DE2303495A1 - Verfahren zur herstellung von ergosterin und seinen estern - Google Patents
Verfahren zur herstellung von ergosterin und seinen esternInfo
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Description
PATENTAN WÄtTC
DR.-ING. VON KREiSLER DR.-ING. SCHÖNWALD
DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES DIPL.-CHEM ALEK VON KREISLER
DIPL-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELTING
KOLNI1DEICHMANNHAuS
Kö?n, den 24.1.1973 AvK /Λχ/Bt
27, Doshomachi 2-ehome, Higashi-ku, Osaka, Japan
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Ergosterin und seinen Estern durch Züchtung von Mikroorganismen,
die Ergosterin oder seine Ester extrazellulär anzuhäufen vermögen und zu den Gattungen Trichoderma,
Fusarium und Cephalosporium gehören.
Ergosterin und seine Ester sind wichtig als Ausgangsverbindungen
für die Synthese von Vitamin D und als Vorstufe für die Herstellung von synthetischen Steroidhormonen und sind
sehr begehrt.
Ergosterin ist als Bestandteil der Zellen von Schimmel pil :■: en
und Hefen bekannt und wird durch Züchtung von Saecharomyccs cerevisiae gewonnen, wobei der Mikroorganismus veranlaßt
wird, Ergosterin intrazellulär anzuhäufen, und das Ergosterin
aus den Zellen extrahiert wird. Der Ergosteringehalt in den
Zellen ist jedoch nicht sehr hoch, weil Ergosterin als Bestandteil der Zellen vom Stoffwechsel system der Zellen abhängt.
Der Produktionssteigerung nach diesem bekannten Verfahren ist somit eine Grenze gesetzt. Die Extraktion der Zellen
ist ferner ziemlich umständlich und führt zu hohen Produktionskosten.
Erwünscht ist ein neues Verfahren, das die Herstellung von Ergosterin vorteilhafter und wirtschaftlicher
ermöglicht.
309831/0986
Gegenstand der Erfindung ist die Herste]Dung von Ergosterin
und seinen Estern nach einem großtechnisch vorteilhaften Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man Mikroorganismen,
die Ergosterin oder seine Ester extraze·] IuI ä.r
anzuhäufen vermögen und zu den Gattungen Trichoderma, Fusarium oder Cepha]osporium gehören, in einem Kulturmedium
züchtet, bis Ergosterin oder seine Ester im Kulturmedium angehäuft sind, und das Ergosterin in freier Form oder in
Form seiner Ester aus dem Kulturmedium isoliert.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mikroorganismen· vermögen Ergosterin oder seine Ester extrazellulär anzuhäufen.
Aufgrund der extrazellulär angehäuften großen
Menge der Endprodukte und der leichten Reinigung dieser Verbindungen
werden beim Verfahren gemäß der Erfindung Ergosterin oder seine Ester in hoher Ausbeute erhalten.
Die für die Zwecke der Erfindung verwendeten Mikroorganismen gehören zu den Gattungen Trichoderma, Fusarium und
Cepha]osporium. Genauer gesagt, die Mikroorganismen der Spezies Trichoderma sp., zu denen der Stamm Trichoderma
sp. IFO 6^55 gehört, der Spezies Trichoderma viride, der
Spezies Fusarium sp., wozu Fusarium sp. IFO 8884 (ATCC
20192) gehört, der Spezies Fusarium oxysporum, der Spezies
Fusarium roseum, der Spezies Cephalosporium coremioides
oder der Spezies CephalosporJum sclerotigenum werden verwendet
.
Als typische Beispiele von Mikroorganismen, die -für die
Zwecke der Erfindung geeignet sind, seien genannt: Trichoderma sp. IFO 6^55, Trichoderma viride IFO 9066,
Fusarium sp. S-I9-5 IFO 8884 (ATCC 20192), Fusarium oxysporum
IFO 447], Fusarium roseum IFO JJ89, Cephalosporium
coremioides IFO 8579 und Cephalosporium sclerotigenum
IFO 8385,ihre Mutanten und Varianten, die Ergosterin und seine Ester anzuhäufen.vermögen" "uno^aurcR^BeTiandlung der
309831/0986
vorstehend genannten Mikroorganismen mit UV-Licht, Röntgenstrahlen
oder γ-Strahlen oder mit chemischen Mitteln, z.B.
Natriumnitrit und N-Methyl-N1-nitro-N-nitrosoguanidin, erhalten
worden sind.
Die vorstehend als typische Beispiele genannten Mikroorganismen sind beim Institute for Fermentation, Osaka, Japan, und
bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter den jeweiligen IFO- und ATCC-Nummern hinterlegt und
der Öffentlichkeit zugänglich.
Verschiedene Arten von Estern von Ergosterin mit Fettsäuren können ausschließlich oder gleichzeitig mit freiem Ergosterin
durch Züchtung der verwendeten Mikroorganismen hergestellt
werden. Infrage kommen beispielsweise Ester mit Fettsäuren,
die 2 bis 19 C-Atome enthalten. Als typische Beispiele
solcher Fettsäuren sind niedere Fettsäuren wie Essigsäure und höhere Fettsäuren mit 14 bis 1δ C-Atomen, z.B.
Palmitinsäure, Stearinsäure und Oleinsäure, zu nennen.
Durch Zugabe der bevorzugten Fettsäure oder ihrer Derivate, z.B. der Ester, zum Kulturmedium können die verschiedensten
Arten von Fettsäureestern von Ergosterin hergestellt werden. Wenn die vorstehend genannten Fettsäuren dem Kulturmedium
zugesetzt werden, ist es möglich, das gebildete Ergosterin
in Form der entsprechenden Fettsäureester zu isolieren.
Die Mikroorganismen können auf einem festen Medium oder in einem flüssigen Medium gezüchtet werden, jedoch ist für die
Großherstellung die Verwendung eines flüssigen Mediums zweck
mäßig. Bei Verwendung eines flüssigen Mediums kann die Züchtung unter Schütteln oder unter Belüftung und Rührung durchgeführt
werden.
Das für das Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Kulturmedium enthält assimilierbare Kohlenstoffquel1 en, verwert-
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bare Stickstoffque]Den, anorganische Sa]ze und Wachstumsfaktoren.
' ,
A]s Koh]enstoffque]]en eignen sich beispie]sweise Kohlenwasserstoffe,
z.B. Norma]paraffine, insbesondere C,Q- CpQ-Paraffine
(z.B. Decan, Undecan, Dodecan, Tridecan, Tetradecan, Pentadeean, Hexadecan, Heptadecan, Octadecan, Nonadecan und
Eicosan) und ihre Gemische, Saccharide (z.B. Glucose, Saccharose, Stärke, ]ös]iche Stärke, Endmelasse, Xylose und
Galactose), Glycerin, Inosit, Mannit, Hirsegel, Sorbit, Dextrin, Essigsäure, Methanol und jS.thano]. Die Kohlenwasserstoffe,
insbesondere n-Paraffine, können im Medium als geeignetste
Kohlenstoffquellen zur Anhäufung einer großen Menge
von Ergosterin oder seinen Estern im Medium verwendet werden.
Als Stickstoffquell en eignen sich beispielsweise Bestandteile
oder Extrakte von Tieren (z.B. Pepton, Fleischextrakt und Casein), Bestandtei3e oder Extrakte von Pflanzen,(z.B.
Maisquel!wasser, entfettetes Sojabohnenmehl, Trockenhefe,
Hefeextrakt, Proteinhydro]ysate (z.B. das enzymatische Hydrolysat von Sojabohnenprotein oder Caseinhydrolysat),
Sojabohnenmehl, Baumwol]saatmehl, Reiskleie und Weizenkleie),
Ammoniumsalze von organischen Säuren (Ammoniumsuccinat,
Ammoniumtartrat und Ammoniumacetat), anorganische Stickstoffverbindungen
(z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsu]fat und Ammoniumphosphat)
und organische Stickstoffverbindungen (z.B. Harnstoff).
Als anorganische Sa]ze werden beispielsweise Phosphorsäuresa]
ze und Metallsalze, z. B. Ka]iumsalze, Magnesiumsalze
oder Ca]ciumsalze, verwendet.
Als Wachstumsfaktoren werden beispielsweise Vitamine, z.B.
Biotin oder Thiamin, verwendet.
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Die Kultivierungsbedingungen, d.h. der pH-Wert des Mediums,
die Ku]tivierungstemperatur und Kultivierungszeit, werden
so gewählt, daß der Mikroorganismus Ergosterin oder seine
Ester in maximaler Menge anhäuft. Beispielsweise wird bei
der Schütte]kultür oder Submerskultür die Züchtung vorteilhaft
bei einer Temperatur von 15 bis 45°C, vorzugsweise
20 bis 380C, und bei einem pH-Wert von 2 bis 9, vorzugsweise
k bis 8, 30 bis j56o Stunden, vorzugsweise 72 bis 192
Stunden durchgeführt.
Die Isolierung und Reinigung des angehäuften Ergosterins
oder der angehäuften Ester von Ergosterin erfolgen in an sich bekannter üblicher Weise. Beispielsweise kann das Kulturmedium
mit einem organischen!Lösungsmittel, .z.B. n-Hexan,
Cyclohexan, Benzol, Äthylacetat, Butylacetat und Chloroform,
extrahiert werden. Die Extraktion kann gegebenenfalls nach
der Entfernung des Mycels vorgenommen werden. Die Produkte gehen bei der Extraktion in das organische Lösungsmittel
über. Die Schicht des organischen Lösungsmittels wird abgetrennt
und unter vermindertem Druck eingedampft, wobei als Rückstand ein brauner Sirup erhalten wird. Der Rückstand
wird in Chloroform gelöst und die Lösung über eine mit Kiesel gel oder Aluminiumoxyd gefüllte Säule geleitet. Als Entwickler
für die Elution wird Chloroform, Petroläther oder Erdöl benzin verwendet. Isoliert werden die Fraktionen, die
eine starke Absorption bei 285 rau zeigen.
Diese isolierten Anteile werden in einem Lösungsmittel, z.B. Hexan und Äthanol, gelöst und in einem kai ten Raum stehen
gelassen, wobei sich das gewünschte Produkt in Form /Kristal len
abscheidet. von
Die Erfindung wird in den folgenden Beispielen weiter erläutert.
Hierin verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich
zu Raumteilen wie Gramm zu ~mI7
309831/0988
Eine Kultur von Fusarium sp. S-]9-5 (IFO 8884, ATCC 20]92)
wird auf einen schräg erstarrten Mährboden (pH 6,5) geimpft, der 1$ Malzextrakt, 1$ Glucose, 1$ Polypepton und 2% Agar
enthält, und 168 Stunden bebrütet.
50 Raumteile eines Impfkulturmediums (pH 6,5), das 2$ Glucose,
2% Sojabohnenmehl, 0,1$ KH2PO^ und 0,5$ Sojabohnenöl
enthält, wird in einen Fermenter gegossen, der ein Fassungsvermögen von 300 Raumteilen hat. Nach Sterilisation für
20 Minuten bei 1200C wird das Medium zur Herstellung einer
Impfkultür mit dem auf der Schrägkultur wachsenden Mycel
geimpft und dann 48 Stunden bei 24°C gehalten.
1000 Raumteile eines Fermentationsmediums (pH 6,5), das
1~y$>
η-Paraffin (Gemisch von Decan, Undecan, Dodecan und
Tridecan), 7$ Polypepton S (Hersteller Daigo Nutritive Chemicals, Ltd.), 0,8$ KHgPO^, 0,2$ KgHPO^, 0,1$ FeSO21.- χ
7H2O, 0,05$ MgSO^.7H2O, 0,01$ CaCl2.2H2O, 0,5$ Sojabohnenöl,
0,5$ der oberflächenaktiven Verbindung "Tween 60" und 1$ "
CaCO, enthält, wird in einen Fermenter gegossen, der ein Fassungsvermögen von 5OOO Raumteilen hat. Nach Sterilisation
für 20 Minuten bei 1200C wird das Medium mit 50 Raumteilen
der oben genannten Impfkultür geimpft und dann 90 Stunden
bei 24°C bebrütet.
Das hierbei erhaltene Kulturmedium wird zur Entfernung des Mycels zentrifugiert. Die Kulturflüssigkeit wird dreimal mit
dem 0,5-fachen Cyclohexanvolumen extrahiert. Die Cyclohexanschichten
werden isoliert und durch Behandlung mit Natriumsulfat getrocknet und dann unter vermindertem Druck eingedampft.
Da1S hierbei erhaltene Konzentrat wird in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung wird der Säulenchromatographie
an Kieselgel (Hersteller Merck & Co.Inc.) unterworfen,
wobei Petroläther-a-1 s-Entwioklep-verwendet wird.
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Von den Petrolätherfraktionen werden diejenigen, die eine
starke Absorption bei 283 ipu zeigen, aufgefangen und eingeengt. Der Rückstand wird in Äthanol gelöst und zwei Tage in
einem kalten Raum stehen gelassen. Die ausgefällten rohen farblosen feinen Nadeln werden abfiltriert und aus Äthanol
umkristallisiert, wobei 0,650 Gew.-Teile Ergosterylpalmitat
in Form von farblosen Plättchen erhalten werden.
Die Kristalle haben einen Schmelzpunkt von 108°C und eine
in ChI oroforml b'sung gemessene optische Drehung von
/α_7_ s= - 58 . Die physikal ischen und chemischen Eigenschaften
stimmen mit den in der Literatur (z.B. Journal of the Pharmaceutical Society of Japan 8j5 (I962) . 107) genannten
Werten gut überein. Das Produkt enthält Kohlenstoff-, Wasserstoff-
und Sauerstoffatome. Die Elementaranalyse ergibt
82,8$ C und 11,6$ H. Das Molekulargewicht wird durch Massenspektrometrie
mit 6^5 ermittelt.· Das Infrarotspektrum ist
mit dem in der Literatur veröffentlichten Infrarotspektrum
völlig identisch. I
Die Mutterlauge, die bei der Entfernung der Kristalle von Ergosterylpalmitat durch Filtration zurückbleibt, wird ein-'
gedampft und in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung
wird durch eine Kiesel gel säule geleitet, worauf mit Chloroform
eluiert wird.
Die auf die Elution von Ergosterylpalmitat folgenden Anteile
werden aufgefangen und eingeengt, wobei 0,2 Gew.-Teile Ergosterin in Form eines gelben Pulvers erhalten werden. Das
Produkt ist in den physikalischen und chemischen Eigenschaften mit einer authentischen Probe von Ergosterin identisch.
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«Beispiel 2
Eine Kultur von Trichoderma sp. IFO 6j555 wird auf einen in
Röhrchen schräg erstarrten Nährboden, der 1$ Malzextrakt, 1$
Glucose, 1$ Polypepton und 2$ Agar enthält, geimpft und 168
Stunden bei 240C bebrütet.
50 Raumteile eines Nährmediums (pH 6,5) für eine Impfkultur,
das 2$ Glucose, 2% Sojabohnenmehl, 0,1$ KHgPO^ und 0,5$ Sojabohhenöl
enthält, wird in einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen
von JOO Raumteilen gegossen. Nach Sterilisation für 20 Minuten bei 1200C wird das Nährmedium mit dem Mycel der
Schrägkultur geimpft und dann zur Bildung einer Impfkultür
48 Stunden bei 24°C gehalten. · ■■'■
Je 20 Raumteile eines FermentationsmedjLums (pH 6Λ5)>
das Ij5$ η-Paraffin (Gemisch von Decan, Undecan, Dodecan und Tridecan),
7$ Polypepton S (Hersteller Daigo Nutritive Chemicals, Ltd.),
0,8$ KH2POj1, 0,2$ K2HPO4, 0,1$ PeSO^.7H2O, 0,05$ MgSO^.7HgO,
0,01$ CaCIg.2HgO, 0,5$ Sojabohnenöl, 0,5$ der oberflächenaktiven
Verbindung "Tween 60" und 1$ CaCO^ (getrennt sterilisiert) enthält, werden in 50 Fermenter gegossen, die ein Fassungsvermögen
von jeweils 200 Raumteilen haben. Nach Sterilisation
für 20 Minuten bei 120°c wird jedes Medium mit 1 Raumteil der Impfku3tür geimpft und dann 90 Stunden bei 24°C bebrütet. Nach
der Bebrütung werden die Kulturmedien zusammengegossen, worauf das Mycel durch Zentrifugiere'n entfernt wird. Die Kulturflüssigkeit
wird dreimal mit dem halben Volumen η-Hexan extrahiert. Die Hexanschicht wird mit Natriumsulfat getrocknet und dann,
unter vermindertem Druck eingedampft. Das Konzentrat wird in Chloroform gelöst und der Säulenchromatographie an Kiesel gel
(Hersteller Merck & Co., Inc.) unterworfen.
Eluatanteile mit hoher Extinktion bei 283 mu werden aufgefangen,
eingeengt und in η-Hexan gelöst. Die Lösung wird zwei Tage in einem kalten Raum stehen gelassen. Die ausgefällten farblosen
feinen Nadeln werden abfiltriert und aus Äthanol umkristalli-
309831/0988
siert, wobei 0,56 Gew.-Teile Ergosterylpalmitat in Form von
färb]ösen Plättchen erhalten wird.
Die nach Entfernung der rohen Kristalle von Ergosterylpalmitat
durch Filtration erhaltene Mutterlauge wird eingedampft
und der Rückstand in Chloroform gelöst. Die Chloroformlösung
wird der Säulenchromatographie an Kiesel gel unterworfen.
Die nach der Elution von Ergosterylpalmitat folgenden
Fraktionen werden aufgefangen und eingeengt, wobei 0,15 Gew.-Teile Ergosterin als gelbes Pulver erhalten wird.
Das Produkt hat die gleichen physikalischen und chemischen
Eigenschaften wie eine authentische Probe von Ergosterin.
Beispiel 3 '
1000 Raumteile eines Nährmediums (pH 6,5), das iy#>
n-Paraffin (Gemisch von Tetradecan, Pentadecan und Hexadecan), 7$
Polypepton S (Hersteller Daigo Nutritive Chemicals, Ltd.), 0,8^ KH2PO2^, 0,2$£ K2HPO^, 0,1$ FeSO2,..7H2O, 0,05# MgSOj1.7HgO,
0,01$ CaCl2.2H2O, 0,5$ Sojabohnenöl, 0,5$ der oberflächenaktiven
Verbindung "Tween 60" und Λ% CaCO-, (getrennt sterilisiert)
enthält, wird in. einen Fermenter mit einem Fassungsvermögen von 3000 Raumteilen gegossen. Nach der Sterilisation
für 20 Minuten bei 120°C wird das Medium mit 50 Raumteilen
der auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise hergestellten
Impfkultur von Fusarium sp.S-19-5 (IFO 8884, ATCC 20192) geimpft.
Das geimpfte Medium wird auf die^in Beispiel 1 beschriebene
Weise bebrütet und gereinigt, wobei 0,58 Gew.-Teile Ergosterylpalmitat
und 0,18 Gew.-Teile Ergosterin erhalten werden.
309831/0986
Fusarium oxysporum IFO 4471 wird in der gleichen Weise und
unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 verwendet, wobei 0,3 Gew.-Teile Ergostery]palmitat und 0,15 Gew.-Teile
Ergosterin aus 1000 Raumteilen Kulturmedium erhal ten;. werden.
1000 Raumteile eines Nährmediums (pH 6,5), das 5$ Saccharose, 7$ Polypepton S, 0,8$ KHgPO2+, 0,2$ KgHPO2+, 0,1$ FeSO2+^HgO, "
0,05$ MgSO2+^HgO, 0,01$ CaCIg.2HgO, 0,5$ der oberflächenaktiven
Verbindung "Tween 60", 1$ CaCO^ und 5$ n-Paraffin
(Gemisch von Decan, Undecan, Dodecan und Tridecan) enthält, wird mit einer Impfkultür von Cephalosporium coremioides
IFO 8579 auf die in Beispiel 2 beschriebene Weise geimpft
und 90 Stunden bebrütet. Das Kulturmedium wird auf die in
Beispiel 2 beschriebene Weise aufgearbeitet, wobei 0,52 Gew.-Teile Ergostery]palmitat und 0,23 Gew.-Teile Ergosterin erhalten
werden.
1000 Raumteile eines Nährmediums (pH 6,5), das 13$ n-Paraffin
(Gemisch von Heptadeoan, Octadecan, Nonadecan und Eicosan),
7$ Polypepton S , 0,8$ KHgPO2+, 0,2$ KgHPO2+, 0,1$ FeSO2+^HgO,
0,05$ MgSO2+^HgO, 0,01$ CaCIg.2HgO, 0,5$ Sojabohnenöl, 0,5$
der oberflächenaktiven Verbindung "Tween 60" und 1$ CaCO1,
(getrennt sterilisiert) enthält, wird in einen Fermenter
mit einem Fassungsvermögen von 3000 RaumteiJen gegossen.
Nach Sterilisation für 20 Minuten bei 120°C wird das Medium
mit 5Θ Raumteilen der gemäß Beispiel 1 hergestellten Impfkultur
von Fusarium sp. S-I9-5 (IFO 8884, ATCC 20192) geimpft
.
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- 33 -
Das geimpfte Medium wird·auf die in Beispiel 3 beschriebene
Weise bebrütet und gereinigt, wobei 0,53 Gew.-Teile Ergostery]pa3mitat
und 0,3 5 Gew.-Teile Ergosterin erhalten werden.
309831 /0986
Claims (3)
- - 12 PatentansprücheVerfahren zur Herstellung von Ergosterin oder seinen Estern,dadurch gekennzeichnet, daß man Mikroorganismen, die Ergosterin oder seine Ester extrazellulär anzuhäufen vermögen und zu den Gattungen Trichoderma, Fusarium und Cephalosporium gehören, in ein Nährmedium impft, die Kultur bebrütet, bis sich Ergosterin oder seine Ester im Kulturmedium angehäuft haben, und das Ergosterin in freier Form oder seine Ester aus dem Kulturmedium isoliert.
- 2) Verfahren'nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikroorganismen Trichoderma sp. IFO 6355* Trichoderma viride, Fusarium sp. IFO 8884 (ATCC 20]92)', Fusarium oxysporum, Fusarium roseum, Cephalosporium coremioides oder Cepha]osporium sclerotigenum verwendet werden.
- 3) Verfahren nach Ansprüchen 3 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Nährmedien'verwendet werden, die n-Paraffine mit 10 bis 20 C-Atomen'aDs Kohlenstoffque]Ie enthalten."309831 /0986
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| NICHTS ERMITTELT * |
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