DE1642747C3

DE1642747C3 - Biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Lycopin

Info

Publication number: DE1642747C3
Application number: DE19671642747
Authority: DE
Inventors: Maria Luise Dipl.-Landw. Bianchi; Giovanni Franceschi; Maria Pia Dipl.-Landw. Marnati; Celestino Dipl.Landw. Spalla
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1966-08-04
Filing date: 1967-07-31
Publication date: 1974-01-03
Also published as: DE1642747B2; DE1642747A1; DK118123B; SE354481B; CH484271A; IL28425A; GB1128440A; BE702235A; GR36623B; AT277915B

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Lycopin in Submerskultur oder Oberfiächcnkultur und unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff und für Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 28°C, während eines Zeitraumes von 4 bis 8 Tagen, vorzugsweise 6 Tagen, wonach das erhaltene Lycopin aus dem Mycel in an sich bekannter Weise isoliert und gereinigt wird.

Lycopin ist in verschiedenen Arten von reifen Früchten und insbesondere in reifen Tomaten enthalten. Erstmals wurde es 1873 in Form von roten Kristallen durch H arisen isoliert, der es aus Früchten von Tamus communis erhielt. Der Name Lycopin wurde jedoch erstmals 1913 durch S c h u η k verwendet, der den Unterschied zwischen Lycopin und Karotin entdeckte. Lycopin ist ein natürlicher Farbstoff und wird daher in der Nahrungsmittelindustrie und insbesondere bei der Herstellung von Margarine und Butter häufig verwendet (britische Patentschrift 838 925.)

In jüngerer Zeit wurde ein Patent erteilt, welches außer einem Verfahren zur Herstellung von Lycopin auch die Verwendung von Lycopin als Futterzusatz für Geflügel, um sowohl deren Fleisch als auch dem Eidotter eine gelbe Farbe zu erteilen, schützt (französische Patentschrift 1 333 942).

Es sind bereits verschiedene Verfahren zur Herstellung von Lycopin bekannt, die entweder auf dessen Extraktion aus verschiedenen Früchten, die es enthalten, auf chemischen Verfahren oder, schließlich, auf Fermentationsverfahren beruhen.

Die Exiraktionsverfahren sind infolge der geringen Menge Lycopin, die in den natürlichen Produkten enthalten ist (20 bis 50 mg pro kg) nicht ökonomisch. Die chemischen Verfahren ergeben zwar eine bessere Ausbeute als die Extraktionsverfahren, bestehen jedoch aus einer komplizierten Synthese mit zahlreichen Stufen, wobei von ziemlich teuren Produkten ausgegangen wird und wobei instabile, teure und oft gefährliche Reagenzien verwendet werden, so daß sich die chemischen Synthesen zur Herstellung von Lycopin auf industrieller Basis wenig eignen.

Die Fermentationsverfahren eignen sich zur Herstellung von Lycopin in industriellem Maßstab am besten, sie sind angenehmer und ökonomischer durchzuführen. I η jüngster Zeit wurde von E. J. S wart h out und Mitarbeitern (USA.-Patentschrift 3 097 146) ein Verfahren beschrieben, welches in der Fermentation von zwei zueinander gehörenden Stämmen verschiedenen Geschlechtes aus der Gruppe der Mucorineen, insbesondere aus der Art Blakeslea trispora, unter aeroben Bedingungen in Submers- oder übernächenkultur besteht.

ίο Obwohl dieses Verfahren im Vergleich zu den bisher bekannten einen technischen Fortschritt mit sich brachte, ist es dennoch noch nicht zufriedenstellend. Erstens ist die Produktivität des Systems der zueinander gehörenden Stämme ziemlich gering (30 bis 150//ml Fermentationsmedium), und zweitens ist die dabei anzuwendende Fermentationstechnik ziemlich kompliziert, da zwei Stämme verwendet werden müssen, wodurch die Wahrscheinlichkeit von Störungen, wie Infektion, Degenerierung der Kulturen, asynchrones

ao Wachstum der beiden Stämme usw., verdoppelt wird.

Wenn bei dem eben beschriebenen Verfahren nur

ein Stamm der Art Blakeslea trispora an Stelle der beiden zueinander gehörenden Stämme verwendet wird, sinkt die Produktivität auf weniger als ein Viertel

as der Mittelwerte ab, die mit den beiden zueinander gehörenden Stämmen erhalten werden (Beispiel 7 der USA.-Patentschrift 3 097 146).

In der französischen Patentschrift 1 403 839 wird ein biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Lycopin beschrieben, bei dem zwei zueinander gehörende Stämme ( \-) und (—) von Blakeslea trispora unter Zusatz von bestimmten Substanzen, welche die Bildung von/J-Karotin zugunsten von Lycopin zurückdrängen (Inhibitoren), verwendet werden. Unbeschadet dessen, was oben bereits an Nachteilen· bei der Verwendung zweier zusammengehörender Stämme ausgeführt worden ist, sei weiter bemerkt, daß es wissen-

■ schaftlich nachgewiesen ist (S u 11 e r R. P. et. al., J. Bact., 95, 1968, S. 426), .daß in den Fermentationsverfahren mit Blakeslea trispora das Endprodukt vom quantitativen Verhältnis zwischen den beiden Stämmen (+) und (—) abhängt. Das Wachstum der beiden Stämme muß daher synchron sein. Diese Bedingung ist jedoch sehr schwierig herzustellen, und zwar auf Grund der verschiedenen Eigenschaften der beiden Stämme ( + ) und (—), so erzeugt z. B. der Stamm (+) üppige Sporen, während der Stamm (—) keine oder sehr wenige Sporen produziert.

Bei dem Verfahren gemäß der französischen Patentschrift 1 403 839 werden nur dann größere Mengen Lycopin erzeugt, wenn ein Inhibitor zugesetzt wird. Dann zeigt sich aber auch, daß in den meisten Fällen neben Lycopin auch noch /Ϊ-Karotin anfällt (s. die Beispiele der französischen Patentschrift 1 403 839).

Den geschilderten Nachteilen hilft die Erfindung ab. Sie besteht in einem Verfahren der eingangs genannten Art, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß der Mikroorganismus Streptomyces chrestomcyceticus var. rubescens, der bei dem Commonwealth Mycological Institute (Großbritannien) mit der Indexnummer IMI 126134 hinterlegt ist, verwendet wird.

Der neue Mikroorganismus, der bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wurde durch mutagene Behandlung von Streptomyces chrestomyceticus var. aurantioideus, welcher in der britischen Patentschrift 1 014 589 beschrieben ist, erhalten.

Der erhaltene neue Stamm wurde mit dem Namen Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens be-

zeichnet und ist bei dem Microbiological Institute of the Rutger University (USA) mit der Indexnummer 3910 und bei dem Commonwealth Mycological Institute (Großbritannien) mit der Indexnummer IMI 126134 hinterlegt.

Dieser Stamm hat folgende mikroskopische, makroskopische und biochemische Eigenschaften.

Mikroskopische Eigenschaften

Auf den üblichen Kulturmedien zeigt das vegetative Mycel dünne Hyphen, mehr oder weniger lang und verzweigt (0,5 bis 1 μ dick). Die Lufthyphen sind spärlich und im allgemeinen gerade, gelegentlich in Hakenform gebogen. Die Konidien sind entweder zylindrisch oder oval mit einem Durchmesser von 0,3 bis 0,4 μ bis 0,6 bis 8 μ.

Makroskopisches Aussehen

in Tabelle 1 sind die Kultureigenschaften zusammengefaßt, die auf den darin angegebenen Medien beobachtet wurden, auf welchen der Mikroorganismus ίο bei 28"C gezüchtet wurde. Die Beobachtungen wurden am 3., 8., 15., 21. und 30. Tag nach der Animpfung gemacht.

Tabelle

Nährmedien

Wachstum Luftmyce!

Vegetatives Mycel

Lösliche
Pigmente

Agar-Kartoffel-Glucose *)

Bennet-Agar¹)

Emerson-Agar¹)

Czapek-Agar¹)

Asparagin-Agar¹) '.

Agar, Stärke und Salze nach P r i d h a m³) Hafer-Agar²)

Glycerin-Asparagin-Agar¹)

dünne fähige Patina

Patina mit vielen Falten

reichlich

flechtenartige

Patina

Schleier

reichlich faltige Patina

dünne faltige Patina

granulierte, gefaltete, opake Patina

gefaltete Patina spärlich,
weißrosa

fehlt

fehlt sehr spärlich,
schmutzigweiß

sehr spärlich,
weißrosa

sehr spärlich,
weißgelblich

himbeerrot

kirschrot

rot

rotorange
gelborange

rotbraun
dunkelrot

intensiv rot

fehlen

^l) Hergestellt nach Wa Ic s m a η, »The Actinomycetes«, Vol. 11, 1961, S. 328 bis 333.

") Hergestellt nach B a 1 d a c c i und Mitarbeiter, »Journal of Microbiology«, 1961, 9, S. 39.

') Hergestellt nach P r i d ha m und Mitarbeiter, »Antibiotics Annual«, 1956 bis 1957, S. 947 bis 953.

Biochemische Eigenschaften

Gelatine: wird hydrolysiert;

Stärke: wird hydrolysiert;

Nitrate: keine Reduktion zu Nitriten; Produktion von H₂S: negativ;

Tyrosin: Abbau;

Milch: Peptonisation ohne Koagulierung; Trehalose, d-Lävulose, d-Sorbit, d-Mannose, Galactose, Lactose, Adonit, d-Mannit, Maltose, Glycerin, Dextrose, Dextrin, Stärke: Verwertung; Rhamnose, 1-Arabinose, d-Xylose, Saccharose:

Keine Verwertung.

Lycopin wird in flüssiger Submerskultur produziert.

Identifizierung des Stammes

Der beim Verfahren der Erfindung einzusetzende Stamm unterscheidet sich von Streptomyces chrestomyceticus var. aurantioideus (britische Patentschrift 1 024 589) durch die Farbe des vegetativen Mycels (ersterer ist gelborgane, letzterer rot) und vom Streptomyces chrestomyceticus (britische Patentschrift 880 035; Canevazzi und S c ο 11 i: Journal of Microbiology 7, 1959, S. 242 bis 250) dadurch, daß er Nitrate nicht reduziert, Milch peplonisiert, ein wesentlich spärlicheres Luftmycel und ein intensiv rot pigmentiertes vegetatives Mycel aufweist und lycopin produziert.

Da sowohl die Herkunft als auch die Eigenschaften sich nicht sehr von denen von Streptomyces chrestomyceticus unterscheiden, wird angenommen, daß der· beim erfindungsgemäßen Verfahren einzusetzende Organismus als Varietät von Streptomyces chrestomyceticus bezeichnet werden kann, und er wurde daher Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens genannt.

Dieser Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens

kann durch Gefriertrocknung gelagert werden, wobei als Suspensionsmittel Milch oder Milchserum ver-

wendet wird, oder durch Aufbewahren der Sporen in einem sterilen Substrat.

Außerdem kann er durch Weiterzüchten auf Kulturen auf einem festen Medium gelagert werden, das Glucose und andere geeignete Zucker und Stickstoff liefernde Substanzen (Hefeextrakt, Pepton, Kaseinhydrolysate) enthält. Die Herstellung von Lycopin wird nach den üblichen, an sich bekannten Methoden durchgeführt; dabei wird zunächst ein flüssiges Kulturmedium hergestellt, dieses wird sterilisiert, und darin wird unter aeroben Bedingungen Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens bei einer Temperatur von 25 bis 35°C, vorzugsweise bei 28°C, während eines Zeitraumes von 4 bis 8 Tagen, vorzugsweise 6 Tagen und,

bei einem pH-Wert, der ursprünglich bei 6,5 bis 6,0 und bei Ende des Fermentationsverfahrens bei 6,0 bis 5,5 liegt,'gezüchtet. Das Kulturmedium enthält eine KohlenstofTquelle, eine Stickstoffquelle und eine Quelle von Salzen. Als Kohlenstoffquelle kann Stärke, Dextrin, Glucose, Glycerin, Manrit, Maltose, Maisquellilücsigkeit, lösliche Weindestillationsrückslände oder Sojaöl Verwendung finden. Die Stickstoffquelle kann auCer den obenerwähnten komplexen Substanzen, die Stickiioff enthalten, Trockenhefe, Fleischpepton oder Kasein sein.

Gute Ergebnisse können auch erzielt werden bei der Verwendung von Ammoniumsalzen, wie Ammonnitrat, Ammonsulfat, Diammonphosphat. Die für die Herstellung VGn Lycopin zweckmäßig verwendeten Mineralsalze hängen von der Art des verwendeten Mediums ab; es können Salze von Kalium, Magnesium, Eisen, Zink und Kupfer Verwendung finden.

Die Fermentation selbst kann in Erlenmeyerkolben oder in Laboratoriums- oder industriellen Fermentern verschiedener Kapazität durchgeführt werden.

Die Menge von Lycopin, die in der Fermentationsbrühe enthalten ist, wird durch spektrophotometrische Versuche von kleinen Mustern der Kulturbrühe, im allgemeinen 1 bis 2 ml, durchgeführt, und die Ablesung wird bei 462 ιτιμ durchgeführt. Das gesamte gebildete Lycopin ist nur im Mycel enthalten, während die Brühe kein Lycopin enthält. Es muß daher zur Isolation des Lycopins das Mycel abfiltriert werden. Die abgetrennte Kulturbrühe wird verworfen. Der Filterkuchen, der das gesamte während der Fermentation gebildete Lycopin enthält, wird dann in einem organischen Lösungsmittel mit niedrigem Siedepunkt aufgeschlämmt und geschüttelt, wie in Äthyläther, Azeton, Methylenchlorid, Chloroform usw.

Es können auch Mischungen der obenerwähnten organischen Lösungsmittel zweckmäßigerweise Verwendung finden. Die vereinigten organischen Extrakte werden dann im Vakuum eingeengt, und der Rückstand wird mit Petroläther aufgenommen und durch eine Säule von SiO₂ chromatographiert und anschließend mit einer Mischung von Petroläther und Azeton eluiert.

Das so erhaltene rohe Lycopin wird durch Umkristallisieren aus Petroläther gereinigt.

Die folgenden Beispiele sollen den Gegenstand der vorliegenden Erfindung erläutern.

Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens, welcher bei dem Commonwealth Mycological Institute (Grotbritannien) mit der Indexnummer IMl 126134 hinterlegt ist, wird durch Übertragen auf Streifen eines Mediums folgender Zusammensetzung gelagert:

Hefeextrakt 5 g

Glucose 10 g

MgSO₄-7H₂O 0,5 g

Na₂HPO₁ 1,4 g

KH₁PO₄ 0,4 g

Agar 25 g

Destilliertes Wasser auf 1000 ml.

von einigen 300-ml-Kolben verwendet, wobei jeder 60 ml des folgenden vegetativen Mediums enthält:

Dextrin 30 g

Kasein 5 g

CaCO₃ 4 g

Maisquellflüssigkeit 3 g

(NH₄),SO₄ Ig

K₂HPO₄ 0,1g

Leitungswasser auf 1000 ml.

Vor der Sterilisierung beträgt der pH-Wert 6,4.
Sterilisierung 20 Minuten lang bei 120⁰C.

Das Medium wird 26 Stunden lang bei 28°C auf einem Drehschüttler mit einer Exzentrizität von 3,5 cm und 230 U. p. M. bebrütet.

Die so erhaltenen Kulturen dienen zum Animpfen von 300-ml-Kolben, wovon jeder 30 ml Produktionsmedium folgender Zusammensetzung enthält:

Stärke 100 g

Sojamehl 80 g

(NHJ₂SO₄ 3 g

CaCO₃ 3 g

KH₂PO₁ 7,5 g

NaCl 2,5 g

MgSO₄ · 7 H₂O Ig

ZnSO₄-7 H₂O 0,010 g

FeSO₄ · 7 H₂O 0,010 g

CuSO₄ · 5 H₄O 0,001 g

Leitungswasser auf 1000 ml.

Vor der Sterilisierung beträgt der pH-Wert 5,8.
Sterilisierung 20 Minuten lang bei 12O⁰C.

Das Medium wird bei 28°C auf einem Drehschüttelapparat mit einer Exzentrizität von 3,5 cm bei 230 U. p. M. bebrütet. Nach 6 bis 7 Tagen zeigt die spektrophotometrische Analyse die Anwesenheit von 52Oy Lycopin pro Milliliter Brühe. Zu diesem Zeitpunkt wird kieselsäurehaltiges Material als Filtrierhilfsstoff der Fermentationsmasse zugesetzt, und das mit diesem Material gemischte Mycel wird von der Flüssigkeit abfiltriert. Die Flüssigkeit wird, da sie kein Lycopin enthält, verworfen. Der Filterkuchen wird mit Azeton, gegebenenfalls in Mischung mit Methylenchlorid, geschüttelt.

Die vereinigten Extrakte werden im Vakuum zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wird mit niedersiedendem Petroläther aufgenommen, und die so erhaltene Rohlösung wird über eine Säule aus Kieselgel chromatographiert und mit Petroläther mit einem Gehalt von 2°/₀ Azeton eluiert. Die Eluate werden im Vakuum zur Trockene eingedampft, und der Rückstand wird aus Petroläther umkristallisiert, wobei reines Lycopin mit einem Schmelzpunkt von 170 bis 172 C erhalten wird.

Die Identität dieses Produktes wird sowohl durch Vergleich seines Spektrums mit dem Spektrum eines Standardmusters von Lycopin oder durch Chromatographie oder durch Bestimmung des Mischschmelzpunktes bewiesen.

Beispiel 2

Vor der Sterilisierung beträgt der pH-Wert 7.
Sterilisierung: 20 Minuten lang bei 120⁰C.

Unter den im Beispiel 1 angegebenen Bedingungen 65 wurde ein Versuch durchgeführt, um den Einfluß des Belüftungsgrades des Produktionsmediums auf die Das Medium wird 6 Tage lang bei 28⁰C bebrütet. Produktion von Lycopin festzustellen. Die-verschiede-Die so erhaltenen Kulturen werden zum Animpfen nen Belüftungsgrade wurden dadurch erhalten, daß das

Volumen des Produktionsmediums im Kolben geändert wurde. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben, aus welcher eindeutig hervorgeht, daß die Produktion von Lycopin dem Beliiftungsgrad direkt proportional ist.

Mediumvolumen	Lycopin produzier!
	nach 7 Tagen
(ml)	(y/ml Brühe)
20	580
30	490
40	410
50	220
60	45

Beispiel 3

Unter den gleichen Bedingungen, wie im Beispiel 1 beschrieben, wurde ein Versuch durchgeführt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle angegeben.

Alter der Kultur

des vegetativen

Mediums

(Stunden)

22
26
30
36

Lycopin produziert nach 7 Tagen

0'/ml Brühe)

350 530 .518 480

benen Produktionsmediunis folgendes Medium verwendet wurde:

Lösliche Weindesttllationsrück-

ständc

Trockenhefe

Maisquellflüssigkeit

Dextrin

MgSO₄

K₂HPO₄

FeSO₄ · 7 H.,0

ZnSO₄ · 7 H₂O

CuSO₄ · 5 H₂O

Leitungswasser auf 1000 ml.

44g

5g

3g 80 g

0,5 g

0,3 g

0,010 g

0,001g

Beispiel 4

Die Fermentation wird wie im Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt, wobei jedoch aft Stelle des dort beschrie- 35 450 γ Lycopin pro Milliliter Brühe erzielt.

Vor der Sterilisierung beträgt der pH-Wert 6,5. Sterilisierung: 20 Minuten lang bei 120⁰C.

Nach 6tägiger Fermentation enthielt die Kulturbrühe Lycopin in einer Konzentration von 410 y/ml.

Beispiel 5

In einem 10-1-Fermenter werden 61 Produktionsmedium mit der im Beispiel 1 beschriebenen Zusammenas Setzung durch 40 Minuten langes Erhitzen auf 120⁰C sterilisiert.

Nach Abkühlen des Mediums wird es mit 600 ml eines vegetativen Mediums, hergestellt wie im Beispiel 1 angegeben, beimpft. Das Medium wird bei 28°C mit einem Belüftungsgrad entsprechend einem Luftstrom von 6 1 p. M. bebrütet, wobei mit einem Rührwerk mit sechs Schaufeln mit einer Geschwindigkeit von 380 Umdrehungen pro Minute gerührt wird.

Nach 6tägiger Bebrütung wird eine Produktion vor

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Herstellung von Lycopin in Submerskultur oder Oberfiächenkultur und unter aeroben Bedingungen in einem wäßrigen Nährmedium, das eine Quelle für Kohlenstoff, für Stickstoff und für Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 25 bis 35^CC, vorzugsweise bei 28°C, während eines Zeitraumes von 4 bis 8 Tagen, vorzugsweise 6 Tagen, wonach das erhaltene Lycopin aus dem Mycel in an sich bekannter Weise isoliert und gereinigt wird, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Streptomyces chrestomyceticus var. rubescens, der bei dem Commonwealth Mycological Institute (Großbritannien) mit der Indexnummer IMl 12^134 hinterlegt ist, verwendet wird.