DE3612927A1

DE3612927A1 - Mit mycotrienin verwandte verbindungen, ihre verwendung zur behandlung von tumoren und sie enthaltende pharmazeutische mittel

Info

Publication number: DE3612927A1
Application number: DE19863612927
Authority: DE
Inventors: Shigeru Kawagoe Saitama Hiramoto; Tetsuo Kounosu Saitama Sasaki; Haruo Hachioji Tokio/Tokyo Seto; Masanori Sakado Saitama Sugita; Noboru Yokohama Kanagawa Ötake
Original assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Current assignee: Nisshin Seifun Group Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-17
Publication date: 1986-11-06
Anticipated expiration: 2006-04-18
Also published as: GB2175586B; GB8609775D0; DE3612927C2; US4649135A; GB2175586A

Description

Anmelder:Nisshin Flour Milling Co., Ltd, 19-12, Nihonbashi-Koami-cho, Chuo-ku, Tokyo/Japan

Mit Mycotrienin verwandte Verbindungen, ihre Verwendung zur Behandlung von Tumoren und sie enthaltende pharmazeutische Mittel

Die Erfindung betrifft neue, mit Mycotrienin verwandte Verbindungen mit den nachstehend angegebenen chemischen Strukturen; sie betrifft insbesondere neue Verbindungen, die nachstehend als Verbindungen T-23-X, T-23-XI, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV bezeichnet werden, die Antitumoraktivitäten aufweisen und daher in der Medizin für die Behandlung von Tumoren verwendet werden können, sowie sie enthaltende pharmazeutische Mittel.

Vor kurzem ist es gelungen, die Anwesenheit der Verbindungen der nachstehend angegebenen Strukturformeln mit einem Ansamycin-Grundgerüst, die Antitumor-Aktivitäten aufweisen, im Fermentationsprodukt des neuen Stammes Streptomyces rishiensis T-23 nachzuweisen (hinterlegt beim "Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science & Technology, MITI (Japan)" unter der

1 Hinterlegungsnummer FERM P-6141):

V- OCH.

OCH-

IH

OCH,

OH

Die obengenannten Verbindungen wurden in der vorstehend angegebenen Reihenfolge bezeichnet als Verbindung T-23-I, Verbindung T-23-II, Verbindung T-23-VIII bzw. Verbindung T-23-IX. Die Verbindungen T-23-I und T-23-II sind in der am 24. November 1982 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 444 474 (inzwischen US-PS 4 521 339) beschrieben und die Verfahren zu Ihrer Herstellung sind in der am 29. Januar 1985 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 696 040, einer Ausscheidungsanmeldung aus USSN 444 474, beschrieben. Die Verbindungen T-23-VIII und T-23-IX sind in der am 6. September 1985 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 773 445 beschrieben.

Die Verbindungen T-23-I, T-23-II, T-23-VIII und T-23-IX werden wie folgt hergestellt:

Insbesondere der obengenannte stamm Streptomyces rishiensis T-23 wird nach einem konventionellen Verfahren zur Kultivierung des Actinomyces-Stammes kultiviert. Die dabei erhaltene Kulturbrühe wird dann in das Mycel und die überstehende Flüssigkeit aufgeteilt. Aus dem Mycel wird mit Aceton-Wasser eine aktive Fraktion extrahiert. Der die aktive Fraktion enthaltende Extrakt wird über ein nicht-ionisches Austauscherharz laufengelassen, um eine Absorption der aktiven Fraktion daran zu bewirken, danach wird sie mit einem Lösungsmittel, wie z.B. Aceton oder einem niederen Alkohol, extrahiert. Getrennt davon wird die aktive Fraktion auch mit einem organischen Lösungsmittel direkt aus der überstehenden Flüssigkeit extrahiert. Die beiden Extrakte werden vereinigt und das organische Lösungsmittel wird aus der Mischung entfernt, wobei man eine wäßrige Phase erhält, die dann mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie z.B. Chloroform oder Ethylacetat, extrahiert und dann eingeengt wird. Danach wird das Konzentrat mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel versetzt, um die aktive Fraktion auszufällen, die dann an einer Silicagel-Kolonne adsorbiert

wird. Nach dem Waschen mit Benzol wird die Kolonne mit Benzol/Aceton (4:1) eluiert, wobei man eine T-23-I enthaltende Lösung erhält. Die Elution der Silicagel-Kolonne wird mit dem gleichen Lösungsmittel fortgesetzt, wobei man eine Lösung erhält, die T-23-VIII enthält. Diese Kolonne wird mit Benzol/Aceton (7:3) weiter eluiert, wobei man eine Lösung erhält, die T-23-II enthält. Nach Erhalt der T-23-II enthaltenden Lösung wird die Elution der Kolonne mit dem gleichen Lösungsmittel fortgesetzt, wobei man eine Lösung erhält, die T-23-IX enthält.

Als Ergebnis weiterer Untersuchungen, die schließlich zu. der vorliegenden Erfindung geführt haben, wurde folgendes gefunden:

Die obengenannte aktive Fraktion, die mit dem aliphatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel in einem Verfahren zur Herstellung der eine Reihe von Τ-23-Substanzen einschließlich T-23-I enthaltenden Lösungen ausgefällt worden war, wurde an einer Silicagel-Kolonne adsorbiert. Nach dem Waschen mit Chloroform wurde die Kolonne mit Chloroform/Methanol (100:1) eluiert und das Eluat wurde in getrennten Portionen eines definierten Volumens fraktioniert. Jede der Fraktionen wurde einer Silicagel-Dünnschichtchroiuätographie, entwickelt mit Dichlormethan/Methanol (15:1), unterzogen, wobei gefunden wurde, daß eine geringe Menge einer aktiven Komponente (R_f = 0,50), die von den Verbindungen T-23-I (R_f = 0,64) und T-23-VIII (R_f = 0,63) verschieden war, in der Fraktion enthalten war, die nach der Elution der die obengenannten Verbindungen T-23-I und T-23-VIII enthaltenden Fraktion erhalten wurde, und daß eine geringe Menge einer aktiven Komponente (R_f = 0,32), die von der obengenannten geringen Menge der obengenannten aktiven Komponente (R_f = 0,50) verschieden war, in der Fraktion vorhanden war, die nach der Elution der die obengenannte geringe Menge der aktiven Komponente (R^ = 0,50) enthaltenden Fraktion erhal-

ten worden war, und daß außerdem drei Arten von geringen Mengen von aktiven Komponenten (R_f = 0,31, Rf = 0,30 und R^ = 0,29), die von den obengenannten zwei Arten von geringen Mengen von aktiven Komponenten (R^ = 0,50 und R_ s= o, 32) verschieden waren, in der Fraktion enthalten waren, die nach der Elution der die obengenannten zwei Arten von geringen Mengen von aktiven Komponenten (R,- = 0,50 und R_f S= 0,32) jeweils enthaltenden Fraktionen in der genannten Reihenfolge erhalten worden waren, und die Verbindungen T-23-II (R_f = 0,28) und T-23-IX (R_f » 0,27) wurden dann nach der Elution der obengenannten drei Arten von geringen Mengen von aktiven Komponenten eluiert.

Die Komponente mit R_f = 0,50 wird hier als Verbindung T-23-XI bezeichnet, die Komponente mit R^ = 0,31 wird hier als Verbindung T-23-XII bezeichnet, die Komponente mit R_f = 0,30 wird hier als Verbindung T-23-XIII bezeichnet und die Komponente mit R_f = 0,29 wird hier als Verbindung T-23-XIV bezeichnet. Bei der Untersuchung der physikalisch-chemischen Eigenschaften dieser Verbindungen wurde gefunden, daß sie jeweils neue Verbindungen mit den nachstehend angegebenen Strukturformeln darstellen und daß sie Antitumor-Aktivitäten aufweisen.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind neue Verbindungen, die jeweils durch die nachstehend angegebenen Strukturformeln identifiziert werden:

(JyV^ov^^a

(T-23-X)

TT H
35

OCH.

OCH, (Τ-23-ΧΙ)

^—Tm

OH

OH (Ι-23-ΣΙΙ)

OCH, (Τ-23-ΖΕΙΙ)

OCH^ (Τ-23-ΧΓ7)

OH

Der Einfachheit halber werden die obengenannten Verbindungen T-.23-X, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV generell durch die folgende allgemeine Strukturformel dargestellt:

worin R Isobutyl, sec-Butyl, Isopentyl oder Cyclohexyl bedeutet.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die beiliegenden Zeichnungen näher erläutert. In den beiliegenden Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung T-23-X, Fig. 2 das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung T-23-X, Fig. 3 das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung T-23-XI, Fig. 4 das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung T-23-XI, Fig. 5 das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung T-23-XII/ Fig. 6 das H-NMR-Spektrum der Verbindung T-23-XII, Fig. 7 das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung T-23-XIII, Fig. 8 das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung T-23-XIII, Fig. 9 das IR-Absorptionsspektrum der Verbindung T-23-XIV

und
Fig.10 das ¹H-NMR-Spektrum der Verbindung T-23-XIV.

Erfindungsgemäß werden die Fraktionen, die T-23-X, T-23-XI, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV enthalten, unter vermindertem Druck eingeengt und danach wird das Konzentrat einer präparativen Silicagel-Dünnschichtchromatographie, entwickelt mit Dichlorethan/Methanol (15:1)j unterworfen, wobei die Verbindung T-23-XI bei R_f = 0,50, die Verbindung T-23-X bei R_f = 0,32, die Verbindung T-23-XII bei

R_f = 0,31, die Verbindung T-23-XIII bei R_f = 0,30 und die Verbindung T-23-XIV bei R_f = 0,29 auftreten. Die ihren jeweiligen Verbindungen entsprechenden Fraktionen werden einzeln herausgekratzt und dann mit einem Lösungsmittelgemisch aus Chloroform und Methanol (10:1) eluiert. Die Eluate werden einzeln im Vakuum eingeengt, wobei man jeweils die Verbindungen T-23-X, T-23-XI, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV als weißes Pulver erhält.

Alternativ wird die obengenannte, T-23-X, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV enthaltene Fraktion im Vakuum eingeengt. Das Konzentrat wird dann in einer geringen Menge Chloroform gelöst und die Lösung wird einer präperativen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen unter Verwendung einer Silicagel-Kolonne, wobei die Elution der Kolonne mit dem Lösungsmittel Chloroform/Methanol (30:1) in einer Strömungsrate von 5 ml/min durchgeführt wird. Das Eluat wird mittels UV-Absorption bei 270 nm nachgewiesen, wobei drei Peaks (Spitzenwerte) bei einer Retentionszeit von 19, 21 bzw. 22 Minuten auftreten, nach dem Auftreten eines der Verbindung T-23-X entsprechenden Peaks bei der 18-Minuten-Retentionszeit. Beim Einengen der diesen drei Peaks entsprechenden Eluate im Vakuum erhält man jeweils die Verbindungen T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV in Form eines weißen Pulvers.

Diese Verbindungen T-23-X, T-23-XI, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV weisen, wie gefunden wurde, ähnlich wie die obengenannten Verbindungen T-23-I, T-23-II und dgl. Antitumor-Aktivitäten auf und können daher in der Medizin verwendet werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen T-23-X, T-23-XI, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV können nach den vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellt werden. Eine Untersuchung dieser Verbindungen in bezug auf ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften und ihre biologischen

Aktivitäten ergab, daß sie die nachstehend aufgezählten Eigenschaften aufweisen:

(A) Verbindung T-23-X 1. Aussehen: farbloses amorphes Pulver

2. MG (Molekulargewicht): 622

3. Elementaranalyse:

C% H% N% 0% ber. für C, .-H^N-O.,: 69,43 8,09 4,50 17,98

gef.: 69,20 8,23 4,48 18,09

⁷ = +151° (C = 0,169, MeOH)

5. F. 135°C

6. UV-Absorρtionsspektrum (in Methanol)

^max 256 nm (ε 25500)

260 nm (s 27000)

271 Bm (β 33000) 20

282 nm (ε 25400)

7. IR-Absorptionsspektrum (in KBr) (vgl. Fig. 1)

>Ws 3350, 2950, 1730, 1650,

1540, 1450, 1380, 1300, _1

1210, 1100, 1000 cm

8. Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chlo roform und Pyridin,

unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser 30

9. C-NMR-Spektrum-chemische Verschiebung (in CDCl₃)

Nr. ^UC * Kr.

1	168.8	(s)	. 15	124.8	(d)
2	43.6	(t)	16	25.6	(t)
3	78.9	(d)	17	33.2	(t)
4	130.7	(d)	18	144.0	(s)
5	134.1	(d)	19	112.2	(d)
6	129.3	(d)	20	138.4	(s)
7	133.7	(d)	21	105.9	(d)
8	133.4	Cd)	22	157.3	(s)
9	129.5	id)	23	111.0	(d) -
10	•33.2	(t)	24	9.9	(q)
11	75.5	(d)	25	20.4	(q)
12	39.4	(d)	26	56.7	(q)
13	68.4	(d)	27	172.9	(s)
14	138.2	(s)	28	48.6	(d)
29	17.6	(q)	33	25.6	(t)
30	176.7	(s)	34	25.6	(t)
31	44.9	(d)	35	25.6	(t)
32	29.4	(t)	36	29.4	(t)

*Multiplizität im Nicht-ResonanzSpektrum

30VO 15^16

T ir^H

ir

OH

10. ¹H-NMR-Spektrum (in CDCl₃) (vgl. Fig. 2)

(B) Verbindung T-23-XI

1· Aussehen: farbloses amorphes Pulver

2. MG: 652

3. Elementaranalyse:

C% H% N% 0% ber. für: C₃₇H₅₂N₂O₃: 68,07 8,03 4,29 19,61

gef.: 68,04 8,07 4,26 19,63

4. A/p⁵ = + 373° (C = 0,045, MeOH)

5. F. 128°C

6. UV-Absorptionsspektrum (in CH₃OH) 30

^amax 262 um (£ 44100) 272 nm (ε 57600)

281 nm (ε 43700) 35

7. IR-Absorptionsspektrum (in KBr) (vgl. Fig. 3) ^t 3350, 2930, 1730, 1640, 1530, 1480, 1450, 1380, 1200, 1100, 1000 cm"

8. Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform und Pyridin,

unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser 9. C-NMR-Spektrum-chemische Verschiebung (in CDCl₃) ITr. *c * ITr. ⁵C *

1 169.7 Cs) ' ·■' 19 , 142.2 (s.)

2 43.0 (t) 20 125.0 (s)

3 79.1 (d) 21 106.0 (d)

4 129.4 (d) 22. 152.5 Cs)

5 134.6 (d) 23 115.1 (d) 6 129.2 (d) 24 9.6 (O

7 134.4 (d) 25 20.2 (q)

8 133.6 (d) 26 56.6 '(O

9 129.3 Cd) 27 173.1 (O 10 33,8 (t) 28 48.5 (d)

11 75.3 (d) 29 17.8 (O

12- 38.9 (d) 30 176.4 (s)

13 68.4 (d) 31 45.1 (d) 30

14· 138.0 (s) 32 29.4 (t)

15 124.2 (d) 33 25.6 (t)

16 26.5 (t) 34 25.6 (t) ¹? 32.2 (t) 35 25.6 (t)

18 * 133.2 Cs). 36 29.4 (t) * Multiplizxtät des !TIcHt-Resonanζsspektrums

54-

10. H-NMR-Spektrum (in CDCl₃) (vgl. Fig. 4) (C) Biologische Aktivität

Die Verbindungen T-23-X und T-23-XI wurden in bezug auf ihre Antitumor-Aktivität (in vitro) gegenüber L-5178Y Tumorzellen mit der Verbindung T-23-II verglichen.

Ϊ-23-Σ

Ϊ-23-2Ι

1-23-11

Konz. Zustand des ZeI- Konz. · Zustand des ZeI- Konz. Zustand des Ze

(llg/ml) lenwachstums - fog/ml) lenwachstums (gg/ml) lenwachstums

0.4

0.2 +

0.1 +

+ 0.05 +

1	33
0.	11 .
0.	04
0.

1	33
0.	11
0.	44
0.

Zellenwachstum

_— kein Zellenwachstum

COPY ORIGINAL INSPECTED

Das Zellenwachstum wurde festgestellt unter Anwendung eines VerdünnungsVerfahrens, in dem ein Eagle-NEM-Medium (Nissui), ergänzt durch ein 10%-Pferdeserum und 100 mg/1 Asparagin verwendet wurde, das 120 Stunden lang bei 37°C kultiviert wurde. Die Testverbindungen in Ethanollösung wurde zu einem Assay-System zugegeben.

Die obigen Daten zeigen, daß beide Verbindungen T-23-X und T-23-XI einen starken carcinostatischen Effekt aufweisen, weil sie kein Wachstum der Tumorzellen bei etwa 1/3 der minimalen Heim-Konzentration aufweisen, verglichen mit der Verbindung T-23-II. Insbesondere zeigt die Verbindung T-23-II kein Wachstum der Tumorzellen bei 0,4 jum/ml, während die Verbindungen T-23-X und T-23-XI kein Wachstum der Tumorzellen bei 0,11 pm/ ml zeigen.

(D) Verbindung T-23-XII

1· Aussehen: farbloses amorphes Pulver

2. MG: 610

3. Elementaranalyse:

ber. für: C₃₅H₅₀N₂O₇: 25 gef.s

4. A/q^{5 = +}18⁷° (^c = 0,062, MeOH)

5. F. 105°C

6. UV-AbsorptionsSpektrum (in CH₃OH)

^max 250 mn (ε 31100)

259 um (S 33100) '271 um (S 40700)

. 282 nm (ε 3U00) 35

c%	83	8	H%	4	N%	0%
68,	69	■8	,25	■ 4	,59	18,33
68,		,35	,57	18,39

7. IR-Absorptionsspektrum (in KBr) (vgl. Fig. 5) Vmax 3300, 2940, 1740, 1660, 1550, 1450, 1380, 1310, 1220, 1100, 1000 cm"¹

8. Löslichkeit:

Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, Chloroform und Pyridin,

unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser 9. Sc-NMR-Spektrum-chemische Verschiebung (in CDCl₃) 10

ITr.	168.7 (s)	Fr.	144	.0	*
C--1	43.5 (t)	C-18	112,	.0	(s)
- 2	78.6 (d)	-19*	138,	.5	(d)
- 3	130.6 (d)	-20	105,	.8	(s)
- 4	134.1 (d)	-21	157,	.2	(d)
- 5	129.4 (d)	-22	110,	.8	(s).
- 6	133.6 (d)	-23	9.	.9	(d)
- 7	133.4 (d)	-24	20,	.4	(q)
- 8	129.3 (d)	-25	56.	,8	(q)
- 9	33.2 (t)	-26	172.	,9	(O
-10	75.4 (d)	-27	48.	7	(s)
-11	39.5 (d)	-28	17.	7	(d)
-12	68.4 (d)	-29	173.	9	(d)
-13	138.2 (s)	-30	34.	3	Cb)
-14	124.8 (d)	-31	34.	3	(t)
-15	29.5 (t)	-32	27.	8	(t)
-16 .	36.2 (t)	-33	22.	3	(d)
-17		-34	22.	3	(O
	·" Multiplizität des	-35		(O
		Nicht-Re sonanzspektrums

10

20 25 30 35

10. Ή-NMR-Spektrum (in CDCl₃) (vgl. Fig. 6)

(E) Verbindung T-23-XIII

1.	Aussehen:	farbloses	amorphes	Pulver
2.	MG:	596
3.	Elernentaranalyse:
		C% H%	N%	0%
ber	. für: 0,,Η._οΝ.,0_:	68,43 8,1	1 4,69	18,77

gef.: 68,21 8,06 4,68 19,05

4. ß/^⁵ = +232° (C = 0,034, MeOH)

5. F. 127°C

6. UV-Absorptionsspektrum (in CH₃OH)

*max 250 nm (S 31100)

260 nm (€ 32700) 271 nm (e 39900) 282 nm (f 30600)

7. IR-AbsorptionsspeKtrum (in KBr) (vgl. Fig. 7)

3300, 29.40, 1740, 1670, 1560, 1460, 1390, 1320, 1220, 1100, 1020 cm

-1

¹ 8. Löslichkeit: Löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylaceton, Chloroform und Pyridin, unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser

5 9. ^C-NMR-Spektrum-chemische Verschiebung (in CDCl₃)

10 Hr. tfc

C- 1	168.7	(s)	C-18	144.0	(s)
- 2	43.5	(t). ...	' -19	112.0	(d)
- 3	78.6	(d)	-20	138.4	(fl)
- 4	130.6	(d)	-21	105.8	(d)
- 5	134.1	(d)	-22	157.2	(s)
- 6	129.4	(d)	-23	110.8	(d)
- 7	133.5	(d)	-24	9.8	U)
- 8	133.3	(d)	-25	20.3	U)
- 9	129.3	(d)	-26	56.7	U)
-10	33.1	(t)	-27	172.8	(sj
-11	75.4	(d)	-28	48.5	(d)
-12	39.5	(d)	-29	17.8	U)
-13	68.4	(d)	-30	177.0	(s)
-14	138.3	(s)	-31	42.8	(d)
-15	124.9	(d)	-32	27.2	(t)
-16	29.6	(t)	-33	11.8	(q)
-17	36.2	(t)	-34	17.1	(O

* Multiplizität des flicht-Resonazspektrums

10

15 20 25 30 35

10. H-NMR-Spektrum (in CDCl₃) (vgl. Fig. 8)

(F) Verbindung T-23-XIV

1 .	Aussehen:	farbloses	H%	amorphes	Pulver
2.	MG:	596	8,11
3.	Elementaranalyse:		8,30
		C%	N%	0%
ber	. für C₃₄H₄₈N₂O₇:	68,43	4,69	18,77
qef	•	68,29	4,67	18,74

4. ^7p⁵ = +267° (C = 0,015, MeOH)

5. F. 127°C

6. UV-Absorptionsspektrum

^Ama3: 252 um (£ 37600) 259 um (^ 39700) 271 nm (€ 48700)

282 um (S 37500)

7. IR-Absorptionsspektrum (in KBr) (vgl. Fig. 9)

3300, 2940, 1740, 1670, 1560, 1460,

1390, 1320, 1220, 1100, 1020 cm

¹ 8. Löslichkeit:

löslich in Methanol, Ethanol, Aceton, Ethylacetat, ChIoform und Pyridin,

unlöslich in η-Hexan, Petroläther und Wasser ⁵ 9. C-NMR-Spektrum-chemische Verschiebung (in CDCl₃)

10 ITr. . " *c * Ή

r.

C- 1	168.7	(β)	C-18	144.0	(3)
- 2	43.5	(t)	-19	112.0	(d)
- 3	78.6	(d)	-20	138.3	(s)
- 4	130.6	(d)	-21	105.8	u)
- 5	134.1	(d)	-22	157.2	(s)
- 6	129.4	(d)	-23	110.8	(d)
- 7	133.5	(d)	-24	9.8	u)
- 8	133.3	(d)	-25	20.3	U)
- 9	129.3	(d)	-26	56.8	U)
-10	33.2	(t)	-27	172.8	(a)
-11	75.4	(d)	-28	48.6	(d)
-12	39.6	(d)	-29	17.7	U)
-13	68.4	(d)	-30	173.1	(s)
-14.	138.5	(s)	-31	45.5	(t)
-15	124.8	(d).	-32	26.2	(d)
-16	29.6	(t)	-33	22.4	U)
-17	36.2	(t)	-34	22.4	U)

* Multiplitität des Nicht-Resonanzspektrums

10. H-NMR-Spektrum (in CDCl₃) (vgl. Fig. 10) (G) Biologische Aktivität

Die Verbindungen T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV der vorliegenden Erfindung weisen biologische Aktivitäten auf, wie sie in der nachfolgenden Tabelle angegeben sind, und sie können in Antitumor-Mitteln verwendet werden.

Antitumor-Aktivität (in vitro) gegenüber L5178Y-Tumor-

zellen

Konz. (uer/ml)	T-23-XII
2,0	-
1.0	-
0.5	-
0.25	- ·
0.125	-
0.0625	• +

Zustand des Zellenwachstums

Ϊ-23-ΣΪΪΙ T-23-XIT

Zellenwachstum

_ kein Zellenwachstum

Das Zellenwachstum wurde festgestellt unter Anwendung eines Verdünnungsverfahrens, in dem ein Eagle-NEM-Medium (Nissui), ergänzt durch 10 % Pferdeserum und 100 mg/1 Asparagin, verwendet wurde und das 120 Studen lang bei 37°C kultiviert wurde.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein.

Beispiel 1

Eine ösenfüllung des Stammes T-23 von Streptomyces rishiensis, aufbewahrt auf einem Reagenzglas-Schrägagar-Medium, enthaltend 1,0 % lösliche Stärke, 0,2 % Hefeextrakt und 1,5 % Agar, wurde in einen Sakaguehi-Kolben inokuliert, der 100 ml Impfmedium, enthaltend 1,0 % lösliche Stärke, 1,0 % Abfallmolassen, 1,0 % Fleischextrakt und 1,0 % Polypepton (pH 7,0) enthielt. Der Kolben wurde auf einem hin und her gehenden Schüttler 48 Stunden lang bei 30°C inkubiert. Ein 0,5 ml-Anteil der Kultur wurde in einen Sakaguchi-Kolben inokuliert, der 100 ml des gleichen Mediums enthielt, und die Kultur wurde auf einem hin und her gehenden Schüttler 24 Stunden lang bei 30°C inkubiert, wobei man ein Impfinokulum für die Produktionskultur der Verwendung einer Flaschenfermentiervorrichtung erhielt.

Zur Durchführung der Produktionskultivierung wurden 6 Flaschen-Fermentiervorrichtungen aus rostfreiem Stahl mit einer Kapazität von 30 Liter verwendet, die jeweils 15,0 Liter eines Mediums (pH 7,0) enthielten, das 1,0 % Glucose, 1,5 lösliche Stärke, 1,5 % Sojabohnenmehl, 0,2 % getrocknete Hefe, 0,2 % Ammoniumsulfat, 0,5 % NaCl, 0,4 % gefälltes Calciumcarbonat und 0,33 % Antischaummittel (Toshiba "Silicone" YMA 6509) enthielt.

Das erhaltene Inokulum wurde in einem Mengenanteil von 4,0 % zu jeder Fermentiervorrichtung zugegeben und die Kultivierung unter Belüften und Rühren (15,0 l/min, 200 UpM) wurde 24 Stunden lang bei 30 C durchgeführt.

Unmittelbar nach Beendigung der Kultivierung wurden die Mycele mittels einer großen kontinuierlichen Zentrifuge abfiltriert, in 20 Liter einer 60%igen wäßrigen Acetonlösung unter Rühren für eine kurze Zeitspanne eingetaucht und dann 3 Stunden lang stehengelassen. Dann wurden die Mycele abfiltriert, wobei man einen Extrakt erhielt. Die gleiche Behandlung wurde zweimal wiederholt. Die Extrakte wurden miteinander vereinigt zu einer Menge von bis zu 40 Litern. Aus den kombinierten Extrakten wurde das Aceton im Vakuum abdestilliert, wobei 18,0 Liter einer wäßrigen Lösung zurückblieben. Zu dieser Lösung (18,0 Liter) wurden 6,5 kg Natriumchlorid zugegeben und die resultierende Lösung wurde zweimal mit jeweils 9,0 Liter Ethylacetat extrahiert. Die erhaltene Ethylacetatlösung wurde über Na₃SO₄ (1kg) getrocknet und eine Zeitlang stehengelassen. Nach dem Dehydratisieren wurde die Lösung im Vakuum auf ein geeignetes Volumen eingeengt. Zu dem erhaltenen Konzentrat wurde Hexan zugegeben, um dadurch die die aktiven Substanzen enthaltende Fraktion auszufällen. Der erhaltene Niederschlag wurde mit Hexan gewaschen und getrocknet. Die erhaltene rohe Mischung wurde in 150 ml Chloroform gelöst und an einer Silicagel-Kolonne (8 cm χ 40 cm) absorbiert, mit Chloroform gewaschen und mit Chloroform/Methanol (100:1) eluiert.

Die ersten 2,5 Liter des Eluats wurden verworfen, weil sie keine aktive Substanz enthielten, und danach wurden die folgenden Eluate in jeweils 15 ml-Portionen fraktioniert. Jede Fraktion wurde einer Dünnschichtchromatographie (Entwicklungslösungsmittel: Dichlormethan/Methanol = 15:1) unter Verwendung einer Silicagel-Platte aus Kieselgel 6°^F254 (^t* 5715) verworfen. Das erhaltene Chromatogramm wurde unter einer UV-Lampe bei 254 nm be-

trachtet, um die Anwesenheit der Verbindungen T-23 festzustellen, wobei gefunden wurde, daß die sechzehnte (16.) bis dreißigste (30.) Fraktionen eine reine Verbindung T-23-I, die zweiundvierzigste (42.) bis dreiundfünfzigste (53.) Fraktionen die Verbindung T-23-XI, die neunzigste (90.) bis einhundertdritte (103.) Fraktionen die Verbindungen T-23-X, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV enthielten und die einhundertzehnte (110.) bis einhundertzweiunddreißigste (132.) Fraktionen eine reine Verbindung T-23-II enthielten.

Die Fraktionen, die jeweils die Verbindungen T-23-I und T-23-II enthielten, wurden einzeln im Vakuum destilliert, um das Lösungsmittel daraus zu entfernen, wobei man 1,6 g eines gelben Pulvers der Verbindung T-23-I bzw. 12,1 g eines weißen Pulvers der Verbindung T-23-II erhielt.

Die die Verbindung T-23-XI enthaltenden Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt, wobei man 60 mg eines braunen PuI-vers erhielt, das die Verbindung T-23-XI enthielt. Das so erhaltene Pulver wurde in Aceton gelöst und die Lösung wurde einer süicagel-Dünnschichtchromatographie (Merk's Kieselgel 6OF₂₅₄ Art. 5744)' unterworfen, mit einem Lösungsmittelgemisch aus Dichlormethan und Methanol (15:1) entwickelt. Das erhaltene Chromatogramm wurde unter einer UV-Lampe bei 254 nm betrachtet. Dabei wurde gefunden, daß die Verbindung T-23-XI-Fraktion in der Nähe von R_f = 0,50 auftrat. Diese T-23-XI-Fraktion wurde herausgekratzt und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol (10:1) eluiert. Das Eluat wurde im Vakuum eingeengt, wobei man 24 mg eines weißen Pulvers der Verbindung T-23-IX erhielt. In entsprechender Weise wurden die Fraktionen, welche die Verbindungen T-23-X, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV enthielten, im Vakuum eingeengt, wobei man 85 mg eines rötlich-braunen Pulvers erhielt.

Das erhaltene Pulver wurde in einer geringen Menge Chloroform gelöst und die Lösung wurde einer präparativen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen (Hitachi 635A Liquid Chromatograph, Detector: Nihon Bunko UVIDEC 100, Kolonne: Kusano Kagaku C.I.G. Silica Gel Prepack Column CPS-153-1). Die Elution mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol (30:1) wurde bei einer Strömungsrate von 5 ml/min durchgeführt und das Eluat wurde durch Ultraviolett-Absorption bei 270 nm nachgewiesen, wobei ein der Verbindung T-23-X entsprechender Peak bei einer Retentionszeit von 18 Minuten auftrat, ein der Verbindung T-23-XII entsprechender Peak bei einer Retentionszeit von 19 Minuten auftrat, ein der Verbindung T-23-XIII entsprechender Peak bei einer Retentionszeit von 21 Minuten auftrat und ein der Verbindung T-23-XIV entsprechender Peak bei einer Retentionszeit von 22 Minuten auftrat. Die ihren jeweiligen Peaks entsprechenden Eluate wurden im Vakuum eingeengt, wobei man 45 mg der Verbindung T-23-X, 6 mg der Verbindung T-23-XII, 2 mg der Verbindung T-23-XIII.und 8 mg der Verbindung T-23-XIV jeweils in Form eines weißen Pulvers erhielt.

Beispiel 2

Das in Beispiel 1 beschriebene Verfahren wurde wiederholt, wobei man Fraktionen erhielt, welche jeweils die Verbindungen T-23-X, T-23-XII, T-23-XIII und T-23-XIV enthielten. Die Fraktionen wurden im Vakuum eingeengt, wobei man 85 mg eines rötlich-braunen Pulvers erhielt. Dieses rötlich-braune Pulver wurde einer Fraktionierungsbehandlung, wie nachstehend beschrieben, unterworfen. Das heißt, 85 mg des Pulvers wurden in Aceton gelöst und die Lösung wurde einer Dünnschichtchromatographie unterworfen (Merk's Kieselgel 6°^F254 ^Art· 5744) und mit einem gemischten Lösungsmittel aus Dichlormethan und Methanol (15:1) entwickelt. Das erhaltene Chromatogramm wurde unter einer

UV-Lampe bei 254 nm betrachtet, um die Anwesenheit der Τ-23-Substanzen festzustellen, wobei gefunden wurde, daß die Verbindung T-23-X-Fraktion in der Nähe von R_f = 0,32, die Verbindung T-23-XII-Fraktion in der Nähe von R_f = 0,31, die Verbindung T-23-XIII-Fraktion in der Nähe von R_f = 0,30 und die Verbindung T-23-XIV-Fraktion in der Nähe von R_f = 0,29 auftraten. Die ihren jeweiligen Verbindungen entsprechenden Fraktionen wurden herausgekratzt, einzeln mit einem gemischten Lösungsmittel aus Chloroform und Methanol (10:1) eluiert und die Eluate wurden einzeln im Vakuum eingeengt, wobei man 45 mg der Verbindung T-23-X, 6 mg der Verbindung T-23-XI, 2 mg der Verbindung T-23-XIII und 8 mg der Verbindung T-23-XIV jeweils in Form eines weißen Pulvers erhielt. 15

Claims

T 55 441 Anmelder: Nisshin Flour Milling Co., Ltd. 19-12, Nihonbashi-Koami-cho, Chuo-ku, Tokyo/Japan Patentansprüche

1. Mit Mycotrienin verwandte Verbindung, gekennzeichnet durch die folgende Struktürformel:

OH

worin R Isobutyl, sec-Butyl, Isopentyl oder Cyclohexyl bedeutet.
25

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Cyclohexyl bedeutet.

3. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Isopentyl bedeutet.

4. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R sec-Butyl bedeutet.

5. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß R Isobutyl bedeutet.

6. Mit Mycotrienin verwandte Verbindung, gekennzeichnet durch die folgende Strukturformel:

OCH,

7. Pharmazeutisches Mittel, dadurch gekennzeichnet, daß es als Wirkstoff mindestens eine Verbindung.nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gegebenenfalls in Kombination mit mindestens einem üblichen, pharmazeutisch verträglichen Träger und/oder Hilfsstoff, enthält.

8. Verwendung der Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Behandlung von Tumoren.