DE2254505A1 - Verfahren zur herstellung von cephalosporin c - Google Patents

Description

DR.-ING. VON KREISLER DR.-ING. SCHÖN WALD DR.-ING. TH. MEYER DR. FUES, DIPI.-CHEM. ALEK VON KREISLER D1PL.-CHEM. CAROLA KELLER DR.-ING. KLÖPSCH DIPL.-ING. SELtING

KÖLN 1, DEIGHMANNHAUS

Köln, den 2.11.1972 Kl/Ax

Takeda Chemical Industries, Ltd.,

27, Doshomachi 2-chome, Higashi-ku, Osaka (Japan).

Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C durch Züchtung neuer Mikroorganismen, die als Cephalosporium polyaleurum bezeichnet werden. Cephalosporin C ist eine wichtige Verbindung, die als Ausgangsverbindung für die Synthese anderer Antibiotika vom Cephalosporintyp wertvoll ist.

Cephalosporin C wird durch Kultivierung von Mikroorganismen, die Cephalosporin C bilden, hergestellt. Obwohl es bekannt ist, daß Mikroorganismen, die zu einigen Spezies gehören, nämlich Cephalosporium acremoniura, Emericellopsis glabra und Emericellopsis microspora, Cephalosporin C bilden, wurden auf Grund der Tatsache, daß die von ihnen gebildete : Menge an Cephalosporin C gering ist, keine anderen Mikroorganismen außer Cephalosporium acremonium CMI 49157 und sein Mutant 8650 (ATCC-14553) für die Großherstellung von Cephalosporin C verwendet. Ferner bilden alle bisher bekannten Cephalosporin C bildenden Mikroorganismen gleichzeitig Penicillin N in einer Menge, die ein Mehrfaches der gebildeten Menge an Cephalosporin C ist.

Die Abtrennung von Cephalosporin C vom Gemisch aus Cepha-

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losporin C und Penicillin N erfolgt unter Ausnutzung des Vorteils des Unterschiedes in ihrer Säurebeständigkeit
durch Säurebehandlung des Gemisches. Cephalosporin C ist zwar säurebeständiger als Penicillin N, jedoch wird ee
ebenfalls durch Säure mehr oder weniger zersetzt. Es ist daher erwünscht, den Anteil von Penicillin H im Kulturmedium möglichst gering zu halten.

Es wurde nun gefunden, daß ein neuer Mikroorganismus, der vom Boden in Wakayama, Japan, isoliert wurde und als
Cephalosporium polyaleurum bezeichnet wird, Cephalosporin in einer weit größeren Menge als Penicillin N, nämlich im allgemeinen zehnmal mehr Cephalosporin C als Penicillin N bildet.

Gegenstand der Erfindung ist demgemäß die Herstellung von Cephalosporin C nach einem Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen zu Cephalosporium polyaleurum gehörenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium züchtet, Cephalosporin C im Medium anhäuft und das angehäufte
Cephalosporin C aus dem Kulturmedium isoliert.

Bei; Verfahren gemäß der Erfindung beträgt die gleichzeitig it Cephalosporin C gebildete Menge an Penicillin N
wen.' £qt als 1/10 der Menge an Cephalosporin C, so daß es möglich ist, auf die Säurebehandlungsstufe bei der Reinigung von Cephalosporin zu verzichten, da diese geringe
Menge an Penicillin N in den anschließenden Reinigungsstufen, insbesondere bei der Kristallisation von Cephalosporin C, vollständig entfernt wird. Ferner sind die beim Verfahren gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen in der Lage, eine weit größere Menge an Cephalosporin C
als die bisher bekannten Mikroorganismen anzuhäufen. Zwar wird bei diesem Verfahren gleichzeitig Helvolsäure
gebildet, jedoch kann diese Säure beispielsweise durch
Extraktion mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat oder Butylacetat, leicht vom

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Cephalosporin C abgetrennt werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist somit für die Großherstellung von Cephalosporin C weit vorteilhafter.

Die gemäß der Erfindung verwendeten Mikroorganismen Cephalosporium polyaleurum 199 und Cephalosporium polyaleurum Y-505 sind beim Fermentation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, Chiba, Japan, unter den Nummern FERM-P 1159 "bzw.- FERM-P 1160 und bei der American Type Culture Collection, Maryland, USA, unter den Nummern ATCC-20359 bzw. ATCC-20360 hinterlegt worden.

Um nachzuweisen, daß der Stamm Cephalosporium polyaleurum 199 zu einer neuen Spezies gehört,, sind nachstehend seine mikrobiologischen Eigenschaften und Kulturmerkmale genannt. Die nachstehend genannten Eigenschaften wurden, bei Kultivierung für 168 Stunden bei 27°C beobachtet.

I) Kultureigenschaften auf Agar '

1) Malzextrakt-Agar-Medium

Wachstum: schnell, sieht ausbreitend, spinnwebenartig, mit spärliehem Luftmycel, zunächst weiß, wird dann leicht blaß cremefarben.

Lufthyphen: 1,0 bis 1,5 η breit
Rückseite: glasklar (hyalin)

2) Kartoffelagarmedium

Wachstum: schnell, sich ausbreitend, mit sehr reichlichem weißem bis blaßbraunem Luftmycel. Rückseite: glasklar (hyalin) bis blaßgelb

3) Czapek-Agar

Wachstum: schnell, sich ausbreitend, mit reichlichem reinweißem Luftmycel
Rückseite: glasklar (hyalin)

4) Hafermehlagar ^ Wachstum: schnell, sich ausbreitend

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Rückseite: glasklar (hyalin) bis blaßgelb

5) 1$iges Glucosebouillonagar

Wachstum: schnell, sich ausbreitend Lufthyphen: reichlich
Rückseite: blaßgelb

II) Morphologische Eigenschaften

1) Konodiophoren entwickeln sich zu Beginn des Wachstums spärlich, erheben sich oder richten sich auf als Seitenzweige an Lufthyphen, 40 bis 6Ou Länge, 1,0 bis 1,5 A Breite, am Fuß 2 Ai breit, zum größten Teil . unverzweigt, bilden einen schleimigen Konidienball.

2) Konidien sind flaschenförmig (phialosporous), elliptisch, gerade, 1,5· bis 20 χ 3 bis 6 yu, glasklar (hyalin), einzellig.

3) Aleuriosporen entwickeln sich reichlich endständig oder .pleurogen an Hyphen, birnenförmig, gerade oder leicht gekrümmt, dickwandig, haben eine trennende Faltenkrause (frill) an der Base, gewöhnlich einzeln, 3 bis 4 χ 4 bis 6 u, glasklar (hyalin)

4) Ein Organ für die geschlechtliche Vermehrung wird nicht gebildet.

III) Die optimale Temperatur für das Wachstum beträgt 25 bis 30⁰C und der optimale p^-Wert 5,0 bis 7,0.

Aus der Klassifierung in "Ainsworth and Bisby's Dictionary of Fungi", 6. Auflage, ergibt sich, daß·die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen zu Fungi Imperfeeti, Ordnung Moniliales, Familie Moniliacea, Gattung Cepholsoporium gehören, mit denen sie die Bildung eines schleimigen Konidienballes am oberen Ende der Konidiophoren gemeinsam haben.

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Aus der Tatsache, daß die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen dadurch gekennzeichnet sind, daß sie die Fähigkeit zur reichlichen Bildung von charakteristischen Aleuriussporen und eine stark verringerte Konidienbildung haben, ergibt sich eindeutig, daß sie nicht zu irgendwelchen Spezies der Gattung Cephalosporium gehören, die, aus "Kryptogamenflora der Mark Brandenburg VIII (1907) von "Rabe'nhorst'V'Mycologia¹¹ !55 (1965) von Sakapure und Thirumalachar und "Colorado State University" Nr.248 (1965). von Dureil bekannt sind.

Bezüglich ähnlicher Spezies gleicht der erfindungsgemäß . verwendete Mikroorganismus dem Cephalosporium acremonium in der Farbe des Wachstums und in der Größe der Konidien, aber der erstere läßt sich leicht vom letzteren dadurch unterscheiden, daß er wenige Konidien hat und zahlreiche Aleuriosporen bildet, und daß die Konidiophofen des ersteren kürzer sind als die des letzteren. .

Der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus gleicht Cephalosporium asteroides Grutzii Ben in Bezugvauf die Bildung weniger Konidien und die kurzen Konidiophoren, jedoch unterscheidet er sich vom letzteren in der Bildung von Aleuriosporen. Die reichliche Bildung der Aleuriosporen ist eines der auf fallenden Merkmale des erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismus. Demzufolge wurde festgelegt, daß der erfindungsgemäß verwendete Stamm 199 zu einer neuen Spezies der Gattung Cephalosporium gehört, und die Spezies ist nunmehr als Cephalosporium polyaleurum bezeichnet ■worden.

Die bekannten Stämme, die Cephalosporin bilden, erzeugen gleichzeitig Penicillin N und Cephalosporin C und P, jedoch bildet der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus kein Cephalosporin C, aber Helvolsäure. Diese Tatsache ist ebenfalls ein auffallendei-Merkmal des erfindungsgemäß· verwendeten Mikroorganismus.

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Gemäß der Erfindung werden zur neuen Spezies Cephalosporium polyaleurum gehörende Mikroorganismen verwendet. Außer dem oben genannten Stamm 199 können Mutanten, die beispielsweise durch Bestrahlung des Stammes 199 mit Ultraviolettlicht oder durch Teilung von einzelnen Zellen des oben genannten Stammes erhalten werden, für die Zwecke der Erfindung verwendet werden.

Als Kulturmedien können für die Zwecke der Erfindung alle für die Züchtung der bekannten Mikroorganismen der Gattung Cephalosporium verwendeten Medien verwendet werden. Als Kohlenstoffquellen eignen sich beispielsweise Saccharide (z.B. Glucose, Saccharose, Stärke und lösliche Stärke), Endmelassen, η-Paraffine, Essigsäure, Äthanol, Glycerin und Sorbit. Als Stickstoffquellen eignen sich beispielsweise anorganische Stickstoffverbindungen, z.B. Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat und die verschiedenen Arten von Ammoniumsalzen und -nitraten, und organische Stickstoffverbindungen, i..B. Harnstoff, Fleischextrakt, Pepton, Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl, Maisquellwaaser, Hefeextrakt, Trockenhefe und Kasein. Metallsalze, z.B. Kalium-, Magnesium- und Calciumchlorid, -carbonat und phosphat, können dem Kulturmedium zugesetzt werden, falls erforderlich. Durch Zusatz von Stoffen wie Methionin, Cystin, Cystein, Methyloleat und Schmalzöl zum Medium wird die Ausbeute an Cephalosporin C gewöhnlich erhöht.

Die Züchtung wird vorteilhaft in der Submerskultur unter Belüftung bei einer Temperatur von 15 bis 37⁰C, vorzugsweise 20 bis 32⁰C, und bei p_H-^werten von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8, 10 bis 360 Stunden, vorzugsweise 48 bis 240 Stunden durchgeführt.

In dem in dieser Weise fermentierten Kulturmedium werden eine weit größere Menge Cephalosporin C und Helvolsäure und eine geringe Menge Penicillin N angehäuft. Diese Substanzen werden kaum intrazellulär, sondern hauptsächlich extrazellulär angereichert.

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Die Abtrennung von Cephalosporin C vom Kulturmedium erfolgt zweckmäßig, indem man zunächst das Kulturmedium filtriert und die Zellen mit Wasser wäscht und dann das Cephalosporin C vom Gemisch aus Filtrat und Waschflüssigkeit abtrennt. Die_ Abtrennung des in dieser Weise angehäuften Cephalosporin C aus dem Gemisch kann nach allen für die Abtrennung von Cephalosporin C an sich bekannten Methoden erfolgen. Beispielsweise wird der ρτ,-Wert des Gemisches auf etwa 5 eingestellt und das Gemisch zur Extraktion der Helvölsäure mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, z.B. Äthylacetat oder Butylacetat, behandelt. Cephalosporin C und Penicillin Ii liegen im wässrigen Teil . vor. Der wässrige Teil wird über eine Aktivkohlesäule geleitet und mit wässrigem Aceton eluiert.Die hierbei erhaltene Aceton-Vi'asser-Lösung wird gegebenenfalls nach Einengung durch eine Säule eines schwach basischen Ionenaustauscherharzes geleitet und.mit einer geeigneten Lösung, z.B. einer Ämmoniumacetat-Essigsäure-PufferlÖsungj eluiert. Die vorstehend genannten Verfahrensschritte können.wiederholt werden. Anschließend kann das Uatriumsalz von Cephalosporin C in Kristallform abgetrennt werden. Penicillin wird im gereinigten Produkt nicht festgestellt. Die gereinigten Kristalle sind iri allen physikalischen und ehemischen Eigenschaften mit den in der Literatur genannten Eigenschaften von Cephalosporin identisch.

Die Helvolsäure kann, falls gewünscht, ebenfalls nach an/ sich bekannten Reinigungsverfahren isoliert werden. Die vereinigte Lösung aus Kulturfiltrat und Waschflüssigkeit wird mit einer Säure, z.B.Salzsäure, auf p™ 5,0 eingestellt und anschließend mit. einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, z.B. Butylacetat, behandelt. Die Helvolsäure geht in die Lösungsmittelschicht über. Nach Einengung zu einem Sirup wird dieser der Säulenchromatographie an Kieselgel unterworfen. Durch Einengen des die Helvol- ■ säure enthaltenden Eluats werden rohe Kristalle von Helvolsäure erhalten. Die rohen Kristalle werden durch Um-

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kristallisation gereinigt, wobei Helvolsäure in Form von weißen Nadeln erhalten wird»

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert. In diesen Beispielen verstehen sich die Teile als Gewichtsteile, falls nicht anders angegeben. Gewichtsteile verhalten sich zu Raumteilen wie Gramm zu Kubikzentimeter. Die Prozensätze basieren auf Gewicht/Volumen (g/100 ml), falls nicht anders angegeben.

Beispiel 1

100 Raumteile eines Impfkulturmediums (p_H 7,0), das 3,0$ Saccharose, 1,5$ Fleischextrakt, 0,5$ Maisquellwasser und 0,15^ CaCO, enthält, werden in einen Fermenter gegossen, der ein Fassungsvermögen von 400 Raumteilen hat. Nach der Sterilisation wird das Medium mit einer Kultur von Cephalosporium polya.leurum 199 (PERM-P Nr. 1159, ATCC-20259) geimpft und dann 48 Stunden bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelvorrichtung bei 200 UpM bebrütet.

5000 Raumteile eines Fermentationsmediums (p^ 7,0), das 3,0$ Saccharose, 3,0$ rohes Sojabohnenmehl, 0,5$ DL-Methionin und 0,15$ CaCO, enthält, wird in einen Fermenter gegossen, der ein Fassungsvermögen von 20000 Raumteilen hat, und dann sterilisiert. Zum Fermentationsmedium werden 400 Raumteile des Inocolums gegeben. Nach Bebrütung für 144 Stunden bei 24°C ,zeigt das fermentierte Medium pro ml eine Potenz von 165 yUg Cephalosporin C, 150 Mg Helvol— säure und nicht mehr als 10 ag Penicillin N.

Das Kulturmedium wird dann zur Entfernung des Mycels filtriert. 25ΟΟ Raumteile des Filtrats werden mit Salzsäure auf P^ 5,0 eingestellt. Diese Lösung wird zweimal mit dem halben Volumen an Äthylacetat extrahiert. Die wässrige Schicht wird zur Adsorption von Cephalosporin C durch eine Aktivkohlesäule geleitet, worauf das Cephalosporin C mit einem Gemisch von* je 50 Vol.-$ Aceton und Wasser eluiert wird. Das Eluat wird durch eine Säule des Ionenaus-

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tauscherharzes Amberlite IRA-9OO (Aoetatform) (Rohm and . Haas Comp.) geleitet. Das adsorbierte Cephalosporin C wird -mit einer 0,2-molaren Ammoniumacetatpufferlösung (p_H 5,0) eluiert. \

Die Teile von Cephalosporin C, die antibakterielle Wirkung zeigen, werden aufgefangen und unter vermindertem Druck eingeengt» Das Konzentrat wird zur Adsorption von Cephalosporin C durch eine Aktivkohlesäule geleitet. Das Antibiotikum wird mit einem Gemisch von je 50 VoI*-# Aceton und Wasser eluiert und das Eluat unter vermindertem Druck eingeengt. Das Konzentrat wird in eine überschüssige Acetonmenge gegeben, wobei ein rohes Pulver von Cephalosporin C erhalten wird. Dieses rohe Pulver wird in Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule des Ionenaustauscherharzes "Dowex 1x2" (Acetatform).(Dow Chemical Comp.) geleitet. Das am Harz adsorbierte Cephalosporin C wird mit dem oben· genannten Amraoniumacetatpuffer eluiert. Das Eluat wird durch eine Aktivkohlesäule geleitet und das adsorbierte Cephalosporin C mit einem Gemisch von je 50 Vol«,-$ Aceton und Wasser eluiert. Die Teile von Cephalosporin C werden vereinigt, eingeengt und mit Natriumhydroxydlösung neutralisiert. Äthanol wird der Lösung in einer solchen Menge zugesetzt, daß eine 70#ige (Vol./Vol.) Äthanollösung erhalten wird. Hierdurch werden Kristalle des Natriumsalzes von Cephalosporin C ausgefällt. Die Kristalle werden abfiltriert und getrocknet, wobei 0,124 Gew.-Teile Kristalle erhalten werden. Die physikalischen Eigenschaften einschließlich des Schmelzpunkts des Produkts sind identisch mit denen einer authentischen Probe von Cephalosporin G.

Die beim vorstehend beschriebenen Verfahren erhaltenen Fraktionen der Äthylacetatlösung werden vereinigt, mit Wasser gewaschen und anschließend unter vermindertem Druck eingeengt. Die eingeengte Lösung wird durch eine Kieselgelsäule geleitet. Die adsorbierte Helvolsäure wird mit Chloroform eluiert. Aus dem Teil, dessen Konzentration

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genügt» um das Wachstum von Staphylococcus aureua 209 F zu verhindern, werden 0,3 Gew.-Teile rohe Kristalle von Helvolsäure erhalten.

Beispiel 2

500 Raumteile eines Impfkulturmediums (p„ 7,0), das die gleichen Bestandteile wie in Beispiel 1 enthält, werden in einen F.ermenter gegossen, der ein Passungsvermögen von 2000 Raumteilen hat, und sterilisiert. Das Medium wird mit einer Kultur von Cephalosporium polyaleurum Y-505 (FERM-P Hr.1160, ATCC-20360) geimpft, der durch Ultraviolettbehandlung und Teilung von Einzelzellen von Cephalosporium polyaleurum 199 erhalten worden war. Das geimpfte Medium wird 48 Stunden bei 28⁰C auf e:
richtung bei 200 UpM bebrütet.

wird 48 Stunden bei 28⁰C auf einer rotierenden Schüttelvor-

30000 Raumteile eine3 Fermentationsmediums (p„ 7,0), das 3,096 rohes Sojabobnenmehl, 3,0# Saccharose, O,5?6 DL-Methionin und 0,15% CaCO, enthält, werden in einen Fermenter gegossen, der ein Fassungsvermögen von 50000 Raumteilen hat, und dann sterilisiert. Zum Fermentationsmedium werden 1000 Raumteile der in der oben beschriebenen Weise hergestellten Impfkultur gegeben. Das geimpfte Medium wird 96 Stunden bei 26⁰C unter Rühren und Belüftung bebrütet (zugeführte Luftmenge 30000 Raumteile/Minute, Rührergeschwindigkeit 200 UpM). Das Kulturmedium wird dann zur Entfernung des Mycels filtriert, wobei 25000 Raumteile FiI-tra.t erhalten werden, das pro ml eine Konzentration von 2400 ug Cephalosporin C, 1800 ag Helvolsäure und 40 ug Penicillin N aufweist.

Die Aufarbeitung des in dieser Weise erhaltenen Filtrats in der in Beispiel 1 beschriebenen Weise ergibt 21,0 Gew,-Teile Cephalosporin C und 51,0 Gew.-Teile rohe Helvolsäure. Das hierbei erhaltene Cephalosporin C hat die gleichen physikalischen Eigenschaften wie eine authentische Probe von Cephalosporin C.

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Der Nachteil der Bildung einer großen Menge Penicillin Λ wird durch den folgenden Versuch veranschaulicht.

An Stelle von'Cephalosporiurn polyaleurüm Y-505 wird Cephalosporiurn acremonium ATCC 14 553 in der in Beispiel 2 beschriebenen Weise verwendet. Durch Bebrütung für 144 Std. werden Cephalosporin C in einer Konzentration von 120 ng/ml und Penicillin N in einer Konzentration von 6j5O ug/ml erhalten. Das hierbei erhaltene Kulturmedium wird zur Abtrennung des Mycels filtriert. Der p„-Wert wird mit 2N-Salzsäure auf 3*0 eingestellt. Die Lösung wird 2 Std. bei j57°C stehen gelassen, wobei Cephalosporin C in einer Konzentration von 85 ug erhalten wird., während Penicillin N in der Lösung nicht festgestellt wird. Es sind somit 30 Gew.-% Cephalosporin C durch diese Behandlung zersetzt worden.

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Claims (4)

Patentansprüche

1) Verfahren zur Herstellung von Cephalosporin C, dadurch gekennzeichnet, daß man einen zu Cephalosporium polyaleurum gehörenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium unter aeroben Bedingungen züchtet, Cephalosporin C im Medium anhäuft und das angehäufte Cephalosporin C daraus isoliert.

2) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung "bei einer Temperatur von 15 bis 37°C, vorzugsweise 20 bis 32⁰C, und einem p_R-Wert des Kulturmediums von 3 bis 10, vorzugsweise 5 bis 8, durchgeführt wird.

3) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Cephalosporium polyaleurum 199 (PERM-P Nr.1159, ATCC-20359) verwendet wird.

4) Verfahren nach Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Mikroorganismus Cephalosporium polyaleurum Y-505 (PERM-P Nr.1160, ATCC 20360) verwendet wird.

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