DE69119024T2 - Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver 3-Methyladipinsäure - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver 3-MethyladipinsäureInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung optisch aktiver 3-Methyladipinsäure aus Squalen. Die erfindungsgemäß hergestellte optisch aktive 3-Methyladipinsaure ist eine chirale Verbindung mit einer Methylgruppe am asymmetrischen Kohlenstoffatom und verwendbar als Ausgangsmaterial für die Synthese von Pharmazeutika, Agrochemikalien und anderen physiologisch wirksamen Substanzen sowie das Ausgangsmaterial für flüssigkristalline Polymere.
- 2. Beschreibung des Stands der Technik Derzeit sind als Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver 3-Methyladipinsäure ein Verfahren bekannt, worin eine optisch aktive, natürlich vorkommende Verbindung, (S)-(-)-Citronellol, zur Bildung von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure oxidiert (J. Chem. Soc. Commum., 803, 1984) und ein Verfahren, worin eine optisch aktive, natürlich vorkommende Verbindung (R)-(+)-Pulegonsäure zur Bildung von (R)-(+)-3-Methyladipinsäure oxidiert wird (Bull. Soc. Chim. Fr.[5] 6, 1355, 1939), wobei aber die obigen Verfahren beide nachteilig sind sowohl in industrieller Hinsicht, da sie als Ausgangsmaterial eine teure optisch aktive Substanz verwenden, als auch weil sie ein Produkt bilden, welches nur geringe optische Reinheit wegen einer Racematbildung während der Oxidation besitzt.
- Die vorliegende Erfindung stellt also ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven 3-Methyladipinsäure mit einem sehr hohen optischen Reinheitsgrad bereit. Die erfindungsgemäß hergestellte optisch aktive 3-Methyladipinsaure ist zu wenigstens 95 %, vorzugsweise zu wenigstens 98 % und in am meisten bevorzugter Weise zu 100 % optisch rein.
- Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven 3-Metyhladipinsäure der Formel 1 bereit:
- worin das Symbol * ein asymmetrisches Kohlenstoffatom bedeutet, umfassend die Schritte:
- Kultivieren eines Mikroorganismus, der als zugehörig zu den Gattungen Candida lipolytica, Saccharomycopsis lipolytica und Yarrowia lipolytica ausgewiesen ist, in einem Squalen enthaltenden Medium, Prüfung auf Anwesenheit von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure und Gewinnen der (S)-(-)-3-Methyladipinsäure aus dem kultivierten Produkt.
- Figur 1 zeigt ein Infrarotabsorptions(IR)-Spektrum von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde, und Fig. 2 zeigt ein ¹³C-Kernspinresonanz (NMR)-Spektrum von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten wurde.
- Die erfindungsgemäß verwendeten Mikroorganismen können beispielsweise durch das folgende Verfahren erhalten werden. Eine natürlich vorkommende Quelle wird zu einer Kulturlösung, die Squalen als einzige Kohlenstoffquelle enthält, gegeben und eine Kultivierung zur Isolierung von Mikroorganismen durchgeführt, die zur Assimilierung von Squalen als Kohlenstoffquelle befähigt sind.
- Als Kulturlösung kann jede gebräuchliche Lösung verwendet werden, solange es Squalen als einzige Kohlenstoffquelle enthält, d. h. sie enthält die Bestandteile, welche für das Wachstum des Mikroorganismus erforderlich sind, beispielsweise eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und, sofern erforderlich, andere weniger bedeutende Nährstoffe wie Vitamine, Aminosäuren und Nukleotide und ähnliche. Squalen als einzige Kohlenstoffquelle ist in einer Menge von 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 1 bis 10 g pro Liter enthalten.
- Als Stickstoffquelle werden beispielsweise Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Harnstoff und ähnliche allein oder in Kombination verwendet. Die Menge der verwendeten Stickstoffquelle variiert in Abhängigkeit von der Art der Stickstoffquelle und beträgt normalerweise 0,1 bis 10 g, vorzugsweise 1 bis 3 g pro Liter Medium. Als anorganische Salze werden Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(III)-sulfat, Eisen(III)-chlorid, Calciumchlorid und ähnliche allein oder in Kombination verwendet. Die Menge der verwendeten anorganischen Salze variiert in Abhängigkeit von der Art der anorganischen Säure und beträgt normalerweise 0,001 bis 10 g, vorzugsweise 0,01 bis 5 g pro Liter.
- Sofern notwendig, können andere weniger bedeutsamere Nährstoffe wie Vitamine, Hefeextrakt, Pepton, Maiswasser und ähnliche allein oder in Kombination verwendet werden. Die zugegebene Menge ist abhängig von der Art des Zusatzes und beträgt normalerweise bis zu 10 g, beispielsweise 0,05 bis 10 g und vorzugsweise 0,1 bis 5 g pro Liter. Der pH-Wert der Kulturlösung kann 2 bis 10 und vorzugsweise 3 bis 6 betragen.
- Weiterhin enthält die Lösung vorzugsweise ein Antibiotikum, Biozid oder ähnliches, um das selektive Wachstum eines bestimmten Mikroorganismus zu ermöglichen. Beispielsweise wird für das selektive Wachstum von Hefe Streptomycin zu der Kulturlösung in einer Menge von 0,1 bis 100 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg pro Liter gegeben, um das Wachstum von Bakterien zu hemmen.
- Die Quellen, aus denen Mikroorganismen isoliert werden, können alle natürlich vorkommenden Materialien wie Erde, Abwässer oder verdorbenes Obst sein. Die Quelle wird zu einem Medium in einer Menge von 1 bis 100 g, vorzugsweise 30 bis 50 g pro Liter zugegeben. Die Kulturtemperataur beträgt 15 bis 80ºC, vorzugsweise 20 bis 35ºC, und die Kultivierung wird 1 bis 30 Tage lang, vorzugsweise 4 bis 7 Tage lang ausgeführt, und dann ein Teil der Kultur in ein frisches Medium gegeben und das Kultivieren 1 bis 30 Tage lang, vorzugsweise 4 bis 7 Tage lang durchgeführt. Dieses Verfahren wird zwei- bis fünfmal wiederholt. Die Kultivierung wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt, die durch gebräuchliche Maßnahmen wie Belüften oder Rühren oder eine Kombination der beiden erreicht werden.
- Das Wachstum der Mikroorganismen wird durch Messung der Trübung oder durch mikroskopische Beobachtung bestimmt.
- Vorzugsweise wird die Isolierung der Mikroorganismen durchgeführt, nachdem die Trübung OD&sub6;&sub1;&sub0; = 0,1 bis 10, in bevorzugterer Weise 0,2 bis 1 erreicht worden ist. Für die Isolierung wird ein gebräuchliches Isolierungsverfahren, wie ein Plattenkulturverfahren verwendet. Das Plattenkulturmedium enthält 0,1 bis 10 % Agar und ist beispielsweise ein Hefeextrakt/Malzextraktmedium, enthaltend 2 % Agar (YM-Agarmedium).
- Beispielhaft fur einen nach dem oben beschriebenen Verfahren isolierten Mikroorganismus, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendbar ist, sei eine Hefezellinie SQL349 erwähnt. Dieser Zellinie SQL349 wurde bei der Fermantation Research Institute Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japan, FERN P-11653 am 9. August 1990 hinterlegt und am 26. September 1991 in eine internationale Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag als FERN BP-3580 überführt.
- Der Mikroorganismus SQL349 hat folgende taxonomische Eigenschaften.
- a. Morphologie
- Pflanzliche Zelle: Sphärisch-elliptisch,
- Proliferation durch mehrpoliges Keimen
- Flüssige Kultur: Bildet Niederschlag und Oberflächenfilmschicht (25ºC, 3 Tage)
- Pseudomycelium: Gebildet (25ºC, 3 Tage)
- Echtes Mycelium: Gebildet (25ºC, 6 Tage)
- Ascospore: Nicht gebildet auf Adamsmedium, Gorodkowamedium, Malzmedium, YM-Medium, V-8-Medium, und einem Kartoffeldextrosemedium b. Physiologische Eigenschaften Fermentation von Zuckern Glucose Maltose Raffinose Assimilierung von: Nitrat Erythritol Glucose Cellobiose Wachstumstemperatur DBB-Farbstoffreaktion Fettabbau Saccharose Lactose Galactose Inositol Trehalose
- Den obigen Ergebnissen zufolge wurde die Zellinie SQL349 als Candida lipolytica identifiziert. Es ist anzumerken, daß Candida lipolytica taxonomisch das gleiche ist wie die unvollständige Erzeugung von Saccharomycopsis lipolytica, vorhanden am Institute of Fermentation Osaka (IFO) und die unvollständige Erzeugung von Yarrowia lipolytica, vorhanden am American Type Culture Collection (ATCC).
- Zusätzlich zu den oben erwähnten Mikroorganismen können erfindungsgemäß beispielsweise Candida lipolytica IFO 0746 (ATCC 20114), IFO 1209 (ATCC 8662), IFO 1542 (ATCC 20306), IFO 1632, IFO 1741, IFO 10073 (ATCC 48436), IFO 1742 (ATCC 9773), IFO 1195, IFO 1548 (ATCC 18942), IFO 1549 (ATCC 18945), IFO 1550 (18943), IFO 1746, ATCC 20237, ATCC 20255, ATCC 20362, ATCC 20363, ATCC 20460, ATCC 20461, ATCC 20496, ATCC 22421, ATCC 22422, ATCC 22423, ATCC 34922, ATCC 44601, ATCC 46330, ATCC 46482, ATCC 46483, ATCC 46484 und ähnliche verwendet werden und unter ihnen können die mit IFO markierten Zellinien ohne Einschränkung vom Institute of Fermentation Osaka, 17 - 85, Juso-honmachi 2-chome, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japan, erhalten werden und die mit ATCC markierten Zellinien können ohne Einschränkung von der American Type Culture Collection (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA erhalten werden.
- Das zur erfindungsgemäßen Herstellung von 3-Methyladipinsäure verwendete Medium enthält Komponenten, die für das Wachstum eines produzierenden Mikroorganismus notwendig sind, d. h. eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, anorganische Salze und, sofern erforderlich, weniger bedeutende Komponenten wie Vitamine, Aminosäuren, Nukleotide und ähnliche. Obwohl Squalen als ausschließliche Kohlenstoffquelle verwendet werden kann, können Zucker wie Glucose oder Erythritol, Kohlenwasserstoffe wie n- Paraff ine oder Alkohole wie Ethanol oder Propanol etc., sofern erforderlich, verwendet werden. Die Menge der verwendeten Kohlenstoffquelle variiert in Abhängigkeit von der Art der Kohlenstoffquelle und beträgt normalerweise bis zu 100 g, beispielsweise 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 0,5 bis 10 g pro Liter. Als Stickstoffquelle werden beispielsweise Kaliumnitrat, Ammoniumnitrat, Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniak, Harnstoff und ähnliche allein oder in Kombination verwendet. Die Menge der Stickstoffquelle variiert in Abhängigkeit von der Art der Stickstoffquelle und beträgt normalerweise 0,1 bis 10 g, vorzugsweise 1 bis 3 g pro Liter Medium.
- Als anorganische Salze werden Kaliumphosphat, Natriumphosphat, Magnesiumsulfat, Eisen(III)-sulfat, Eisen(III)-chlorid, Calciumchlorid und ähnliche allein oder in Kombination verwendet. Die Menge an anorganischen Salzen ist abhangig von der Art des anorganischen Salzes und beträgt normalerweise 0,001 bis 10 g, vorzugsweise 0,01 bis 5 g pro Liter. Falls notwendig, werden Vitamine, Nukleotide, Hefeextrakt, Pepton, Maiswasser und ähnliche allein oder in Kombination verwendet. Die Menge des Zusatzes hängt von der Art des Zusatzes ab und beträgt normalerweise bis zu 10 g, beispielsweise 0,05 bis 10 g, vorzugsweise 0,1 bis 5 g pro Liter.
- Der pH-Wert des Mediums wird im allgemeinen auf 2 bis 11, vorzugsweise auf 3 bis 6 eingestellt. Wenn sich der pH-Wert des Mediums während des Kultivierens erniedrigt, wird der pH-Wert durch Zusatz einer Lauge wie wassriger NaOH geregelt. Zusätzlich zu dem oben erwähnten Medium können andere gebräuchliche Medien wie Bouillonmedium, Hefeextrakt/Malzextraktmedium (YM-Medium) und ähnliche verwendet werden.
- Als Vorstufe der 3-Methyladipinsäure wird Squalen zu einer Kulturlösung gegeben. Das Squalen kann vor dem Beginn des Kultivierens zu der Lösung gegeben werden, oder es kann kontinuierlich oder periodisch während des Kultivierens zugegeben werden. Die gesamte Menge an verwendetem Squalen beträgt beispielsweise 0,1 bis 100 g, vorzugsweise 2 bis 20 g pro Liter.
- Um eine große Menge des gewünschten Produkts herzustellen, ist eine Kultur im großen Maßstab notwendig, und daher wird vorzugsweise vor der Erzeugerkultur eine Impfkultur hergestellt. Für die Impfkultur kann das gleiche Medium, wie oben für die Erzeugerkultur beschrieben, verwendet werden mit der Ausnahme, daß Squalen im Impfkulturmedium nicht notwendig ist.
- Das Kultivieren in der Impfkultur und in der Erzeugerkultur (Hauptkultur) wird bei 15 bis 80ºC, vorzugsweise 20 bis 35ºC, 1 bis 20 Tage, vorzugsweise 2 bis 5 Tage lang unter Schütteln, Rühren, Bewegen und/oder Belüften durchgeführt.
- Gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführung kann, wenn ein Erzeugermikroorganismus kultiviert worden ist und die kultivierten Zellen in Berührung mit Squalen in einem wässrigen Medium wie Phosphatpuffer unter aeroben Bedingungen gebracht worden sind, beispielsweise unter den gleichen Bedingungen wie diejenigen, die für das Kultivieren beschrieben sind, das gewünschte Produkt, d. h. 3-Methyladipinsäure, hergestellt werden.
- Das Verfahren zur Gewinnung des gewünschten Produkts aus einer Kulturbrühe oder einem Reaktionsgemisch ist nicht kritisch. Beispielsweise wird zuerst eine Kulturbrühe oder ein Reaktionsgemisch auf einen pH von 1 bis 6, vorzugsweise einen pH von 1 bis 3 eingestellt und dann mit einem Lösungsmittel extrahiert, um einen Extrakt zu erhalten, welcher das gewünschte Produkt, d. h. 3-Methyladipinsäure, enthält.
- Jedes Lösungsmittel, welches das erwünschte Produkt löst, beispielsweise ein organisches Lösungsmittel wie Tetrachlorkohlenstoff, Trichlorethylen, Toluol, Benzol, Dichlormethan, Chloroform, Diethylether oder Ethylacetat kann verwendet werden, aber vorzugsweise wird Dichlormethan, Chloroform, Diethylether oder Ethylacetat verwendet.
- Zur Isolierung und Reinigung des erwünschten Produkts aus dem Extrakt können herkömmliche Verfahrensweisen wie Adsorption, Elution, Destillation und ähnliche verwendet werden. Beispielsweise wird ein Extrakt verdampft, um das Lösungsmittel zu entfernen und aus dem erhaltenen Rückstand wird das erwünschte Produkt durch Adsorptionschromatographie unter Verwendung von Kieselgel, Aktivkohle, Styroldivinyl/Benzol- Copolymerharz oder ähnlichem und Ionenaustauschchromatogaphie unter Verwendung eines starken Anionenaustauscherharzes oder eines schwachen Anionenaustauscherharzes oder ähnlichem gereinigt.
- In alternativer Weise können die erhaltenen Produkte zu einem Methylester verestert werden durch ein herkömmliches Verfahren zur Herstellung eines Methylesters, beispielsweise durch Kochen unter Rückfluß mit Methanol in Gegenwart eines sauren Katalysators und Destillation des erhaltenen Estergemischs zur Isolierung von 3-Metyhladipinsäuremethylester.
- Bei der vorliegenden Erfindung wurde die Identifizierung und Bestimmung der optischen Reinheit der optisch aktiven 3-Methyladipinsäure wie folgt durchgeführt. Die Bestätigung des erwünschten Produkts 3-Methyladipinsäure wurde durch ein IR-Spektrum, ein ¹H-NMR-Spektrum, ein ¹³C-NMR-Spektrum und ein Massenspektrum durchgeführt.
- Die absolute Konfiguration und optische Reinheit der vorliegenden Verbindung wurden durch Vergleich der spezifischen Drehung der vorliegenden Verbindung mit derjenigen, die in der Literatur beschrieben ist und eine ¹³C-NMR-Sepktrumanalyse eines Diastereomers der vorliegenden Verbindung mit L-Menthol bestimmt. Die absolute Konfiguration und die optische Reinheit des Produkts wurden durch Vergleich seiner spezifischen Drehung mit der spezifischen Drehung von (R)-(-)-3- Methyladipinsäure [α]²²D = + 8,6º (c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O), beschrieben in der Literatur (Am. Soc. 69, 2568, 1947), erhalten. Weiterhin ließ man das Produkt mit L-Menthol in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure zur Synthese eines Diastereomers reagieren und das ¹³C-NMR-Spektrum wurde aufgenommen. Dann wurde die optische Reinheit aus dem Verhältnis der Signaiflächen eines Kohlenstoffatoms in 2-Position der R- und S-Form des 3-Methyladipinsäureanteils berechnet.
- Die erfindungsgemäß erhaltene Verbindung besitzt Carboxylgruppen und kann daher Salze bilden, beispielsweise Salze von Alkalimetallen wie Lithium, Natrium und Kalium, Erdalkalimetallen wie Calcium und Magnesium, und Ammonium und ähnlichen. Diese Salze können gemäß einem gebräuchlichen Verfahren aus der freien Verbindung erhalten werden. Beispielsweise kann eine freie Verbindung mit einer entsprechenden Base neutralisiert werden, um das entsprechende Salz zu erhalten.
- Da die erfindungsgemäß erhaltene Verbindung Carboxylgruppen besitzt, kann sie beispielsweise in einen Aldehyd oder Alkohol durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid überführt werden.
- Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung detailliert unter Bezugnahme auf Beispiele erläutert.
- Zunächst wurden jeweils 50 ml der in Tabelle 1 aufgeführten Medien in 500-ml-Sakaguchi-Kolben gegeben und bei 121ºC 20 Minuten lang autoklaviert. Dem Medium wurden 1 g einer Nährbodenprobe (von Miura, Kanagawa, Japan) hinzugefügt und dann die Kultur 5 Tage lang bei 30ºC unter Schütteln gehalten. Von diesen Kulturen wurden diejenigen ausgewählt, die ein mikrobielles Wachstum zeigten, ein Teil der Kultur wurde auf einem YM-Agar-Medium, das in Tabelle 2 gezeigt ist, ausplattiert und eine Zellinie SQL349 (FERN BP-3580) isoliert.
- Diese Zellinie wurde unter flüssigem YM-Medium bei 30ºC 24 Stunden lang unter Schütteln kultiviert und ein Teil der Kulturbrühe in 50 ml eines Mediums der in Tabelle 1 gezeigten Zusammensetzung beimpft bei einem Beimpfungsverhältnis von 1 Vol.-% und die Kultur 4 Tage lang bei 30ºC gehalten. Die Kulturbrühe wurde auf einen pH-Wert von 2 mit Chlorwasserstoffsäure eingestellt und mit Diethylether extrahiert und nach Phasentrennung wurde die organische Phase über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und anschließend das Lösungsmittel abdestilliert. Der erhaltene feste Rückstand wurde dann auf eine Silicagelsäule gegeben und stufenweise mit Hexan/Diethylether (100 : 10), Hexan/Diethylether (80 : 20) und Hexan/Diethylether (60 : 40) in dieser Reihenfolge eluiert.
- Die Fraktionen von Hexan/Diethylether (60 : 40) wurden vereint, das Lösungsmittel abdestilliert und der erhaltene Rückstand auf einer HP-2MG-Harzsäule (Mitsubishi Chemicals, Japan) adsorbiert und mit Wasser/Methanol (100 : 10) eluiert, um eine Fraktion zu erhalten, die die gewünschte Verbindung (S)-(-)-3-Methyladipinsäure enthält, die in Form eines weißen Feststoffs in einer Menge von 46 mg pro Liter Kulturbrühe anfiel.
- Mittels IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum und Massenspektrum wurde bestätigt, daß es sich bei der Verbindung um 3-Methyladipinsäure handelt. Das IR-Spektrum und das ¹³C-NMR-Spektrum der erhaltenen 3-Methyladipinsäure sind jeweils in den Figuren 1 und 2 gezeigt.
- Die absolute Konfiguration und optische Reinheit der erhaltenen Verbindung wurden durch Vergleich ihrer spezifischen Drehung mit dem in der Literatur bericheten Wert und einer ¹³C-NMR-Spektrumanalyse eines Diastereomers des Produktes mit L-Menthol bestimmt. Eine spezifische Drehung des Produkts [α]²²D = -8,9º (c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O) wurde mit dem Literaturwert von [α]²²D = +8,6º (c = 5,0 g/100 ml, H&sub2;O) von (R)-(+)-3-Methyladipinsäure verglichen und die Konfiguration und optische Reinheit des Produkts wurden als S-Form und jeweils 100 % bestimmt.
- Ferner wurde das Produkt mit L-Menthol in Gegenwart von p-Toluolsulfonsäure umgesetzt, um ein Diastereomer zu synthetisieren, und dessen ¹³C-NMR-Spektrum wurde erhalten. Der Enantiomerüberschuß, der aus dem Verhältnis der Signaiflächen des Kohlenstoffatoms in 2-Position der R- und S-Form von 3-Methyladipinsäure erhalten wurde, betrug mindestens 98 % e.e. Tabelle 1 Zusammensetzung Zugegebene Menge Squalen Hefeextrakt Tabelle 2 Zusammensetzung Zugegebene Menge Hefeextrakt Malzextrakt Pepton Glucose Agar
- Der Zellinie SQL349 (FERN BP-3580) wurde in einem flüssigen YM-Medium 16 Stunden lang bei 30ºC unter Schütteln kultiviert und mit der Kulturbrühe 3 l eines Mediums in einer 5 l Steinfermenter beimpft. Das Medium hatte die in der Tabelle 1 gezeigte Zusammensetzung, enthielt aber 10,6 g/l Squalen und 1,0 g/l Glucose als Kohlenstoffquelle. Die Kultivierung wurde bei 30ºC, 500 UpM und 0,5 VVM-Belüftung 64 Stunden lang durchgeführt und die gebildete (S)-(-)-3-Methyladipinsäure wurde entsprechend demselben Verfahren, wie in Beispiel 1 beschrieben, gereinigt, um (S)-(-)-3-Methyladipinsäure in einer Ausbeute von 0,85 g je Liter Kulturbrühe zu erhalten.
- Durch IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum, Massenspektrum, spezifische Drehung und ein ¹³C-NMR- Spektrum des Diastereomers mit L-Menthol wurde festgestellt, daß es sich bei dem Produkt um (S)-(-)-3-Methyladipinsäure mit einer optischen Reinheit von mindestens 98 % handelt.
- Eine Zellinie SQL340 (FERN BP-3580) wurde in 10 ml eines YM-Mediums bei 30ºC 72 Stunden lang kultiviert und die Kultur zentrifugiert, um kultivierte Zellen zu erhalten. Die Zellen wurden mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7) gewaschen und in 10 ml des gleichen Puffers suspendiert, 10 mg Glucose und 20 mg Squalen hinzugegeben und das Gemisch 48 Stunden bei 30ºC geschüttelt. Das Produkt (S)-(-)-3-Methyladipinsäure wurde entsprechend dem wie oben in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren gereinigt und im Ergebnis (S)-(-)-3-Methyladipinsäure in einer Ausbeute von 69 mg/1 Reaktionsgemisch erhalten.
- Durch IR-Spektrum, ¹H-NMR-Spektrum, ¹³C-NMR-Spektrum, Massenspektrum, spezifische Drehung und ¹³C-NMR-Spektrum des Diastereomers des L-Menthol wurde bestätigt, daß es sich bei dem Produkt um (S)-(-)-3-Methyladipinsäure handelt und die optische Reinheit mindestens 98 % betrug.
- Die in Tabelle 3 gezeigten mikrobiellen Zellinien wurden getrennt voneinander entsprechend demselben wie in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren kultiviert, um eine optisch aktive 3-Methyladipinsäure herzustellen. Die erhaltenen Produkte wurden gereinigt und die optische Aktivität, wie in Beispiel 1 beschrieben, bestimmt. Tabelle 3 Zellinie Kulturzeit (h) Menge der gebildeten 3-Methyladipinsäure sterische Konfiguration optische Reinheit
Claims (3)
1. Verfahren zur Herstellung einer optisch aktiven
3-Methyladipinsäure entsprechend der Formel (I):
worin das Symbol * ein asymmetrisches Kohlenstoffatein
bedeutet, umfassend folgende Schritte:
Kultivieren eines Mikroorganismus, der als zugehörig zu
den Gattungen Candida lipolytica, Saccharomycopsis
lipolytica und Yarrowia lipolytica ausgewiesen ist, in
einem Squalen enthaltenden Nährstoff,
Prüfung auf Anwesenheit von (S)-(-)-3-Methyladipinsäure
und Gewinnen der (S)-(-)-3-Methyladipinsäure aus dein
kultivierten Produkt.
e
2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der
Mikroorganismus zu einer Zellinie gehört, die aus der
Gruppe ausgewählt ist, die aus Candida lipolytica SQL349
(FERM BP 3580), IFO 0746 (ATCC 20114), IFO 1209 (ATCC
8662), IFO 1542 (ATCC 20306), IFO 1632, IFO 1741, IFO
10073 (ATCC 48436), IFO 1742 (ATCC 9773), IFO 1195, IFO
1548 (ATCC 18942), IFO 1549 (ATCC 18945), IFO 1550
(18943), IFO 1746, ATCC 20237, ATCC 20255, ATCC 20362,
ATCC 20363, ATCC 20460, ATCC 20461, ATCC 20496, ATCC
22421, ATCC 22422, ATCC 22423, ATCC 34922, ATCC 44601,
ATCC 46330, ATCC 46482, ATCC 46483 und ATCC 46484
besteht.
3. Hefelinie der Gattung Candida, bezeichnet als
SQL 349 und hinterlegt unter der internationalen
Hinterlegungsnummer FERN BP-3580 bei der Fermentation
Research Institute Agency of Industrial Science and
Technology (Japan), sowie diejenigen ihrer Mutanten und
Abkömmlinge, die im Verfahren entsprechend Anspruch 1
nutzbar sind.
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