Enyzme auch eine Abspaltung des
Glykoseteiles und der Acetylgruppe eintreten, wodurch dann
neben den erwähnten primären Glykosiden auch die 4 entsprechenden
sekundären Glykoside Digitoxin, Gitoxin,
Digoxin und Diginatin in der Droge zugegen sind. Das Mengenverhältnis
der primären zu den sekundären Glykosiden
schwankt in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen der
Pflanze, was aber vom Gesichtspunkt der Verfahrenstechnik
beziehungsweise Technologie der Gewinnung der Glykoside
überhaupt nicht vorteilhaft ist. Dabei bleibt das
Lanatosid-A bei der Gewinnung der als Arzneimittel verwendbaren
in der 12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden
Glykoside als unbrauchbares Nebenprodukt zurück.
Zur Hydroxylierung des Aglykonteiles von 12-Desoxyherzglykosiden
können nach den Schrifttumsangaben verschiedene
Mikroorganismen verwendet werden. So wurden für diesen
Zweck zum Beispiel Fusarium lini (Helv. Chim. Acta. 41
[1960], 297), Gibberella fujikuroii und Helicostylum piriforme
(Nature 184 [1959], 469), Gibberella saubinetti
(Chem. Pharm. Bull. 8 [1960], 530), Calonectria decora und
Nigrospora sphaerica (Abstr. Symposium on the Chem. of
Digitalis Cardiac Glycosides [1960], 114) vorgeschlagen.
Mit der Hydroxylierung des therapeutisch anwendbaren
Herzglykosides Digitoxin hat sich aber nur eine japanische
Forschergruppe, von welcher die Mikroorganismenstämme
Streptomyces owashiensis, Streptomyces diastatochromogenes,
Mortierella isabellina, Trichocladium asperum und Circinella
muscae mit Erfolg zur Herstellung von Digoxin verwendet wurden
(Agr. Biol. Chem. 29 [1965], 783), befaßt.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches
und im Großbetrieb wirtschaftlich durchführbares
mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von therapeutisch
wertvollen, in der 12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden
Herzglykosiden unter Verwendung eines bei aerober Gärung
zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von
12-Desoxyherzglykosiden fähigen
neuen Mikroorganismenstammes zu schaffen.
Die Erfindung beruht darauf, daß es überraschenderweise
gelungen ist, aus einem Waldboden einen solchen Streptomycesstamm
zu isolieren und heranzuzüchten, welcher die Fähigkeit
hat, bei aerober Gärung beziehungsweise Fermentation eine
12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden
einzuführen. Taxonomisch ist der neue Stamm auf
Grund seiner nachfolgend ausführlich beschriebenen Eigenschaften
als Streptomyces praecox anzusehen (vergleiche
Waksman: The Actinomycetes, Vol. 2, 1961).
Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur
Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen der
allgemeinen Formel
worin
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel
in welchletzterer R₁ Wasserstoff
oder einen Acetylrest bedeutet,
darstellt,
welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Cardenolidverbindungen
der allgemeinen Formel
worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen
Medium mit Streptomyces praecox MNG 127 in Berührung gebracht
und dann das erhaltene, biologisch aktive, hydroxylierte
Produkt aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird.
Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, bei
aerober Gärung zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in
den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähige, aus
Waldboden erhaltene Stamm Streptomyces praecox wurde am
4. Juni 1974 unter der Bezeichnung Streptomyces praecox
MNG 127 bei der Nationalen Stammsammlung des ungarischen
Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos
Közeg´szs´gügyi Int´zet) hinterlegt und hat die folgenden
charakteristischen Eigenschaften:
Morphologie: Die aus den Hyphen der Luftmyzelien entspringenden
Sporenträger zeigen monopodiale Verzweigungen,
die einzelnen Zweige sind kurz, zu etwa 50% sind sie rankenförmig
und zu 50% bestehen sie aus 2 bis 3 Schleifen aufweisenden lockeren oder kompakten Spiralen, die Sporen
sind glattwandig und ellipsoidförmig, ihre Größe ist
0,95 bis 1,00 µm×1,10 bis 1,28 µm;
an Saccharose-Nitrat-Agar nur zerstreutes Wachstum der Kolonien, das Luftmyzel ist cremefarbig, die Nährbodenmyzelien sind hell zimtfarbig, kein lösliches Pigment wird gebildet;
an Tyrosin-Agar kein Wachstum;
an Nähr-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sind farblos mit wachsartiger Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Glucose/Asparagin-Agar sehr schnelles Wachstum, die Luftmyzelien haben eine staubige Oberfläche und spinnengewebeartige Form, sowohl die Luftmyzelien, als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig (ist eine braune Farbe), es entsteht kein lösliches Pigment;
an Bouillon-Agar schnelles Wachstum der Kolonien, es entsteht kein Luftmyzel, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig, kein lösliches Pigment diffundiert in den Agar;
an Kartoffel/Glucose-Agar schnelles Wachstum, die Luftmyzelien sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappfarbig, die Nährbodenmyzelien sind drapp- beziehungsweise zimtfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Sabouraud/Glucose-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich mit weißer Farbe aus, die Nährbodenmyzelien sind cremefarbig, kein lösliches Pigment;
an Löfflerschem geronnenem Molkenährboden gutes Wachstum, keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen wie Bakterienkolonien aus und haben eine wachsartige Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal;
an Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle gutes Wachstum;
positive Gelatineverflüssigung;
an Kartoffelschnitten schnelles Wachstum, zimtfarbige Luftmyzelien, kein lösliches Pigment;
an Blut-Agar graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche mit Durchmessern von 1 mm, nach 1wöchiger Bebrütung bei 26°C keine Sporenbildung, schwache β-Hämolyse;
Kohlenstoffquellenassimilation
an Saccharose-Nitrat-Agar nur zerstreutes Wachstum der Kolonien, das Luftmyzel ist cremefarbig, die Nährbodenmyzelien sind hell zimtfarbig, kein lösliches Pigment wird gebildet;
an Tyrosin-Agar kein Wachstum;
an Nähr-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sind farblos mit wachsartiger Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Glucose/Asparagin-Agar sehr schnelles Wachstum, die Luftmyzelien haben eine staubige Oberfläche und spinnengewebeartige Form, sowohl die Luftmyzelien, als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig (ist eine braune Farbe), es entsteht kein lösliches Pigment;
an Bouillon-Agar schnelles Wachstum der Kolonien, es entsteht kein Luftmyzel, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig, kein lösliches Pigment diffundiert in den Agar;
an Kartoffel/Glucose-Agar schnelles Wachstum, die Luftmyzelien sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappfarbig, die Nährbodenmyzelien sind drapp- beziehungsweise zimtfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Sabouraud/Glucose-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich mit weißer Farbe aus, die Nährbodenmyzelien sind cremefarbig, kein lösliches Pigment;
an Löfflerschem geronnenem Molkenährboden gutes Wachstum, keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen wie Bakterienkolonien aus und haben eine wachsartige Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal;
an Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle gutes Wachstum;
positive Gelatineverflüssigung;
an Kartoffelschnitten schnelles Wachstum, zimtfarbige Luftmyzelien, kein lösliches Pigment;
an Blut-Agar graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche mit Durchmessern von 1 mm, nach 1wöchiger Bebrütung bei 26°C keine Sporenbildung, schwache β-Hämolyse;
Kohlenstoffquellenassimilation
D-Glucosegute Assimilation
D-Galaktosegute Assimilation
Saccharosegute Assimilation
Maltosesehr gute Assimilation
Lactosesehr gute Assimilation
Raffinose-
Sorbose-
Cellobiosegute Assimilation
Trehalosesehr gute Assimilation
Melibiose-
Melecitoseschwache Assimilation
lösliche Stärkegute Assimilation
D-Xylosesehr gute Assimilation
L-Arabinosegute Assimilation
L-Rhamnose-
Galaktit-
D-Mannitgute Assimilation
Inositsehr gute Assimilation
Salicinim Nähr-Agar gut diffundierendes braunes Pigment
α-Methyl-D-glucosidschwache Assimilation
Der wichtigste Vorteil der Erfindung besteht darin,
daß sie die wirtschaftliche Herstellung von therapeutisch
wirksamen Herzglykosiden ermöglicht. Bei der Gewinnung von
Lanatosid C aus der Pflanze Digitalis lanata bleiben
immer große Mengen des therapeutisch wertlosen Lanatosides A
zurück und bei der Herstellung von Digoxin wird das
therapeutisch ebenfalls wertlose Digitoxin als Nebenprodukt
erhalten. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen
Verfahrens können aus diesen wertlosen Nebenprodukten
therapeutisch wertvolle Herzglykoside erhalten werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
kann der Stamm Streptomyces praecox MNG 127
unter Verwendung von Nährbodenbestandteilen, deren
Eignung zum Züchten von Streptomyceten bekannt ist, gezüchtet
werden. So können als Energiequellen vorteilhaft
Glucose, Maltose, Galaktose, Lactose, Stärke und/oder
Dextrin eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können
organische Stoffe natürlicher Herkunft, wie Caseinhydrolysat,
Sojamehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Peptone und/oder
Hefeauszüge, sowie ferner synthetische Produkte, wie
Aminosäuren, Harnstoff oder Ammoniumsalze, dienen. Die
Nährbodenbestandteile können in verschiedenen Kombinationen
verwendet werden. Es ist zweckmäßig, im Nährboden auch
anorganische Salze, insbesondere Phosphate und/oder
Kalium-, Calcium-, Magnesium- und/oder Eisensalze, mit zu
verwenden. Die Mengen und das Mengenverhältnis der Kohlenstoffquelle
und der Stickstoffquelle im Nährboden können
innerhalb weiter Grenzen (von etwa 0,5 bis 4 Gew.-%) variiert
werden. Das Absinken des pH-Wertes der Gärflüssigkeit kann
durch einen Zusatz von Calciumcarbonat im Nährboden verhindert
werden.
Die Gärung kann von 20 bis 40°C, insbesondere aber bei
der für Streptomyceten günstigen Temperatur von 28 bis 30°C,
durchgeführt werden. Die Züchtung kann in geschüttelten Erlenmeyerkolben
oder in mit einem Rührwerk ausgerüsteten Gärvorrichtungen
erfolgen. Die Luftzufuhr kann durch kräftiges
Schütteln der Kolben beziehungsweise in Gärvorrichtungen
durch Einblasen von Luft in das Gärmedium erfolgen. Die
hydroxylierende Aktivität der Mikroorganismen kann durch
mehrmaliges Umimpfen der Kultur auf frische Nährböden gesteigert
werden.
Das zu hydroxylierende Substrat kann zu der schon voll
entwickelten Kultur oder während der Phase des kräftigen
Wachstums zugegeben werden; dasselbe Ergebnis wird aber
auch dann erzielt, wenn das Substrat schon vor dem Anfang
des Wachstums dem Nährboden zugesetzt wird, da das Wachstum
der Kultur durch die Gegenwart von Herzglykosiden
nicht beeinflußt wird. Es kann ferner auch in der Weise gearbeitet
werden, daß die ausgewachsene Kultur vom Nährboden
durch Filtrieren abgetrennt und in einer Pufferlösung suspendiert
wird und dann das Substrat dieser Suspension
zugesetzt wird. Die Sauerstoffversorgung des Reaktionsgemisches
und die geeignete Temperatur müssen aber in jedem
Fall sichergestellt werden.
Als als Substrat dienende Cardenolidverbindungen
können beliebige 12-Desoxyherzglykoside der allgemeinen
Formel II oder auch die entsprechenden Aglycone selbst,
wie Digitoxin, α-Acetyldigitoxin oder Digitoxigenin, eingesetzt
werden. Die als Substrat einzusetzende Cardenolidverbindung
wird zweckmäßig in Lösung in einem mit Wasser
mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol
oder Methanol, dem Gärmedium zugeführt; die Umsetzung kann
aber auch dann mit gutem Ergebnis durchgeführt werden,
wenn die feingepulverte Verbindung in Suspension in Wasser
dem Gärmedium zugesetzt wird.
Vorteilhaft wird als Cardenolidverbindung der allgemeinen
Formel II Digitoxin oder a-Acetyldigitoxin eingesetzt.
Die als Produkt des Gärverfahrens erhaltene in der
12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisende Verbindung
der allgemeinen Formel I kann durch Extrahieren mit einem
mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft
Chloroform, Dichlormethan oder Äthylacetat, aus der Gärflüssigkeit
gewonnen werden. Nach dem Einengen der so erhaltenen
organischen Lösung und nach dem Chromatographieren
des Rückstandes kann das erhaltene rohe Produkt durch Umkristallisieren
gereinigt werden.
Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele
näher erläutert.
Es wurde der Stamm Streptomyces praecox MNG 127 an
einem
1,0 Gew.-% Glucose
0,2 Gew.-% Casamin
0,1 Gew.-% Fleischextrakt
0,01 Gew.-% Lanatosid A und
1,7 Gew.-% Agar
0,2 Gew.-% Casamin
0,1 Gew.-% Fleischextrakt
0,01 Gew.-% Lanatosid A und
1,7 Gew.-% Agar
enthaltenden Nährboden gezüchtet. Eine Abschwemmung der
auf Schrägagar bereiteten Sporen in 5 cm³ destilliertem
Wasser wurde als Impfstoff für die submerse Kultur verwendet.
100 cm³ einer 2 Gew.-% Sojamehl, 3 Gew.-% Glucose und
0,5 Gew.-% Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösung
(Nährlösung "S") wurden mit 1 cm³ der obigen Suspension
beimpft. Vor dem Impfen wurde die Nährlösung, deren
pH-Wert 7 war, 25 Minuten lang bei 120°C sterilisiert.
Die Züchtung der Streptomyceten erfolgte bei 28°C auf
einem Schütteltisch mit einer Amplitude von 2,5 cm und
300 Umdrehungen/Minute. Nach 2 Tagen dauernder Bebrütung
wurde die Kultur mit einer Lösung von 50 mg Digitoxin in
2 cm³ Methanol versetzt und sie wurde bei 37°C weitergeschüttelt.
Das Fortschreiten der biochemischen Reaktion
wurde durch die dünnschichtchromatographische Analyse des
Chloroformauszuges von täglich entnommenen Proben des
Mediums verfolgt. Zu diesem Zweck wurden Platten von Kieselgel
HF₂₅₄ verwendet; als Laufmittel
diente ein Gemisch von Cyclohexan, Äthylacetat und absolutem
Äthanol im Volumverhältnis von 35 : 55 : 10. Die Flecke
des Umsetzungsproduktes wurden durch Verwendung einer
essigsauren Anisaldehydlösung bei 105°C sichtbar gemacht.
In dem auf Grund der dünnschichtchromatographischen Analyse
als vom Gesichtspunkt der Digoxinbildung am günstigsten erscheinenden
Zeitpunkt, welcher etwa 90 Stunden nach der
Zugabe des Digitoxines lag, wurde die Gärung beendet. Aus
den aus 40 geschüttelten Kolben erhaltenen 4 l Gärflüssigkeit
wurden die abgesetzten Bestandteile durch Zentrifugieren
abgetrennt und mit 500 cm³ Methanol extrahiert und
die methanolische Lösung wurde zur Trockne eingedampft.
Die beim Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit
wurde 3mal mit je 3 l Chloroform extrahiert und die Auszüge
wurden vereinigt. In dieser vereinigten Chloroformlösung
wurde auch der Trockenrückstand des obigen Methanolauszuges
gelöst und die Lösung wurde über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und bei 40°C unter Vakuum eingedampft.
Der ölige Rückstand wurde in 10 cm³ eines Gemisches
von Chloroform und Methanol im Volumverhältnis von 1 : 1
aufgenommen und auf 20 g Silicagel (zur Säulenchromatographie
geeignete Qualität) auftrocknen gelassen. Das das
rohe Produkt aufweisende Silicagel wurde in eine Säule
mit einer Höhe von 70 cm und einem Durchmesser von 4 cm
eingebracht. Das Chromatographieren wurde mit trockenem
Träger begonnen und in aufsteigender Richtung durchgeführt.
Anfangs wurde als Lösungsmittel ein Gemisch von Cyclohexan,
Äthylacetat und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von
35 : 55 : 2,5 verwendet, dessen Volumverhältnis dann linear
zu 35 : 55 : 10 geändert wurde, bis ein Eluatvolumen von
1100 cm³ erreicht war. Danach wurde das Volumverhältnis
der Lösungsmittel während des weiteren Eluierens unverändert
gelassen, aber die anfängliche Durchflußgeschwindigkeit
von 30 cm³/Stunde auf 20 cm³/Stunde vermindert. Das unverändert
gebliebene Digitoxin erschien in den Fraktionen
von 960 bis 1070 cm³, dann wurde aus den Fraktionen von
1070 und 1150 cm³ das Hauptumsetzungsprodukt Digoxin und
aus den nachfolgenden Fraktionen das ebenfalls gebildete
7β-Hydroxydigoxin erhalten.
Die Digoxin enthaltenden Fraktionen wurden 2 Tage lang
auf -20°C gehalten; während dieser Zeit schied sich das
rohe Digoxin (330 mg) in Form von nadelförmigen Kristallen
aus. Die Mutterlauge wurde unter Vakuum eingedampft, der
ölige Rückstand wurde in 5 cm³ Chloroform gelöst und der
Lösung wurde Cyclohexan bis zur beginnenden Trübung zugetropft.
Die Trübung wurde durch die Zugabe von einigen
Tropfen Methanol aufgehoben und das Gemisch wurde auf
-20°C abgekühlt und zum Kristallisieren stehengelassen.
In 2 Tagen schieden sich 140 mg Digoxin in kristalliner
Form aus. Die beiden rohen Produktfraktionen wurden vereinigt
und aus heißem 80%igem Methanol umkristallisiert.
So wurden 450 mg kristallines Digoxin mit einem Schmelzpunkt
von 245 bis 250°C und einem [α]-Wert von +10,8°
(c=1, Pyridin) erhalten.
Ultrarotspektrum (KBr):
3400 cm-1,3510 cm-1, 3090 cm-1,1720 cm-1, 1620 cm-1,1400 cm-1, 1270 cm-1, 860 cm-1 und 820 cm-1.
3400 cm-1,3510 cm-1, 3090 cm-1,1720 cm-1, 1620 cm-1,1400 cm-1, 1270 cm-1, 860 cm-1 und 820 cm-1.
Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch
saure Hydrolyse hergestellte Dipoxigenin zeigte die folgenden
Spektraldaten:
Spitzenwerte des Massenspektrums:
390 (M⁺),372 (30%), 354 (70%),262 (42%), 219 (40%),201 (100%), 147 (40%),und 111 (41%).
390 (M⁺),372 (30%), 354 (70%),262 (42%), 219 (40%),201 (100%), 147 (40%),und 111 (41%).
UV-Spektrum (in konzentrierter Schwefelsäure):
λ max. :
228 nm, 317 nm und 388 nm.
λ max. :
228 nm, 317 nm und 388 nm.
Magnetisches Kernresonanzspektrum [NMR] (in Dimethylsulfoxid):
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,85 (3-H) ppm,
4,05 s (14-OH) ppm,
4,2 d (3-OH) ppm,
4,6 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,85 (3-H) ppm,
4,05 s (14-OH) ppm,
4,2 d (3-OH) ppm,
4,6 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.
Aus dem Eindampfrückstand der 7b-Hydroxydigoxin enthaltenden
Fraktionen wurden nach dem Umkristallisieren aus
80%igem Methanol 175 mg kristallines Produkt mit einem
Schmelzpunkt von 210 bis 217°C und einem [α]-Wert von
+16,1° (c=1, Pyridin) erhalten.
Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure
Hydrolyse hergestellte 7β-Hydroxydigoxigenin zeigte die folgenden
Spektraldaten:
Spitzenwerte des Massenspektrums:
403 (M⁺, 3%), 281 (36%), 278 (30%) und 163, 145 (43%).
403 (M⁺, 3%), 281 (36%), 278 (30%) und 163, 145 (43%).
Ultrarotspektrum (KBr):
3570 cm-1,3370 cm-1, 2910 cm-1,1710 cm-1, 1600 cm-1,1430 cm-1, 1310 cm-1, 860 cm-1 und 825 cm-1.
3570 cm-1,3370 cm-1, 2910 cm-1,1710 cm-1, 1600 cm-1,1430 cm-1, 1310 cm-1, 860 cm-1 und 825 cm-1.
Magnetisches Kernresonanzspektrum [NMR] (in Dimethylsulfoxid):
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,9 (3-H) ppm,
4,25 d (3-OH) ppm,
4,65 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm,
5,3 s (14-OH) ppm,
5,5 d (7-OH) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,9 (3-H) ppm,
4,25 d (3-OH) ppm,
4,65 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm,
5,3 s (14-OH) ppm,
5,5 d (7-OH) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.
UV-Spektrum (in konzentrierter Schwefelsäure):
λ max. :
230 nm, 380 nm und 460 nm.
λ max. :
230 nm, 380 nm und 460 nm.
Die Züchtung des Stammes Streptomyces praecox MNG 127
und die mikrobiologische Umsetzung des zugesetzten Substrates
wurden unter den im Beispiel 1 beschriebenen
Bedingungen durchgeführt. Zu je 100 cm³ ausgewachsene Kultur
wurden als Substrat 20 mg α-Acetyldigitoxin in Lösung in
1 cm³ Äthanol zugegeben. Die Gärung wurd 4 Tage lang fortgesetzt,
dann wurde das erhaltene Produkt in der im Beispiel
1 beschriebenen Weise extrahiert und chromatographisch
gereinigt, jedoch mit dem Unterschied, daß der Lösungsmittelgradient
in der Weise eingestellt wurde, daß das anfängliche
Volumverhältnis von 35 : 55 : 2,5 des Gemisches von Cyclohexan,
Äthylacetat und absolutem Äthanol bis zum Abfließen
von 1600 cm³ Eluat auf 35 : 55 : 8 verdünnt war; im weiteren
Verlauf des Eluierens wurde dann dieses Verhältnis beibehalten.
Die von 1550 bis 1770 cm³ Eluatvolumen gesammelten
Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft; der Rückstand
wurde aus 80%igem Methanol kristallisiert; das erhaltene
kristalline Produkt konnte auf Grund seiner dünnschichtchromatographischen
Eigenschaften als α-Acetyldigoxin identifiziert
werden. Das Produkt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie
weiter gereinigt. Das so erhaltene analytisch reine
α-Acetyldigoxin hatte einen Schmelzpunkt von 224 bis 229°C
und einen [α]-Wert von 18,2° (c=1, Pyridin).
Das nach der Hydrolyse dieses Produktes erhaltene
Genin zeigte dieselben physikalisch-chemischen Daten wie
das nach dem Beispiel 1 erhaltene Digoxigenin.
Von einer an einen Kartoffelextrakt und Glucose enthaltendem
Schrägagar gewachsenen 5 bis 6 Wochen alten Kultur
des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 wurde mit 10 cm³
sterilem destilliertem Wasser eine Suspension hergestellt.
Mit je 1 cm³ dieser Suspension wurden in 500 cm³ Erlenmeyerkolben
je 100 cm³ einer 0,8 Gew.-% staubförmigen Sojaextrakt
und 3 Gew.-% Glucose enthaltenden sterilisierten Nährlösung
(PS-Nährlösung) beimpft. Die Nährlösung, deren
pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,0 war, wurde vor dem Impfen
45 Minuten bei 120°C sterilisiert; die Sterilisierung der
in der Nährlösung zu verwendenden Glucose erfolgte getrennt
in 50%iger Lösung 30 Minuten bei 120°C.
Der staubförmige Sojaextrakt wurde wie folgt hergestellt:
Extrahiertes Sojamehl wurde durch ein Sieb mit
einer Maschenweite von 0,4 mm gesiebt und in Leitungswasser
suspendiert. Die 10% Mehl enthaltende Suspension wurde
1 Stunde unter einem Druck von 1 atü erhitzt, dann auf
37°C abgekühlt und mit 0,4% Pankreatin 2 Stunden lang
unter ständigem Rühren hydrolysiert, wobei der pH-Wert des
Reaktionsgemisches mit nach Bedarf zugesetztem Natriumhydroxyd
während der Hydrolyse auf 7,5 bis 8,0 gehalten
wurde. Nach der Beendigung der Hydrolyse wurde das Gemisch
zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit unter Zerstäubung
getrocknet. Der Stickstoffgehalt des so gewonnenen
pulverförmigen Sojaextraktes betrug 9%.
Die Bebrütung des Stammes Streptomyces praecox MNG 127
im beimpften Kolben erfolgte bei 32°C auf einem Schütteltisch
mit einer Amplitude von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute.
Mit der unter diesen Bedingungen in 24 Stunden
voll ausgewachsenen 400 cm³ Schüttelkultur wurden in
einer 10 l Laboratoriumsgärvorrichtung aus Glas 5 l der
oben genannten Nährlösung (PS-Nährlösung), welche außer dem
Sojaextrakt und der Glucose in diesem Fall auch 0,2 Gew.-%
Palmöl zur Verhinderung des Schäumens enthielt, beimpft.
Die Gärung wurde bei 32°C unter Belüftung mit 5 l/Minute
steriler Luft und unter Rühren mit 350 Umdrehungen/Minute
1 Tag fortgesetzt, dann wurde die Temperatur der Kultur
auf 37°C erhöht und es wurde eine durch Filtrieren sterilisierte
Lösung von 2,5 g Digitoxin in 100 cm³ Methanol zugesetzt.
Nach 2 Tagen langem Bebrüten wurdedie Gärflüssigkeit
filtriert und das Filtrat 2mal mit je ¹/₃ seines Volumens
Benzol und anschließend 3mal mit je ¹/₃ seines Volumens
Chloroform extrahiert. Aus dem Chloroformauszug wurden
750 mg Digoxin und 440 mg 7β-Hydroxidigoxin erhalten.
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen
der allgemeinen Formel
worin
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel in welchletzterer R₁ Wasserstoff oder einen Acetylrest bedeutet, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen Medium mit Streptomyces praecox MNG 127 in Berührung bringt und dann das erhaltene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel in welchletzterer R₁ Wasserstoff oder einen Acetylrest bedeutet, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen Medium mit Streptomyces praecox MNG 127 in Berührung bringt und dann das erhaltene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet,
daß man als Cardenolidverbindung der allgemeinen
Formel II Digitoxin oder α-Acetyldigitoxin einsetzt.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HU78GO1405A HU175474B (hu) | 1978-05-23 | 1978-05-23 | Novyjj mikrobiologicheskijj sposob poluchenija proizvodnykh kardenolida soderzhahhikh gruppu 12-beta-gidroksila |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE2921052A1 DE2921052A1 (de) | 1980-01-17 |
DE2921052C2 true DE2921052C2 (de) | 1987-10-29 |
Family
ID=10996859
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE19792921052 Granted DE2921052A1 (de) | 1978-05-23 | 1979-05-23 | Bei aerober gaerung zur einfuehrung einer 12 beta -hydroxygruppe in den aglykonteil von 12-desoxyherzglykosiden faehiger aus waldboeden erhaeltlicher mikroorganismenstamm und verfahren zur herstellung von 12 beta -hydroxycardenolidverbindungen |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
CH (1) | CH642978A5 (de) |
DD (1) | DD143927A5 (de) |
DE (1) | DE2921052A1 (de) |
GB (1) | GB2023144B (de) |
HU (1) | HU175474B (de) |
NL (1) | NL7904103A (de) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
HU176250B (en) * | 1978-10-30 | 1981-01-28 | Gyogyszerkutato Intezet | Process for producing mikrobiologically 12-beta-hydroxycardenolide derivatives |
WO1996015253A1 (de) * | 1994-11-14 | 1996-05-23 | Schering Aktiengesellschaft | Verfahren zur herstellung von 1-hydroxymethyl-1.4-androstadien-3.17-dion |
-
1978
- 1978-05-23 HU HU78GO1405A patent/HU175474B/hu not_active IP Right Cessation
-
1979
- 1979-05-21 DD DD21303179A patent/DD143927A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-22 CH CH477179A patent/CH642978A5/de not_active IP Right Cessation
- 1979-05-23 GB GB7918023A patent/GB2023144B/en not_active Expired
- 1979-05-23 DE DE19792921052 patent/DE2921052A1/de active Granted
- 1979-05-23 NL NL7904103A patent/NL7904103A/xx not_active Application Discontinuation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
GB2023144A (en) | 1979-12-28 |
DE2921052A1 (de) | 1980-01-17 |
GB2023144B (en) | 1982-11-03 |
HU175474B (hu) | 1980-08-28 |
DD143927A5 (de) | 1980-09-17 |
CH642978A5 (de) | 1984-05-15 |
NL7904103A (nl) | 1979-11-27 |
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