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Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibiotikums
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung eines neuen, Variotin genannten Antibiotikums auf mikrobiologischem Wege.
Dieses neue Antibiotikum wird während der Kultivierung eines neuen Stammes einer bekannten Spezies von Mikroorganismen, nämlich den Paecilomyces varioti Bainier unter kontrollierten Bedingun- gen gebildet. Dieser Stamm, welcher aus dem Boden isoliert wurde, besitzt dem in "Manual of the Penicillia" [1949], S. 691 beschriebenen Paecilomyces varioti Bainier sehr ähnliche Eigenschaften. Eine Kultur solcher lebender Mikroorganismen wurde bei der American Type Culture Collection unter der Nr.
ATCC 13, 435 hinterlegt. Dieser Stamm ist im folgenden auch als Stamm Nr. K-5201 bezeichnet.
Das neue Antibiotikum zeigt Wirksamkeit gegen eine Anzahl von Pilzen. Es hat sich gezeigt, dass verschiedene pilztötende Stoffe bei der Kultivierung von Mikroorganismen des Bodens entstehen. Wie jedoch weiter unten beschrieben wird, ist sowohl durch die physikalischen, biologischen und chemischen Eigenschaften dieses Antibiotikums als auch durch die Eigenschaften des dieses Antibiotikum erzeugenden Stammes dieses von den bereits bekannten Antibiotika unterschieden.
Der neue Stamm ATCC 13, 435 wurde in Petri-Schalen auf Czapek's Agar bzw. MaisquellwasserAgar (Czapek's Agar mit 10/0 Maisquellwasser) kultiviert.
Es wurde bei einer Temperatur von 25,30 bzw. 370C inkubiert und die entstandenen Kolonien wurden makroskopisch und mikroskopisch betrachtet.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in den folgenden Tabellen angegeben. Die in diesen Tabellen verwendeten beschreibenden Bezeichnungen sind Abe's "The Classification of the Genus penicí1lium" ent- nommen (s. Journal of General and Applied Microbiology, Band 12, Nr. l, 2 und 3 [1956]). Die in diesen Tabellen angegebenen Farben sind nach Ridgway's Color Standard and Nomenclature angegeben.
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Kennzeichen von Kolonien des Stammes Nr. K -'5201
EMI2.1
<tb>
<tb> Wachstumsgeschwindigkeit
<tb> (Durchmesser <SEP> der <SEP> Kolonien <SEP> in <SEP> mm)
<tb> Maisquell <SEP> Agar <SEP> Kultivierungstemperatur <SEP> Czapek's <SEP> Agar <SEP>
<tb> 20 <SEP> Tage <SEP> 10 <SEP> Tage <SEP> 5 <SEP> Tage <SEP> 5 <SEP> Tage <SEP> 10 <SEP> Tage <SEP> 20 <SEP> Tage
<tb> 85 <SEP> 370 <SEP> 85
<tb> 85 <SEP> 300 <SEP> 85
<tb> 86 <SEP> 85 <SEP> 55 <SEP> 250 <SEP> 55 <SEP> 85 <SEP> 86
<tb> Czapek's-Agar <SEP> Maisquell-Wasser-Agar <SEP>
<tb> Textur <SEP> faserartig <SEP> faserartig
<tb> Tiefe <SEP> nach <SEP> 5-6 <SEP> Tagen
<tb> Kultivierung <SEP> (fi) <SEP> 200-600-1,000 <SEP> 250-700-1,000
<tb> Tiefe <SEP> nach <SEP> 10-12 <SEP> Tagen
<tb> Kultivierung <SEP> (li) <SEP> 300-800-1,200 <SEP> 300-900-1,
300
<tb> Aussehen <SEP> der <SEP> Oberfläche <SEP> glatt <SEP> glatt
<tb> Aussehen <SEP> des <SEP> Randes <SEP> gewöhnlich <SEP> samtartig <SEP> gewöhnlich <SEP> samtartig
<tb> Exsudat <SEP> keines <SEP> keines
<tb> Farbe <SEP> der <SEP> Kolonien <SEP> und <SEP> Altgold <SEP> (Old <SEP> Gold) <SEP> oder <SEP> Rand-und <SEP> Übergangsbereich <SEP> : <SEP>
<tb> deren <SEP> Veränderungen <SEP> Schwefelgelb <SEP> (Sulphine <SEP> wie <SEP> bei <SEP> Czapek's <SEP> Agar
<tb> Yellow) <SEP> Zitronengelb <SEP> Zentraler <SEP> Bereich <SEP> : <SEP> Dunkles
<tb> (Citrin) <SEP> Olivebraun <SEP> (Dark <SEP> Olive
<tb> Buff)- <SEP> bräunliches <SEP> Zitronengelb <SEP> (Buffy <SEP> Citrine)
<tb> Rückseite <SEP> der <SEP> Kolonie <SEP> Randbereich <SEP> :
<SEP> sattes <SEP> Olivbraun <SEP> Wie <SEP> bei <SEP> Czapek's <SEP> Agar
<tb> (Deep <SEP> Olive <SEP> Buff) <SEP> e, <SEP> Chaeturaschwarz <SEP>
<tb> Zentraler <SEP> Bereich <SEP> : <SEP> sattes <SEP> Dun- <SEP> (Chaetura <SEP> Black)
<tb> kelolive <SEP> (Deep <SEP> Dark <SEP> Olive)
<tb> Olivschwarz <SEP> (Oliveaceus <SEP> Black)
<tb> Pigmentierung <SEP> des <SEP> keine <SEP> oder <SEP> bläuliches <SEP> Grau- <SEP> keine <SEP>
<tb> Subtrates <SEP> grün <SEP> (Bluish <SEP> Gray <SEP> Green)
<tb> Schrägagarkultur <SEP> bläuliches <SEP> Graugrün
<tb> (Bluish <SEP> Gray <SEP> Green)
<tb>
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Mikroskopisches Bild der Konidienentwicklung des Stammes Nr.
K-5201
EMI3.1
<tb>
<tb> Konidienketten <SEP> Konidien
<tb> Kolonie <SEP> auf <SEP> der <SEP> Platte <SEP> Schrägkultur <SEP> Form <SEP> Grösse <SEP> Form <SEP> Aussehen
<tb> 190 <SEP> - <SEP> 340 <SEP> <SEP> 250 <SEP> - <SEP> 390 <SEP> <SEP> divergen <SEP> 3,4-4,5 <SEP> x1, <SEP> 7-2,8 <SEP> ellipsoidisch <SEP> oder <SEP> glatt
<tb> vereinzelt <SEP> spindelförmig
<tb> 5, <SEP> 6-7, <SEP> 6x <SEP> 3, <SEP> 1-4, <SEP> 3 <SEP>
<tb> Sterigmata
<tb> Anzahl <SEP> Anordnung <SEP> Durchmesser <SEP> Länge <SEP> Aussehen
<tb> 1-4 <SEP> divergent <SEP> 2,8-4, <SEP> 2 <SEP> p <SEP> 5, <SEP> 3-18, <SEP> 7-21 <SEP> glatt
<tb> Metulae
<tb> Anzahl <SEP> Anordnung <SEP> Durchmesser <SEP> Länge <SEP> Aussehen
<tb> an <SEP> den <SEP> Enden
<tb> 1-5 <SEP> divergent <SEP> 2, <SEP> 8-4, <SEP> 3 <SEP> 2, <SEP> 8 <SEP> 4,
<SEP> 3 <SEP> il <SEP> glatt
<tb>
EMI3.2
<tb>
<tb> Zweige <SEP> (Branches)
<tb> Spitzen <SEP> Durchmesser <SEP> Länge <SEP> Aussehen
<tb> 3,1-5,0 <SEP> <SEP> 2,8-4,9 <SEP> <SEP> 6,2-18,7 <SEP> <SEP> glart
<tb> Conidiophore
<tb> Spitzen <SEP> Durchmesser <SEP> Länge <SEP> Aussehen
<tb> 5, <SEP> 0-7, <SEP> 5JL <SEP> 3, <SEP> 1-5, <SEP> 0 <SEP> Jl <SEP> 30- <SEP> 65 <SEP> JL <SEP> glatt <SEP>
<tb>
Der Stamm ATCC Nr. 13,435 zeigt starkes ausgebreitetes Wachstum und das Aussehen der Kolonie ist faserartig, faltenlos und deren Farbe ist ein Altgold oder ein Schwefelgelb, das im Laufe der Kultivierung in Zitronengelb übergeht. Der Randbereich der Kolonie zeigt veilchenblaue, faserartige Struktur.
Die Ruckseite der Kolonie zeigt im Randbereich dunkles Olivbraun und der mittlere Teil zeigt tief dunkles Oliv, welches nach einer Kultivierungsdauer von über 20 Tagen in ein Olivschwarz übergeht. Es zeigt sich kein Pigment, welches in das Kulturmedium diffundiert, mit Ausnahme eines in geringen Mengen entstehenden bläulich graugrunen Pigmentes. In Schrägkulturen wurde gelegentlich die Bildung eines bläulich graugrünen Pigmentes beobachtet.
Wie aus den mikroskopischen Beobachtungen hervorgeht, ist die Form der Konidien ellipsoidisch oder spindelförmig und das Verhältnis deren Abmessungen in Längs- und Querrichtung schwankt zwischen 3, 4
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- 2,Paecilomyces. Alle Organe wachsen derart, dass sie sich in verschiedenen Richtungen ausbreiten. Alle
Organe sind glatt. Die Farbe der Kolonie zusammen mit der Pigmentbildung in dem Kulturmedium sind zwar nicht die gleichen wie beim bereits bekannten Paecilomyces varioti Bainier (s. Kenneth B. Raper &
Chartes Thom ; A Manual of the Penicillia [1949]), doch sind diese Unterschiede nicht so gross, als dass es gerechtfertigt wäre, den Stamm ATCC Nr. 13, 435 als neue Spezies zu bezeichnen.
Es ist bisher noch nicht bekanntgeworden, dass durch Kultivierung eines Stammes der Gattung
Paecilomyces ein Antibioticum erhalten werden kann. Der Stamm ATCC Nr. 13, 435 erzeugt einen neuen, Variotin genannten, gegen Pilze wirksamen Stoff.
Nach diesen systematischen Merkmalen musste darauf geschlossen werden, dass der Stamm ATCC Nr.
13, 435 eine Variante des Paecilomyces varioti Bainier ist und dieser Stamm wurde als Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus bezeichnet.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung des Variotins können auch Mutanten und Varianten des Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus verwendet werden, die ebenfalls das neue Antibiotikum Variotin erzeugen. Unter dem Ausdruck "Stamm des Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus" sollen deshalb alle jene Mikroorganismen einzureihen sein, die durch natürlich oder künstlich herbeigeführte Mutation, beispielsweise durch Röntgenbestrahlung, Ultraviolettbetrahlung, durch Stickstofflost u. dgl. erhalten werden können.
Variotin ist gegen eine Anzahl von Pilzen, jedoch nicht gegen Bakterien wirksam. Die Wirksamkeit des Variotins kann auf verschiedene Art gemessen werden. Eine der brauchbaren Methoden, die Cup-plateMethode, bedient sich eines Stammes des Penicillium chrysogenum Q-176 als Testorganismus. Im folgenden wird als eine Variotineinheit jene Mindestmenge dieses Stoffes bezeichnet, welche das Wachstum eines Standardstammes des Penicillium chrysogenum Q-176 in einem cm3 Czapek-Agar vollständig inhibiert.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens zur Herstellung des Variotins wird ein variotinerzeugender Stamm von Paecilomyces in einem geeigneten Kulturmedium unter aeroben Bedingungen so lange kultiviert, bis dieses Medium ausreichende antibiotische Wirkung besitzt.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens verwendbare Nährstoffe sind solche, wie sie bereits früher in Kulturen von Mikroorganismen verwendet wurden, beispielsweise eine Kohlenstoffquelle wie Sucrose, Glucose, Fructose, Mannose, Glycerin, Stärke, Mannan, Malzzucker, Xylose, Lactose, Melasse u. dgl. ; eine anorganische Stickstoffquelle wie Natriumnitrat, Ammoniumnitrat, Calciumnitrat, Ammoniumsulfat u. dgl. ; eine organische Stickstoffquelle wie Sojabohnenmehl, Erdnussmehl, Baumwollsamenmehl, Fleischextrakt, Pepton, Maisquellwasser, Hefeextrakt, u. dgl. Erforderlichenfalls können Mineralsalze wie Natriumchlorid, Salze der Phosphorsäure, Schwermetallsalze usw. dem Kulturmedium zugesetzt werden.
Im Rahmen der verwendbaren Kultivierungsmethoden können zur Bildung des Variotins auch feste Nährsubstrate Anwendung finden, obzwar für eine wirtschaftliche Herstellung ein flüssiges Nährsubstrat, insbesondere bei Submerskulturen, erfolgreich Anwendung finden kann. Die Kultivierung wird vorzugsweise unter aeroben Bedingungen durchgeführt, wobei mit sterilisierter Luft belüftet und die Temperatur auf 20 - 40oC, vorzugsweise etwa 250C gehalten wird. Die Kultivierung wird so lange durchgeführt, bis sich das Nährmedium genügend an Variotin angereichert hat.
Im allgemeinen werden die höchsten Aus- beuten an Variotin dann erhalten, wenn die Kultivierung während 3 - 7 Tagen in Schüttelkulturen oder während 2 - 6 Tagen in Gärungsbehältern erfolgt.
EMI4.1
weder dadurch, dass zunächst die Feststoffe aus der Fermentationsflüssigkeit durch Filtration entfernt werden und das Variotin aus den Feststoffen und aus der Filtrationsflüssigkeit getrennt gewonnen werden oder dadurch, dass das Variotin direkt aus der Fermentationsflüssigkeit gewonnen wird, da das Variotin in der Kulturlösung und den mycelhältigen Feststoffen enthalten ist.
Sowohl während der Kultivierung als auch während der Extraktion wird der pH-Wert der Lösung auf 4, 0 - 7, 0 gehalten, da Variotin bei einem pH-Wert von 4,0 bis 7,0 stabil, bei einem höheren pH-Wert als 7,0 jedoch instabil ist. Um das Variotin aus der von den mycelhältigen Feststoffen getrennten Fermentationsflüssigkeit zu gewinnen, wird das Variotin mit einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, wie beispielsweise Butanol, Amylalkohol, Methylisobutylketon, Benzol, Chloroform, Äthylacetat, Butylacetat, Tetrachlorkohlenstoff usw. extrahiert, wobei das Variotin mit sehr guter Ausbeute in die organische Lösungsmittelschicht übergeht. Mit Ligroin oder Petroläther kann das Variotin nicht so gut extrahiert werden.
Um das Variotin aus den das feuchte Mycel enthaltenden Feststoffen zu gewinnen, werden diese Feststoffe mit einem, das Variotin lösenden, mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, wie beispielsweise
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Aceton, Methanol, Äthanol, oder den oben erwähnten, für die Extraktion des Variotins verwendeten Lösungsmittel versetzt und nach heftigem Rühren die Feststoffe abgenutscht. Das Variotin kann sodann durch ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel in der gleichen Weise getrennt werden, wie sie oben für die Extraktion des Variotins aus dem Filtrat der Fermentationsflüssigkeit angegeben worden ist.
Aus der Fermentationsflüssigkeit kann das Variotin unter heftigem Rühren durch ein mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel in der gleichen Weise gewonnen werden, wie bei der Extraktion des Variotins aus dem Filtrat der Fermentationsflüssigkeit.
Wenn eine Lösung des Variotins in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise in Äthylacetat, unter vermindertem Druck eingeengt und vollständig getrocknet wird, wird ein rotbräunlicher Sirup erhalten. Dieser Sirup wird in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol, Äther, Tetrachlorkohlenstoff usw. aufgelöst, gekuhlt und sodann, um in den oben angegebenen Lösungsmitteln nicht lösliche Stoffe abzutrennen, filtriert. Zur Reinigung ist es von Vorteil, das in einer kleinen Menge organischen Lösungsmittels, beispielsweise Äther, gelöste Variotin mit einem grossen Volumen Petroläther oder Ligroin zu versetzen, um das Variotin auszufällen.
Wenn eine Lösung des Variotins in dem zuletzt verwendeten organischen Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingeengt wird, wird das Variotin als eine schwach gelb gefärbte, ölige Substanz gewonnen, welche eine Wirksamkeit von uber 140 Einheiten pro mg besitzt. Das wie oben dargestellte Variotin ist eine ölige Substanz ; sie wird durch Verwendung von Wasser und organischen Lösungsmitteln durch Gegenstromverteilung gereinigt und die hoch aktiven Fraktionen des Extraktes werden gesammelt und unter vermindertem Druck eingeengt. Das so erhaltene gereinigte Variotin wird als ölige Substanz gewonnen, welche eine Wirksamkeit von 166 Einheiten pro mg besitzt. Die Gegenstromverteilung zeigte, dass es sich bei dieser Probe um einen einzigen Stoff handelt.
Die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften des nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Variotins sind folgen- de : Variotin ist eine farblose, ölige Substanz mit einem blumigen, esterartigen Geruch. Unter normalem Druck erhitzt, verfärbt es sich bei etwa 1500C allmählich und wird schliesslichtnter Zersetzungserschei-
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teln, wie beispielsweise Methanol, Äthanol, Butanol, Amylalkohol, Äthylacetat, Butylacetat, Aceton, Methylisobutylketon, Äther, Benzol, Benzyläther, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Schwefelkohlenstoff, Pyridin, Dioxan, Cyclohexanol, Glycerin, Äthylenglykol, Essigsäure usw. löslich. Die optische
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In Fig. 1 der Zeichnung ist das Infrarotspektrum des Variotins (Flüssigkeitsfilm) gezeigt.
Absorptionsmaxima treten bei 3460, 3100. 2950, 2880,1740, 1670,1600, 1485, 1465,1430, 1350, 1310,1260, 1190,1160, 1125,1075, 1065, 1025, 1005,970, 935,885, 865,840, 800 und 715 cm' auf.
EMI5.3
Wie später noch beschrieben werden wird, ist Variotin in schwach sauren oder neutralen Lösungen (PH = 4, 0-7, 0) relativ stabil ; in alkalischen Lösungen jedoch ist Variotin sehr instabil und verliert seine antibiotische Wirksamkeit bei Raumtemperatur äusserst rasch.
Wird Variotin in Gegenwart von Platinschwarz katalytisch reduziert, entsteht ein farbloses öliges Material, das keine antibiotische Wirksamkeit mehr besitzt.
Variotin reagiert mit Diazo-Verbindungen und Nitroalkylen und gibt Hydroxamsäurereaktionen. Mit Ferrichlorid, Millon-, Ehrlich-, Sakuguchi- und Molisch-Reagenz, reagiert es nicht und zeigt auch-keine Biuret-, Xanthoprotein- und Ninhydrin-Reaktion.
Die antibiotische Wirksamkeit des Variotins wird durch Verdlmnungsmethoden bestimmt, wobei Czapek's-Medium oder Sabouraud's-Medium (Glukose-Pepton-Medium) verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind folgende :
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Inhibitionsverdünnung
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> Inkubation <SEP> bei <SEP> 250C)
<tb> Penicillium <SEP> chrysogenum <SEP> Q <SEP> 176 <SEP> X <SEP> 160 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Penicillium <SEP> rubellum <SEP> X <SEP> 40000
<tb> Penicillium <SEP> glaucum <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Aspergillus <SEP> clavatus <SEP> X <SEP> 240 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Aspergillus <SEP> glaucus <SEP> X <SEP> 50000
<tb> Aspergillus <SEP> oryzae <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Aspergillus <SEP> niger <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Aspergillus <SEP> japonicus <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Rhizopusjavanicus <SEP> X <SEP> 24000 <SEP>
<tb> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Rhizopus <SEP> japonicus <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Rhizopus <SEP> delemar <SEP> X <SEP> 30 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Mucor <SEP> mucedo <SEP> X <SEP> 1000
<tb> Monilia <SEP> formosa <SEP> X <SEP> 160000
<tb> Ceratostomella <SEP> fimbriata <SEP> X <SEP> 50000
<tb> Trichophytoninterdigitale <SEP> X <SEP> 160000 <SEP>
<tb> Trichophyton
<SEP> rubrum <SEP> X <SEP> 80000
<tb> Cryptococcus <SEP> neo <SEP> formans <SEP> X <SEP> 320000 <SEP>
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> X <SEP> 640000
<tb> Epidermophyton <SEP> inguinale <SEP> X <SEP> 160000 <SEP>
<tb> Blastomyces <SEP> dermatitidis <SEP> X <SEP> 1280000
<tb> Microsporum <SEP> japonicum <SEP> X <SEP> 10000
<tb> Saccharomyces <SEP> cerevisiae <SEP> 0
<tb> Zygosaccharomyces <SEP> salsus <SEP> 0
<tb> Torula <SEP> utilis <SEP> 0
<tb> Torula <SEP> rubra <SEP> 0
<tb> Torulaspora <SEP> delbrückii <SEP> 0
<tb> Hanseniaspora <SEP> delbrückii <SEP> 0
<tb> Pichia <SEP> miyaji <SEP> 0
<tb> Willia <SEP> anomalis. <SEP> +
<tb> Staphylococcus <SEP> aureus <SEP> 209 <SEP> P <SEP> 0
<tb> Escherichia <SEP> coli <SEP> 0
<tb> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 0
<tb> Mycobacterium <SEP> sp.
<SEP> 607 <SEP> 0 <SEP>
<tb>
Die Wirksamkeit des Variotins gegen pflanzenpathogene Organismen wurde durch die AgarstrichVerdünnungsmethode (agar streak-dilution method) bestimmt, wobei folgende Ergebnisse erhalten wurden :
EMI6.2
<tb>
<tb> Organismus <SEP> inhibitionsverdünnung
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> Inkubation <SEP> bei <SEP> 25 C)
<tb> Fusarium <SEP> bulbigenum <SEP> X <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> - <SEP> 10000 <SEP>
<tb> Alternaria <SEP> bataticola <SEP> X <SEP> 1000-10 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Colletotrichum <SEP> lagenarium <SEP> X <SEP> 100000 <SEP> - <SEP> 1000000 <SEP>
<tb> Phytophthora <SEP> infestans <SEP> X <SEP> 1000-10 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Ophiobolus <SEP> miyabeanus <SEP> X <SEP> 1000 <SEP> 000- <SEP>
<tb> Ophiobolus <SEP> graminis <SEP> X <SEP> 100 <SEP> 000-1000 <SEP> 000 <SEP>
<tb> Colletotrichum <SEP> cingulata <SEP> X <SEP> 10000 <SEP> - <SEP> 100000 <SEP>
<tb>
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<tb>
<tb> Organismus <SEP> Inhibitionsverdünnung
<tb> (nach <SEP> 7 <SEP> Tagen <SEP> Inkubation <SEP> bei <SEP> 25 C)
<tb> Colletotrichum <SEP> lindemuthianum <SEP> X <SEP> 1000 <SEP> - <SEP> 10000
<tb> Colletotrichum <SEP> gossypii <SEP> X <SEP> 10000 <SEP> - <SEP> 100000
<tb> Ceratostomella <SEP> fimbriata <SEP> X <SEP> 10000 <SEP> - <SEP> 100000 <SEP>
<tb> Endothia <SEP> parasitica <SEP> X <SEP> 1 <SEP> 000 <SEP> - <SEP> 10000 <SEP>
<tb> Rosellinianecatrix <SEP> X <SEP> 1000-10000 <SEP>
<tb> Gibberella <SEP> fujikuroi <SEP> X <SEP> 10000 <SEP> - <SEP> 100000
<tb>
Die pilztötende Wirkung des Variotins wurde dadurch geprüft, dass menschliches Serum dem Kulturmedium zugefugt wurde, wobei Trichophyton interdigitale und Trichophyton rubrum als Testorganismen verwendet wurden. Die Aktivität des Variotins wurde im Vergleich zu serumfreien Nährmedien auf etwa die Hälfte bis etwa ein Viertel verringert.
Variotin wurde in 5% Carboxymethylcellulose enthaltendem, sterilisiertem Wasser suspendiert und die erhaltene Suspension wurde um die Toxizität des Variotins zu überprüfen, Mäusen intraperitoneal injiziert. Die Verabreichung des Variotins in Dosen bis zu 330 mg/kg erzeugt keine toxische Wirkung. Die Toxizität des Variotins in Dosierungen uber 330 mg/kg konnte wegen der geringen Löslichkeit des Variotins in Wasser nicht gemessen werden.
Variotin besitzt, wie in der obigen Tabelle gezeigt ist, spezifische pilztötende Wirksamkeit, besonders gegen solche pathogene Pilzarten wie Trichophyton interdigitale, Trichophyton rubrum und Cryptococcus neoformans und gegenüber solchen pflanzenpathogenen Pilzarten wie Colletotrichum lagenarium und Gibberells fujikuroi. Die Wirksamkeit der Variotins wurde etwas verschlechtert, wenn dem Kulturmedium menschliches Serum zugegeben wurde.
Es wurde nachgewiesen, dass Variotin die menschliche Haut nicht reizt und nicht die geringste Toxizität besitzt. Es ist ein wirksames Therapeutikum bei der Behandlung von Hautpilzkrankheiten von Menschen und Tieren, insbesondere der Dermatomycosis und auf Grund obiger Tatsachen kann angenommen werden, dass es gegen systematische Mycosis und Anthraenose von Gurken und gegen die Bakanae-Krankheit von Reispflanzen wirksam ist.
In den folgenden Beispielen wird das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von Variotin, dessen Abtrennung und dessen Reinigung beschrieben. Die angeführten Beispiele erläutern den Erfindungsgegenstand und schränken diesen in keiner Weise ein.
Beispiel1 :Zueinem,einenpH-Wertvon6,0aufweisendenund0,1%Natriumnitrat,0,2%Kaliumbiphosphat, 0, 0ffl/o Magnesiumsulfat, 0, 05% Kaliumchlorid und 0, 001% Ferrosulfat enthaltendes Ausgangsmedium wurden 3% an a) Sucrose, b) Glucose, c) Fructose, d) Mannose, e) Glycerin, f) Mannan, g) Maltose, h) Stärke, i) Xylose, j) Lactose bzw. k) Galactose zugefügt. Mit einem Stamm Nr. K-5201 des Paecilomyces varioti Bainier var. antibioticus wurde jedes der so erhaltenen Kulturmedien beimpft. Die Kulturmedien befinden sich hiebei als 100 cm 3¯Portionen in 500 cm3-Schüttelflaschen und wurden nach Sterilisierung in der fur Schuttelkulturen üblichen Weise bei einer Temperatur von 250C kultiviert. Nach einer Kultivierungsdauer von 3 bis 6 Tagen wurde in der Kulturlösung eine maximale Menge an Variotin erzeugt.
Nach der Cup-plate-Methode durchgefuhrte Messungen ergaben, ausgedrückt in Ein-
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22, i)Pepton bzw. i) 1 Grew.-% Maisquellwasser zugefügt. Mit einem Stamm K-5201 des Paecilomyces varioti Brainier var. antibioticus wurde jedes der so erhaltenen Kulturmedien beimpft. Die Kulturmedien befinden sich hiebei als 100 cm3-Portionen in 500 cn-Schuttelflaschen und wurden nach Sterilisierung in der für Schüttelkulturen üblichen Weise bei einer Temperatur von 250C kultiviert. Nach einer Kultivierungsdauer von 3 bis 6 Tagen wurde in der Kulturlösung eine maximale Menge an Variotin erzeugt.
Nach der Cup-plate-Methode durchgeführte Messungen ergaben, ausgedrückt in Einheiten pro cm3, einen Variotingehalt von a) 35, b) 28, c) 28, d) 12, e) 10, f) 10, g) 12, h) 10 und i) 15. Das Variotin wurde hiebei durch Kultivierung eines Stammes Nr. K-5201 erzeugt, wobei die oben angegebenen Stoffe als Stick-
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stoffquelle benutzt wurden.
Beispiel 3 : 10 l eines 3, 0% Sucrose, 0, 3% Natriumnitrat,. 0, 2o Kaliumbiphosphat, 0, 05% Ma- gnesiumsulfat, 0, 050/0 Kaliumchlorid und 0, 0010/0 Ferrosulfat enthaltenden und einen pH-Wert von 6, 0 aufweisenden Ausgangsmediums wurden mit einem Stamm Nr. K-5201 beimpft. Die Kultivierung wurde innerhalb eines Zeitraumes von 60 h durchgeführt, wobei Variotin in einer Konzentration von 30 Einhei- ten entstand. Nach Ablauf dieser Zeit wurde die Fermentationslösung vom Mycel durch Filtration ge- trennt und das Filtrat wurde zweimal mit 3 1 Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck konzentriert.
Das Konzentrat wurde in 100 cm3 Methanol gelöst und nach Ab- filtrieren der nach Kühlung entstandenen Fällung wurde die Methanollösung unter vermindertem Druck eingeengt. Auf diese Weise wurden 1, 8 g Variotin erhalten, das eine Wirksamkeit von 120 Einheiten pro mg besass.
Das durch Filtrieren abgetrennte Mycel wurde mit 11 Methanol vermengt. Nach gründlichem Mah- len und Rühren wurde durch Zentrifugieren getrennt. Das Methanol wurde hierauf unter vermindertem
Druck abdestilliert und der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde wieder unter ver- mindertemDruckkonzentriert und das erhaltene Konzentrat wurde in etwa 100 crn Methanol gelöst. Nach
Entfernung der nach Kühlung abgeschiedenen Stoffe, wurde die Methanollösung unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 0, 8 g Variotin mit einer Wirksamkeit von 90 Einheiten pro mg erhalten wurden.
Beispiel 4 : 100 1 des in Beispiel 3 verwendeten Mediums wurden in einen 200 l fassenden Gärung- behälter eingebracht. 50 g eines mitDampf behandelten und sodann mit dem Stamm Nr. K-5201 beimpf- ten und 1 Woche bis zur vollen Entwicklung der Sporen gelagerten Reises wurden in den Tank eingebracht und unter Belüftung und Rührung bei einer Temperatur von 26 oder 270C 90 h lang kultiviert, wobei die Belüftung durch Durchleiten sterilisierter Luft mit einer Geschwindigkeit von 90 l/min erfolgte.
Nach Ablauf der Kultivierungszeit enthielt die Fermentationsflüssigkeit 16 Einheiten Variotin pro cm\ 86 l der Mycel enthaltenden Fermentationsflüssigkeit wurden zweimal mit 30 l Äthylacetat extrahiert, wobei für die Abtrennung des Lösungsmittels eine Sharples-Zentrifuge verwendet wurde. Die vereinigten Extrakte wurden unter vermindertem Druck konzentriert, wobei ungefähr 55 g eines bräunlich gefärbten Sirups erhalten wurden. Dieser Sirup wurde in 250 ems Methanol gelöst und sodann gekühlt. Ausgefallene, unlösliche Stoffe wurden durch Filtration entfernt. Die so behandelte Methanollösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert und der erhaltene Sirup wurde in Äther gelöst und Unlösliches sodann abfiltriert.
Die Ätherlösung wurde unter vermindertem Druck auf ein Volumen von ungefähr 25 cm3 eingeengt und mit dem zehnfachen Volumen Petroläther verdünnt und die Mischung sodann gekühlt. Sich abscheidende, ölige Stoffe wurden vom Lösungsmittel durch Dekantieren getrennt und mit einem kleinen Volumen Petroläther gewaschen. Nach dem Trocknen wurden die so erhaltenen öligen Stoffe in 300 cm3 Tetrachlorkohlenstoff gelöst und dann gekühlt. Das entstandene rotbräunlich gefärbte, ölige Material wurde durch Dekantieren entfernt und die Tetrachlorkohlenstofflösung wurde unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 6, 6 g einer schwach gelb gefärbten, öligen Substanz erhalten wurden, deren Aktivität 145 Einheiten pro mg betrug.
1 g der oben erhaltenen öligen Substanz wurde in einem 47 Röhren umfassenden Gegenstromverteilungsgerät unter Verwendung eines im Verhältnis 1 : 1 aus 70%obigem Methanol und Tetrachlorkohlenstoff bestehenden Lösungsmittels behandelt. Die Ergebnisse des Bio-Versuches, die Ultraviolettabsorption und die Bestimmung der Gewichte zeigte, dass die biologisch aktive Komponente hauptsächlich in den Röhren Nr. 12-Nr. 32 enthalten war, und dass die Röhre Nr. 21 die höchste Konzentration der aktiven Komponente aufwies. Die aus den Röhren Nr. 15-Nr. 26 gewonnenen Proben wurden vereinigt und nochmals in einem 130 Röhren aufweisenden Gegenstromverteilungsapparat behandelt. Nach dieser Gegenstromverteilungsbehandlung fand sich das Variotin in den Röhren Nr. 47 - Nr. 73, von welchen die Röhre Nr. 61 den höchsten Gehalt an Variotin aufwies.
Jede der auf Grundlage des Bio-Versuches, der Ultraviolettabsorption und der Gewichtsbestimmung aufgenommenen Verteilungskurven stimmte mit der theoretischen Kurve gut überein, womit bewiesen wurde, dass Variotin ein einzelner Stoff ist. Die aus den Röhren Nr. 48 - Nr. 63 stammenden Proben wurden vereinigt und unter vermindertem Druck konzentriert, wobei 110 mg einer farblosen öligen Substanz gewonnen wurden, welche eine Variotinaktivität von 166 Einheiten pro mg besass.