DE1152411B

DE1152411B - Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen

Info

Publication number: DE1152411B
Application number: DEP26765A
Authority: DE
Inventors: Donald Beck; Gilbert Malcolm Shull
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Pfizer Inc
Priority date: 1960-06-09
Filing date: 1961-03-16
Publication date: 1963-08-08
Also published as: GB899396A; US2970087A; BR6127458D0

Description

DEUTSCHES

PATENTAMT C 07c; C 12d

P 26765 IVb/12 ο

ANMELDE TA G: 16. MARZ 1961

BEKANNTMACHUNG DER ANM.ELDUNG UNDAUSGABEDER AUSLEGESCHRIFT: 8. AUGUST 1963

Gegenstand der Erfindung ist ein neues Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin-Antibiotica durch Einführung einer Hydroxylgruppe in ein 12a-Desoxytetracyclin mittels bestimmter Ascomycetenstämme.

Die 12a-Desoxyderivate der Tetracyclin-Antibiotica sind bekannt und lassen sich nach einer Reihe von Verfahren, z. B. durch Reduktion der Tetracycline mit Zink, wie sie z. B. in Journal of the American Chemical Society, Bd. 75, 1953, S. 5474; Bd. 76, 1954, S. 3574, in der USA.-Patentschrift 2 922 817 und in der südafrikanischen Patentschrift 3651 aus dem Jahre 1958 beschrieben sind, herstellen. 12a-Desoxytetracycline können aber auch durch katalytische Hydrierung eines Tetracyclin-12a-(O-Acyl)-Derivates, dessen Acylrest der einer Carbonsäure mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist, oder des entsprechenden 12a-(O-Arylcarbamyl)-Derivates des betreffenden Tetracyclins in einem praktisch wasserfreien, inerten Lösungsmittel hergestellt werden. 12a-Desoxytetracycline können auch nach üblichen Verfahren aus leicht erhältlichen Zwischenprodukten synthetisiert werden. In »Journal of the American Chemical Society«, Bd. 82, 1960, S. 1250, wird eine Synthese von Desdimethylamino-6-desmethyl-6,12adidessoxy-7-chlortetracyclin beschrieben.

Daher sind Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen in 12a-Stellung im Rahmen einer Vollsynthese der wertvollen Tetracyclin-Antibiotica von besonderer Bedeutung.

Es wurde nun ein besonders wirksames mikrobiologisches Verfahren für eine solche Umwandlung gefunden, bei dem die oxydierende Wirksamkeit bestimmter Mikroorganismen der Gruppe Ascomyceten ausgenutzt wird. Diese Wirksamkeit besitzen die Arten Sporormia minima und Thielavia terricola. Verschiedene Stämme dieser Organismen sind bekannt und als Wachstumskulturen frei erhältlich. So kann z. B. Sporormia minima NRRL 2475 von der Kulturensammlung des Northern Regional Research Laboratory in Peoria, Illinois, bezogen werden. Sporormia minima ist aber auch von dem Dominion Laboratory of Plant Pathology, Ste-Anne-De-La-Pocatiere, Quebec (Kultur Nr. 345), und von dem »Centraalbureau vor Schimmelcultures, Baarn, Holland, erhältlich. Von öffentlichen Stellen erhältliche Thielavia-terricola-Kulturen sind ATCC 1722 und ATCC 11769 von American Type Culture Collection in Washington, D. C; QM 214 und QM 843 von Quartermaster Culture Collection, Quartermaster General Laboratories, Philadelphia, und Nr. 2002 von Japanese Type Culture Collection, Nagao Institute, Kitashinagawa, Tokio. Derartige Verfahren zur Hydroxylierung von lla-Desoxytetracyclinen

Anmelder:

Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N. Y. (V. St. A.)

Vertreter: Dr. W. Beil, A. Hoeppener

und Dr. H. J. Wolff, Rechtsanwälte,

Frankfurt/M.-Höchst, Antoniterstr. 36

Beanspruchte Priorität: V. St. v. Amerika vom 9. Juni 1960 (Nr. 34 886)

Donald Beck, Mystic, Conn., und Gilbert Malcolm Shull, Old Lyme, Conn.

(V. St. Α.),
sind als Erfinder genannt worden

Kulturen sind auch vom Centraalbureau vor Schimmelcultures, Baarn, Holland, der New York Botanical Garden Laboratory Collection und dem Institute for Fermentation, Osaka, erhältlich. Außerdem wurde eine Kultur von Thielavia terricola bei der American Type Culture Collection in Washington, D. C, unter der Bezeichnung ATCC Nr. 13807 hinterlegt. Diese Kultur wurde aus Erde isoliert und dadurch identifiziert, daß man davon gewonnene Kulturen auf zur Identifizierung solcher Mikroorganismen normalerweise verwendete Medien pflanzte, die Kulturen untersuchte und ihr Wachstum und/oder die damit verbundenen Veränderungen beobachtete. Diese Kultur wächst in zufriedenstellender Weise auf vielen für die Fortpflanzung von Ascomycetenstämmen verwendeten Medien, wie Kartoffel-Dextrose-Agar. Letzterer kann so hergestellt werden, daß man 100 g geschälte, in Scheiben geschnittene Kartoffeln 30 Minuten in 500 cm³ destilliertem Wasser dämpft und den entstandenen Extrakt auf 1 1 verdünnt. Nach Zusatz von 10 g Dextrose und 20 g Agar werden diese · Substanzen gelöst. Die Lösung wird dann in Röhrchen gebracht und 20 Minuten bei einem Wasserdampfdruck von 1,4 atü sterilisiert. Ein bestimmter pn-Wert braucht nicht eingestellt zu werden.

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Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen in 12a-Stellung mittels Organismen, die sich von den vorliegend beschriebenen stark unterschieden, sind bereits vorbeschrieben. Im Journal of the American Chemical Society, Bd. 81, 1959, S. 4750/4751 wird die Verwendung von Curvularia lunata, Curvularia pallescens und Botrytis cinerea der Gruppe Fungi Imperfecti beschrieben. Eine Vielzahl von Mikroorganismen wurden auf ihre Wirksamkeit bei der Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen untersucht. Die meisten dieser Mikroorganismen zeigten keine derartige Hydroxylierungswirkung. Im Gegensatz zu' den veröffentlichten Verfahren und den schlechten Ergebnissen, die mit einer Reihe von Organismen, die die Erfinder des vorliegenden Verfahrens untersuchten, erzielt wurden, führten die erfindungsgemäß verwendeten Ascomyceten zu auffallend günstigen Ergebnissen, wodurch die Herstellung solch wertvoller Produkte, wie Tetracyclin, in äußerst reiner Form und in Ausbeuten von über 3O°/o ermöglicht wurde.

Die 12-Desoxytetracycline entsprechen der Formel

R4 Ri

OH
CONH₂

in der

Ri

R₂

R₃

R₄

OH O OH O

H oder eine Dimethylaminogruppe,

H oder OH,

H oder CH₃,

H, Cl oder Br ist.

Dazu gehören beispielsweise

12a-Desoxytetracyclin,
5-Hydroxy-12a-desoxytetracyclin,
6-Desmethyl-12a-desoxy tetracyclin,
6-Desoxy-12a-desoxytetracyclin,
6-Desoxy-6-desmethyl-12a-desoxytetracyclin,
5-Hydroxy-6,12a-didesoxytetracyclin,
4-Desdimethylamino-12a-desoxytetracyclin,
4-Desdimethylamino-6,12a-didesoxytetracyclin,
4-Desdimethylamino-6-desmethyl-12a-desoxy-

tetracyclin,
4-Desdimethylamino-6-desmethyl-6,12a-dides-

oxytetracyclin,
4-Desdimethylamino-5-hydroxy-12a-desoxy-

tetracyclin,
4-Desdimethylamino-5-hydroxy-6,12a-dides-

oxytetracyclin,

6-Desmethyl-7-chlor-12a-desoxytetracyclin,
6-Desmethyl-7-bromo-12a-desoxytetracyclin,
4-Desdimethylamino-7-chlor-12a-desoxy-

tetracyclin.

Bei Durchführung der Hydroxylierung in 12a-Stellung nach dem neuen Verfahren kann das
12a-Desoxytetracyclin unter submersen aeroben Bedingungen einer wachsenden Kultur des Ascomycetenstammes zugesetzt werden, oder es kann dem
Medium vor der Beimpfung zugefügt werden. Man kann aber auch so vorgehen, daß man die Kultur
in einem wäßrigen Nährmedium sich vermehren
läßt, bis ein merkliches Wachstum erreicht ist, danach filtriert, das gewünschte 12a-Desoxytetracyclin dem zellfreien Filtrat zufügt und die Hydroxylierung unter aeroben Bedingungen fortschreiten läßt.

In dem neuen Verfahren können zur Vermehrung der Mikroorganismen eine Reihe von wäßrigen Medien eingesetzt werden. Eine organische oder anorganische Stickstoffquelle soll vorhanden sein. Geeignete Stickstoffquellen sind: Sojabohnenmehl, ίο Maisquellwasser, enzymatische Cäseinauszüge und Hefe-Stickstoffbasen sowie Ammoniumsalze oder Harnstoff. Außerdem soll eine Kohlehydratquelle, wie Zucker, Stärke oder Glycerin, vorhanden sein. Oft erweist es sich als vorteilhaft, noch andere Wachstumsstoffe zu verwenden, z. B. die, die im Hefe-Extrakt oder in den löslichen Rückständen aus der. Alkoholgärung enthalten sind. Der Mineralsalzbedarf der Organismen wird gewöhnlich durch den natürlichen Salzgehalt der anderen Bestandteile 2ü sowie dadurch gedeckt, daß man zur Herstellung des Mediums Leitungswasser verwendet, das bereits verschiedene Spurenmetalle enthält.

Ein zufriedenstellendes Wachstum der erfindungsgemäß verwendeten Ascomyceten ist innerhalb eines weiten pH-Bereichesmöglich. Der anfängliche pn-Wert des Mediums liegt gewöhnlich zwischen etwa 4 und 8. Die Einstellung eines bestimmten Ph-Wertes ist im allgemeinen nicht nötig. Nach der Sterilisierung, die zweckmäßig durch Anwendung von Wärme erfolgt, kann das Medium gekühlt und mit einer Schrägnährbodenkultur des gewählten Organismus beimpft werden. Im Laboratorium verwendet man zur Vermehrung der Kultur zweckmäßig Fernbachkolben, die mechanisch geschüttelt werden, um für die entsprechende Belüftung und Durchmischung zu sorgen. Hingegen können bei der in einer ,größeren Anlage durchgeführten Normalgärung für eine submerse aerobe Gärung ausgerüstete Behälter eingesetzt werden. Temperaturen zwischen etwa 20 und 40⁰C, vorzugsweise zwischen 25 und 30⁰C, erweisen sich als zufriedenstellend. Während der Gärung beobachtet man im allgemeinen, daß der pH-Wert auf etwa 2 bis 4,5 absinkt. Die jeweils günstigste Gärzeit hängt von dem Organismus, der Temperatur und den anderen Bedingungen, unter denen die Gärung jeweils erfolgt, ab. Ausgezeichnete Ergebnisse erzielt man gewöhnlich mit Gärzeiten zwischen etwa 24 und 72 Stunden.

Wurde das ^a-Desoxytetracyclin-Antibioticum dem Medium nicht vor der Impfung zugesetzt, so kann es nun der Brühe oder gegebenenfalls dem zellfreien Filtrat aus der Brühe zugegeben werden. Das Tetracyclin kann in trocknem Zustand oder als Dispersion in einem geeigneten Träger, wie Aceton oder 70%igem wäßrigem Äthanol, zugefügt werden. Die Konzentrationen des Tetracyclins in der Brühe können innerhalb eines weiten Bereiches schwanken. Um jedoch die Kapazität der Anlage besser auszunutzen, verwendet man vorzugsweise Konzentrationen von mindestens etwa 0,25 bis 1 g/l. Wird das Tetracyclin als Dispersion in wäßrigem Äthanol oder in einer ähnlichen organischen Flüssigkeit zugegeben, so beschränkt man die Menge einer solchen Flüssigkeit vorzugsweise auf etwa 3 Gewichtsprozent pro Volumeinheit oder weniger, bezogen auf das Gesamtvolumen der Brühe. Nach Zugabe des 12a-Desoxytetracyclins wird die Belüftung fortgesetzt, und zwar vorzugsweise so lange, bis praktisch das

gesamte Substrat verbraucht ist. Hierfür sind gewöhnlich etwa 8 bis 72 zusätzliche Belüftungsstunden angebracht. Meistens genügen etwa 24 Stunden.

Der Verlauf der Umsetzung wird zweckmäßig durch Papierchromatographie verfolgt. Hierfür eignet sich Whatman-Papier Nr. 4, das mit einer durch Auffüllen von 2,05 cm³ einer 0,2molaren wäßrigen Dinatriumphosphatlösung mit einer 0,1 molaren wäßrigen Zitronensäurelösung auf 10 cm³ hergestellten Macllvaine-Puffersubstanz (pH-Wert = 3) gepuffert und getrocknet ist und das mit einem von folgenden Lösungsmittelsystemen verwendet werden kann: z. B. mit Wasser gesättigtem Äthylacetat oder mit der oberen Phase, die nach Einstellung des Phasengleichgewichtes zwischen 10 Volumen Äthylacetat und je 1 Volumen Butanol und Wasser erhalten wird. Nach einer Entwicklungszeit von etwa 1 bis 15 Stunden wird das Chromatogramm getrocknet, mit Ammoniak neutralisiert und unter ultraviolettem Licht auf seine Fluoreszenszonen untersucht. Die Komponenten werden durch gleichlaufende Chromatographie von bekannten Proben von Substrat und erwartetem Produkt äußerst genau identifiziert.

Die in 12a-Stellung hydroxylierten Produkte werden in gereinigter Form nach bekannten Verfahren leicht aus den Reaktionsgemischen gewonnen. Beispielsweise kann man der filtrierten Gärbrühe etwa 2 g/l eines Calcium- oder Magnesiumsalzes, wie Calciumchlorid, zusetzen und den pH-Wert auf etwa 7,5 bis 8 einstellen. Die Wirksamkeit kann dann in ein praktisch mit Wasser nicht mischbares Lösungsmittel, wie Butanol, extrahiert und der Extrakt im Vakuum auf etwa ein Zehntel seines Volumens eingeengt werden. Dem Konzentrat wird dann Hexan zugesetzt, und das Produkt wird mit einer verdünnten wäßrigen Säure extrahiert. Nach Neutralisation der wäßrigen Lösung fällt das Produkt in Form der freien Base aus und kann aus einem geeigneten Lösungsmittelgemisch, wie Isopropylalkohol, der mit verdünnter Salzsäure angesäuert ist, kristallisiert werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Desoxytetracyclinen in 12a-Stellung ist höchst zuverlässig, führt zu guten Ausbeuten und stellt dadurch ein sehr erwünschtes Zwischenglied in der Gesamtsynthese der wertvollen Tetracylin-Antibiotica dar. Man erhält praktisch von nicht umgesetztem Ausgangsmaterial freie Produkte, deren Reinigung daher sehr einfach ist.

Die nachstehenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Glukosemonohydrat 30,0 g

Hefe-Stickstoffbase (bezogen von

den Difco Laboratoris in

Detroit) 6,7 g

Hefe-Extrakt (bezogen von den

Difco Laboratoris in Detroit) ... 5,0 g
Wasser um auf 1 1 aufzufüllen

• Obiges Medium, dessen pH-Wert etwa 5,7 beträgt, wird in einen Fernbachkolben mit Wattebausch gebracht und im Autoklav 30 Minuten bei 121⁰C sterilisiert. Nach dem Abkühlen auf 28⁰C wird das Medium mit Sporen von Sporormia minima NRRL 2475 beimpft, die aus einem Agar-Schrägnährboden mit sterilem Wasser ausgespült wurden, und die Kultur wird auf einem Schüttelautomaten 24 Stunden bei 28 ⁰C geschüttelt. Zu diesem Zeitpunkt ist der pH-Wert bereits auf etwa 3 abgesunken. Ig Ha-Desoxytetracyclin, das in 30 cm³ 70%igem wäßrigem, mit Methanol vergälltem Äthanol suspendiert ist, wird nun eingeführt und das Schütteln 16 Stunden bei 28⁰C fortgesetzt, wonach ein Papierchromatogramm einen starken Tetracyclinflecken

ίο sowie den vollständigen Verbrauch des 12a-Desoxytetracyclins anzeigt.

Das Gärgemisch wird filtriert, und 2 g Calciumchlorid werden dem Filtrat zugesetzt. Den pH-Wert stellt man mit Natriumhydroxyd auf 7,5 bis 8 ein, und die Lösung wird zweimal mit jeweils 500 cm³ Butanol extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt und bei etwa 40⁰C im Vakuum auf 100 cm³ eingeengt. Nach Zugabe von 200 cm³ Hexan wird das Tetracyclin mehrmals mit jeweils 20 cm³ 0,1 n-Salzsäure extrahiert. Nach Neutralisation der wäßrigen Phase mit Natriumhydroxyd fällt die Tetracyclinbase aus, die in guter Ausbeute gewonnen wird. Ein mikrobiologischer Trübungstest zeigt, daß das feste Produkt eine Wirksamkeit von 500 y/mg hat. Das Produkt wird durch Umkristallisieren aus Isopropylalkohol, dessen pn-Wert mit verdünnter Salzsäure auf 2,5 eingestellt wurde, weiter gereinigt. Durch Vergleich mit einer, authentischen Probe wird das Tetracyclin identifiziert. Umwandlung, bezogen auf das eingesetzte Oa-Desoxytetracyclin, 25%.

Beispiel 2

Unter Verwendung des Mediums von Beispiel 1 wird Thielavia terricola in submersem aerobem Wachstum 36 Stunden gezüchtet, wonach die Brühe filtriert wird. Zu 100 cm³ des Filtrats werden 25 mg 12a-Desoxytetracyclin, das in 1 cm³ 70%igem Äthanol dispergiert ist, gegeben. Belüftung und Schütteln werden fortgesetzt, und Proben werden periodisch zur papierchromatographischen Analyse entnommen. 8 Stunden nach erfolgtem Substratzusatz kann etwas Tetracyclin nachgewiesen werden, und nach 24 Stunden ist das 12a-Desoxytetracyclin vollständig verbraucht. Zu diesem Zeitpunkt ist die Umsetzung beendet, und das Produkt wird gewonnen und gereinigt. Umwandlung, bezogen auf das eingesetzte Oa-Desoxytetracyclin, 40%.

Beispiel 3

Man verfährt wie im Beispiel 1, doch wird nun das 12a-Desoxytetracyclin dem Medium vor der Beimpfung zugesetzt. Wiederum wird Tetracyclin gewonnen und gereinigt.

Beispiel 4

Das Verfahren des Beispiels 1 wird mit Erfolg auf 5-Hydroxy-12a-desoxytetracyclin angewendet, wobei man nun aber folgendes Medium verwendet:

Sojabohnenmehl 10,0 g

Glukosemonohydrat 20,0 g

Lösliche Rückstände aus

der Alkoholgärung 0,5 g

Wasser um auf 11 aufzufüllen
Beispiel 5

Wiederum wird das Verfahren des Beispiels 1 mit Erfolg auf o-Desmethyl-na-desoxytetracyclin ange-

Claims

7 8 wendet, wobei nun an Stelle des vorstehend ver- bringen mit dem oxydierend wirkenden Substrat wendeten folgendes Medium eingesetzt wird: eines Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, -rj ff , 5 daß man als Mikroorganismus einen Ascomyceten- /XTXT^ ?rr>A i'n ** stamm der Art Sporormia minima oder Thielavia (NH^2HPO4 3,0 g . j verwend;t Saccharose 20,0 g Hefe-Extrakt 5,0 g 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn- w , , , uf zeichnet, daß als na-Desoxytetracyclin-Derivat wasser um aui ι laut Oa-Desoxytetracyclin oder 5-Hydroxy-12a-Des- zu u en oxytetracyclin verwendet werden. PATENTANSPRÜCHE: io —

1. Verfahren zur Hydroxylierung von 12a-Des- In Betracht gezogene Druckschriften:

oxytetracyclinen in 12a-Stellung durch Zusammen- J. Am. Chem. Soc, Bd. 81, 1959, S. 4750/4751.