DE2921052C2

DE2921052C2 -

Info

Publication number: DE2921052C2
Application number: DE19792921052
Authority: DE
Inventors: Maria Natonek; Karoly Albrecht; Zoltan Dr. Szeleczky; Ernoe Dr. Szarka; Attila Dr. Szentirmai; Geb. Cserei-Pechan Eva Dr. Udvardy-Nagy; Maria Trinn; Lajos Nagy; Miklos Budai; Adam Trompler; Janos Kiss; Tibor Dr. Balogh; Laszlo Toelgyesi; Lajos Budapest Hu Ila
Original assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar RT
Current assignee: Richter Gedeon Vegyeszeti Gyar Nyrt
Priority date: 1978-05-23
Filing date: 1979-05-23
Publication date: 1987-10-29
Also published as: DE2921052A1; CH642978A5; GB2023144B; DD143927A5; HU175474B; GB2023144A; NL7904103A

Description

Die Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen unter Verwendung eines bei aerober Gärung zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähigen neuen Mikroorganismenstammes (vgl. Anspruch 1).

Es ist bekannt, daß die handelsüblichen Herzmittel Lanatosid-C, Acetyldigoxin und Digoxin aus den Blättern der Pflanze Digitalis lanata gewonnen werden. Die Blätter dieser Pflanze enthalten ein Gemisch der Glykoside Lanatosid-A, Lanatosid-B, Lanatosid-C und Lanatosid-D. Es kann aber unter der Einwirkung der vorliegenden hydrolysierend wirkenden Enyzme auch eine Abspaltung des Glykoseteiles und der Acetylgruppe eintreten, wodurch dann neben den erwähnten primären Glykosiden auch die 4 entsprechenden sekundären Glykoside Digitoxin, Gitoxin, Digoxin und Diginatin in der Droge zugegen sind. Das Mengenverhältnis der primären zu den sekundären Glykosiden schwankt in Abhängigkeit von den Züchtungsbedingungen der Pflanze, was aber vom Gesichtspunkt der Verfahrenstechnik beziehungsweise Technologie der Gewinnung der Glykoside überhaupt nicht vorteilhaft ist. Dabei bleibt das Lanatosid-A bei der Gewinnung der als Arzneimittel verwendbaren in der 12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden Glykoside als unbrauchbares Nebenprodukt zurück.

Zur Hydroxylierung des Aglykonteiles von 12-Desoxyherzglykosiden können nach den Schrifttumsangaben verschiedene Mikroorganismen verwendet werden. So wurden für diesen Zweck zum Beispiel Fusarium lini (Helv. Chim. Acta. 41 [1960], 297), Gibberella fujikuroii und Helicostylum piriforme (Nature 184 [1959], 469), Gibberella saubinetti (Chem. Pharm. Bull. 8 [1960], 530), Calonectria decora und Nigrospora sphaerica (Abstr. Symposium on the Chem. of Digitalis Cardiac Glycosides [1960], 114) vorgeschlagen. Mit der Hydroxylierung des therapeutisch anwendbaren Herzglykosides Digitoxin hat sich aber nur eine japanische Forschergruppe, von welcher die Mikroorganismenstämme Streptomyces owashiensis, Streptomyces diastatochromogenes, Mortierella isabellina, Trichocladium asperum und Circinella muscae mit Erfolg zur Herstellung von Digoxin verwendet wurden (Agr. Biol. Chem. 29 [1965], 783), befaßt.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und im Großbetrieb wirtschaftlich durchführbares mikrobiologisches Verfahren zur Herstellung von therapeutisch wertvollen, in der 12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisenden Herzglykosiden unter Verwendung eines bei aerober Gärung zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähigen neuen Mikroorganismenstammes zu schaffen.

Die Erfindung beruht darauf, daß es überraschenderweise gelungen ist, aus einem Waldboden einen solchen Streptomycesstamm zu isolieren und heranzuzüchten, welcher die Fähigkeit hat, bei aerober Gärung beziehungsweise Fermentation eine 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden einzuführen. Taxonomisch ist der neue Stamm auf Grund seiner nachfolgend ausführlich beschriebenen Eigenschaften als Streptomyces praecox anzusehen (vergleiche Waksman: The Actinomycetes, Vol. 2, 1961).

Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen der allgemeinen Formel

worin
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel

in welchletzterer R₁ Wasserstoff oder einen Acetylrest bedeutet, darstellt, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel

worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen Medium mit Streptomyces praecox MNG 127 in Berührung gebracht und dann das erhaltene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird.

Der im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete, bei aerober Gärung zur Einführung einer 12β-Hydroxygruppe in den Aglykonteil von 12-Desoxyherzglykosiden fähige, aus Waldboden erhaltene Stamm Streptomyces praecox wurde am 4. Juni 1974 unter der Bezeichnung Streptomyces praecox MNG 127 bei der Nationalen Stammsammlung des ungarischen Landesinstitutes für Gesundheitswesen (Országos Közeg´szs´gügyi Int´zet) hinterlegt und hat die folgenden charakteristischen Eigenschaften:

Morphologie: Die aus den Hyphen der Luftmyzelien entspringenden Sporenträger zeigen monopodiale Verzweigungen, die einzelnen Zweige sind kurz, zu etwa 50% sind sie rankenförmig und zu 50% bestehen sie aus 2 bis 3 Schleifen aufweisenden lockeren oder kompakten Spiralen, die Sporen sind glattwandig und ellipsoidförmig, ihre Größe ist 0,95 bis 1,00 µm×1,10 bis 1,28 µm;
an Saccharose-Nitrat-Agar nur zerstreutes Wachstum der Kolonien, das Luftmyzel ist cremefarbig, die Nährbodenmyzelien sind hell zimtfarbig, kein lösliches Pigment wird gebildet;
an Tyrosin-Agar kein Wachstum;
an Nähr-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, es entwickeln sich keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sind farblos mit wachsartiger Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Glucose/Asparagin-Agar sehr schnelles Wachstum, die Luftmyzelien haben eine staubige Oberfläche und spinnengewebeartige Form, sowohl die Luftmyzelien, als auch die Nährbodenmyzelien sind drappfarbig (ist eine braune Farbe), es entsteht kein lösliches Pigment;
an Bouillon-Agar schnelles Wachstum der Kolonien, es entsteht kein Luftmyzel, die Nährbodenmyzelien bilden eine sehr dünne Schicht und sind schleimig, kein lösliches Pigment diffundiert in den Agar;
an Kartoffel/Glucose-Agar schnelles Wachstum, die Luftmyzelien sind anfangs weiß, später zimtfarbig und schließlich drappfarbig, die Nährbodenmyzelien sind drapp- beziehungsweise zimtfarbig, es entsteht kein lösliches Pigment;
an Sabouraud/Glucose-Agar Wachstum mit mittelmäßiger Geschwindigkeit, Luftmyzelien bilden sich nur langsam und spärlich mit weißer Farbe aus, die Nährbodenmyzelien sind cremefarbig, kein lösliches Pigment;
an Löfflerschem geronnenem Molkenährboden gutes Wachstum, keine Luftmyzelien, die Nährbodenmyzelien sehen wie Bakterienkolonien aus und haben eine wachsartige Oberfläche, es entsteht kein lösliches Pigment, die proteolytische Wirkung ist minimal;
an Cellulose als einziger Kohlenstoffquelle gutes Wachstum;
positive Gelatineverflüssigung;
an Kartoffelschnitten schnelles Wachstum, zimtfarbige Luftmyzelien, kein lösliches Pigment;
an Blut-Agar graubraune Kolonien mit wachsartiger Oberfläche mit Durchmessern von 1 mm, nach 1wöchiger Bebrütung bei 26°C keine Sporenbildung, schwache β-Hämolyse;
Kohlenstoffquellenassimilation

D-Glucosegute Assimilation D-Galaktosegute Assimilation Saccharosegute Assimilation Maltosesehr gute Assimilation Lactosesehr gute Assimilation Raffinose- Sorbose- Cellobiosegute Assimilation Trehalosesehr gute Assimilation Melibiose- Melecitoseschwache Assimilation lösliche Stärkegute Assimilation D-Xylosesehr gute Assimilation L-Arabinosegute Assimilation L-Rhamnose- Galaktit- D-Mannitgute Assimilation Inositsehr gute Assimilation Salicinim Nähr-Agar gut diffundierendes braunes Pigment α-Methyl-D-glucosidschwache Assimilation

Der wichtigste Vorteil der Erfindung besteht darin, daß sie die wirtschaftliche Herstellung von therapeutisch wirksamen Herzglykosiden ermöglicht. Bei der Gewinnung von Lanatosid C aus der Pflanze Digitalis lanata bleiben immer große Mengen des therapeutisch wertlosen Lanatosides A zurück und bei der Herstellung von Digoxin wird das therapeutisch ebenfalls wertlose Digitoxin als Nebenprodukt erhalten. Durch die Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können aus diesen wertlosen Nebenprodukten therapeutisch wertvolle Herzglykoside erhalten werden.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann der Stamm Streptomyces praecox MNG 127 unter Verwendung von Nährbodenbestandteilen, deren Eignung zum Züchten von Streptomyceten bekannt ist, gezüchtet werden. So können als Energiequellen vorteilhaft Glucose, Maltose, Galaktose, Lactose, Stärke und/oder Dextrin eingesetzt werden. Als Stickstoffquellen können organische Stoffe natürlicher Herkunft, wie Caseinhydrolysat, Sojamehl, Erdnußmehl, Maisquellwasser, Peptone und/oder Hefeauszüge, sowie ferner synthetische Produkte, wie Aminosäuren, Harnstoff oder Ammoniumsalze, dienen. Die Nährbodenbestandteile können in verschiedenen Kombinationen verwendet werden. Es ist zweckmäßig, im Nährboden auch anorganische Salze, insbesondere Phosphate und/oder Kalium-, Calcium-, Magnesium- und/oder Eisensalze, mit zu verwenden. Die Mengen und das Mengenverhältnis der Kohlenstoffquelle und der Stickstoffquelle im Nährboden können innerhalb weiter Grenzen (von etwa 0,5 bis 4 Gew.-%) variiert werden. Das Absinken des pH-Wertes der Gärflüssigkeit kann durch einen Zusatz von Calciumcarbonat im Nährboden verhindert werden.

Die Gärung kann von 20 bis 40°C, insbesondere aber bei der für Streptomyceten günstigen Temperatur von 28 bis 30°C, durchgeführt werden. Die Züchtung kann in geschüttelten Erlenmeyerkolben oder in mit einem Rührwerk ausgerüsteten Gärvorrichtungen erfolgen. Die Luftzufuhr kann durch kräftiges Schütteln der Kolben beziehungsweise in Gärvorrichtungen durch Einblasen von Luft in das Gärmedium erfolgen. Die hydroxylierende Aktivität der Mikroorganismen kann durch mehrmaliges Umimpfen der Kultur auf frische Nährböden gesteigert werden.

Das zu hydroxylierende Substrat kann zu der schon voll entwickelten Kultur oder während der Phase des kräftigen Wachstums zugegeben werden; dasselbe Ergebnis wird aber auch dann erzielt, wenn das Substrat schon vor dem Anfang des Wachstums dem Nährboden zugesetzt wird, da das Wachstum der Kultur durch die Gegenwart von Herzglykosiden nicht beeinflußt wird. Es kann ferner auch in der Weise gearbeitet werden, daß die ausgewachsene Kultur vom Nährboden durch Filtrieren abgetrennt und in einer Pufferlösung suspendiert wird und dann das Substrat dieser Suspension zugesetzt wird. Die Sauerstoffversorgung des Reaktionsgemisches und die geeignete Temperatur müssen aber in jedem Fall sichergestellt werden.

Als als Substrat dienende Cardenolidverbindungen können beliebige 12-Desoxyherzglykoside der allgemeinen Formel II oder auch die entsprechenden Aglycone selbst, wie Digitoxin, α-Acetyldigitoxin oder Digitoxigenin, eingesetzt werden. Die als Substrat einzusetzende Cardenolidverbindung wird zweckmäßig in Lösung in einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, z. B. Äthanol oder Methanol, dem Gärmedium zugeführt; die Umsetzung kann aber auch dann mit gutem Ergebnis durchgeführt werden, wenn die feingepulverte Verbindung in Suspension in Wasser dem Gärmedium zugesetzt wird.

Vorteilhaft wird als Cardenolidverbindung der allgemeinen Formel II Digitoxin oder a-Acetyldigitoxin eingesetzt.

Die als Produkt des Gärverfahrens erhaltene in der 12β-Stellung eine Hydroxygruppe aufweisende Verbindung der allgemeinen Formel I kann durch Extrahieren mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorteilhaft Chloroform, Dichlormethan oder Äthylacetat, aus der Gärflüssigkeit gewonnen werden. Nach dem Einengen der so erhaltenen organischen Lösung und nach dem Chromatographieren des Rückstandes kann das erhaltene rohe Produkt durch Umkristallisieren gereinigt werden.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.

Beispiel 1

Es wurde der Stamm Streptomyces praecox MNG 127 an einem

1,0 Gew.-% Glucose
0,2 Gew.-% Casamin
0,1 Gew.-% Fleischextrakt
0,01 Gew.-% Lanatosid A und
1,7 Gew.-% Agar

enthaltenden Nährboden gezüchtet. Eine Abschwemmung der auf Schrägagar bereiteten Sporen in 5 cm³ destilliertem Wasser wurde als Impfstoff für die submerse Kultur verwendet.

100 cm³ einer 2 Gew.-% Sojamehl, 3 Gew.-% Glucose und 0,5 Gew.-% Calciumcarbonat enthaltenden Nährlösung (Nährlösung "S") wurden mit 1 cm³ der obigen Suspension beimpft. Vor dem Impfen wurde die Nährlösung, deren pH-Wert 7 war, 25 Minuten lang bei 120°C sterilisiert. Die Züchtung der Streptomyceten erfolgte bei 28°C auf einem Schütteltisch mit einer Amplitude von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute. Nach 2 Tagen dauernder Bebrütung wurde die Kultur mit einer Lösung von 50 mg Digitoxin in 2 cm³ Methanol versetzt und sie wurde bei 37°C weitergeschüttelt. Das Fortschreiten der biochemischen Reaktion wurde durch die dünnschichtchromatographische Analyse des Chloroformauszuges von täglich entnommenen Proben des Mediums verfolgt. Zu diesem Zweck wurden Platten von Kieselgel HF₂₅₄ verwendet; als Laufmittel diente ein Gemisch von Cyclohexan, Äthylacetat und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von 35 : 55 : 10. Die Flecke des Umsetzungsproduktes wurden durch Verwendung einer essigsauren Anisaldehydlösung bei 105°C sichtbar gemacht. In dem auf Grund der dünnschichtchromatographischen Analyse als vom Gesichtspunkt der Digoxinbildung am günstigsten erscheinenden Zeitpunkt, welcher etwa 90 Stunden nach der Zugabe des Digitoxines lag, wurde die Gärung beendet. Aus den aus 40 geschüttelten Kolben erhaltenen 4 l Gärflüssigkeit wurden die abgesetzten Bestandteile durch Zentrifugieren abgetrennt und mit 500 cm³ Methanol extrahiert und die methanolische Lösung wurde zur Trockne eingedampft. Die beim Zentrifugieren erhaltene überstehende Flüssigkeit wurde 3mal mit je 3 l Chloroform extrahiert und die Auszüge wurden vereinigt. In dieser vereinigten Chloroformlösung wurde auch der Trockenrückstand des obigen Methanolauszuges gelöst und die Lösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bei 40°C unter Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand wurde in 10 cm³ eines Gemisches von Chloroform und Methanol im Volumverhältnis von 1 : 1 aufgenommen und auf 20 g Silicagel (zur Säulenchromatographie geeignete Qualität) auftrocknen gelassen. Das das rohe Produkt aufweisende Silicagel wurde in eine Säule mit einer Höhe von 70 cm und einem Durchmesser von 4 cm eingebracht. Das Chromatographieren wurde mit trockenem Träger begonnen und in aufsteigender Richtung durchgeführt. Anfangs wurde als Lösungsmittel ein Gemisch von Cyclohexan, Äthylacetat und absolutem Äthanol im Volumverhältnis von 35 : 55 : 2,5 verwendet, dessen Volumverhältnis dann linear zu 35 : 55 : 10 geändert wurde, bis ein Eluatvolumen von 1100 cm³ erreicht war. Danach wurde das Volumverhältnis der Lösungsmittel während des weiteren Eluierens unverändert gelassen, aber die anfängliche Durchflußgeschwindigkeit von 30 cm³/Stunde auf 20 cm³/Stunde vermindert. Das unverändert gebliebene Digitoxin erschien in den Fraktionen von 960 bis 1070 cm³, dann wurde aus den Fraktionen von 1070 und 1150 cm³ das Hauptumsetzungsprodukt Digoxin und aus den nachfolgenden Fraktionen das ebenfalls gebildete 7β-Hydroxydigoxin erhalten.

Die Digoxin enthaltenden Fraktionen wurden 2 Tage lang auf -20°C gehalten; während dieser Zeit schied sich das rohe Digoxin (330 mg) in Form von nadelförmigen Kristallen aus. Die Mutterlauge wurde unter Vakuum eingedampft, der ölige Rückstand wurde in 5 cm³ Chloroform gelöst und der Lösung wurde Cyclohexan bis zur beginnenden Trübung zugetropft. Die Trübung wurde durch die Zugabe von einigen Tropfen Methanol aufgehoben und das Gemisch wurde auf -20°C abgekühlt und zum Kristallisieren stehengelassen. In 2 Tagen schieden sich 140 mg Digoxin in kristalliner Form aus. Die beiden rohen Produktfraktionen wurden vereinigt und aus heißem 80%igem Methanol umkristallisiert. So wurden 450 mg kristallines Digoxin mit einem Schmelzpunkt von 245 bis 250°C und einem [α]-Wert von +10,8° (c=1, Pyridin) erhalten.

Ultrarotspektrum (KBr):
3400 cm^-1,3510 cm^-1, 3090 cm^-1,1720 cm^-1, 1620 cm^-1,1400 cm^-1, 1270 cm^-1, 860 cm^-1 und 820 cm^-1.

Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure Hydrolyse hergestellte Dipoxigenin zeigte die folgenden Spektraldaten:

Spitzenwerte des Massenspektrums:
390 (M⁺),372 (30%), 354 (70%),262 (42%), 219 (40%),201 (100%), 147 (40%),und 111 (41%).

UV-Spektrum (in konzentrierter Schwefelsäure):
λ _max.:
228 nm, 317 nm und 388 nm.

Magnetisches Kernresonanzspektrum [NMR] (in Dimethylsulfoxid):
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,85 (3-H) ppm,
4,05 s (14-OH) ppm,
4,2 d (3-OH) ppm,
4,6 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.

Aus dem Eindampfrückstand der 7b-Hydroxydigoxin enthaltenden Fraktionen wurden nach dem Umkristallisieren aus 80%igem Methanol 175 mg kristallines Produkt mit einem Schmelzpunkt von 210 bis 217°C und einem [α]-Wert von +16,1° (c=1, Pyridin) erhalten.

Das aus dem erhaltenen kristallinen Produkt durch saure Hydrolyse hergestellte 7β-Hydroxydigoxigenin zeigte die folgenden Spektraldaten:

Spitzenwerte des Massenspektrums:
403 (M⁺, 3%), 281 (36%), 278 (30%) und 163, 145 (43%).

Ultrarotspektrum (KBr):
3570 cm^-1,3370 cm^-1, 2910 cm^-1,1710 cm^-1, 1600 cm^-1,1430 cm^-1, 1310 cm^-1, 860 cm^-1 und 825 cm^-1.

Magnetisches Kernresonanzspektrum [NMR] (in Dimethylsulfoxid):
δ=0,7 s (18-Me) ppm,
0,9 s (19-Me) ppm,
3,9 (3-H) ppm,
4,25 d (3-OH) ppm,
4,65 d (12-OH) ppm,
4,9 s (21-H) ppm,
5,3 s (14-OH) ppm,
5,5 d (7-OH) ppm und
5,8 s (22-H) ppm.

UV-Spektrum (in konzentrierter Schwefelsäure):
λ _max.:
230 nm, 380 nm und 460 nm.

Beispiel 2

Die Züchtung des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 und die mikrobiologische Umsetzung des zugesetzten Substrates wurden unter den im Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Zu je 100 cm³ ausgewachsene Kultur wurden als Substrat 20 mg α-Acetyldigitoxin in Lösung in 1 cm³ Äthanol zugegeben. Die Gärung wurd 4 Tage lang fortgesetzt, dann wurde das erhaltene Produkt in der im Beispiel 1 beschriebenen Weise extrahiert und chromatographisch gereinigt, jedoch mit dem Unterschied, daß der Lösungsmittelgradient in der Weise eingestellt wurde, daß das anfängliche Volumverhältnis von 35 : 55 : 2,5 des Gemisches von Cyclohexan, Äthylacetat und absolutem Äthanol bis zum Abfließen von 1600 cm³ Eluat auf 35 : 55 : 8 verdünnt war; im weiteren Verlauf des Eluierens wurde dann dieses Verhältnis beibehalten. Die von 1550 bis 1770 cm³ Eluatvolumen gesammelten Fraktionen wurden vereinigt und eingedampft; der Rückstand wurde aus 80%igem Methanol kristallisiert; das erhaltene kristalline Produkt konnte auf Grund seiner dünnschichtchromatographischen Eigenschaften als α-Acetyldigoxin identifiziert werden. Das Produkt wurde durch präparative Dünnschichtchromatographie weiter gereinigt. Das so erhaltene analytisch reine α-Acetyldigoxin hatte einen Schmelzpunkt von 224 bis 229°C und einen [α]-Wert von 18,2° (c=1, Pyridin).

Das nach der Hydrolyse dieses Produktes erhaltene Genin zeigte dieselben physikalisch-chemischen Daten wie das nach dem Beispiel 1 erhaltene Digoxigenin.

Beispiel 3

Von einer an einen Kartoffelextrakt und Glucose enthaltendem Schrägagar gewachsenen 5 bis 6 Wochen alten Kultur des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 wurde mit 10 cm³ sterilem destilliertem Wasser eine Suspension hergestellt. Mit je 1 cm³ dieser Suspension wurden in 500 cm³ Erlenmeyerkolben je 100 cm³ einer 0,8 Gew.-% staubförmigen Sojaextrakt und 3 Gew.-% Glucose enthaltenden sterilisierten Nährlösung (PS-Nährlösung) beimpft. Die Nährlösung, deren pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,0 war, wurde vor dem Impfen 45 Minuten bei 120°C sterilisiert; die Sterilisierung der in der Nährlösung zu verwendenden Glucose erfolgte getrennt in 50%iger Lösung 30 Minuten bei 120°C.

Der staubförmige Sojaextrakt wurde wie folgt hergestellt: Extrahiertes Sojamehl wurde durch ein Sieb mit einer Maschenweite von 0,4 mm gesiebt und in Leitungswasser suspendiert. Die 10% Mehl enthaltende Suspension wurde 1 Stunde unter einem Druck von 1 atü erhitzt, dann auf 37°C abgekühlt und mit 0,4% Pankreatin 2 Stunden lang unter ständigem Rühren hydrolysiert, wobei der pH-Wert des Reaktionsgemisches mit nach Bedarf zugesetztem Natriumhydroxyd während der Hydrolyse auf 7,5 bis 8,0 gehalten wurde. Nach der Beendigung der Hydrolyse wurde das Gemisch zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit unter Zerstäubung getrocknet. Der Stickstoffgehalt des so gewonnenen pulverförmigen Sojaextraktes betrug 9%.

Die Bebrütung des Stammes Streptomyces praecox MNG 127 im beimpften Kolben erfolgte bei 32°C auf einem Schütteltisch mit einer Amplitude von 2,5 cm und 300 Umdrehungen/Minute. Mit der unter diesen Bedingungen in 24 Stunden voll ausgewachsenen 400 cm³ Schüttelkultur wurden in einer 10 l Laboratoriumsgärvorrichtung aus Glas 5 l der oben genannten Nährlösung (PS-Nährlösung), welche außer dem Sojaextrakt und der Glucose in diesem Fall auch 0,2 Gew.-% Palmöl zur Verhinderung des Schäumens enthielt, beimpft. Die Gärung wurde bei 32°C unter Belüftung mit 5 l/Minute steriler Luft und unter Rühren mit 350 Umdrehungen/Minute 1 Tag fortgesetzt, dann wurde die Temperatur der Kultur auf 37°C erhöht und es wurde eine durch Filtrieren sterilisierte Lösung von 2,5 g Digitoxin in 100 cm³ Methanol zugesetzt. Nach 2 Tagen langem Bebrüten wurdedie Gärflüssigkeit filtriert und das Filtrat 2mal mit je ¹/₃ seines Volumens Benzol und anschließend 3mal mit je ¹/₃ seines Volumens Chloroform extrahiert. Aus dem Chloroformauszug wurden 750 mg Digoxin und 440 mg 7β-Hydroxidigoxin erhalten.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von 12β-Hydroxycardenolidverbindungen der allgemeinen Formel worin
X für Wasserstoff oder eine Hydroxygruppe steht und
R Wasserstoff oder einen Rest der allgemeinen Formel in welchletzterer R₁ Wasserstoff oder einen Acetylrest bedeutet, darstellt, dadurch gekennzeichnet, daß man Cardenolidverbindungen der allgemeinen Formel worin X und R wie oben festgelegt sind, in einem wäßrigen Medium mit Streptomyces praecox MNG 127 in Berührung bringt und dann das erhaltene, biologisch aktive, hydroxylierte Produkt aus dem Reaktionsgemisch abtrennt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Cardenolidverbindung der allgemeinen Formel II Digitoxin oder α-Acetyldigitoxin einsetzt.